CN117425705A - 用于近红外荧光验证的稳定液体体模 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及光学成像领域。更特别地，本发明涉及含在Good’s缓冲剂中溶解的具有近红外发射的有机染料的制剂作为合适的体模用于评估，验证和校准近红外荧光成像系统的用途。
Description
技术领域
本发明涉及光学成像领域。更具体地，本发明涉及包含溶解在Good’s缓冲剂中的具有近红外发射的有机染料的制剂作为合适的体模(phantom)用于评估、验证和校准近红外荧光成像系统的用途。
背景技术
近红外荧光成像装置可用于临床实践中以提供组织中的荧光图像，所述荧光图像通常源自在成像阶段之前或期间施用于患者的外源性造影剂。这种近红外荧光检测系统的性能验证对于确保可再现和定量评估是至关重要的。应该测试成像装置以验证它们正确地执行，以避免可能不会被用户注意到的可能的缺陷，诸如激发光强度劣化或检测光学器件中的机械问题。这在医学应用中尤其重要，其中成像装置的性能可能影响诊断和治疗(即手术)结果。然而，尽管最近在荧光成像方面取得了进展，但是用于评估成像系统的灵敏度的合适的验证系统和标准的可用性仍然是未满足的需求。
可以用特定的计量仪器来执行成像装置的测试。然而，这不允许同时验证成像装置的照明单元和获取单元。
另一种可能性是使用嵌入不同浓度的量子点(在半导体工艺中制造的小颗粒)的可固化聚氨酯基质或复合体模，例如如US9,167,240中所述(其涉及用于验证荧光成像和断层成像(tomography)装置的固体体模的方法和组合物)，以及Gorpas等人在J.Biomed.Opt.2017,22(1):016009中所述(其描述了使用复合固体体模来验证和标准化荧光成像装置)。然而，复合体模的产生和控制是复杂的，并且量子点表现出非常高的可见光吸收(特别地，远高于通常在医学应用中使用的荧光试剂之一)，使得它们可以用于仅在具有受控照明的环境中验证成像装置的性能。
备选地，已经通过将具有类似于人体组织(例如血红蛋白和英脱利匹特(intralipid))的吸收和散射特性的材料与与有机荧光团如吲哚菁绿(ICG)组合来设计组织模拟体模。在US2006-056580和De Grand等人，Biomed.Opt.2006,11(1):014007中描述了这种体模的实例，其公开了用于验证荧光成像系统的组织样固体体模。然而，这种体模的制备相对复杂，因此考虑到所需的不同材料(聚合物，散射剂，吸收剂，染料，缓冲剂，赋形剂)，大规模生产可能是麻烦的以及相当昂贵的。
这些系统的更简单的替代方案通过使用由在合适的缓冲剂中的有机染料组成的液体体模来表示。液体体模比固体体模更加用户友好和可定制，因为染料溶液可以填充在实验室或医院中常见的一次性设备，如多孔板，小瓶或毛细管中。常用的液体体模的实例是由ThermoFisher销售的荧光素NIST-可追踪的标准溶液(代码:F36915)。然而，荧光素在可见电磁光谱(515nm)中发射，并且没有NIST-可追踪的标准品可用于控制、验证和校准在高于650nm的波长下工作的近红外荧光成像装置。
Koller等人，Nat.Commun.2018,9(1):3739和Hoogstins等人，Mol.Imaging.Biol.2019,21(1):11-18报道了这种体模溶液的另外的实例，其公开了使用含有近红外染料的液体体模来验证术中荧光成像装置和名为Calibration Disk(SurgVision)的测试装置(支架)，该测试装置在装置验证程序之前填充有含有近红外染料溶液的小瓶。
然而，这些测试装置需要手动干预(例如，现场制备)，这取决于操作者并且容易出错。此外，大多数有机染料在溶液中的稳定性相对较低，并且普通用户缺乏适当的设备，技术诀窍，程序和分析方法来控制制备后和保质期期间染料溶液的质量(即纯度，浓度，特性)。而且，上述参考文献提及使用高分子量分子(贝伐珠单抗-800CW)，其中NIR染料与抗体缀合，因此即使在这种情况下，大规模制备这种体模用于常规系统性能验证也可能非常复杂且昂贵。此外，将贝伐珠单抗-800CW溶解在中，所述/>是模拟人体组织的包含磷脂和脂肪酸的脂肪乳液，但由于对标准吸光度测量的光学干扰，它不允许适当地控制染料的精确浓度。最后，如Ter Weele等人，Eur.J.Pharm.Biopharm.104(2016)226-234所报道的，如果在pH 7的等渗磷酸盐缓冲氯化钠溶液中配制，则贝伐珠单抗-800CW是稳定的，但当制剂含有其他组分时稳定性降低，因此制剂在/>中的长期稳定性得不到保证，从而在常规系统性能验证过程中引入了潜在的偏差。
