CN117551196A - 抗cll-1纳米抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体地涉及抗CLL‑1纳米抗体及其应用。本发明公开了一种抗抗CLL‑1纳米抗体，其可变结构域基本上由4个框架区(FR1～4)和3个互补决定区(CDR1～3)组成组成，其中所述CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、10、18、27、35中之一，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：2、11、19、28、36中之一，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：3、12、20、29、37中之一。本发明的抗人抗CLL‑1的纳米抗体特异结合髓系肿瘤，易于改造、易予其他抗体联合构建双特异性抗体，易于构建CAR‑T，易于制备为和其他药物的偶联物，为靶向CLL‑1相关疾病提供了新的诊断产品和治疗产品。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地涉及抗CLL-1纳米抗体及其应用。
背景技术
C-type lectin-like molecule1(也名为CLL-1，KLRl，和CLECl2A)是一种II型跨膜糖蛋白，属于C型凝集素样受体家族的第五组，为与免疫调节相关的C-型凝集素样受体大家族的成员，作为抑制性受体在免疫调节中发挥重要作用。CLL-1的表达模式在造血细胞具有限制性，研究发现，CLL-1存在于多数的CD34+或CD34-AML，主要表达在外周髓系白血病与淋巴系列白血病。CLL-1作为LSC的标志抗原，有助于正常干细胞和白血病干细胞之问的鉴别和分离，在白血病免疫分型诊断和AML的MRD检测上有重要的价值。
目前，有关CLL-1靶点的药物开发主要涉及CAR-T、双抗和ADC，进入临床阶段的基本上都是CAR-T细胞疗法，且采用多靶点的设计策略，在美国，2022年9月，Kite的CLL-1CAR-T(KITE-222)获FDA授予孤儿药称号，用于AML治疗。在国内，百暨基因的自体CLL-1CAR-T疗法正在进行临床试验。
CN104736562A公开了一种CLL-1特异性的抗体，其为人单克隆抗体；WO2020227475A1公开提供用于过继T细胞疗法的改进的CLL-1靶向多肽和组合物，用于治疗、预防或改善癌症、传染病、自身免疫性疾病、炎症性疾病和免疫缺陷或与之相关的病症的至少一种症状；CN113507937A描述了特异性结合CLL-1的抗体，以及制备和使用此类抗体的方法。后2篇专利公开了抗CLL-1纳米抗体或VHH抗体，为靶向CLL-1相关疾病提供了新的诊断策略和治疗策略。
纳米抗体或VHH抗体由4个保守的框架区和3个高变的互补决定区构成，是目前发现天然存在的最小的功能性抗体结构。与传统单克隆抗体相比，单域抗体有以下优势：(1)分子量小，穿透性好；(2)有更好的溶解性和稳定性；(3)易大量生产，可以在细菌、酵母或植物中表达，所以生产成本很低；(4)不易聚集；(5)免疫原性低，更容易改造或人源化。
综上，本领域亟待开发更多的靶向CLL-1的纳米抗体，为靶向CLL-1相关疾病提供了新的诊断策略和治疗策略。
发明内容
本发明的目的在于提供抗CLL-1纳米抗体及其应用，为靶向CLL-1相关疾病提供了新的诊断产品和治疗产品。
为此，本发明公开了一种抗CLL-1纳米抗体，其可变结构域基本上由4个框架区(FR1～4)和3个互补决定区(CDR1～3)组成，其中：
(i)CDR1的氨基酸序列为如下：
(a)SEQ ID NO：1、10、18、27、35中之一；或
(b)与SEQ ID NO：：1、10、18、27、35的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列中之一；
和/或
(ii)CDR2的氨基酸序列为如下：
(c)SEQ ID NO：：2、11、19、28、36中之一；或
(d)与SEQ ID NO：2、11、19、28、36的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列中之一；
和/或
(iii)CDR3的氨基酸序列为如下：
(e)SEQ ID NO：3、12、20、29、37中之一；或
(f)与SEQ ID NO：3、12、20、29、37的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列中之一。
在一些优选例中，所述3个互补决定区(CDR1～3)组成，其中：
(i)CDR1的氨基酸序列为：SEQ ID NO：1；或与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(ii)CDR2的氨基酸序列为：SEQ ID NO：2；或与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(iii)CDR3的氨基酸序列为：SEQ ID NO：3；或与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些优选例中，所述3个互补决定区(CDR1～3)组成，其中：
(i)CDR1的氨基酸序列为：SEQ ID NO：10；或与SEQ ID NO：10的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(ii)CDR2的氨基酸序列为：SEQ ID NO：11；或与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(iii)CDR3的氨基酸序列为：SEQ ID NO：12；或与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些优选例中，所述3个互补决定区(CDR1～3)组成，其中：
(i)CDR1的氨基酸序列为：SEQ ID NO：18；或与SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(ii)CDR2的氨基酸序列为：SEQ ID NO：19；或与SEQ ID NO：19的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(iii)CDR3的氨基酸序列为：SEQ ID NO：20；或与SEQ ID NO：20的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些优选例中，所述3个互补决定区(CDR1～3)组成，其中：
(i)CDR1的氨基酸序列为：SEQ ID NO：27；或与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(ii)CDR2的氨基酸序列为：SEQ ID NO：28；或与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(iii)CDR3的氨基酸序列为：SEQ ID NO：29；或与SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些优选例中，所述3个互补决定区(CDR1～3)组成，其中：
(i)CDR1的氨基酸序列为：SEQ ID NO：35；或与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(ii)CDR2的氨基酸序列为：SEQ ID NO：36；或与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(iii)CDR3的氨基酸序列为：SEQ ID NO：37；或与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
另一优选例中，所述4个框架区FR，所述框架区FR为选自下组的一种或多种：
(i)FR1的氨基酸序列为如下：
(a)SEQ ID NO：4、13、21、30、38中之一；或
(b)与SEQ ID NO：：4、13、21、30、38的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列中之一；
