CN117434267A - 基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置及检测方法，所述装置包括：外壳；位于外壳上半部分的荧光旋转衍射光栅模块、进样混合孵育模块；位于外壳下半部分的海尔贝克磁控模块，其与荧光旋转衍射光栅模块平行布置，且与进样混合孵育模块相连通；所述检测方法基于上述装置。与现有技术相比，本发明中，经进样混合孵育模块孵育的磁流体工作液在海尔贝克磁场阵列磁场的作用下，均匀吸附在均质吸附平板，且呈均一化分布；光源发出的光束经调节透镜调整角度后，投射在衍射光栅上，衍射光栅将光束反射至均质吸附平板，激发磁流体工作液的荧光，检测器检测不同波段的荧光强度，经分析处理对应不同抗性基因含量。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置及检测方法。
背景技术
抗生素污染是目前困扰全球的环境污染问题。虽然大部分抗生素的半衰期较短，但是由于常年持续不断地进入到环境中，抗生素已经形成一种“持久性”的污染状态。环境残存的抗生素会对细菌产生选择性压力，使细菌对原先敏感的药物产生抗性，表现出不敏感，在动物体内以及环境中诱导出抗性菌和抗生素抗性基因。目前，在医疗废水、养殖废水、生活污水、河流湖泊，甚至在饮用水中均能检测出多种抗性基因的存在，主要包括四环素类、磺胺类、β-内酰胺类、大环内酯类、氨基糖苷类等。当前对抗性基因的检测主要依赖以聚合酶链式反应(PCR)的扩增法为主的传统分子生物学手段，需要数十次的温度循环，同时需要严格的温度循环仪器以及专业的操作人员，严重限制了其在现场检测及欠发达实验室中的应用，且无法实现对多种抗性基因的同时快速检测，最终导致检测成本高，周期长。
免疫磁性颗粒表面固定有抗体或抗原等生物活性分子，在一定条件下，能够与目标物特异性结合的一类具有超顺磁性的生物纳米微球复合材料。纳米免疫磁性颗粒与免疫荧光等技术的结合能进一步提高检测的灵敏度，实现快速在线检测，因此将荧光免疫磁性颗粒用于抗性基因检测具有较大技术潜力和优势。然而，在现有免疫荧光磁性颗粒的使用中，存在磁场布局排布不合理、纳米磁性微球易聚集等问题，同时当激光波长远远大于或接近纳米颗粒尺寸时，光线往往会越过颗粒或与其相互作用，导致光线散射，荧光检测效应减弱，降低了检测灵敏度和准确度。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷中的至少一种而提供一种灵敏度高、检测限低及操作简便的基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置及检测方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明目的之一在于一种基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置，包括：
外壳；
位于外壳上半部分的荧光旋转衍射光栅模块、进样混合孵育模块；
位于外壳下半部分的海尔贝克磁控模块，其与荧光旋转衍射光栅模块平行布置，且与进样混合孵育模块相连通；
所述海尔贝克磁控模块包括平行布置的均质吸附平板、海尔贝克磁场阵列和旋转台，所述旋转台位于海尔贝克磁场阵列下方，以带动海尔贝克磁场阵列的旋转；所述荧光旋转衍射光栅模块包括与均质吸附平板平行布置的检测器，以及布置在于均质吸附平板和检测器间的光源、调节透镜和衍射光栅。
进一步地，所述荧光旋转衍射光栅模块中衍射光栅为旋转式反射光栅，周期性调制将接受到光源的光束反射至均质吸附平板。
进一步地，所述光源位于调节透镜的焦点处。
更具体地，所述光源为大功率光源，其发出的点光源激光后经调节透镜调整角度后平行投射至衍射光栅，衍射光栅通过旋转一定范围角度将光均匀反射至均质吸附平板，均质吸附平板上附着的荧光免疫磁流体进一步被激发荧光并被检测器所检测。
