CN117497065B - 筛选促进多年生牧草再生的微生物种类的方法及其所用装置与计算机可读存储介质 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了筛选促进多年生牧草再生的微生物种类的方法及其所用装置与计算机可读存储介质，涉及生物信息学技术领域。本发明要解决的技术问题是如何获得促进多年生牧草再生的微生物种类。本发明提供了筛选促进多年生牧草再生的微生物种类的方法，包括获得不同再生天数的多年生牧草根际土壤微生物的物种信息和物种的丰度分布并进行多样性分析，根据不同再生天数下多年生牧草根际土壤微生物的物种信息、物种的丰度分布以及多样性分析的结果获得促进多年生牧草再生的微生物种类。本发明可用于筛选或辅助筛选促进多年生牧草再生的微生物种类，为利用微生物促进牧草再生、提高牧草产量、改善牧草品质提供数据和技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及生物信息学技术领域中的筛选促进多年生牧草再生的微生物种类的方法及其所用装置与计算机可读存储介质。
背景技术
人工种植优质牧草是草地畜牧业稳产提质增效的重要途径之一。多年生牧草因其持久性强、生产力高、可利用时间长等优点成为建设优质高产稳产牧草生产基地的首选。开发种植以利用营养体为主（如放牧、刈割等）的优质牧草，可在一定程度上解决我国饲草料不足的问题，也将有效缓解天然草原的放牧压力，进而推进现代草地畜牧业进程，促进农业可持续生态系统的发展。
牧草被利用后生物量和品质的形成取决于再生。刈割或放牧后，多年生牧草的再生是草地生产力形成的关键，增强多年生牧草的再生能力是提高人工或半人工草地牧草产量的有效途径之一。根际（Rhizosphere）作为植物根系与土壤间物质交换和能量流动的直接界面，其中包含了大量微生物，如细菌、丛枝菌根真菌、其他真菌以及放线菌，范围为距根系约0.5~4 mm宽的区域。近年来，根际微生物的巨大应用潜力在大量相关研究中被证实。植物根际土壤微生物受到土壤理化性质、土壤环境中的原生动物及植物本身特性的影响。根际微生物群落多样性及其组成直接影响植物的营养吸收、促进植物生长、提高植物抵抗生物和非生物胁迫的能力等。因此，对不同多年生牧草的根际土壤中微生物的组成进行全面、系统地研究是十分必要的。目前国内外对于根际微生物的研究主要集中在一年生作物上，对于多年生牧草的根际微生物组成及其功能还知之甚少，因此亟需对多年生牧草根际土壤微生物进行全面、深入的分析与研究，为开发利用根际微生物以提高牧草产量、改善牧草品质以及加强牧草抗病虫害能力提供科学的理论依据。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何获得促进多年生牧草再生的根际微生物种类。
为解决该技术问题，第一个方面，本发明提供筛选或辅助筛选促进多年生牧草再生的微生物种类的方法，所述方法包括获得不同再生天数的多年生牧草根际土壤微生物的物种信息和基于物种的丰度分布并进行多样性分析，根据不同再生天数下多年生牧草根际土壤微生物的物种信息、物种的丰度分布以及多样性分析的结果获得促进多年生牧草再生的微生物种类。
本发明中，所述多样性分析包括α-多样性分析和β-多样性分析。
进一步地，所述的方法中，获得所述促进多年生牧草再生的微生物种类的步骤具体包括：述将多年生牧草根际土壤微生物的物种信息、物种的丰度分布以及多样性分析获得的结果进行综合比较、分析获得促进多年生牧草再生的微生物种类。
进一步地，所述的方法中，所述物种信息和基于物种的丰度分布通过如下步骤获得：
S1、收集待检测多年生牧草刈割后不同再生天数的根际土壤，得到样本，所述再生天数为大于等于0的自然数；
S2、提取所述根际土壤中的DNA，使用16S rRNA基因特异性引物515F和806R进行PCR扩增16S rRNA基因的V4区域，获得16S rRNA基因V4区域文库；
所述引物515F的核苷酸序列是SEQ ID No.1：5‘-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’，
所述引物806R的核苷酸序列是SEQ ID No.2：5‘-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’；
S3、对所述16S rRNA基因V4区域文库用Illumina Miseq平台进行测序得到原始数据，并对原始数据进行质量控制，得到有效数据；
S4、将所述有效数据与Greengenes 2数据库比对做物种注释，得到每个样本的根际土壤微生物的物种信息和基于物种的丰度分布。
进一步地，所述的方法中，所述再生天数可选自0、1、2、7、14、21、28。
本发明中，所述再生天数可为多年生牧草刈割后的天数，单位为天。
具体地，刈割当天（刈割后第0天）多年生牧草的再生天数为0天。刈割后第1天多年生牧草的再生天数为1天。刈割后第2天多年生牧草的再生天数为2天。依此类推。刈割后第7天多年生牧草的再生天数为7天。刈割后第14天多年生牧草的再生天数为14天。刈割后第21天多年生牧草的再生天数为21天。刈割后第28天多年生牧草的再生天数为28天。
进一步地，所述的方法中，S3中所述的对原始数据进行质量控制可包括如下步骤：
（S301）、数据拼接：根据barcode进行拆分并去除测序获得的reads中的接头序列和barcode序列；通过FLASH软件（Fast Length Adjustment of Short Reads）对R1和R2序列数据进行拼接，获得拼接的Raw Tags；
（S302）、质控步骤1：对Raw Tags，使用fastp软件进行过滤低质量和短长度的序列，得到高质量的Tags数据；
（S303）、质控步骤2：对质控步骤1得到的Clean Tags继续去除嵌合体，得到有效Tags，且每个样品产出至少5万条有效Tags；