和/或
(ii)FR2的氨基酸序列为如下：
(c)SEQ ID NO：：5、14、22、31、39中之一；或
(d)与SEQ ID NO：5、14、22、31、39的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列中之一；
和/或
(iii)FR3的氨基酸序列为如下：
(e)SEQ ID NO：6、15、23、32、40中之一；或
(f)与SEQ ID NO：6、23、32、40的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列中之一；
和/或
(iiii)FR4的氨基酸序列为如下：
(g)SEQ ID NO：7、24中之一；或
(h)与SEQ ID NO：7、24的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列中之一。
另一优选例中，所述抗CLL-1纳米抗体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：8、16、25、33、41中之一。
第二方面，本发明还提供一种抗CLL-1抗体，所述抗体包括一条或多个如本发明的第一方面所述的抗CLL-1纳米抗体。
在另一优选例中，所述抗CLL-1抗体包含一条或多条氨基酸序列如SEQ ID NO：8、16、25、33、41所示。
在另一优选例中，所述抗体可以为单体、二价抗体、和/或多价抗体。
在本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：如本发明第一方面所述抗CLL-1纳米抗体，或如本发明第二方面所述的抗CLL-1抗体。
在另一优选例中，所述多核苷酸的核苷酸序列包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:42中的一种或多种。
在另一优选例中，所述多核苷酸为RNA、DNA或cDNA。
在本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体表达本发明的第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合。优选地，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒、或其组合。
在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第四方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明的第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞，293T细胞。
在本发明的第六方面，提供了一种产生抗CLL-1纳米抗体的方法，包括步骤：
(a)在适合产生抗CLL-1纳米抗体的条件下，培养本发明的第五方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗CLL-1纳米抗体的培养物；以及
(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗CLL-1纳米抗体；及任选的
(c)纯化和/或修饰步骤(b)所获得的抗CLL-1纳米抗体。
在另一优选例中，所述的抗CLL-1纳米抗体具有如SEQ ID NO：8、16、25、33、41中之一所示的氨基酸序列。
在本发明的第七方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：
(a)如本发明第一方面所述的纳米抗体，或如本发明的第二方面所述的抗CLL-1抗体；和可操作性连接的
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白、或其组合。
在另一优选例中，所述的放射性核素包括：
(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188、或其组合；和/或
(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133 Yb-169、Yb-177、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。
在另一优选例中，所述的药物为细胞毒性药物。
在另一优选例中，所述的细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、或其组合。
特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepinecontainingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines)、长春花生物碱(vinca alkaloids)、或其组合。
在另一优选例中，所述的毒素选自下组：
耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
在另一优选例中，所述偶联部分为微管抑制剂DM1。
在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如上述的抗CLL-1纳米抗体、或如上所述的抗CLL-1抗体。
在另一优选例中，所述多价是指，在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如上述的抗CLL-1纳米抗体、或如上所述的抗CLL-1抗体。
在另一优选例中，所述的免疫偶联物用于癌症的诊断或预后，尤其是用于表达CLL-1的肿瘤(即CLL-1阳性的肿瘤)。
在另一优选例中，所述免疫偶联物用于诊断和/或治疗表达CLL-1蛋白的肿瘤。
在本发明的第八方面，提供了如本发明第一方面所述的纳米抗体，或如本发明第二方面所述的抗CLL-1抗体的用途，用于制备(a)用于检测CLL-1分子的试剂；(b)用于治疗肿瘤的药物。
在另一优选例中，所述的检测为体内检测或体外检测。
在另一优选例中，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测。
在本发明的第九方面，提供了一种药物组合物，含有：
(i)如本发明的第一方面所述的纳米抗体，或如本发明第二方面所述所述的抗CLL-1抗体，和/或本发明第七方面所述的免疫偶联物；
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中，所述的药物组合物中还含有治疗肿瘤的其他药物，如细胞毒性药物。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗表达CLL-1蛋白(即CLL-1阳性)的肿瘤。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：包括AML(急性骨髓性或骨髓增生性白血病)、MDS(骨髓增生异常综合征)、骨髓纤维化、CMML(慢性骨髓单核细胞白血病)、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和CML(慢性骨髓性或骨髓增生性白血病)。
在另一优选例中，所述骨髓瘤为AML。
在本发明的第十方面，提供了如本发明的第一方面所述的纳米抗体，或如本发明第二方面所述所述的抗CLL-1抗体，如本发明第七方面所述的免疫偶联物，或如本发明的第九方面所述的药物组合物的一种或多种的用途：
(a)用于检测CLL-1分子；
(b)用于流式检测；
(c)用于细胞免疫荧光检测；
(d)用于治疗肿瘤；
(e)用于肿瘤诊断。
(f)用于制备特异性结合人CLL-1的细胞治疗产品；
(g)用于制备治疗肿瘤的抗体药物、靶向人CLL-1的免疫毒素、抗体药物偶联物产品；
(h)用于制备治疗肿瘤的细胞治疗产品。
在另一优选例中，所述用途为非诊断的和非治疗的。