进一步地，所述装置还设有磁流体添加管、样品进样管和工作液进液管道；所述磁流体添加管、样品进样管与进样混合孵育模块的入口相连通；所述工作液进液管道一端与进样混合孵育模块的出口相连通，另一端与海尔贝克磁控模块相连通。
更具体地，所述磁流体中的荧光免疫磁性颗粒为粒径为10-100nm、包被多种抗性基因抗体的Fe3O4超顺纳米磁性微球，包括三种代表性抗性基因磺胺类sul1，四环素类tetC和β-内酰胺类blaOXA-1，三种抗体分别与FITC等不同颜色荧光素相连，荧光免疫磁性颗粒溶于表面活性剂后经磁力搅拌均匀分散后形成磁流体。所述磁流体由磁流体添加管进入装置，样品经样品进样管添加，两者共同进入进样混合孵育模块后进行充分混合和控温孵化，形成样品混合磁流体工作液，后通过工作液进液管道进入海尔贝克磁控模块。
进一步地，所述均质吸附平板上端面的两侧设有用于冲洗均质吸附平板的刮片，单次检测结束后刮片配合自样品进样管添加的冲洗清洁剂剂对均质吸附平板表面的磁流体进行冲洗，并通过排污管道送入后端排污模块。
进一步地，所述海尔贝克磁场阵列的磁钢组等距间隔排列，磁钢组内的磁钢块按“双极性”原则排列。更具体地，所述海尔贝克磁场阵列由等距间隔的磁钢组构成，磁钢组排列成直线型以产生单边磁场，进而调控纳米级荧光免疫磁流体在均质吸附平板上的均一化分布。所述海尔贝克磁场阵列在旋转台上方，旋转台旋转海尔贝克磁场阵列以调节磁力线方向。
进一步地，所述装置还设有位于外壳下半部分的排污模块；所述排污模块与海尔贝克磁控模块间设有用于连通二者的排污管道。
进一步地，所述排污模块内设有用于检测废液深度的液位传感器。
进一步地，所述装置还设有控制模块；所述控制模块至少与衍射光栅、检测器、旋转台或液位传感器中的一个电连。
更具体地，所述控制模块为显示控制屏，所述衍射光栅在显示控制屏远程电控下不断转动，周期性调制将激光束反射至均质吸附平板，并形成不断滚动的条状光斑，在增强光照效率的同时确保荧光免疫磁流体被充分照射；所述检测器接收各波段激发光后，检测器将数据传输至显示控制屏快速显示多种抗体基因的含量；所述海尔贝克磁场阵列能在显示控制器远程电控下随旋转台转动，磁钢组协同磁力线分布和方向改变，使磁流体在均质吸附平板上发生滚动，使得荧光免疫磁性颗粒被充分照射，在强磁场保证磁性分离效果的同时增强荧光效率。所述排污模块内的液位传感器通过电控传感实时检测废液深度，并与显示控制屏进行连通，提醒使用者定期清理并倒空排污模块。
本发明目的之二在于一种如上所述基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置的检测方法，包括如下步骤：
荧光免疫磁流体和样品的混合液经混合孵育模块搅拌和控温孵化后对样品中的多种抗性基因实现磁性分离，得到孵育后的磁流体工作液；
孵育后的磁流体工作液进入海尔贝克磁控模块，受海尔贝克磁场阵列和旋转台联合控制；在海尔贝克磁场阵列的作用下，孵育后的磁流体工作液被磁场吸附在均质吸附平板，并保持均一化分散性分布；在旋转台的作用下，荧光免疫磁流体在在均质吸附平板不断滚动，便于荧光得到充分激发；
特定波长激光自光源发出后，经调节透镜调整角度后平行投射至衍射光栅，衍射光栅不断转动，周期性调制将激光束反射至均质吸附平板，确保荧光免疫磁流体被充分照射；检测器检测不同波段的荧光强度，经分析处理对应不同抗性基因含量。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明中，经进样混合孵育模块孵育的磁流体工作液在海尔贝克磁场阵列磁场的作用下，均匀吸附在均质吸附平板且呈均一化分布；光源发出的光束经调节透镜调整角度后，投射在衍射光栅上，衍射光栅将光束反射至均质吸附平板，激发磁流体工作液的荧光，检测器检测不同波段的荧光强度，经分析处理对应不同抗性基因含量。