（S304）、质控步骤3：用于对质控步骤2得到的有效Tags通过DADA2进行降噪，并过滤掉丰度小于5的序列，获得最终的扩增子序列变异ASVs（有效数据），并生成待测样本的特征表和代表序列。
进一步地，所述的方法中，S4中所述物种注释可采用QIIME 2的q2-greengenes2插件和greengenes2 taxonomy命令对所述有效数据中的每个16S rRNA 的V4区域进行物种注释。
在本发明的实施例中，上述物种注释的具体步骤如下：于QIIME 2官网下载最新的Greengenes 2特异的V4区域分类器。在Ubuntu 20.04.6 LTS终端基于qiime feature-classifier classify-sklearn命令输入下载好的分类器以及ASVs序列，输出物种注释结果，输出文件命名为taxonomy.qza。将输出的taxonomy.qza文件可视化后，上传至QIIME 2view官网查看注释的结果。
利用QIIME 2中qiime taxa barplot命令，将不同分类水平上的物种相对丰度及比例用堆叠柱状图的形式可视化，输入特征表，注释结果和分组信息，输出可视化的堆叠柱状图。
将上述输出的堆叠柱状图文件上传至QIIME 2 view官网，查看在不同分类水平上（界、门、纲、目、科、属、种）各物种的相对丰度及比例。
本发明中展示了刈割后不同再生天数的样本在门水平上排名前10的根际土壤微生物的物种的相对丰度及比例，以及在属水平上的不同再生天数下每个样本中排名前10的根际土壤微生物的物种信息和基于物种的丰度分布。
进一步地，所述的方法中，所述多年生牧草可选自豆科牧草、禾本科牧草和/或车前科牧草。
进一步地，所述的方法中，所述多年生牧草可选自A1）、A2）和/或A3），
A1）紫花苜蓿（Medicago sativa, L.）；
A2）鸭茅（Dactylis glomerataL.）；
A3）车前（Plantago asiaticaL.）。
进一步地，所述的方法中，S3中所述的Illumina Miseq平台可为Illumina公司的Miseq PE 300平台。
本发明中，所述多样性分析具体可为：使用QIIME2对ASVs进行多序列比对并构建系统发育树，并基于各多年生牧草的所有待测样本中最大和最小序列数进行多样性分析，包括α-多样性分析和β-多样性分析。
第二个方面，本发明提供筛选或辅助筛选促进多年生牧草再生的微生物种类的装置，所述装置可包括如下模块：
（1）数据接收模块：用于接收待测样本的微生物16S rRNA扩增子的原始数据，所述16S rRNA扩增子为16S rRNA基因的V4区域的扩增产物；所述待测样本为待检测多年生牧草刈割后不同再生天数的根际土壤，所述再生天数为大于等于0的自然数；
（2）数据质控分析模块：用于将所述原始数据进行质量控制得到有效数据；
（3）物种注释模块：用于将所述有效数据与Greengenes 2数据库特异的V4区域分类器比对做物种注释，得到每个样本的根际土壤微生物的物种信息和基于物种的丰度分布；
（4）多样性分析模块：用于根据所述物种信息和所述丰度分布进行多样性分析；
（5）结论获取模块：用于根据不同再生天数下多年生牧草根际土壤微生物的物种信息、物种的丰度分布以及多样性分析的结果获得促进多年生牧草再生的微生物种类。
进一步地，所述的装置中，（2）中所述的数据质控分析模块可包括如下子模块：
①、数据拼接模块：用于根据barcode进行拆分并去除测序获得的reads中的接头序列和barcode序列；通过FLASH软件（Fast Length Adjustment of Short Reads）对R1和R2序列数据进行拼接，获得拼接的Raw Tags；
②、质控模块1：用于对数据拼接模块获得的Raw Tags，使用fastp软件进行过滤低质量和短长度的序列，得到高质量的Tags数据；
③、质控模块2：用于对质控模块1得到的Clean Tags继续去除嵌合体，得到有效Tags，且每个样品产出至少5万条有效Tags；
④、质控模块3：用于对质控模块2得到的Effective Tags通过DADA2进行降噪，并过滤掉丰度小于5的序列，获得最终的有效数据（扩增子序列变异ASVs），并生成待测样本的特征表和代表序列。
进一步地，所述的装置中，所述物种注释模块（3）中的物种注释可采用QIIME 2的q2-greengenes2插件和greengenes2 taxonomy命令对所述有效数据中的每个16S rRNA 的V4区域进行物种注释。
进一步地，所述的装置中，（4）中所述多样性分析模块可包括α-多样性分析模块和β-多样性分析模块，
所述α-多样性分析模块包括α-多样性指数统计模块和物种多样性曲线绘制模块。
所述α-多样性指数统计模块为用于基于ASVs，使用QIIME2对ASVs进行多序列比对并构建有根系统发育树，依据每个植物物种的特征表中的最小序列数进行抽平，通过QIIME2中qiime diversity diversity core-metrics-phylogenetic命令，输入质控步骤3中生成的特征表和有根系统发育树rooted-tree..qza文件，计算核心多样性；之后通过QIIME 2中qiime diversity alpha-group-significance命令进行α-多样性组间差异显著性分析和可视化的模块；
物种多样性曲线绘制模块为用于基于ASVs，使用QIIME2对ASVs进行多序列比对并构建系统发育树，依据每个植物物种的特征表中的最大序列数，通过QIIME 2中qiimediversity alpha-rarefaction命令，输入质控模块3中生成的特征表和有根系统发育树.qza文件，绘制α-多样性稀释曲线并可视化的模块；