在本发明的第十一方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明第一方面所述的纳米抗体或如本发明第二方面所述的抗CLL-1抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签和HA标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合CLL-1蛋白。
在本发明的第十二方面，提供了如本发明第一方面所述的纳米抗体或如本发明第二方面所述的抗CLL-1抗体，如本发明第七方面所述的免疫偶联物，或如本发明的第九方面所述的药物组合物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中CLL-1蛋白；
其中，所述药剂用于治疗或预防表达CLL-1的肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤包括：AML(急性骨髓性或骨髓增生性白血病)、MDS(骨髓增生异常综合征)、骨髓纤维化、CMML(慢性骨髓单核细胞白血病)、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和CML(慢性骨髓性或骨髓增生性白血病)。
在本发明的第十三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有如本发明第一方面所述的纳米抗体或如本发明第二方面所述的抗CLL-1抗体，如本发明第七方面所述的免疫偶联物，或如本发明的第九方面所述的药物组合物。
在本发明的第十四方面，提供了一种检测样品中CLL-1蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与本发明第一方面所述的纳米抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在CLL-1蛋白。
在另一优选例中，所述方法为体外方法。
在另一优选例中，所述方法为非治疗非诊断的方法。
在本发明的第十五方面，提供了一种治疗CLL-1相关疾病的方法，所述方法包括，给有需要的对象施用如本发明第一方面所述的纳米抗体或如本发明第二方面所述的抗CLL-1抗体，如本发明第七方面所述的免疫偶联物，或如本发明的第九方面所述的药物组合物。
在本发明的第十六方面，提供了一种CAR-T细胞，所述CAR-T细胞表达嵌合抗原受体CAR，所述CAR的抗原结合结构域具有如本发明第一方面所述的纳米抗体。
在本发明的第十七方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明的第十六方面所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。
在另一优选例中，所述制剂的剂型包括注射剂。
附图说明
图1.羊驼抗CLL-1血清效价；
图2.纳米抗体菌液PCR电泳图；
图3.SDS-PAGE胶电泳检测抗CLL-1纳米抗体纯度；图中1为上清液，2为流穿液，3为Mark，4为5nM咪唑洗杂液，5为15nM咪唑洗杂液，6为25nM咪唑洗杂液，7为250nM咪唑洗脱液，8为500nM咪唑洗脱液，；
图4.抗CLL-1纳米抗体亲和性检测；
图5.CLL-1纳米抗体与肿瘤细胞结合流式细胞检测。
具体实施方式
人C型凝集素样分子-1(CLL-1)，也称为MICL或CLEC12A，是II型跨膜糖蛋白和参与免疫调节的C型凝集素样受体大家族的成员。CLL-1先前已经从髓系源性细胞中得到鉴定。CLL-1的胞内结构域含有基于免疫酪氨酸的抑制基序(ITIM)和YXXM基序。各种细胞上的含ITIM受体的磷酸化通过募集蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1、SHP-2和SHIP导致激活途径的抑制。YXXM基序具有PI-3激酶13的p85亚基的潜在SH2结构域结合位点，其涉及细胞活化途径，揭示了CLL-1作为髓系细胞上的抑制和活化分子的潜在双重作用。事实上，在经转染的和髓系源性细胞系中已经以实验方式证实了CLL-1与SHP-1和SHP-2的关联。
CLL-1在造血细胞中的表达模式受到限制。其特别是在源自外周血和骨髓的髓系细胞中，以及在大多数AML胚细胞中见到。最近的研究说明CLL-1也存在于AML中的CD34+/CD38-区室中的大多数白血病干细胞上，但不存在于正常骨髓和再生骨髓对照中的CD34+/CD38-细胞，其有助于区分正常干细胞和白血病干细胞。(参见，例如Zhao等人，Haematologica 95:71-78(2010)；Bakker等人，Cancer Res.64:8443-8450(2004))。
CLL-1的核苷酸和蛋白质序列对于许多物种是已知的。例如，人序列可在Genbank登录号AF247788.1和Uniprot登录号Q5QGZ9中见到。
术语
如本文所用，术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“纳米抗体(singledomain antibody，sdAb，或VHH)”、“纳米抗体”(nanobody)具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“单域抗体(VHH)”、“纳米抗体”(nanobody)具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗CLL-1蛋白抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementaritydeterminingregion,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合CLL-1蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
为了比较两个或更多个核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的“序列同源性”百分比可以通过将[第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置上的核苷酸相同的核苷酸数目]除以[第一核苷酸序列中核苷酸的总数]并乘以[100％]，其中第二核苷酸序列中的核苷酸的每个缺失、插入、置换或添加-与第一核苷酸序列相比较-被认为是在单个核苷酸(位置)上的差异。或者，使用标准设置，使用用于序列比对的已知计算机算法如NCBI Blast v2.0来计算两个或更多个核苷酸序列之间的序列同源性程度。例如在WO 04/037999、EP 0967284、EP 1085089、WO 00/55318、WO 00/78972、WO 98/49185和GB2357768中描述了用于确定序列同一性程度的一些其他技术、计算机算法和设置。通常，为了根据上文概述的计算方法确定两个核苷酸序列之间“序列同源性”的百分比，具有最多核苷酸数量的核苷酸序列将被视为“第一”核苷酸序列，而另一个核苷酸序列将被视为“第二”核苷酸序列。
为了比较两个或更多个氨基酸序列，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列(在本文中也称为“氨基酸同源性”)之间的“序列同源性”百分比可以通过将[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中对应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基数目]除以[第一氨基酸序列中氨基酸残基的总数]并乘以[100％]，其中第二氨基酸序列中的氨基酸残基的每个缺失、插入、置换或添加-与第一氨基酸序列相比-被认为是在单个氨基酸残基(位置)处的差异，即如本文所定义的“氨基酸差异”。或者，可以使用已知的计算机算法来计算两个氨基酸序列之间的序列同源性程度，所述已知的计算机算法例如上面提到的用于确定核苷酸序列的序列同源性程度的算法的那些，同样使用标准设置。通常，为了根据上文概述的计算方法确定两个氨基酸序列之间“序列同源性”的百分比，具有最大数目的氨基酸残基的氨基酸序列将被视为“第一”氨基酸序列，而另一个氨基酸序列将被视为“第二”氨基酸序列。