(2)本发明中，衍射光栅为旋转衍射光栅，周期性调制将接受到光源的光束反射至均质吸附平板，使得光线在均质吸附平板上不断左右层扫，以增强的特异性照明充分照射荧光免疫磁流体，提升检测效率和准确度。此外，衍射光栅在增强特定波长光线的同时，对其他波长光线进行抑制，从而提升对抗性基因的特异性检测。
附图说明
图1为实施例中基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置的示意图；
图2为实施例中基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置的内部结构图；
图3为实施例中磁钢组内部磁钢块的磁极排列方式及磁场分布图；
图中标号所示：1-外壳；2-磁流体添加管；3-样品进样管；4-控制模块；5-排污模块；6-进样混合孵育模块；7-工作液进液管道；8-排污管道；9-荧光旋转衍射光栅模块；901-光源；902-调节透镜；903-衍射光栅；904-检测器；10-海尔贝克磁控模块；1001-均质吸附平板；1002-海尔贝克磁场阵列；1003-旋转台。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
一、一种基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置，包括：
外壳1；
位于外壳1上半部分的荧光旋转衍射光栅模块9、进样混合孵育模块6；
位于外壳1下半部分的海尔贝克磁控模块10，其与荧光旋转衍射光栅模块9平行布置，且与进样混合孵育模块6相连通；
海尔贝克磁控模块10包括平行布置的均质吸附平板1001、海尔贝克磁场阵列1002和旋转台1003；荧光旋转衍射光栅模块9包括与均质吸附平板1001平行布置的检测器904，以及布置在于均质吸附平板1001和检测器904间的光源901、调节透镜902和衍射光栅903；旋转台1003位于海尔贝克磁场阵列1002下方，以带动海尔贝克磁场阵列1002的旋转，进而调节磁力线方向。均质吸附平板1001上端面的两侧设有用于冲洗均质吸附平板1001的刮片，单次检测结束后刮片配合自样品进样管3添加的冲洗清洁剂剂对均质吸附平板1001表面的磁流体进行冲洗，并通过排污管道8送入后端排污模块5。海尔贝克磁场阵列1002的磁钢组等距间隔排列，磁钢组内的磁钢块按“双极性”原则排列。更具体地，海尔贝克磁场阵列1002由等距间隔的磁钢组构成，磁钢组排列成直线型以产生单边磁场，进而调控纳米级荧光免疫磁流体在均质吸附平板上的均一化分布。
荧光旋转衍射光栅模块9中衍射光栅903为旋转式反射光栅，周期性调制将接受到光源901的光束并将其反射至均质吸附平板1001。光源901位于调节透镜902的焦点处。光源901为大功率光源，其发出的点光源激光后经调节透镜902调整角度后平行投射至衍射光栅903，衍射光栅903通过旋转一定范围角度将光均匀反射至均质吸附平板1001，均质吸附平板1001上附着的荧光免疫磁流体进一步被激发荧光并被检测器所检测。
装置还设有磁流体添加管2、样品进样管3和工作液进液管道7；磁流体添加管2、样品进样管3与进样混合孵育模块6的入口相连通；工作液进液管道7一端与进样混合孵育模块6的出口相连通，另一端与海尔贝克磁控模块10相连通。磁流体中的荧光免疫磁性颗粒为粒径为10-100nm、包被多种抗性基因抗体的Fe3O4超顺纳米磁性微球，包括磺胺类sul1，四环素类tetC和β-内酰胺类blaOXA-1，三种抗体分别与FITC、CY3和CY5三种不同颜色荧光素相连，荧光免疫磁性颗粒溶于表面活性剂后经磁力搅拌均匀分散后形成磁流体。磁流体由磁流体添加管2进入装置，样品经样品进样管3添加，两者共同进入进样混合孵育模块6后进行充分混合和控温孵化，形成样品混合磁流体工作液，后通过工作液进液管道7进入海尔贝克磁控模块10。
