CN117551801A - 分子标记及其应用和基于erg11基因拷贝数检测近平滑念珠菌氟康唑耐药性的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及用于近平滑念珠菌氟康唑耐药性检测的新分子标记及其应用、检测方法及系统，其中，所述分子标记包括ERG11基因，所述ERG11基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过检测该ERG11基因的拷贝数判定近平滑念珠菌是否具有氟康唑耐药性，能够至少部分地实现近平滑念珠菌氟康唑耐药性的快速且高特异性的检测。
Description
技术领域
本公开涉及临床微生物药敏检测技术领域，具体地，涉及用于一种新分子标记(ERG11基因拷贝数)在近平滑念珠菌氟康唑耐药性检测中的应用及其检测方法和系统。
背景技术
近平滑念珠菌是一种重要的人类致病性真菌，近年来发病率逐年增加。目前，在拉美、加拿大、欧洲和亚太的部分地区，近平滑念珠菌目前已经成为第二或第三常见的侵袭性致病念珠菌。国内的报道发现近平滑念珠菌血症的发病率也呈上升趋势，有研究一家医院四年间临床侵袭性真菌感染率由8.0％升至13.4％，虽然白念珠菌仍是引起临床感染的主要真菌，但其构成比下降，而近平滑念珠菌的构成比四年间增加了6.7％，成为临床侵袭性真菌感染的第二位病原菌。近平滑念珠菌对唑类药物的耐药情况亦严重且逐年增加，耐药率在全球部分地区甚至高达50％，给近平滑念珠菌感染的预防和治疗构成了严峻挑战。准确且快速得对患者所感染的近平滑念珠菌进行耐药性检测，以及时更换适用的抗真菌药物，对近平滑念珠菌病的治疗十分重要。
近平滑念珠菌对氟康唑的耐药最常见途径是麦角甾醇生物合成机制的改变，主要为药物靶点14-α-去甲基化酶Erg11或后期合成关键酶Erg3突变或过度表达。药物外排泵，包括ATP转运蛋白家族(Cdr1和Cdr2)和蛋白外排超家族(Mdr1)表达上调是该菌种对氟康唑的产生耐药性的另一关键因素，多由其对应的转录因子TAC1和MRR1发生功能获得性突变所介导。但上述机制无法解释近平滑念珠菌的约半数的氟康唑耐药性。
基于基因型检测微生物耐药性检测方法是直接从临床样本中检测与耐药性相关的基因的有无、表达量或者突变情况，从而判定是否耐药，对时段检测时间短、定量分析以及明确耐药机制具有重要作用。目前，针对念珠菌对抗真菌药物耐药性的基因型检测方法所采用的分子标记主要是耐药相关基因突变位点，但这些突变位点检测无法检测到所有的近平滑念珠菌氟康唑耐药株，漏检率约50％。
因此，迫切需要新的特异性分子标记用于念珠菌的耐药性快速检测，以降低基因型耐药性检测方法的漏检率。
发明内容
本公开的目的是提供一种新分子标志物标记(ERG11基因拷贝数)在近平滑念珠菌氟康唑耐药性的检测中的应用及其检测方法和系统，提高基于基因型检测近平滑念珠菌氟康唑耐药性方法的检出率。
为了实现上述目的，本公开一方面提供了一种分子标记，所述分子标记包括ERG11基因，所述ERG11基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本公开另一方面提供了分子标记在检测近平滑念珠菌氟康唑耐药性中的应用，所述分子标记包括ERG11基因，通过检测所述ERG11基因的拷贝数判定所述近平滑念珠菌的氟康唑耐药性；若所述分子标记的基因拷贝数不小于3，则判定近平滑念珠菌对氟康唑具有耐药性；所述ERG11基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
另一方面，本公开还提供了一种非诊断目的近平滑念珠菌氟康唑耐药性分子标记的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：S1、提取近平滑念珠菌的总DNA；S2、使用Illumina二代测序法对所述近平滑念珠菌的总DNA进行测序；S3、使用YMAP方法对步骤S2测定的全基因组数据进行基因拷贝数分析；若所述分子标记的基因拷贝数不小于3，则判定近平滑念珠菌对氟康唑具有耐药性；所述分析标记包括ERG11基因，所述ERG11基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
另一方面，本公开还提供了一种用于检测近平滑念珠菌氟康唑耐药性的系统，该系统包括测序装置、计算装置和输出装置；所述测序装置用于对待测样本的总核酸进行核酸序列测序，得到总核酸序列；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下判别：若所述总核酸序列中ERG11基因拷贝数不小于3，则判定为近平滑念珠菌对氟康唑具有耐药性；所述输出装置用于输出所述计算装置的判定结果。
通过上述技术方案，本公开将ERG11基因作为耐药氟康唑近平滑念珠菌检测的特异性分子标记，通过测定ERG11基因拷贝数，能够至少部分地实现氟康唑耐药近平滑念珠菌的快速且高特异性的检测，提高了基于基因型检测近平滑念珠菌氟康唑耐药性方法的检出率。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是本公开对于氟康唑耐药性近平滑念珠菌菌株发生的染色体节段性非整倍体拷贝数测定结果。
图2是氟康唑耐药性近平滑念珠菌菌株的短片段局部扩增ERG11基因拷贝数测定结果。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