β-多样性分析模块为基于ASVs，使用QIIME2对ASVs进行多序列比对并构建有根系统发育树，依据每个植物物种的特征表中的最小序列数进行抽平，通过QIIME 2中qiimediversity diversity core-metrics-phylogenetic命令，输入质控模块3中生成的特征表和有根系统发育树rooted-tree.qza文件，计算核心多样性；之后通过QIIME 2中qiimediversity beta-group-significance命令进行β-多样性组间差异显著性分析和可视化的模块。
进一步地，所述的装置中，（1）中所述再生天数可选自0、1、2、7、14、21、28。
进一步地，所述的装置中，所述多年生牧草可选自豆科牧草、禾本科牧草和/或车前科牧草。
进一步地，所述的装置中，所述多年生牧草可选自A1）、A2）和/或A3），
A1）紫花苜蓿（Medicago sativa, L.）；
A2）鸭茅（Dactylis glomerataL.）；
A3）车前（Plantago asiaticaL.）。
本发明中，所述多年生牧草的来源地包括但不限于温室种植或田间栽培的各牧草品种。
本发明中，所述多年生牧草的采集时期均为生殖生长初期。
本发明中，根际土壤的定义为：将牧草连根从土中取出，用抖土法抖落附着在根系表面的多余土壤后紧密附着于根系的土壤即为根际土壤。用软毛刷仔细刷下紧密附着于根系的根际土壤，混合均匀并去除根毛。
所述待测样本为多年生牧草刈割当天起连续性取样获得的待测样本。
所述连续性取样按照下列步骤进行：选择刈割当天、刈割后1天、2天、7天、14天、21天和28天的多年生牧草，将牧草连根从土中取出，用抖土法抖落附着在根系表面的多余土壤，再用软毛刷仔细刷下紧密附着于根系的根际土壤，混合均匀并去除根毛，并于零下80℃保存。
进一步地，上述的方法或者装置中，所述促进多年生牧草再生的微生物种类包括但不限于下述微生物中的一种或多种：放线菌门、变形菌门、泉古菌门、酸杆菌门、厚壁菌门、绿湾菌门、芽单胞菌门、浮霉菌门、硝化螺旋菌门和/或疣微菌门。
进一步地，上述的方法或者装置中，所述促进多年生牧草再生的微生物种类包括但不限于下述微生物中的一种或多种：亚硝化球菌属、芽孢杆菌属、红色杆菌属、互营杆菌属、红游动菌属、土壤红杆菌属、红螺菌属、生丝微菌属、类固醇杆菌属、假单胞杆菌属、芽生杆菌属和/或降解菌属。
进一步地，上述的方法或者装置中，所述微生物的配比可根据其在根际土壤中的丰度分布换算获得。
在本发明的一个实施例中，通过所述的方法（或装置）获得了可能促进或辅助促进不同多年生牧草再生的微生物的微生物种类：对于紫花苜蓿和鸭茅，促进其再生的根际微生物在门水平上按顺序主要分布于放线菌门、变形菌门、泉古菌门、酸杆菌门、厚壁菌门、绿湾菌门、芽单胞菌门、浮霉菌门、硝化螺旋菌门和疣微菌门。对于车前，促进其再生的根际微生物在门水平上按顺序主要分布于放线菌门、变形菌门、泉古菌门、酸杆菌门、厚壁菌门、绿湾菌门、浮霉菌门、芽单胞菌门、疣微菌门和硝化螺旋菌门。在属水平上，对于紫花苜蓿，促进其再生的根际微生物按顺序主要分布于亚硝化球菌属、芽孢杆菌属、红色杆菌属、互营杆菌属、红游动菌属、土壤红杆菌属、红螺菌属、生丝微菌属和类固醇杆菌属。对于鸭茅，促进其再生的根际微生物按顺序主要分布于硝化球菌属、假单胞杆菌属、红色杆菌属、芽孢杆菌属、互营杆菌属、红游动菌属、生丝微菌属、土壤红杆菌属和芽生杆菌属。对于车前，促进其再生的根际微生物按顺序主要分布于亚硝化球菌属、芽孢杆菌属、红色杆菌属、互营杆菌属、红游动菌属、生丝微菌属、红螺菌属、土壤红杆菌属和降解菌属。所述微生物的配比可根据其丰度换算获得。
第三个方面，本发明提供存储有计算机程序的计算机可读存储介质，所述计算机程序使计算机建立如上述任一项所述装置的模块。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）本发明提供的方法及其作用装置可用于筛选或辅助筛选促进多年生牧草再生的根际微生物，为利用微生物促进牧草再生性能、提高牧草产量、改善牧草品质以及加强牧草抗病虫害能力提供数据和技术支持，也可为农业及草牧业发展和环境保护提供一定指导意义和借鉴作用。
（2）本发明中再生的天数的选择首先密集分布于刈割后第0天、1天、2天、7天，随后分布于14天、21天和28天，涵盖了牧草的完整再生过程，揭示了多年生牧草再生过程中特异根际微生物动态招募过程。
附图说明
图1为本发明筛选促进多年生牧草再生的微生物种类的方法的流程图。
图2为紫花苜蓿（MS）在不同再生天数下根际土壤微生物丰富度的差异（n = 5）。其中，小写字母表示不同再生天数下的显著性差异，p<0.05。
图3为鸭茅（DG）在不同再生天数下根际土壤微生物丰富度的差异（n = 5）。
图4为车前（PA）在不同再生天数下根际土壤微生物丰富度的差异（n = 5）。
图5为紫花苜蓿刈割后不同再生天数与第0天根际土壤微生物基于weightedunifrac算法的距离差异。
图6为紫花苜蓿刈割后不同再生天数与第1天根际土壤微生物基于weightedunifrac算法的距离差异。
图7为紫花苜蓿刈割后不同再生天数与第2天根际土壤微生物基于weightedunifrac算法的距离差异。
图8为紫花苜蓿刈割后不同再生天数与第7天根际土壤微生物基于weightedunifrac算法的距离差异。
图9为紫花苜蓿刈割后不同再生天数与第14天根际土壤微生物基于weightedunifrac算法的距离差异。
图10为紫花苜蓿刈割后不同再生天数与第21天根际土壤微生物基于weightedunifrac算法的距离差异。
图11为紫花苜蓿刈割后不同再生天数与第28天根际土壤微生物基于weightedunifrac算法的距离差异。
图12为鸭茅刈割后不同再生天数与第0天根际土壤微生物基于weighted unifrac算法的距离差异。
图13为鸭茅刈割后不同再生天数与第1天根际土壤微生物基于weighted unifrac算法的距离差异。