装置还设有位于外壳1下半部分的排污模块5；排污模块5与海尔贝克磁控模块10间设有用于连通二者的排污管道8。排污模块5内设有用于检测废液深度的液位传感器。
装置还设有控制模块4；控制模块4至少与衍射光栅903、检测器904、旋转台1003或液位传感器中的一个电连。控制模块为显示控制屏，衍射光栅903在显示控制屏远程电控下不断转动，周期性调制将激光束反射至均质吸附平板100101，并形成不断滚动的条状光斑，在增强光照效率的同时确保荧光免疫磁流体被充分照射；检测器904接收各波段激发光后，检测器将数据传输至显示控制屏快速显示多种抗体基因的含量；海尔贝克磁场阵列1002能在显示控制器远程电控下随旋转台1003转动，磁钢组协同磁力线分布和方向改变，使磁流体在均质吸附平板上发生滚动，使得荧光免疫磁性颗粒被充分照射，在强磁场保证磁性分离效果的同时增强荧光效率。排污模块5内的液位传感器通过电控传感实时检测废液深度，并与显示控制屏进行连通，提醒使用者定期清理并倒空排污模块5。
二、一种基于上述检测装置的检测方法，包括如下步骤：
荧光免疫磁流体和样品的混合液经混合孵育模块6搅拌和控温孵化后对样品中的多种抗性基因实现磁性分离，得到孵育后的磁流体工作液；
孵育后的磁流体工作液进入海尔贝克磁控模块10，在海尔贝克磁场阵列1002的作用下，磁流体工作液中的荧光免疫磁流体吸附在均质吸附平板1001，并保持均一化分散性分布；在旋转台1003的作用下，磁流体工作液中的荧光免疫磁流体在均质吸附平板1001不断滚动，便于荧光得到充分激发；
特定波长激光自光源901发出后，经调节透镜902调整角度后平行投射至衍射光栅903，衍射光栅903不断转动，周期性调制将激光束反射至均质吸附平板1001，确保荧光免疫磁流体被充分照射；检测器904检测不同波段的荧光强度，经分析处理对应不同抗性基因含量。
实施例
一、一种基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置，见图1-3，包括控制模块4、进样混合孵育模块6、荧光旋转衍射光栅模块9、海尔贝克磁控模块10和排污模块5，所述进样混合孵育模块6顶部连接磁流体添加管2和样品进样管3，底部通过工作液进液管道7连接海尔贝克磁控模块10，所述海尔贝克磁控模块10上部设有均质吸附平板1001，底部设有海尔贝克磁场阵列1002和旋转台1003，所述荧光旋转衍射光栅模块9顶部设有检测器904，侧壁设有光源901，中部设有调节透镜902，右部设有衍射光栅903，所述排污模块5通过排污管道8与海尔贝克磁控模块10相连接。
本实施例中控制模块4为显示控制屏1，其至少与衍射光栅903、检测器904、旋转台1003、液位传感器电连。
荧光免疫磁流体的主要成分为以表面活性剂为基液的荧光免疫磁性颗粒，制备方式如下：
(1)合成：取30mL Fe3+和20mL Fe2+，与150mL超纯水混合均匀后加入50mL NaOH，70℃下混合搅拌30min，合成Fe3O4纳米磁性粒子。
(2)活化：磁分离Fe3O4纳米磁性粒子后用超纯水洗涤多次至中性，洗涤后超声60min分散磁性粒子，再加入1mg EDC和1mg NHSS活化2h，并保持颗粒悬浮状态。
(3)偶联：将三种抗性基因荧光抗体(磺胺类sul1—FITC，四环素类tetC—CY3和β-内酰胺类blaOXA-1—CY5)加入到已活化并悬浮的磁性颗粒中，室温下于0.1M PBS(pH7.4)缓冲液中偶联3h，利用旋转仪保持磁性颗粒悬浮状态，荧光与抗体的搭配组合详见表1。
(4)封闭：磁分离已包被多重抗性基因抗体的荧光免疫磁性颗粒，0.01MPBS洗涤三次后加入含5％脱脂奶粉的PBS缓冲液，37℃孵育1h。
(5)分散：将疏水性油酸和亲水性十二烷基苯磺酸钠按照2：1的体积比配置为改良的表面活性剂，在55℃将荧光免疫磁性颗粒加入表面活性剂并磁力搅拌30min，使其充分分散，形成荧光免疫磁流体。