因此，需要一种基于有机近红外染料的稳定且方便的液体体模，用于在近红外光谱中的波长下工作的光学成像的荧光系统的常规性能评估。
发明概述
本发明一般地涉及包含溶解在合适的Good’s缓冲剂中的有机近红外染料的制剂作为用于验证近红外荧光系统的液体体模的用途。
所述溶液可任选地包含至少一种添加剂。
特别地，所述近红外染料是如下文详细描述中所示的式(I)的化合物。
该制剂可以在用于储存的最终容器内供应，其不干扰近红外成像程序，并且不需要最终用户的额外操作，例如稀释、分配或质量验证。
因此，本发明的另一方面涉及用于验证近红外荧光装置的性能的试剂盒，其包含一组容器，所述容器携带不同浓度的本发明的制剂(即，近红外染料在Good’s缓冲溶液中的不同稀释液)，以允许同时测试多个浓度下的荧光装置。
本发明的另一方面涉及这种稳定制剂用于至少由照明单元和采集单元组成的近红外荧光成像系统的性能验证的用途。此外，本发明涉及用于生物医学成像应用的近红外荧光成像系统的验证，其中成像是有机和无机物质、细胞和亚细胞结构的显微成像，或者其中成像是组织和器官的断层成像。近红外成像系统可以是临床前或临床成像系统。
本发明的制剂可用于在生物医学成像程序，例如荧光内窥镜检查，荧光微创手术或腹腔镜检查，荧光机器人手术，开放式手术，激光引导手术，光动力疗法，荧光寿命成像或光声或声荧光方法之前验证近红外成像装置的性能。
在又一方面中，本发明涉及使用这种稳定制剂进行近红外荧光成像系统的荧光验证程序的方法。
附图说明
图1示出了表示染料浓度(nM，x轴)相对于荧光强度(平均辐射效率，y轴)的线性回归图，该荧光强度是用从实施例4(R2＝0.999)收集的数据获得。
发明详述
本发明的第一方面是包含式(I)的染料的制剂作为验证荧光成像装置性能的体模的用途，
其中
R7选自氢，氯，苯基和-O-苯基，其任选地被基团-SO3H,-COOH,-CONH-Y,-烷基-COOH或-烷基-CONH-Y取代，其中
Y是被-SO3H或至少两个羟基基团取代的二价烷基；
R1,R2,R3和R4各自独立地选自氢，-SO3H,-COOH和-CONHY，其中Y是被-SO3H或至少两个羟基基团取代的二价烷基，或
R1与R2一起且R3与R4一起分别形成任选地被至少一个-SO3H基团取代的苯并基团；和
R5和R6各自独立地为任选地被选自-SO3H,-COOH和-CONH2的基团取代的二价烷基；
所述式(I)的染料被溶解在Good’s缓冲剂中，所述制剂任选地包含至少一种添加剂。
可用于本发明的近红外染料通常在水性介质中具有包括在750nm与850nm之间的最大吸光度和包括在770nm与900nm之间的最大荧光发射。因此，所述染料的近红外光谱与大多数近红外成像系统相容。
此外，发现式(I)的染料在合适的Good’s缓冲剂中的溶解提供了制剂的期望的长保质期，从而使得能够集中生产、储存和远程运输到测试地点。本发明制剂的组分相对便宜，并且生产过程是可重复的并且适于大规模供应。可以应用标准分析程序来控制释放前制剂的质量。
在一个优选的实施方案中，所述近红外染料是以上式(I)的化合物，其中R2和R3是氢，即式(Ia)的化合物：
其中R1和R4各自独立地选自氢，-SO3H,-COOH和-CONHY，其中Y是被-SO3H或至少两个羟基基团取代的二价烷基，且R5，R6和R7如上文所定义。
更优选地，所述近红外染料是式(Ia)的化合物，其中R1和R4是基团-SO3H，R5和R6各自独立地为任选地被-SO3H或-COOH取代的二价烷基，且R7是氯或任选地被基团-SO3H取代的-O-苯基。