而且，在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度时，本领域技术人员可以考虑所谓的“保守性”氨基酸置换，其通常可以描述为氨基酸置换，其中氨基酸残基被替代为另一种具有相似化学结构并且对多肽的功能、活性或其他生物学特性几乎没有影响的氨基酸残基。这种保守性氨基酸取代在本领域中是公知的，例如从WO 04/037999、GB 2357768，WO 98/49185、WO 00/46383和WO 01/09300中是公知的；并且这些取代的(优选的)类型和/或组合可以根据WO 04/037999以及WO 98/49185和其中引用的其他参考文献的相关教导来选择。
这样的保守性置换优选是这样的置换，其中以下组(a)-(e)内的一个氨基酸被同一组内的另一个氨基酸残基置换：(a)小的脂肪族、非极性或轻微极性的残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性带负电荷的残基和它们的(不带电的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和(e)芳族残基：Phe，Tyr和Trp。特别优选的保守性置换如下：Ala置换为Gly或置换为Ser；Arg置换为Lys；Asn置换为Gln或置换为His；Asp置换为Glu；Cys置换为Ser；Gln置换为Asn；Glu置换为Asp；Gly置换为Ala或置换为Pro；His置换为Asn或置换为Gln；Ile置换为Leu或置换为Val；Leu置换为Ile或置换为Val；Lys置换为Arg，置换为Gln或置换为Glu；Met置换为Leu、置换为Tyr或置换为Ile；Phe置换为Met、置换为Leu或置换为Tyr；Ser置换为Thr；Thr置换为Ser；Trp置换为Tyr；Tyr置换为Trp；和/或Phe置换为Val、置换为Ile或置换为Leu。
适用于本文所述多肽的任何氨基酸置换也可以基于Schulz等(“PrinciplesofProtein Structure”，Springer-Verlag，1978)开发的不同物种的同源蛋白质之间氨基酸变异频率的分析、基于Chou和Fasman(Biochemistry 13∶211，1974；Adv.Enzymol.，47：45-149，1978)开发的结构形成潜力的分析、以及基于Eisenberg等(Proc.Natl.AcadSci.USA81：140-144，1984)，Kyte and Doolittle(J.Molec.Biol.157：105-132，1981)开发的蛋白质中疏水性模式的分析、以及Goldman等(Ann.Rev.Biophys.Chem.15：321-353，1986)，在此全部引入作为参考。关于纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息在本文的说明书和以上引用的一般背景技术中给出。而且，为此目的，来自美洲驼的VHH结构域的晶体结构例如由Desmyter等(Nature Structural Biology，3：803，1996)、Spinelli等(NaturalStructural Biology，3：752-757，1996)、和Decanniere等(Structure，7(4)：361，1999)中给出。关于在常规VH结构域中形成VH/VL界面的一些氨基酸残基和在这些位置上潜在的骆驼化置换的进一步信息可以在上面引用的现有技术中找到。
如果氨基酸序列和核酸序列在其整个长度上具有100％序列同源性(如本文所定义)，则称其为“完全相同”。
当比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比，第一序列位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或置换；应该理解，两个氨基酸序列可以含有一个、两个或更多个这样的氨基酸差异。
“氨基酸差异”可以是任何一个、两个、三个或最多四个置换、缺失或插入或其任何组合，这改进本发明多肽的性质或者至少不会过于减损期望的性质或本发明多肽的期望性质的平衡或组合。在这方面，与包含不具有1、2、3或最多4个置换、缺失或插入的一个或多个CDR序列的多肽相比，本发明的所得多肽应该至少以相同、大约相同或更高的亲和力结合CLL-1，所述亲和力如例如通过表面等离子体共振(SPR)测量。
例如，取决于用于表达本发明多肽的宿主生物体，这样的缺失和/或置换可以以这样的方式设计，即一个或多个用于翻译后修饰的位点(例如一个或多个糖基化位点)被移除，这将在本领域技术人员的能力范围内。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有CLL-1蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明涉及的抗体序列
表1.本发明的纳米抗体及其序列
本发明提供的纳米抗体的VHH链包含选自以下组合的CDRl、CDR2和CDR3:
(1)SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2、SEQ ID NO:3所示的CDR3(对应于纳米抗体1的CDR)；
(2)SEQ ID NO:10所示的CDR1、SEQ ID NO:11所示的CDR2、SEQ ID NO:12所示的CDR3(对应于纳米抗体2的CDR)；
(3)SEQ ID NO:18所示的CDR1、SEQ ID NO:19所示的CDR2、SEQ ID NO:20所示的CDR3(对应于纳米抗体3的CDR)；
(4)SEQ ID NO:27所示的CDR1、SEQ ID NO:28所示的CDR2、SEQ ID NO:29所示的CDR3(对应于纳米抗体4的CDR)；
(5)SEQ ID NO:35所示的CDR1、SEQ ID NO:36所示的CDR2、SEQ ID NO:37所示的CDR3(对应于纳米抗体5的CDR)。
在另一优选例中，本发明的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：8、16、25、33、41中之一所示；以及其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：9、17、26、34、42中之一所示。进一步地，本发明的纳米抗体还包括或与上述序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以上的序列一致性的序列。
在另一优选例中，如SEQ ID NO：9、17、26、34、42中之一所示的核苷酸序列可以添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸序列，以获得能保留与CLL-1高亲和力结合能力的衍生序列。
利用亲和力成熟和计算机模拟技术，可以在本发明的纳米抗体序列上进行氨基酸序列改造，以获得新的纳米抗体序列。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本发明提供一种表达上述针对人CLL-1纳米抗体的表达系统，一种宿主细胞包含上述表达载体。所述宿主细胞优先大肠杆菌。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明提供了一种针对人CLL-1的纳米抗体的制备方法：具体包括以下步骤：首先合成人CLL-1胞外段蛋白和CLL-1高表达细胞株，然后将CLL-1蛋白偶联在酶标板上，展示人CLL-1空间构象，利用驼科天然纳米抗体噬菌体展示库技术筛选纳米抗体，从而获得与人CLL-1特异性结合的纳米抗体，将候选纳米抗体基因转入大肠杆菌中，建立能在大肠杆菌中高效表达纳米抗体的表达系统。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；9.疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
免疫偶联物
本发明还提供了一种免疫偶联物，所述的免疫偶联物含有：
(a)如本发明第一方面所述的抗CLL-1纳米抗体的VHH链、或如本发明第二方面所述的抗CLL-1纳米抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：放射性核素、酶抗体、细胞、或其组合。