为了实现上述目的，本公开一方面提供了一种分子标记，所述分子标记包括ERG11基因，所述ERG11基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本公开另一方面提供了分子标记在检测近平滑念珠菌氟康唑耐药性中的应用，所述分子标记包括ERG11基因，通过检测所述ERG11基因的拷贝数判定所述近平滑念珠菌的氟康唑耐药性；若所述分子标记的基因拷贝数不小于3，则判定近平滑念珠菌对氟康唑具有耐药性；所述ERG11基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，可以利用Illumina NovaSeq PE150平台对待测近平滑念珠菌菌株进行全基因组二代测序，酵母基因型-表型图谱(Ymap)对过滤处理后的有效数据进行基因拷贝数分析。Ymap分析过程包括：FASTQ文件过滤质控、构建比对BAM文件、构建PILEUP文件和拷贝数变异分析(Copy number variation，CNV)。分析过程的第一步是上传并纠正FASTQ格式文件，可以是原始的或以ZIP或GZ格式压缩的文件；第二步是将校正后的FASTQ文件处理成最终的二进制序列比对/映射(BAM)文件。单端或成对末端读取使用Bowtie2进行比对，其中SAM输出模式设置为“非常敏感”，从而产生一个序列比对/映射(SAM)文件。SAMtools用于将其压缩为BAM文件并进行排序，用PicardTools对BAM文件中的读组头进行标准化。FASTQC用于识别输入FASTQ文件中使用的质量编码系统，作为定义Genome Analysis ToolKit(GATK)处理参数的前导步骤，GATK负责处理BAM文件的插入缺失对齐，移除主要比对周围的虚假SNP。第三步是将BAM文件转换为文本文件，其中包含跨基因组的每个坐标的有限数据，以简化后续处理。SAMtools的mpileup功能首先将BAM文件处理成一个“PILEUP”文件，该文件包含有关每个染色体坐标处所有已映射读取的信息。Python脚本提取每个坐标的碱基呼叫计数，丢弃插入缺失和读取的起始/结束信息。每个坐标的原始读取深度数据保存到一个文本文件[‘SNP_CNV.txt’]中，该文件输入到流程的CNV分析部分，得到CNV结果。
另一方面，本公开还提供了一种非诊断目的近平滑念珠菌氟康唑耐药性分子标记的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：S1、提取近平滑念珠菌的总DNA；S2、使用Illumina二代测序法对所述近平滑念珠菌的总DNA进行测序；S3、使用YMAP方法对步骤S2测定的全基因组数据进行基因拷贝数分析；若所述分子标记的基因拷贝数不小于3，则判定近平滑念珠菌对氟康唑具有耐药性；所述分析标记包括ERG11基因，所述ERG11基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
该非诊断目的检测方法可以用于环境菌群耐药检测。
另一方面，本公开还提供了一种用于检测近平滑念珠菌氟康唑耐药性的系统，该系统包括测序装置、计算装置和输出装置；所述测序装置用于对待测样本的总核酸进行核酸序列测序，得到总核酸序列；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下判别：若所述总核酸序列中ERG11基因拷贝数不小于3，则判定为近平滑念珠菌对氟康唑具有耐药性；所述输出装置用于输出所述计算装置的判定结果。
该系统可以用于检测近平滑念珠菌菌株的氟康唑耐药性，以指导临床治疗患者感染时的用药。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
本公开实施例中涉及的原料、试剂、仪器和设备，如无特殊说明，均可通过购买获得。
ERG11基因序列如SEQ ID NO.1所示：
>CPAR2_303740SEQ ID NO.1(ERG11基因)
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实施例1
本实施例用于说明ERG11基因在耐药氟康唑近平滑念珠菌中的特异性。
本实施例对中国医院侵袭性真菌监测网(CHIF-NET)项目收集的来自中国46家医院的113株氟康唑耐药和92株不耐药的近平滑念珠菌临床分离株进行了群体基因组研究。利用Illumina NovaSeq PE150平台对205株菌株进行全基因组二代测序，酵母基因型-表型图谱(Ymap)对过滤处理后的有效数据进行基因拷贝数分析。Ymap分析过程包括：FASTQ文件过滤质控、构建比对BAM文件、构建PILEUP文件和拷贝数变异分析(Copy numbervariation，CNV)。分析过程的第一步是上传并纠正FASTQ格式文件，可以是原始的或以ZIP或GZ格式压缩的文件；第二步是将校正后的FASTQ文件处理成最终的二进制序列比对/映射(BAM)文件。单端或成对末端读取使用Bowtie2进行比对，其中SAM输出模式设置为“非常敏感”，从而产生一个序列比对/映射(SAM)文件。SAMtools用于将其压缩为BAM文件并进行排序，用PicardTools对BAM文件中的读组头进行标准化。FASTQC用于识别输入FASTQ文件中使用的质量编码系统，作为定义Genome Analysis ToolKit(GATK)处理参数的前导步骤，GATK负责处理BAM文件的插入缺失对齐，移除主要比对周围的虚假SNP。第三步是将BAM文件转换为文本文件，其中包含跨基因组的每个坐标的有限数据，以简化后续处理。SAMtools的mpileup功能首先将BAM文件处理成一个“PILEUP”文件，该文件包含有关每个染色体坐标处所有已映射读取的信息。Python脚本提取每个坐标的碱基呼叫计数，丢弃插入缺失和读取的起始/结束信息。每个坐标的原始读取深度数据保存到一个文本文件[‘SNP_CNV.txt’]中，该文件输入到流程的CNV分析部分，得到CNV结果。