详见图3，海尔贝克磁场阵列1002采取直线型排列方式，以产生单边增强磁场。磁钢组等距间隔排列，磁钢组内的磁钢块按“双极性”原则排列，已预先充磁后的磁体段根据阵列的拓扑结构经磁体胶粘连在一起形成磁钢块，磁钢块同样平行排列且相邻磁钢间的间距相等，磁流体在磁场作用下磁性粒子发生链状聚集，从而均匀平铺在均质吸附平板1001上，减少纳米磁性粒子堆叠，增强对抗性基因的磁性分离效果。海尔贝克磁场阵列1002能在控制模块4远程电控下随旋转台1003转动，磁钢组协同磁力线分布和方向改变，使磁流体在均质吸附平板上发生滚动，使得荧光免疫磁性颗粒被充分照射，在强磁场保证磁性分离效果的同时增强荧光效率。
衍射光栅903为反射光栅，推荐尺寸为12.5×12.5mm或25×225mm。衍射光栅903在增强特定波长光线的同时，对其他波长光线进行抑制，从而提升对抗性基因的特异性检测。衍射光栅903将光反射至均质吸附平板1001形成条形光斑，通过控制模块4远程电控对条状光斑进行周期性调制，使得光线在均质吸附平板上不断左右层扫，以增强的特异性照明充分照射荧光免疫磁流体，提升检测效率和准确度。
二、一种基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置的检测方法，包括如下步骤：
荧光免疫磁流体自磁流体添加管2进入装置，样品自样品进样管3添加后共同进入进样混合孵育模块6，形成磁流体工作液并借助特定性抗体在充分搅拌和控温孵化后对样品中的多种抗性基因实现磁性分离。
孵育后的磁流体工作液通过工作液进液管道7自进样混合孵育模块6进入海尔贝克磁控模块10，并被磁场吸附在均质吸附平板1001上。受海尔贝克磁场阵列1002和旋转台1003联合控制，海尔贝克磁控模块10内产生单边增强型磁场，进而控制磁流体工作液中的磁流体保持纳米级尺寸避免富集，同时通过控制模块4远程电控旋转和调控海尔贝克磁场阵列1002中的磁钢组使得已吸附抗性基因的荧光免疫磁流体在均质吸附平板1001上保持均一化分散性分布。旋转台1003带动海尔贝克磁场阵列1002转动，改变调节磁力线方向，进而在不接触磁流体工作液的情况下使得荧光免疫磁流体不断滚动，使其被光充分激发从而提升后续检测效率。
特定波长激光自光源901发出后，经调节透镜902调整角度后平行投射至衍射光栅903。衍射光栅903在控制模块4远程电控下不断转动，周期性调制将激光束反射至均质吸附平板1001，并形成不断滚动的条状光斑，在增强光照效率的同时确保荧光免疫磁流体被充分照射。检测器904检测不同波段的荧光强度，经分析处理对应不同抗性基因含量，最终检测器904将数据传输至控制模块4，实现对不同抗性基因含量的多重、快速、精准检测。检测完的磁流体废液经排污管道8进入排污模块5进行统一收集和废液处置。
表1抗性基因与荧光素偶联组合
| 抗性基因 | 荧光素 | 激发光波长(nm) | 发射光波长(nm) |
| 磺胺类sul1 | FITC | 495 | 520 |
| 四环素类tetC | CY3 | 550 | 570 |
| β-内酰胺类blaOXA-1 | CY5 | 646 | 664 |
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置，其特征在于，包括：
外壳(1)；
位于外壳(1)上半部分的荧光旋转衍射光栅模块(9)、进样混合孵育模块(6)；
位于外壳(1)下半部分的海尔贝克磁控模块(10)，其与荧光旋转衍射光栅模块(9)平行布置，且与进样混合孵育模块(6)相连通；
所述海尔贝克磁控模块(10)包括平行布置的均质吸附平板(1001)、海尔贝克磁场阵列(1002)和旋转台(1003)；所述旋转台(1003)位于海尔贝克磁场阵列(1002)下方，以带动海尔贝克磁场阵列(1002)的旋转；