本发明提供了一种靶向人CLL-1的纳米抗体与DM1的偶联物，其中，将抗CLL-1纳米抗体与微管抑制剂DM1偶联，获得基于抗人CLL-1纳米抗体的药物偶联物，以CCK-8检测此药物偶联物对CLL-1+细胞的细胞毒作用。
本发明提供的靶向人CLL-1的纳米抗体与DM1的偶联物对CLL-1+骨髓瘤细胞具有显著的体外杀伤作用。
本发明的免疫偶联物可以用于非侵入性地检测待测对象的CLL-1表达，具有小尺寸和高度特异性，适合同时靶向原发及转移肿瘤的全身检测，准确度高，辐射剂量小。
细胞毒剂
构成本发明抗体偶联物的偶联部分包括：毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体。细胞毒剂的例子包括但不限于：耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonariaofficinalis)抑制剂以及糖皮质激素和其它化学治疗剂，以及放射性同位素，如Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133 Yb-169、Yb-177和包括Lu177在内的Lu的放射性同位素。抗体也可与能够将前药转化成其活性形式的抗癌前药活化酶偶联。
优选的小分子药物为具有高细胞毒性的化合物，优选单甲基澳瑞他汀(monomethylauristatin)、加利车霉素、美登素类、或其组合；更佳地选自：单甲基澳瑞他汀-E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀-D(MMAD)、单甲基澳瑞他汀-F(MMAF)、或其组合。
CLL-1相关病症
本公开的抗体和/或融合蛋白可用于例如检测和/或治疗CLL-1相关病症，即与在标准对照(例如，正常、非疾病、非癌细胞)中的CLL-1表达相比CLL-1的细胞表面表达升高或降低相关的疾病。CLL-1表达通常限于髓系谱系细胞，例如外周血和脾中的树突细胞、粒细胞和单核细胞。在一些情况下，CLL-1水平升高与癌症相关，特别是在造血CSC(例如，LSC)中，和在骨髓增生性病症中，包括白血病如AML(急性骨髓性或骨髓增生性白血病)、MDS(骨髓增生异常综合征)、骨髓纤维化、CMML(慢性骨髓单核细胞白血病)、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和CML(慢性骨髓性或骨髓增生性白血病)。参见，例如Morsink等人，Blood Rev.pii:S0268-960X(18)30072-9.doi:10.1016/j.blre.2018.10.003.[Epub]；Bakker等人，CancerRes.64:8443-8450(2004)；Van Rhenen等人，Blood 110:2659-66(2007)；Zhao等人，Haematologica 95:71-78(2010)；Van Rhenen等人，Leukemia21:1700-7(2007)；和Herrmann等人，Haematologica 97:219-26(2012)。
通过检测细胞表面标志物表达，可对AML细胞进行表征并将其与其他细胞区分开来。除了CLL-1+之外，AML细胞可为CD33+(尽管一些是CD33-)、CD45+和CDw52+。AML胚细胞(包括LSC)通常是CD34+CD38-。HSC和LSC的特征可在于CD34的表达，但前者不表达CLL-1。MDS细胞的特征可在于CDS、CD7、CD13和CD34的表达。CML细胞的特征可在于CD33、CD34和CD38的表达。
骨髓增生异常综合征(MDS)包括一组密切相关的血液形成病症，其中骨髓显示出暗示白血病前期过程的定性和定量变化，但具有不一定终止为急性白血病的慢性病程。许多术语，包括白血病前期、难治性贫血、难治性骨髓细胞生成障碍性贫血(refractorydysmyelopoietic anemia)、郁积型(smoldering)或亚急性白血病、骨髓细胞生成障碍综合征(DMPS)和骨髓发育不良(myelodysplasia)，都用于描述MDS。这些病况的特征可在于成熟受损(骨髓细胞生成障碍)和血细胞数量减少的细胞骨髓。DMPS的特征可在于存在巨成红血细胞样细胞(megablastoid)、巨核细胞发育异常(megarkaryocytedysplasia)和异常胚细胞数量增加，反映了粒细胞成熟过程增强。DMPS患者通常显示与在急性髓系白血病中见到的那些相似的染色体异常，并且在某些部分的患病患者中发展为急性髓系白血病。
慢性骨髓增生性病症是一系列病况，其特征可在于成熟和未成熟的粒细胞、红细胞和血小板的数量增加。慢性骨髓增生性疾病可转变为此组中的其他形式，具有终止于急性髓系白血病的趋势。此组内的特定疾病包括真性红细胞增多症、慢性髓系白血病、原因不明的髓系白血病、原发性血小板增多症和慢性中性粒细胞性白血病。
骨髓纤维化的特征可在于骨髓的瘢痕形成，其可导致红细胞和白细胞以及血小板的数量减少。骨髓纤维化瘢痕形成可由白血病引起，但可具有其他原因，诸如血小板增多症或药物副作用。
在各种情况下，本文所述的抗体和/或融合蛋白治疗、减轻CLL-1相关病症的一种或多种症状或生物标志物，或降低其患病率，降低其频率，或降低其水平或量。具体的症状和症状的进展在受试者之间不同。因此，在一些实施方案中，将本文所述的抗体和/或融合蛋白施用到有需要的受试者，例如患有CLL-1相关病症的受试者。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合CLL-1蛋白分子，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的纳米抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10纳克/千克体重-约50毫克/千克体重，更佳地50纳克/千克体重-约1毫克/千克体重或10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。
此外，本发明的多肽或其偶联物还可与其他治疗剂(如抗肿瘤剂或免疫调节剂)一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10纳克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约50纳克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
标记的纳米抗体
在本发明的一个优选例中，所述纳米抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，抗CLL-1的纳米抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的纳米抗体。
本发明的抗CLL-1纳米抗体具有很好的特异性，很高的效价。
CAR-T细胞
如本文所用，术语“CAR-T细胞”、“CAR-T”、“本发明CAR-T细胞”均指本发明第十九方面所述的CAR-T细胞。
如本文所用，嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)包括细胞外结构域、任选的铰链区、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括任选的信号肽和靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激分子和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含本发明第一方面所述的VHH链、或本发明第二方面所述的纳米抗体。
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
CAR在T细胞中表达时，胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子如IL-2和IFN-γ等，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。
检测方法