图14为鸭茅刈割后不同再生天数与第2天根际土壤微生物基于weighted unifrac算法的距离差异。
图15为鸭茅刈割后不同再生天数与第7天根际土壤微生物基于weighted unifrac算法的距离差异。
图16为鸭茅刈割后不同再生天数与第14天根际土壤微生物基于weightedunifrac算法的距离差异。
图17为鸭茅刈割后不同再生天数与第21天根际土壤微生物基于weightedunifrac算法的距离差异。
图18为鸭茅刈割后不同再生天数与第28天根际土壤微生物基于weightedunifrac算法的距离差异。
图19为车前刈割后不同再生天数与第0天根际土壤微生物基于weighted unifrac算法的距离差异。
图20为车前刈割后不同再生天数与第1天根际土壤微生物基于weighted unifrac算法的距离差异。
图21为车前刈割后不同再生天数与第2天根际土壤微生物基于weighted unifrac算法的距离差异。
图22为车前刈割后不同再生天数与第7天根际土壤微生物基于weighted unifrac算法的距离差异。
图23为车前刈割后不同再生天数与第14天根际土壤微生物基于weightedunifrac算法的距离差异。
图24为车前刈割后不同再生天数与第21天根际土壤微生物基于weightedunifrac算法的距离差异。
图25为车前刈割后不同再生天数与第28天根际土壤微生物基于weightedunifrac算法的距离差异。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，如无特殊说明均设置三次重复，结果取平均值。
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试剂、材料、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例采用SPSS 26.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，不同的小写字母表示具有显著性差异，p<0.05。
本发明的发明人研究发现，牧草在刈割后会分泌大量的次生代谢物质并以根系分泌物的形式释放到土壤中，有选择性地招募在根际聚集的动态微生物集群，形成特异的根际微生物。该根际微生物类群可分泌活化土壤养分的酶以及生长素等激素类物质从而促进牧草的再生生长。因此比较不同再生天数（即牧草刈割后天数）下多年生牧草根际土壤中微生物群落的多样性与组成，可获得促进多年生牧草再生性能的微生物种类。
根据多年生牧草的生长及利用特性，通常在牧草进入现蕾期或抽穗期进行刈割。刈割后，牧草再生中需要的碳、氮主要来自根系贮藏的碳水化合物和含氮物质，同时根系会迅速反应并释放次级代谢物质以活化根际土壤养分，招募有益微生物。约在28~30天后，牧草将再次进入现蕾期或抽穗期。本发明中再生的天数的选择首先密集分布于刈割后第0天、1天、2天、7天，随后分布于14天、21天和28天，涵盖了牧草的完整再生过程。
基于此，本发明提供筛选促进多年生牧草再生的微生物种类的方法及其所用装置与计算机可读存储介质。通过下述实施例进行详细的说明。
实施例1、筛选促进多年生牧草再生的微生物种类的装置及方法
本发明提供了筛选促进多年生牧草再生的微生物种类的方法及其所用装置与计算机可读存储介质。筛选促进多年生牧草再生的微生物种类的方法的流程如图1。筛选促进多年生牧草再生的微生物种类的装置包括如下模块：
（1）数据接收模块：用于接收待测样本的微生物16S rRNA扩增子的原始数据，所述16S rRNA扩增子为16S rRNA基因的V4区域的扩增产物；所述待测样本为植物的根际土壤；
（2）数据质控分析模块：用于将所述原始数据进行质量控制得到有效数据；
（3）物种注释模块：用于将所述有效数据与Greengenes 2数据库比对做物种注释，得到每个样本的根际土壤微生物的物种信息和基于物种的丰度分布；
（4）多样性分析模块：用于根据所述物种信息和所述丰度分布进行多样性分析；
（5）结论获取模块：用于获得促进多年生牧草再生的微生物种类。
下面结合具体应用案例进行详细的介绍。
一、数据接收模块：用于接收待测样本的微生物16S扩增子的原始数据，包括1-4共计四个子模块：
1、样本采集模块：用于植物根际土壤的采集与保存；
选择生殖生长初期的紫花苜蓿、鸭茅和车前（共3种牧草），在刈割当天、刈割后1天、2天、7天、14天、21天和28天进行破坏性取样，将植株连根从土中取出，用抖土法抖落附着在根系表面的多余土壤，再用软毛刷仔细刷下紧密附着于根系的根际土壤，混合均匀并去除根毛等杂质，并于零下80 ℃保存，每个处理设置5个重复。
其中，紫花苜蓿在刈割当天、刈割后1天、2天、7天、14天、21天和28天的取样分别编号为MS0、MS1、MS2、MS7、MS14、MS21、MS28。鸭茅在刈割当天、刈割后1天、2天、7天、14天、21天和28天的取样分别编号为DG0、DG1、DG2、DG7、DG14、DG21、DG28；车前在刈割当天、刈割后1天、2天、7天、14天、21天和28天的取样分别编号为PA0、PA1、PA2、PA7、PA14、PA21、PA28。编号为MS0样品的5个重复分别在编号为MS0-1、MS0-2、MS0-3、MS0-4、MS0-5。其余样品的5个重复的编号参照MS0。
MS0表示紫花苜蓿在刈割当天所取样本，再生天数为0天；MS1表示紫花苜蓿在刈割后1天所取样本，再生天数为1天；MS2表示紫花苜蓿在刈割后2天所取样本，再生天数为2天；MS7表示紫花苜蓿在刈割后7天所取样本，再生天数为7天；MS14表示紫花苜蓿在刈割后14天所取样本，再生天数为14天；MS21表示紫花苜蓿在刈割后21天所取样本，再生天数为21天；MS28表示紫花苜蓿在刈割后28天所取样本，再生天数为28天。