所述荧光旋转衍射光栅模块(9)包括与均质吸附平板(1001)平行布置的检测器(904)，以及布置在于均质吸附平板(1001)和检测器(904)间的光源(901)、调节透镜(902)和衍射光栅(903)。
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置，其特征在于，所述衍射光栅(903)为旋转式反射光栅，周期性调制将接受到光源(901)的光束反射至均质吸附平板(1001)。
3.根据权利要求1所述的一种基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置，其特征在于，所述光源(901)位于调节透镜(902)的焦点处。
4.根据权利要求1所述的一种基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置，其特征在于，所述装置还设有磁流体添加管(2)、样品进样管(3)和工作液进液管道(7)；
所述磁流体添加管(2)、样品进样管(3)与进样混合孵育模块(6)的入口相连通；
所述工作液进液管道(7)一端与进样混合孵育模块(6)的出口相连通，另一端与海尔贝克磁控模块(10)相连通。
5.根据权利要求1所述的一种基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置，其特征在于，所述均质吸附平板(1001)上端面的两侧设有用于冲洗均质吸附平板(1001)的刮片。
6.根据权利要求1所述的一种基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置，其特征在于，所述海尔贝克磁场阵列(1002)的磁钢组等距间隔排列，磁钢组内的磁钢块按“双极性”原则排列。
7.根据权利要求1所述的一种基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置，其特征在于，所述装置还设有控制模块(4)；所述控制模块(4)至少与衍射光栅(903)、检测器(904)或旋转台(1003)中的一个电连。
8.根据权利要求7所述的一种基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置，其特征在于，所述装置还设有位于外壳(1)下半部分的排污模块(5)；所述排污模块(5)与海尔贝克磁控模块(10)间设有用于连通二者的排污管道(8)。
9.根据权利要求8所述的一种基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置，其特征在于，所述排污模块(5)内设有用于检测废液深度的液位传感器；所述液位传感器与控制模块(4)电连。
10.一种如权利要求1-9任一项所述基于荧光免疫磁流体的抗性基因检测装置的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
荧光免疫磁流体和样品的混合液经混合孵育模块(6)搅拌和控温孵化后对样品中的多种抗性基因实现磁性分离，得到孵育后的磁流体工作液；
孵育后的磁流体工作液进入海尔贝克磁控模块(10)，在海尔贝克磁场阵列1002的作用下，磁流体工作液中的荧光免疫磁流体吸附在均质吸附平板(1001)，并保持均一化分散性分布；在旋转台(1003)的作用下，磁流体工作液中的荧光免疫磁流体在均质吸附平板(1001)不断滚动，便于荧光得到充分激发；
特定波长激光自光源(901)发出后，经调节透镜(902)调整角度后平行投射至衍射光栅(903)，衍射光栅(903)不断转动，周期性调制将激光束反射至均质吸附平板(1001)，确保荧光免疫磁流体被充分照射；检测器(904)检测不同波段的荧光强度，经分析处理对应不同抗性基因含量。
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