本发明还涉及检测CLL-1蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中CLL-1蛋白的水平。
在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。
试剂盒
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明还提供了用于检测CLL-1水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别CLL-1蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
本发明还提供了一种含有本发明的免疫偶联物的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、同位素示踪剂以及选自下组的一种或多种试剂：造影剂、流式检测试剂、细胞免疫荧光检测试剂、纳米磁粒和显像剂。
优选的，本发明的试剂盒是体内诊断试剂盒，用于非侵入性地检测待测对象的CLL-1表达。
应用
如上所述，本发明的纳米抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与CLL-1相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对CLL-1的临床诊断和靶向治疗。
本发明还提供了所述的靶向人CLL-1的纳米抗体与DM1的偶联物在制备肿瘤药物中的应用。
本发明的主要优点包括
(1)本发明的抗人CLL-1的纳米抗体特异识别高表达CLL-1的细胞的CLL-1抗体，分子量小，易于改造、易予其他抗体联合构建双特异性抗体，易于构建CAR-T，易于制备为和其他药物的偶联物，对表达CLL-1细胞的补体依赖性毒性和抗体依赖性毒性都有效，为靶向CLL-1相关疾病提供了新的诊断策略和治疗策略。
(2)本发明的纳米抗体可采用原核表达系统表达从而降低生产成本，生产简便，从而扩展靶向人CLL-1治疗型抗体的应用范围。
(3)本发明的抗CLL-1纳米抗体药物偶联物相比常规全尺寸抗体偶联药物具有更小的分子量，理论上将具有更好的肿瘤组织穿透性，因而在实体瘤的治疗方面可能有独特的优势。纳米抗体在生产、运输和给药方式上具有明显的优势。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：CLL-1抗原和羊驼抗CLL-1血清制备
1.CLL-1抗原的制备
我们依据NCBI网站上CLL-1蛋白序列和基因序列信息，合成表达CLL-1抗原表达载体，293T细胞进行转染，表达可有效诱导羊驼产生针对CLL-1胞外段的特异性抗原，在C端连接His-tag(hCLL-1-his)或用于后续纯化及检测。
1.1细胞转染
(1)转染前一天，计数正常培养的293F细胞，吸取适量细胞悬液离心(1000rpm,5min)，弃上清后以新鲜Expi293TM Expression Medium(含6mML-glutamine)重悬至1×106cells/mL(总体积180mL)，继续37℃，5％CO2，125rpm过夜培养；
(2)次日准备转染复合物：
1.2纯化蛋白
采用重组蛋白的镍柱亲和层析法进行纯化，并采取SDS-PAGE胶进行纯化验证
Ni NTA纯化，依次用PBS清洗，5mM咪唑，pH 7.4；用PBS清洗，40mM咪唑，pH 7.4；用PBS洗脱，250mM咪唑，pH 7.4；用PBS洗脱，500mM咪唑，pH 7.4；
2.羊驼免疫与抗血清的获得
2.1免疫方案
(1)免疫剂量：Human CLL1蛋白首次免疫注射1mg，后续免疫每次各注射0.5mg。
(2)首次免疫：用弗氏完全佐剂与样品按照体积比1:1比例混合乳化后皮下多点注射免疫。
(3)第二、第三、四、五次免疫：用弗氏不完全佐剂与样品按照体积比1：1比例混合乳化后皮下注射免疫。在第14天、28天、42天、56天用Human CLL-1蛋白与弗氏不完全佐剂按照体积比1:1加强免疫4次。第四次和第五次免疫后，采血检测抗血清滴度，第5次免疫1周后，采血100ml用于噬菌体抗体库的构建。
2.2ELISA法检测血清效价
(1)96孔板准备工作
①第一天，用抗原稀释缓冲液将检测原稀释至1.0μg/mL，然后每孔加100μL抗原。封口后4℃孵育过夜；
②第二天，弃上清。每孔加200μL封闭缓冲液37℃孵育30min，备用。使用前，弃上清；
(2)ELISA滴定
①按照10倍梯度稀释法将血清和阴性对照样品稀释106倍，准备102至106共5个稀释度的样品备用。将100μL样品和阴性对照分别加到适当的孔中，封口后37℃孵育1h；
②弃上清并用洗涤缓冲液洗涤3次；
③每孔加入100μL HRP标记的山羊抗羊驼IgG H&L(SPAB02)(1：15000dilution)，37℃下孵育40min；
④弃上清并用洗涤缓冲液洗涤5次；
⑤每孔加入100μL TMB(A液和B液混匀)一步法底物试剂，在室温孵育15min，并轻轻摇动。
⑥每孔加入50μL终止液，并迅速在450nm波长下读数。
⑦血清阳性滴度计算原则：在相同的稀释倍数下，样品OD450值≥2.1倍阴性对照判为阳性，若阴性对照吸光度值<0.05，则按0.05计算。结果如图1所示，4免以及5免的抗血清效价均大于105。由此可见，该抗原可诱导羊驼产生特异性针对hCLL-1蛋白的高滴度抗血清。
实施例2：羊驼噬菌体文库和淘选
1.羊驼外周血PBMC分离
取免疫后的羊驼外周血100ml,利用淋巴细胞分离液分离羊驼外周血。获取羊驼PBMC。
2.RNA提取
参照QIAGEN公司的Plus MiniRNA提取试剂盒说明书。
(1)取上述步骤中获得的淋巴细胞，每支加入700μL RLT Plus试剂(使用前每mL加入10μLβ-巯基乙醇)，震荡混匀细胞，使细胞充分裂解；
(2)取gDNA吸附柱置于2mL收集管中，将细胞裂解液加gDNA吸附柱中，12000g室温离心30s，弃去gDNA吸附柱，向流出液中加入等体积70％乙醇，吹打混匀；
(3)将RNeasy吸附柱置于新的2mL收集管中，取700μL样品加RNeasy吸附柱，12000g室温离心15s，弃滤液，将剩余的样品再次加入RNeasy吸附柱，重复上述操作；
(4)向RNeasy吸附柱中加入700μL RW1试剂，12000g室温离心15s，弃滤出液；
(5)向RNeasy吸附柱中加入500μL RPE试剂，12000g室温离心15s，弃滤出液；
(6)向RNeasy吸附柱中加入500μL RPE试剂，12000g室温离心2min，弃滤出液；
(7)将RNeasy吸附柱置于新的2mL收集管中，14000g室温离心1min；
(8)将RNeasy吸附柱置于新的无RNA酶1.5mL离心管中，直接向吸附柱膜加入30μL无RNA酶超纯水，12000g室温离心1min，重复上述操作步骤，两次洗脱RNA；
(9)将洗脱的RNA合并，测定浓度，直接用于反转录实验，或-80℃保存。
3.cDNA反转录
参照Invitrogen公司的SuperIII First-Strand Synthesis System提取试剂盒说明书。
4μg RNA+oligo(dt)1μL+1μL dNTP(共10μL)；→65℃，5min；冰浴1min；→10μLcDNA Synthesis Mix；→50℃，50min；→85℃，5min；→1μL RNase；→37℃，20min；→取出-80-20℃/℃保存；
cDNA Synthesis Mix：
2μL 10*RT Buffer
4μL 25mM MgCl2
2μL 0.1M DTT
1μL RNaseOUT
1μL Super ScriptⅢRT
4.CLL-1纳米抗体扩增
4.1第一轮PCR
将3中反转cDNA文库进行基因模板扩增，扩增体系如下表所示：
第一轮扩增条件：PCR mix system：50μL reaction volume
PCR reaction system：28cycles
4.2第二轮PCR
将第一轮PCR产物作为模板进行二次扩增，扩增体系如下表所示：
第二轮扩增条件：PCR mix system：50μL reaction volume
| DNA | 10ng |
| VHH-FOR | 10pmol |
| VHH-REV | 10pmol |
| HiFi酶 | 0.25μL |