在另一个优选的实施方案中，所述近红外染料是选自以下的化合物：sulfo-Cy7(CAS Nr.:2104632-29-1),S0456(CAS Nr.:1252007-83-2),IRDye 800CW(CAS Nr.:1088919-86-1)和IRDye 800BK(CAS Nr.:748120-01-6)。
在另一个优选的实施方案中，所述近红外染料是以上式(I)的化合物，其中R1与R2一起且R3与R4一起分别形成苯并基团，即式(Ib)的化合物：
其中R5，R6和R7如上文所定义且R8各自独立地为氢或-SO3H。
优选的式(Ib)化合物例如由IR-820(CAS Nr.:172616-80-7)及其衍生物表示。
优选地，用于本发明制剂的缓冲剂高度溶于水，具有最小的盐效应，是化学稳定的，并且是光学透明的。为了方便地使用本发明的制剂作为用于验证荧光成像装置的性能的体模，需要缓冲剂不干扰染料的吸收和发射性质，从而产生与在蒸馏水中溶解的相同染料相当的UV-VIS区域中的电磁光谱。
在一个优选的实施方案中，合适的缓冲剂是包含被基团-SO3H或-COOH取代的二价C1-C4烷基的兼性离子生物缓冲剂。
更优选地，所述Good’s缓冲剂选自MOPS(3-(吗啉-4-基)丙-1-磺酸)，MES(2-吗啉-4-基乙磺酸)，TRICINE({[1,3-二羟基-2-(羟基甲基)丙-2-基]氨基}乙酸)，HEPES(2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸)，BES(2-[双(2-羟基乙基)氨基]乙磺酸)，TES(2-[[1,3-二羟基-2-(羟基甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸)，TAPSO(3-[[1,3-二羟基-2-(羟基甲基)丙-2-基]氨基]-2-羟基丙-1-磺酸)，PIPES(1,4-哌嗪二乙磺酸)等。最优选地，所述缓冲化合物选自MOPS,BES,HEPES和TRICINE。
在下表I中提供了优选的Good’s缓冲剂的化学结构和20℃下的pKa。
表I-优选的Good’s缓冲剂的化学结构和20℃下的pKa
以上定义的制剂已被证明当保持在2-8℃时稳定至少一个月，并且如果保持在25℃的工作台上则稳定至少2周。此外，它们可以容易地由可以储存在冰箱中的储备溶液制备。
式(I)的近红外染料可以容易地溶解在含有Good’s缓冲剂的水溶液中，其浓度与常见荧光检测系统的灵敏度相容。特别地，这样的浓度不大于1mg/mL。例如，在低灵敏度荧光检测系统的情况下，此类浓度包含在1-1000μg/mL溶液的范围内，并且在高灵敏度荧光检测系统的情况下，此类浓度包含在1-1000ng/mL溶液的范围内。此外，对于具有极高灵敏度的荧光检测系统，浓度范围可以是1-1000pg/mL溶液。
在本发明的优选实施方案中，将式(I)的近红外染料以1nM至100nM的浓度溶解在水性Good’s缓冲剂中。
Good’s缓冲剂的浓度在1mM至100mM的范围内，更优选在5mM至50mM之间。
在本发明的另一个实施方案中，将式(I)的近红外染料溶解在pH值为6至8、更优选6.5至7.5的Good’s缓冲溶液中。
在另一个实施方案中，本发明的制剂还包含至少一种添加剂。合适的添加剂包括有机溶剂、表面活性剂和抗微生物物质。合适的有机溶剂包括例如乙醇，甲醇，二甲亚砜，甲酰胺，二甲基甲酰胺，N-甲基甲酰胺。合适的表面活性剂包括例如聚山梨醇酯如吐温20和吐温80，不同尺寸分布的聚乙二醇(例如PEG 40，PEG 100，PEG 300，PEG 400)，硬脂酸钠，月桂基硫酸钠，Triton X-100和NP-40。合适的抗微生物物质包括例如叠氮化钠和苄醇。
在另一方面中，本发明提供了如上定义的制剂在容器封闭系统中作为储备溶液提供的用途。容器封闭系统适于容纳液体溶液而没有泄漏或蒸发的风险。例如，容器封闭系统选自瓶子，管，小瓶，器皿，储存袋等。
本发明的另一方面涉及验证试剂盒，其包含如上定义的稳定制剂，所述稳定制剂包含在适于荧光检测的初级包装中。该初级包装是适合于储存液体溶液的适当容器。例如，该初级包装可以是管，小瓶，安瓿，注射器，比色杯(cuvette)，具有合适盖子的多孔板。