DG0表示鸭茅在刈割当天所取样本，再生天数为0天；DG1表示鸭茅在刈割后1天所取样本，再生天数为1天；DG2表示鸭茅在刈割后2天所取样本，再生天数为2天；DG7表示鸭茅在刈割后7天所取样本，再生天数为7天；DG14表示鸭茅在刈割后14天所取样本，再生天数为14天；DG21表示鸭茅在刈割后21天所取样本，再生天数为21天；DG28表示鸭茅在刈割后28天所取样本，再生天数为28天。
PA0表示车前在刈割当天所取样本，再生天数为0天；PA1表示车前在刈割后1天所取样本，再生天数为1天；PA2表示车前在刈割后2天所取样本，再生天数为2天；PA7表示车前在刈割后7天所取样本，再生天数为7天；PA14表示车前在刈割后14天所取样本，再生天数为14天；PA21表示车前在刈割后21天所取样本，再生天数为21天；PA28表示车前在刈割后28天所取样本，再生天数为28天。
2、DNA提取模块：用于提取根际土壤中的DNA；
从-80 ℃冰箱中取出并准确称量250 mg土壤样本，加入DNeasy PowerSoil ProKit （QIAGEN GmbH, Germany）试剂盒中，按照生产商提供的标准步骤（见试剂盒产品中）提取根际土壤中的总DNA，保存于-80℃超低温冰箱；
3、PCR扩增模块；用于PCR扩增获得16S rRNA的扩增序列；
用双标签融合引物法，使用特异性引物16S rRNA的515F和806R做PCR扩增其V4高变区域以构建文库，PCR采用TransGen AP221-02；TransStart Fastpfu DNA Polymerease；PCR仪为ABI GeneAmp®，9700型；全部样本按照标准实验条件进行，每个样本3个生物学重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物；引物515F和引物806R的核苷酸序列如下：
515F：5‘-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’（SEQ ID No.1）；
806R：5‘-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’（SEQ ID No.2）；
引物中M表示核苷酸A或C，H表示核苷酸A或C或T，V表示核苷酸A或G或C，W表示A或T。
参照电泳初步定量结果，进行荧光定量：将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求（不低于5万条有效Tags），进行相应比例的混合；
4、测序模块：用于对合格文库用高通量平台进行测序获得原始数据；
在Illumina Miseq平台上，以PE300模式做16S rRNA的V4高变区域进行Illumina文库构建和测序，获得待测微生物样本的16S扩增子的原始数据（raw data或 raw reads）；
通过PCR将Illumina官方接头序列添加至目标区域外端；使用凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物；Tris-HCl缓冲液洗脱，2%琼脂糖电泳检测；氢氧化钠变性，产生单链DNA片段；Illumina测序时，DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；以DNA片段为模板，芯片上固定的碱基序列为引物进行PCR合成，在芯片上合成目标待测DNA片段；变性、退火后，芯片上DNA的另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥（bridge）”；PCR扩增，产生DNA簇；DNA扩增子线性化成为单链；加入改造后的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3’端粘性，继续聚合第二个核苷酸；统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列；根据barcode进行拆分获得紫花苜蓿、鸭茅和车前在不同再生天数下每个样本的原始数据（raw data 或raw reads）。
原始数据（raw data 或 raw reads）的来源为高通量测序平台Illumina的双端测序获得的原始下机数据。双端测序两个FASTQ文件，左端测序命名为R1，右端测序命名为R2。
测序得到的原始图像数据经 base calling 转化为序列数据即为原始下机数据，结果以 fastq 文件格式存储 （文件名：*.fq），fastq 文件为用户得到的最原始文件，里面存储测序获得的 reads 的序列以及 reads 的测序质量。
二、数据质控分析模块：用于将原始数据进行质量控制得到有效数据；
由于在高通量测序平台测序的建库阶段会出现建库长度的偏差，测序阶段会出现测序错误的情况，数据获得模块中获取的原始数据中会存在无效数据（包含接头信息、低质量碱基、未测出的碱基），无效数据会对生物信息数据分析带来严重的干扰，需要对原始数据进行质量控制，过滤排除无效数据，得到有效数据（Clean Data或 clean reads，数据格式与Raw data相同），以保证生物信息分析的正常进行。质量控制过程具体包括原始数据拼接和过滤。
1、数据质控分析模块：用于将Illumina测序得到的读取序列进行质量控制，获得最终的扩增子序列变异ASVs；数据质控分析模块包括（1）-（4）共计四个子模块：
（1）、数据拼接模块：用于将原始数据进行质量控制得到有效数据。具体地，用于根据barcode进行拆分并去除测序获得的reads中的接头序列和barcode序列；通过FLASH软件（Fast Length Adjustment of Short Reads，下载网址：https://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）对R1和R2序列数据进行拼接，获得拼接的Raw Tags；