| BufferⅡ | 5μL |
| 2.5mM dNTPs | 4μL |
| ddH2O | 补足至50μL |
PCR reaction system：20cycles
5.CLL-1纳米抗体展示载体的构建
(1)将PCR产物通过Pst-I-HF酶与Not-I-HF酶双酶切后，克隆入pMECS噬菌体展示载体中，用PCR产物回收试剂盒按照说明书操作步骤回收酶切产物，测定胶回收产物浓度，用于后续实验；
(2)酶切体系如下表所示：
PCR mix system：50μL reaction volume
(3)先将20μg PCR产物用Pst-I-HF和Not-I-HF双酶切，37℃，16h，使用QIA quickPCR纯化试剂盒，根据制造商的说明对双酶切产物进行回收；将回收产物再用Pst-I-HF和Not-I-HF双酶切，37℃，16h，使用QIA quick PCR纯化试剂盒，根据制造商的说明对双酶切产物进行回收；
(4)将60μg pMECS载体用Pst-I-HF和Not-I-HF双酶切，37℃，16h，使用QIA quickPCR纯化试剂盒，根据制造商的说明对双酶切产物进行回收；将回收产物再用Pst-I-HF和Not-I-HF双酶切，37℃，16h，使用QIAquickPCR纯化试剂盒，根据制造商的说明对双酶切产物进行回收；将第二次回收产物用Pst-I-HF和Not-I-HF进行第三次双酶切，37℃，16h，使用QIAquickPCR纯化试剂盒，根据制造商的说明对双酶切产物进行回收。
(5)用T4 DNA连接酶连接VHH片段与噬菌体展示载体，16℃孵育18h，用PCR产物回收试剂盒按照说明书操作步骤纯化连接产物，用无菌超纯水洗脱连接产物，测定浓度，用于后续实验；
PCR mix system：20μL reaction volume
| pMECS | 50ng |
| PCR酶切回收产物 | 37.5ng |
| T4 DNA连接酶 | 1μL |
| 10×Buffer | 2μL |
| 水 | To 20μL |
| 时间 | 18h |
| 酶切温度 | 16℃ |
6.连接产物转化TG1感受态细胞及噬菌体抗体文库的收获
(1)电转化制备感受态细胞；
(2)取1.2mL TG1电转化感受态细胞，加入50μL(5μg)连接产物，轻轻混匀(冰上操作)，加入提前在冰上预冷的电击杯中，每支电击杯200μL，共4支；(3)用Eppendorf电穿孔仪，设置参数为2.5kV、5ms，电转化感受态细胞。电击后马上取出电击杯，加入4mL 37℃预热的SOC培养基，重悬细胞并移至无菌50mL离心管中，重复上述操作，完成剩余电击转化；
(4)将转化产物置于摇床，37℃120r/min，震荡培养40min。留取100μL培养物用于文库鉴定，将剩余所有培养物均匀涂布于LB/AMPGLU平板(245×245mm方形大平皿)，每块平板1.5mL，37℃培养6h；
(5)向每平皿中加入2mL LB/AMP-GLU培养基，用细胞刮刀收集菌苔，加入1/3体积的50％甘油，混匀分装，-80℃保存；
7.VHH噬菌体抗体文库救援
(1)取100μL噬菌体展示载体文库，接种于100mL 2×YT/AMPGLU培养基中，37℃、200r/min，培养至对数期(OD600值为0.6～0.8)；
(2)加入90μL M13KO7辅助噬菌体(1.7×1013PFU/mL)，大约相当于20个MOI，轻轻混匀，37℃静置30min；
(3)2800g室温离心10min，弃上清，菌体用200mL 2×YT/AMP-KAN培养基重悬，37℃200r/min培养12h；
(4)将培养液分装于50mL离心管中，3800g、4℃离心30min，用吸管小心收集上清(避免吸入沉淀)，加入1/5体积预冷的PEG/NaCl溶液，上下颠倒混匀，冰上静置2h；3800g、4℃离心30min，弃上清，每管加入0.5mL PBS，重悬噬菌体沉淀；
(5)12000g、4℃离心15min，收集上清，加入1/5体积预冷的PEG/NaCl溶液，上下颠倒混匀，冰上静置2h；
(6)10000g、4℃离心10min，弃上清，用1mL PBS重悬噬菌体沉淀，4℃摇床孵育过夜，使噬菌体颗粒充分溶解。
8.重组噬菌体滴度测定
(1)取10μL上述7中的噬菌体溶液，用2×YT培养基10倍梯度稀释取稀释度为10-8、10-9、10-10的样品，分别取100μL加入100μL对数生长期的TG1细胞，混匀，37℃静置感染15min；
(2)将感染不同稀释度噬菌体的TG1细胞分别均匀涂布于LB/AMP-GLU平板，37℃培养8h；
(3)计数平板上的菌落，计算重组噬菌体滴度。
9.重组噬菌体的淘选
(1)抗原包被：将目的蛋白用PBS缓冲液稀释至4μg/ml，取96孔酶标板，选择3复孔，每孔加入100μl(400ng/孔)，4℃包被过夜，PBS作为阴性对照；
(2)封闭：弃去包被液，每孔加入150μl 2％浓度脱脂内粉，室温封闭1h；
(3)孵育噬菌体：用PBST洗涤4次，取2.5.8.制备的噬菌体溶液，用2％脂奶粉，稀释至5×1011pfu/ml，加入酶标板，100μl/孔，室温孵育2h；
(4)洗脱：弃去噬菌体样品，用PBST洗涤10次，再用PBS洗涤5次，每孔加入100μl新鲜配制的0.1M三乙胺，室温静置10min，吸出洗脱液迅速用等体积1M Tris-HCl(pH7.4)中和；
(5)洗脱液噬菌体滴度测定；我们通过检测每轮洗脱液中重组噬菌体的滴度来评估特异性VHH重组噬菌体的富集效果。通过富集克隆计数评估富集效果(表2)。
(6)侵染：取400μl洗脱液，感染4ml对数期TG1细胞，摇匀后37℃静置30min，加入16ml 2×YT/AMP-GLU培养，37℃、200r/min培养至OD600达到0.6～0.8；
(7)救援：向培养液中加入20μl M13KO7辅助噬菌体，摇匀后室温静置1h，2800g室温离心10min，弃上清，菌体用100ml 2×YT/AMP-KAN培养基重悬，37℃、225r/min培养14h；
(8)噬菌体粒子的浓缩纯化，浓缩纯化噬菌体粒子，用于下一轮筛选；
(9)重复步骤1)～8)两次，完成第二轮和第三轮淘选。为了进一步验证富集后的文库中结合hCLL-1-VHH蛋白的阳性噬菌体率，从第3轮富集后的文库里分别挑选96个克隆进行单个噬菌体ELISA检测。结果显示，第3轮文库里89.50％的噬菌体克隆克隆为阳性，而且结合的平均读值在3.0左右(表3)，通过hCLL-1蛋白淘选成功地富集了高结合力的sCLL-1-VHH噬菌体文库。
10.VHH抗体的原核表达
(1)向96孔细胞培养板中每孔加入100μL LB/AMP-GLU培养基，同时从第三轮滴度测定的平板上随机挑取96个单菌落于培养基中，37℃、200r培养6h；
(2)取4个24孔细胞培养板每孔加入1mL TB培养基，按1:100的比例将单克隆菌液转接到培养板中，37℃、200r培养至对数生长期；
(3)每孔加入终浓度为1mM的IPTG，37℃、200r过夜诱导；
(4)将细胞板置于离心机中，4℃、12000r离心2min，弃掉上清，将菌体置于-80℃中冷冻30min后取出；
(5)待菌体恢复至室温，每孔加入500μL PBS重悬菌体；
(6)4℃、12000r离心2min，收集上清；上清即为粗提VHH抗体。
11.VHH抗体的序列测定
11.1上述10中所述单克隆菌株，各取部分菌液进行测序，使用引物MP57序列为：TTATGCTTCCGGCTCGTATG
11.2挑选42个克隆进行测序，测序结果显示，所测多样性为30.9％，比对结果显示，差异序列大多在CDR结合区。经检验，构建了一个hCLL-1-VHH噬菌体抗体文库的库容为2.25×108个/mL，阳性率为90.4％，序列多样性为30.9％，有效插入率为100％。
表2.VHH抗体文库筛选结果
表3.ELISA检测噬菌体文库富集效果
实施例3：纳米抗体真核表达文库的构建及纳米抗体表达
1构建重组表达质粒
将实施2中测定的纳米抗体序列与真核表达质粒pKMD-KSS-hFc重组为蛋白表达质粒,随后进行293F细胞转染。
2细胞转染
(1)转染前一天，计数正常培养的293F细胞，吸取适量细胞悬液离心(1000rpm,5min)，弃上清后以新鲜Expi293TM Expression Medium(含6mM L-glutamine)重悬至1×106cells/mL(总体积50mL)，继续37℃，5％CO2，125rpm过夜培养；