在另一个实施方案中，上述验证试剂盒包含一组多个初级包装，例如多个小瓶或管，其中每个初级包装预填充有本发明制剂在如上定义的有机缓冲化合物的水溶液中的不同稀释液，从而允许同时在多个浓度下测试荧光装置。
优选地，所述验证试剂盒包括含有如上定义的制剂的一组四个初级包装(例如管)，其中所述近红外染料以选定的浓度存在，例如分别为0nM，2nM，8nM和32nM。任选地，可以通过使用对于每种稀释液具有不同颜色的颜色编码帽来识别这种初级包装并将其与不同浓度的荧光稀释液相关联。
在另一个实施方案中，所述初级包装包含在二次包装中，该二次包装适于随时间保持产品的质量，从而限制初级包装暴露于光。例如，所述二次包装选自纸板盒，铝袋，信封，套筒，罐，拉链储存袋。二次包装任选地还包含说明性传单。
在另一方面中，本发明提供了一种校准荧光成像装置的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将以上定义的验证试剂盒暴露于荧光系统的合适激发源下；
b)用合适的检测系统收集荧光发射；
c)用合适的计算机化系统记录荧光数据。
定义
在本说明书中，除非另有说明，否则本文所用的以下术语和短语旨在具有以下含义。
术语“烷基”是指脂族烃基，其可以是链中具有1至6个碳原子的直链或支链。例如，“C1-C4烷基”在其含义内包括包含1至4个碳原子的直链或支链。代表性和优选的烷基包括甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，戊基和己基。除非另有说明，直链或支链烷基是一价基团。在一些情况下，它可以是“二价”或“多价”基团，其中两个或更多个氢原子从上述烃基中除去并被取代，例如亚甲基，亚乙基，亚异丙基等。
本文所用的表述“Good’s缓冲剂”或“生物缓冲剂”或“缓冲剂”是指水溶性有机物质，其通过中和氢离子的作用在给定的最佳范围内(通常为6至8pH)保持恒定的pH。优选地，它们具有6至10的pKa值并且是兼性离子分子、氨基乙烷或氨基丙烷的衍生物，其任选地被磺酸和/或羧酸取代。合适的Good’s缓冲剂的实例可选自MES(2-吗啉-4-基乙磺酸)，Bis-Tris(2-[双(2-羟基乙基)氨基]-2-(羟基甲基)丙-1,3-二醇)，ADA(2,2’,2”-次氮基三乙酸)，PIPES(1,4-哌嗪二乙磺酸)，MOPSO(3-吗啉代-2-羟基丙磺酸)，Bis-Tris Propane(1,3-双[三(羟基甲基)甲基氨基]丙烷)，BES(2-[双(2-羟基乙基)氨基]乙磺酸)，MOPS(3-(吗啉-4-基)丙-1-磺酸)，TES(2-[[1,3-二羟基-2-(羟基甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸)，HEPES(2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸)，DIPSO(3-(N,N-双[2-羟基乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸)，MOBS(4-(N-吗啉代)丁磺酸)，TAPSO(3-[[1,3-二羟基-2-(羟基甲基)丙-2-基]氨基]-2-羟基丙-1-磺酸)，HEPPSO(N-(羟基乙基)哌嗪-N’-2-羟基丙磺酸)，POPSO(哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙磺酸))，EPPS(N-(2-羟基乙基)哌嗪-N’-(3-丙磺酸))，Tricine({[1,3-二羟基-2-(羟基甲基)丙-2-基]氨基}乙酸)，Gly-Gly(甘氨酰甘氨酸)，Bicine(N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸)，HEPBS(N-(2-羟基乙基)哌嗪-N’-(4-丁磺酸))，TAPS([(2-羟基-1,1-双(羟基甲基)乙基)氨基]-1-丙磺酸)，AMPD(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)，TABS(N-三(羟基甲基)甲基-4-氨基丁磺酸)，AMPSO(N-(1,1-二甲基-2-羟基乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)，CHES(2-(环己基氨基)乙磺酸)，CAPSO 