（2）、质控模块1：用于对数据拼接模块获得的Raw Tags，使用fastp软件（Version0.23.1）进行过滤低质量和短长度的序列，得到高质量的Tags数据（Clean Tags）；
（3）、质控模块2：用于对质控模块1得到的Clean Tags继续去除嵌合体，得到有效Tags（Effective Tags），且每个样品产出至少5万条有效Tags；
（4）、质控模块3：用于对质控模块2得到的Effective Tags通过DADA2进行降噪，并过滤掉丰度小于5的序列，获得最终的有效数据（扩增子序列变异ASVs），并生成紫花苜蓿、鸭茅和车前的特征表和代表序列。
2、质控结果分析
（1）测序数据量统计
对数据过滤和拼接处理过程中各步骤得到的序列进行统计，根据统计结果确定样本和数据的有效性，选择符合经验值的质控后的数据进行后续数据分析（表1）。
（2）拼接序列长度分布分析
统计各样本拼接序列的长度分布，由于原始下机的reads包含接头或barcode序列，截取这些序列后对reads进行拼接时，reads的重叠区域长度也会有所变化，所以拼接序列长度会有所波动。通过分析各样本的拼接序列长度的分布，选择分布符合经验的样本进行后续数据分析。
（3）测序质量分布分析
选择测序数据的质量在Q20（碱基质量值大于20，即测序错误率小于1%）以上的样本和数据进行后续数据分析。
（4）测序错误率分布分析选择测序数据的碱基测序错误率低的样本和数据进行后续数据分析。
注：n = 35表示重复样本数为35个；
三、物种注释模块
物种注释模块：用于将有效数据与Greengenes 2数据库比对做物种注释，得到每个样本的根际土壤微生物的物种信息和基于物种的丰度分布。具体地，物种注释模块用于将得到的有效数据（扩增子序列变异ASVs）与Greengenes 2数据库中特异的V4区域分类器比对做物种注释（https://docs.qiime2.org/2023.9/data-resources/），得到每个样本的根际土壤微生物的物种信息和基于物种的丰度分布。物种注释模块包括1和2两个子模块：
1、物种注释子模块：用于将所有待测样本的扩增子序列变异ASVs的代表序列进行物种注释。具体地，物种注释采用QIIME 2的q2-greengenes2插件和greengenes2 taxonomy命令对所述有效数据中的每个16S rRNA 的V4区域进行物种注释。具体如下：
于QIIME 2官网（https://docs.qiime2.org/2023.9/data-resources/）下载最新的Greengenes 2特异的V4区域分类器（Greengenes2 2022.10 from 515F/806R region ofsequences: gg_2022_10_backbone.v4.nb.qza）。在Ubuntu 20.04.6 LTS终端基于qiimefeature-classifier classify-sklearn命令输入下载好的分类器（--i-classifier）以及ASVs序列（--i-reads），输出物种注释结果（--o-classification），输出文件命名为taxonomy.qza。
将输出的taxonomy.qza文件可视化（--o-visualization）后，上传至QIIME 2view官网（https://view.qiime2.org/）可查看注释的结果。对于本实施例中的紫花苜蓿供注释到16719种，鸭茅共注释到16800种，车前共注释到19800种。
2、物种分布分析模块：用于分析所有待测样本在不同分类水平上的物种相对丰度及比例；具体如下：
利用QIIME 2中qiime taxa barplot命令，将不同分类水平上的物种相对丰度及比例用堆叠柱状图的形式可视化，输入质控模块3中生成的特征表（--i-table），物种注释模块中输出的注释结果文件taxonomy.qza（--i-taxonomy）和不同再生天数的分组信息（--m-metadata-file），输出可视化的堆叠柱状图（--o-visualization），将输出的可视化的堆叠柱状图文件命名为taxa-bar-plots.qzv。
将输出的taxa-bar-plots.qzv文件上传至QIIME 2 view官网（https://view.qiime2.org/），可查看在不同分类水平上（界、门、纲、目、科、属、种）各物种的相对丰度及比例，结果见表2-表7。表2-表4展示了本实施例中在门水平上的紫花苜蓿、鸭茅和车前在不同再生天数下排名前10的根际土壤微生物的物种信息和基于物种的丰度分布。表5-表7反映了在属水平上的紫花苜蓿、鸭茅和车前在不同再生天数下排名前10的根际土壤微生物的物种信息和基于物种的丰度分布。
注：n = 5表示重复样本数为5个；第一列中Actinobacteria：放线菌门；Proteobacteria：变形菌门；Crenarchaeota：泉古菌门；Acidobacteria：酸杆菌门；Firmicutes：厚壁菌门；Chloroflexi：绿湾菌门；Gemmatimonadetes：芽单胞菌门；Planctomycetes：浮霉菌门；Nitrospirae：硝化螺旋菌门；Verrucomicrobia：疣微菌门。
注：n = 5表示重复样本数为5个；第一列中Actinobacteria：放线菌门；Proteobacteria：变形菌门；Crenarchaeota：泉古菌门；Acidobacteria：酸杆菌门；Firmicutes：厚壁菌门；Chloroflexi：绿湾菌门；Gemmatimonadetes：芽单胞菌门；Planctomycetes：浮霉菌门；Nitrospirae：硝化螺旋菌门；Verrucomicrobia：疣微菌门。