结果发现仅55.8％的耐药是由现有研究报道的已知机制导致的，如耐药相关基因或转录组突变，ERG11A395T(48.7％)、ERG11A428G(2.6％)、TAC1C1552T(1.8％)，而44.2％(n＝50/113)的氟康唑耐药表型无法用已知机制解释。为了探索潜在的新机制，本实施例进行了CNV分析，结果发现12.4％(14/113)的氟康唑耐药株ERG11基因的拷贝数增加(>2)。
14例ERG11 CNV中，有2个(14.3％)是由于3号染色体长臂(chr3q，约609kb；表1和图1，图1为氟康唑耐药性近平滑念珠菌菌株发生的染色体节段性非整倍体拷贝测定(3号染色体长臂，包含ERG11基因)，每个点代表染色体上1000碱基长度的窗口的序列深度)的拷贝数增加一个造成的，其余12例(85.7％)是由于短片段局部扩增引起的，拷贝数从5到12不等，重复片段长度从2.3kb到12.1kb不等，这些重复片段均包含ERG11基因的编码序列(表1；图2，氟康唑耐药性近平滑念珠菌菌株发生的七种短片段局部扩增形式的ERG11基因拷贝数变异，每个点代表一个碱基在染色体上的序列深度)。
而利用Ymap对92株非耐药菌株进行拷贝数分析，均未发现ERG11的拷贝数变异，也就是氟康唑不耐药菌株中ERG11的拷贝数为2。
实施例2
本实施例用于验证ERG11基因在耐药氟康唑近平滑念珠菌中的特异性。
本实施例从NCBI公共数据库中获取了所有包含氟康唑敏感性数据的近平滑念珠菌全基因组测序数据(n＝26，其中包括18株对氟康唑耐药的分离株)，利用实施例1相同的方法对上述近平滑念珠菌进行拷贝数分析，结果显示，38.9％(n＝7/18)的氟康唑耐药株的ERG11基因拷贝数增加，这7株ERG11基因多拷贝的耐药株分离自葡萄牙(n＝2)、韩国(n＝4)和土耳其(n＝1)。来自葡萄牙的两个分离株中含有ERG11A395T基因的chr3q片段非整倍体(如表1和图1所示)，来自土耳其的分离株显示出独特的CNV模式，重复大小为6kb，有14个拷贝；来自韩国一个医疗中心的四株分离株的CNV重复片段一致(6.0kb，10至16个拷贝)(如表1和图2所示)。
表1
由表1可知，本公开通过检测ERG11基因的拷贝数能够实现在耐药氟康唑近平滑念珠菌的准确检测。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (4)
1.一种分子标记，其特征在于，所述分子标记包括ERG11基因，所述ERG11基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种分子标记在检测近平滑念珠菌氟康唑耐药性中的应用，其特征在于，所述分子标记包括ERG11基因，通过检测所述ERG11基因的拷贝数判定所述近平滑念珠菌的氟康唑耐药性；若所述分子标记的基因拷贝数不小于3，则判定近平滑念珠菌对氟康唑具有耐药性；
所述ERG11基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种非诊断目的近平滑念珠菌氟康唑耐药性的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
S1、提取近平滑念珠菌的总DNA；
S2、使用Illumina二代测序法对所述近平滑念珠菌的总DNA进行测序；
S3、使用YMAP方法对步骤S2测定的全基因组数据进行基因拷贝数分析；
若所述分子标记的基因拷贝数不小于3，则判定近平滑念珠菌对氟康唑具有耐药性；
所述分析标记包括ERG11基因，所述ERG11基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种用于检测近平滑念珠菌氟康唑耐药性的系统，其特征在于，该系统包括测序装置、计算装置和输出装置；
所述测序装置用于对待测样本的总核酸进行核酸序列测序，得到总核酸序列；
所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下判别：
若所述总核酸序列中ERG11基因拷贝数不小于3，则判定为近平滑念珠菌对氟康唑具有耐药性；
所述输出装置用于输出所述计算装置的判定结果。
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-
2023
- 2023-09-25 CN CN202311247272.7A patent/CN117551801A/zh active Pending
Patent Citations (1)
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| AU2006292174A1 (en) * | 2005-09-20 | 2007-03-29 | Advandx, Inc. | Reagents, methods and kits for classification of fungi and direction of anti-fungal therapy |
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