3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸，CAPS(3-(环己基氨基)-1-丙磺酸)和CABS(4-(环己基氨基)-1-丁磺酸)缓冲剂，即通常称为Good’s缓冲剂的生物缓冲剂。
用于本发明的缓冲剂的特征在于在20℃下在水中的溶解度范围为约0.05M至约4M。优选地，它们在水中的溶解度为至少0.1M。
表述“缓冲溶液”是指包含所述生物缓冲剂的水溶液。
术语“兼性离子化合物”是指含有相等数量的带正电荷的官能团和带负电荷的官能团的分子。它通常代表具有酸(例如羧酸或-SO3H)和碱(例如胺)组分的偶极离子，例如氨基酸衍生物。
术语荧光检测系统的“低灵敏度”或“高灵敏度”是指系统的检测极限，其是可以与空白区分开的最低荧光信号。
实验部分
在以下部分中描述的本发明及其特定实施方案仅是示例性的，而不应被认为是对本发明的限制：它们示出了可如何实施本发明，并且旨在说明而不限制本发明的范围。
材料和设备
IRDye 800CW羧酸盐购自LI-COR Inc(Lincoln,Nebraska,USA；代码929-09406，商品号C80209-01)。S0456购自Few Chemicals gmbh(Bitterfeld-Wolfen，德国；代码420456，商品号5114017)。IRDye 800BK如EP1113822B1中所述合成。IRDye 800BK钠盐的纯度在776nm(最大吸光度)为99.6％。
HEPES,MOPS,MES,BES,TRICINE,叠氮化钠和吐温20购自SIGMA。其他试剂购自Merck KGaA并且至少为分析级。MilliQ水用于制备缓冲剂，其由MilliQ装置(MerckMillipore)提供。
使用New Brunswick Scientific Innova 4230培养箱振荡器(MarshallScientific LLC)进行稳定性研究。使用SPECORD 200 PLUS分光光度计(Analytik JenaGmbH)评估吸光度、激发和发射值。
用临床前荧光成像系统IVIS Spectrum(Perkin Elmer)，进行荧光成像测试。
缩写列表
BES 2-[双(2-羟基乙基)氨基]乙磺酸(CAS号:10191-18-1)
EtOH 乙醇
HEPES 2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(CAS号：7365-45-9)
MES 2-吗啉-4-基乙磺酸(CAS号：4432-31-9)
MOPS 3-(吗啉-4-基)丙-1-磺酸(CAS号：1132-61-2)
PIPES 1,4-哌嗪二乙磺酸(CAS号：5625-37-6)
PBS 磷酸盐缓冲盐水
TAPSO 3-[[1,3-二羟基-2-(羟基甲基)丙-2-基]氨基]-2-羟基丙-1-磺酸(CAS号：68399-81-5)
TES 2-[[1,3-二羟基-2-(羟基甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(CAS号：7365-44-8)
TRICINE {[1,3-二羟基-2-(羟基甲基)丙-2-基]氨基}乙酸(CAS号：5704-04-1)
20 聚乙二醇失水山梨醇单月桂酸酯
实施例1：有机缓冲溶液的制备
例如如在以下工序中，针对一些代表性缓冲化合物所报道的，制备适合于溶解式(I)的近红外染料的含有有机缓冲化合物的水溶液：
a)50mM HEPES(pH 7.4)：为了制备500mL 50mM缓冲溶液，将5.96g HEPES溶于450mL水中。通过加入0.1M HCl，将溶液的pH调节至7.4，然后用水使缓冲溶液达到500mL体积，在无菌条件下在0.22μm膜上过滤，并在+2-8℃下储存长达3个月。