(2)次日准备转染复合物：
3.重组蛋白的镍柱亲和层析-Supernatant
使用镍柱亲和层析进行纯化，用PBS清洗，5mM咪唑，pH 7.4；用PBS清洗，15mM咪唑，pH 7.4；用PBS清洗，25mM咪唑，pH 7.4；用PBS洗脱，250mM咪唑，pH 7.4；用PBS洗脱，500mM咪唑，pH 7.4。BCA检测浓度为1.3mg/ml，SDS-PAGE胶显示CLL-1纳米抗体成功纯化(图3)。
实施例4：EC50检测VHH-His(CLL-1Nb)真核表达抗体与hCLL-1蛋白亲和力1.96孔板准备工作
(1)第一天，用抗原稀释缓冲液将检测原稀释至2ug/ml，然后每孔加100ul抗原。封口后4℃孵育过夜。
(2)第二天，弃上清。每孔加200ul封闭缓冲液37℃孵育1h，备用。使用前，弃上清。
2.ELISA滴定
(1)将抗体以200ng/ml起始3倍梯度稀释，将抗体蛋白稀释16个梯度。将100ul样品加到适当的孔中，封口后37℃孵育1h。
(2)弃上清并用洗涤缓冲液洗涤5次。
(3)每孔加入100ul HRP标记的山羊抗小鼠(1:3000dilution)，37℃下孵育1h。
(4)弃上清并用洗涤缓冲液洗涤5次。
(5)每孔加入100ul TMB(A液和B液混匀)一步法底物试剂，在暗室中室温孵育15min，并轻轻摇动。
(6)每孔加入50ul终止液，并迅速在450nm波长下读数。
(7)计算：EC50(nM)＝抗体浓度(g/L)/稀释倍数/抗体分子质量*109(图4)
实施例5：VHH抗体与肿瘤细胞的特异性结合检测
1.用EZLabel Protein FITC Labeling Kit试剂盒标记CLL-1纳米抗体
1.1将100ul纳米抗体与10ul重组EZLabel FITC溶液进行孵育，室温1小时。
1.2加入20ul淬灭缓冲剂,室温，30分钟。
1.3将以上标记混合物，逐滴加载到旋转柱中，1500g，离心2分钟，收集标记的纳米抗体
2.流式检测CLL-1纳米抗体与肿瘤细胞结合
2.1将上述CLL-1纳米抗体与CLL-1阳性细胞THP-1细胞混合孵育，100ul/样品，4℃,30min；PBS洗涤两遍后，上机检测。流式结果显示，CLL-1纳米抗体有效与该阳性细胞结合(图5)。
2.3将CLL-1纳米抗体与CLL-1阴性细胞K562细胞混合孵育，100ul/样品，4℃,30min；PBS洗涤两遍后，上机检测。流式结果显示，CLL-1纳米抗体不能与阴性细胞K562有效结合(图5)。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质。
Claims (10)
1.一种抗CLL-1纳米抗体，其可变结构域基本上由4个框架区FR1～4和3个互补决定区CDR1～3组成，其特征在于：
(i)CDR1的氨基酸序列为如下：
(a)SEQ ID NO：1、10、18、27、35中之一；或
(b)与SEQ ID NO：：1、10、18、27、35的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列中之一；
和/或
(ii)CDR2的氨基酸序列为如下：
(c)SEQ ID NO：：2、11、19、28、36中之一；或
(d)与SEQ ID NO：2、11、19、28、36的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列中之一；
和/或
(iii)CDR3的氨基酸序列为如下：
(e)SEQ ID NO：3、12、20、29、37中之一；或
(f)与SEQ ID NO：3、12、20、29、37的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列中之一。
2.如权利要求1所述的抗CLL-1纳米抗体，其特征在于所述3个互补决定区：
(i)CDR1的氨基酸序列为：SEQ ID NO：1；或与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(ii)CDR2的氨基酸序列为：SEQ ID NO：2；或与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(iii)CDR3的氨基酸序列为：SEQ ID NO：3；或与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的抗CLL-1纳米抗体，其特征在于所述3个互补决定区：
(i)CDR1的氨基酸序列为：SEQ ID NO：10；或与SEQ ID NO：10的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(ii)CDR2的氨基酸序列为：SEQ ID NO：11；或与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(iii)CDR3的氨基酸序列为：SEQ ID NO：12；或与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的抗CLL-1纳米抗体，其特征在于所述3个互补决定区：
(i)CDR1的氨基酸序列为：SEQ ID NO：18；或与SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(ii)CDR2的氨基酸序列为：SEQ ID NO：19；或与SEQ ID NO：19的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(iii)CDR3的氨基酸序列为：SEQ ID NO：20；或与SEQ ID NO：20的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的抗CLL-1纳米抗体，其特征在于所述3个互补决定区：
(i)CDR1的氨基酸序列为：SEQ ID NO：27；或与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(ii)CDR2的氨基酸序列为：SEQ ID NO：28；或与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(iii)CDR3的氨基酸序列为：SEQ ID NO：29；或与SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的抗CLL-1纳米抗体，其特征在于所述3个互补决定区：
(i)CDR1的氨基酸序列为：SEQ ID NO：35；或与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(ii)CDR2的氨基酸序列为：SEQ ID NO：36；或与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(iii)CDR3的氨基酸序列为：SEQ ID NO：37；或与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
7.如权利要求1所述的抗CLL-1纳米抗体，其特征在于所述抗CLL-1纳米抗体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：8、16、25、33、41中之一。
8.一种抗CLL-1抗体，所述抗体包括一条或多个如权利要求1-7中所述的抗CLL-1纳米抗体。
9.一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：
(a)如权利要求1-7中所述的抗CLL-1纳米抗体，或如权利要求8所述的抗CLL-1抗体；和可操作性连接的
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白、或其组合。
10.一种CAR-T细胞，所述CAR-T细胞表达嵌合抗原受体CAR，所述CAR的抗原结合结构域具有如权利要求1-7所述的抗CLL-1纳米抗体。
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