注：n = 5表示重复样本数为5个；第一列中Actinobacteria：放线菌门；Proteobacteria：变形菌门；Crenarchaeota：泉古菌门；Acidobacteria：酸杆菌门；Firmicutes：厚壁菌门；Chloroflexi：绿湾菌门；Planctomycetes：浮霉菌门；Gemmatimonadetes：芽单胞菌门；Verrucomicrobia：疣微菌门；Nitrospirae：硝化螺旋菌门。
注：n = 5表示重复样本数为5个；第一列中Candidatus Nitrososphaera：暂定亚硝化球菌属；Gaiellaceae：属于放线菌门放线菌纲，目前无中文名；Bacillus：芽孢杆菌属；Rubrobacter：红色杆菌属；Syntrophobacter：互营杆菌属；Rhodoplanes：红游动菌属；Solirubrobacter：土壤红杆菌属；Rhodospirillum：红螺菌属；Hyphomicrobium：生丝微菌属；Steroidobacter：类固醇杆菌属。
注：n = 5表示重复样本数为5个；第一列中Candidatus Nitrososphaera：暂定亚硝化球菌属；Pseudomonas：假单胞杆菌属；Gaiellaceae：属于放线菌门放线菌纲，无中文名；Rubrobacter：红色杆菌属；Bacillus：芽孢杆菌属；Syntrophobacter：互营杆菌属；Rhodoplanes：红游动菌属；Hyphomicrobium：生丝微菌属；Solirubrobacter：土壤红杆菌属；Balneimonas：芽生杆菌属。
注：n = 5表示重复样本数为5个；第一列中：Candidatus Nitrososphaera：暂定亚硝化球菌属；Bacillus：芽孢杆菌属；Gaiellaceae：属于放线菌门放线菌纲，暂无中文名；Rubrobacter：红色杆菌属；Syntrophobacter：互营杆菌属；Rhodoplanes：红游动菌属；Hyphomicrobium：生丝微菌属；Rhodospirillum：红螺菌属；Solirubrobacter：土壤红杆菌属；Kaistobacter：降解菌属。
四、多样性分析模块
多样性分析模块：用于根据所述物种信息和所述丰度分布进行多样性分析，使用QIIME2对ASVs进行多序列比对并构建系统发育树，并基于各多年生牧草的所有待测样本中最大和最小序列数（表1）进行多样性分析，包括α-多样性分析模块和β-多样性分析模块两个子模块：
1、α-多样性分析模块：用于将所有待测样本的有效ASVs的代表序列进行α-多样性分析。所述α-多样性分析模块包括α-多样性指数统计模块和物种多样性曲线绘制模块：
（1）α-多样性指数统计模块：用于统计所述所有样本的α-多样性分析指数
基于ASVs，使用QIIME2对ASVs进行多序列比对并构建有根系统发育树（文件命名为rooted-tree.qza），依据每个植物物种的特征表中的最小序列数（表1）进行抽平，通过QIIME 2中qiime diversity diversity core-metrics-phylogenetic命令，输入质控模块3中生成的特征表（--i-table）和有根系统发育树rooted-tree..qza文件（--i-phylogeny），计算核心多样性。之后通过QIIME 2中qiime diversity alpha-group-significance命令进行α-多样性组间差异显著性分析和可视化。通常表征α-多样性的指数包含丰富度指数（Abundance/Richness）、均匀度指数（Evenness）、香农-威纳指数（Shannon）和系统发育多样性指数（Faith-PD）。此处展示了本实施例中紫花苜蓿、鸭茅和车前刈割后不同再生天数下根际土壤微生物丰富度的差异（图2-图4）。
（2）物种多样性曲线绘制模块：用于绘制所述所有待测样本的物种多样性曲线，以分析所述有效数据的数据量的合理性和所述样本中物种的丰富度和均匀度
基于ASVs，使用QIIME2对ASVs进行多序列比对并构建系统发育树，依据每个植物物种的特征表中的最大序列数（表1），通过QIIME 2中qiime diversity alpha-rarefaction命令，输入质控模块3中生成的特征表（--i-table）和有根系统发育树.qza文件（--i-phylogeny），绘制α-多样性稀释曲线并可视化。通常可基于丰富度指数（Abundance/Richness）、香农-威纳指数（Shannon）和系统发育多样性指数（Faith-PD）绘制稀释曲线。此处展示了紫花苜蓿、鸭茅和车前刈割后不同再生天数下根际土壤微生物基于系统发育多样性指数（Faith-PD）的稀释曲线表（表8-表10），表8-表10中第一列数据表示测序深度（Sequencing depth）。
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注：表8-表10中，n = 5表示重复样本数为5个。
2、β-多样性分析模块：用于将所有待测样本的有效ASVs的代表序列进行β-多样性分析
基于ASVs，使用QIIME2对ASVs进行多序列比对并构建有根系统发育树（文件命名为rooted-tree.qza），依据每个植物物种的特征表中的最小序列数（表1）进行抽平，通过QIIME 2中qiime diversity diversity core-metrics-phylogenetic命令，输入质控模块3中生成的特征表（--i-table）和有根系统发育树rooted-tree.qza文件（--i-phylogeny），计算核心多样性。之后通过QIIME 2中qiime diversity beta-group-significance命令进行β-多样性组间差异显著性分析和可视化。通常用于计算样本集间β-多样性的距离算法主要有Bray-Curtis距离、Weighted unifrac、Unweighted unifrac和Jaccard similaritycoefficient。此处仅展示了本实施例中紫花苜蓿、鸭茅和车前刈割后不同再生天数下根际土壤微生物基于weighted_unifrac算法的距离（weighted_unifrac）差异（图5-图25）。
五、结论获取模块
结论获取模块：用于获得促进多年生牧草再生的微生物种类。
将多年生牧草根际土壤微生物的物种信息、基于物种的丰度分布以及多样性分析的结果，即物种注释模块、α-多样性分析模块和β-多样性分析模块获得的结果进行综合比较、分析获得促进多年生牧草再生的微生物种类，结论如下：
（1）不同多年生牧草在不同再生天数下根际微生物多样性（α和β多样性）存在显著差异，表明不同多年生牧草再生过程中动态招募特异根际微生物的机制不同，如紫花苜蓿再生前期（0-2天）其根际微生物α多样性较高，而在再生后期（21-28天）根际微生物α多样性较低，说明紫花苜蓿刈割后，根际微生物的动态招募与组成过程发生在再生前期，而在再生后期，其根际微生物组成趋于稳定。
（2）获得了可能促进或辅助促进不同多年生牧草再生的微生物的微生物种类：对于紫花苜蓿和鸭茅，促进其再生的根际微生物在门水平上按顺序主要分布于放线菌门、变形菌门、泉古菌门、酸杆菌门、厚壁菌门、绿湾菌门、芽单胞菌门、浮霉菌门、硝化螺旋菌门和疣微菌门。对于车前，促进其再生的根际微生物在门水平上按顺序主要分布于放线菌门、变形菌门、泉古菌门、酸杆菌门、厚壁菌门、绿湾菌门、浮霉菌门、芽单胞菌门、疣微菌门和硝化螺旋菌门。在属水平上，对于紫花苜蓿，促进其再生的根际微生物按顺序主要分布于亚硝化球菌属、芽孢杆菌属、红色杆菌属、互营杆菌属、红游动菌属、土壤红杆菌属、红螺菌属、生丝微菌属和类固醇杆菌属。对于鸭茅，促进其再生的根际微生物按顺序主要分布于硝化球菌属、假单胞杆菌属、红色杆菌属、芽孢杆菌属、互营杆菌属、红游动菌属、生丝微菌属、土壤红杆菌属和芽生杆菌属。对于车前，促进其再生的根际微生物按顺序主要分布于亚硝化球菌属、芽孢杆菌属、红色杆菌属、互营杆菌属、红游动菌属、生丝微菌属、红螺菌属、土壤红杆菌属和降解菌属。上述微生物的配比可按照表2-7中的丰度值换算得到。
上述结果可为利用有益微生物功能开发促进牧草再生性能、提高牧草产量、改善牧草品质以及加强牧草抗病虫害能力提供数据和技术支持，也可为农业及草牧业发展和环境保护提供一定指导意义和借鉴作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.筛选或辅助筛选促进多年生牧草再生的微生物种类的方法，其特征在于：
所述方法包括获得不同再生天数的多年生牧草根际土壤微生物的物种信息和物种的丰度分布并进行多样性分析，根据不同再生天数下多年生牧草根际土壤微生物的物种信息、物种的丰度分布以及多样性分析的结果获得促进多年生牧草再生的微生物种类；
所述物种信息和物种的丰度分布通过如下步骤获得：
S1、收集待检测多年生牧草刈割后不同再生天数的根际土壤，得到样本，所述再生天数为大于等于0的自然数；所述再生天数选自0、1、2、7、14、21、28；
S2、提取所述样本中的DNA，使用16S rRNA基因特异性引物515F和引物806R进行PCR扩增16S rRNA基因的V4区域，获得16S rRNA基因V4区域文库；
所述引物515F的核苷酸序列是SEQ ID No.1，
所述引物806R的核苷酸序列是SEQ ID No.2；
S3、对所述16S rRNA基因V4区域文库用Illumina Miseq平台进行测序得到原始数据，并对所述原始数据进行质量控制，得到有效数据；
S4、将所述有效数据与Greengenes 2数据库比对做物种注释，得到每个样本的根际土壤微生物的物种信息和基于物种的丰度分布；所述物种注释采用QIIME 2的q2-greengenes2插件和greengenes2 taxonomy命令对所述有效数据中的每个16S rRNA 的V4区域进行物种注释。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述多年生牧草选自豆科牧草、禾本科牧草和/或车前科牧草。
3.筛选或辅助筛选促进多年生牧草再生的微生物种类的装置，其特征在于：
所述装置包括如下模块：
（1）数据接收模块：用于接收待测样本的微生物16S rRNA扩增子的原始数据，所述16SrRNA扩增子为16S rRNA基因的V4区域的扩增产物；所述待测样本为待检测多年生牧草刈割后不同再生天数的根际土壤，所述再生天数为大于等于0的自然数；所述再生天数选自0、1、2、7、14、21、28；
（2）数据质控分析模块：用于将所述原始数据进行质量控制得到有效数据；
（3）物种注释模块：用于将所述有效数据与Greengenes 2数据库比对做物种注释，得到每个样本的根际土壤微生物的物种信息和基于物种的丰度分布；所述物种注释采用QIIME2的q2-greengenes2插件和greengenes2 taxonomy命令对所述有效数据中的每个16S rRNA的V4区域进行物种注释；
（4）多样性分析模块：用于根据所述物种信息和所述丰度分布进行多样性分析；
（5）结论获取模块：用于根据不同再生天数下多年生牧草根际土壤微生物的物种信息、物种的丰度分布以及多样性分析的结果获得促进多年生牧草再生的微生物种类。
4.根据权利要求3所述的装置，其特征在于：
所述多年生牧草选自A1）、A2）和/或A3），
A1）紫花苜蓿；
A2）鸭茅；
A3）车前。
5.存储有计算机程序的计算机可读存储介质，所述计算机程序使计算机建立如权利要求4所述装置的模块。
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