b)50mM MOPS(pH 7.0)：将5.23g MOPS溶于450mL水中，并按照类似于实施例a)的工序，获得所需的pH和体积。
c)50mM TRICINE(pH 8.0)：将4.48g TRICINE溶于450mL水中，按照类似于实施例a)的工序，获得所需的pH和体积。
d)50mM MES(pH 6.2)：将4.88g MES溶解在450mL水中，并遵循类似于实施例a)的工序，获得所需的pH和体积。
e)50mM PBS(pH 7.4)：为了制备用于对比实验的100mL 50mM PBS溶液，将0.72gNa2HPO4，4g NaCl和0.1g KCl溶解在100mL水中。将溶液在无菌条件下在0.22μm膜上过滤，并在+2-8℃下储存长达3个月。
实施例2：储备溶液的制备(在50mM HEPES pH 7.4中溶解的IRDye 800CW)
通过将IRDye 800CW羧酸盐溶解在如实施例1a)中所述制备的pH 7.4的50mMHEPES缓冲溶液中，制备IRDye 800CW的储备溶液。例如，将20nmol的IRDye 800CW溶解在3mL的50MM HEPES溶液中。
使用朗伯-比尔(Lambert-Beer)等式，在774nm下通过UV/VIS，测定储备溶液的精确浓度：
A＝εc l
其中A是测量的吸光度，c是摩尔浓度，l是光学路径长度，且ε是染料的摩尔消光系数(即，对于IRDye 800CW，ε是240,000M-1cm-1)。
在如上所述制备并用HEPES缓冲剂1:2稀释的储备溶液中IRDye 800CW羧酸盐的浓度的测量显示浓度为4.27±0.05μM(三次测量的平均值)。
实施例3：验证试剂盒(工作溶液)的制备
由如实施例2中所述制备的储备溶液，通过在容量瓶中用HEPES缓冲剂分别稀释225μL、56.2μL和14μL储备溶液至30mL最终体积，进行HEPES缓冲剂中的三种不同稀释以获得浓度为32nM、8nM和2nM的70mL工作溶液。
对于每种IRDye 800CW工作溶液(32，8，2nM)，用1.6mL体积的工作溶液填充30个透明塑料小瓶，并用颜色编码的螺帽封盖(绿色用于32nm，橙色用于8nm，黄色用于2nm)。此外，使用相同的工序，用HEPES缓冲剂填充30个编码为“空白”(0nM)的小瓶，并用透明螺帽盖住。
将每个上述试剂盒(32，8，2，0nM小瓶)置于单独的铝箔封套中并标记。将试剂盒储存在+2-8℃下。
实施例4：荧光成像验证测试
将如实施例3所述制备的验证试剂盒从冰箱中取出，并使其在室温下平衡30-60min，所述验证试剂盒由3个含有工作溶液(即32nM，8nM，2nM)的小瓶和一个含有HEPES缓冲剂(0nM，空白)的小瓶组成，所述试剂盒储存在+2-8℃的铝箔封套中，然后将所述小瓶从封套中取出并置于临床前成像系统IVIS Spectrum的采集室内。使用预定义的采集设置，以745±15nm的激发和800±10nm的检测进行荧光成像。在成像期结束时，获得体模试剂盒的荧光图像。
通过在试剂盒的4个小瓶中的每一个上放置感兴趣的区域来计算信号强度。将荧光强度值相对于浓度作图以评估线性。图1中示出了用实施例3中描述的验证试剂盒获得的染料浓度对荧光强度的这种线性图的实例。验证试剂盒显示在选定浓度范围(2-32nM)内测试成像系统的高检测线性。
实施例5：在+2-8℃下体模溶液的稳定性
进行几项稳定性研究，以评价不同缓冲剂、添加剂例如赋形剂或防腐剂和贮存条件对染料制剂的影响。特别地，首先研究了在冰箱中在+2-8℃下储存后制剂的稳定性。
稳定性测量为使用UV/VIS分光光度计获得的染料的最大波长处的吸光度的降低，从而表示溶液中染料单体含量的降低。然后将所有结果报告为相对于基线(T＝0)的残余百分比，其中在时间＝0时，该百分比为100％。吸光度的降低与制剂缓冲剂中染料浓度的降低有关，从而表明主要发色团物种的低稳定性和降解。
在下表中，报告了在+2-8℃下储存制剂后，不同染料(即IRDye 800CW和S0456)在一些代表性有机缓冲溶液中的残余吸光度。特别地，将染料IRDye 800CW和S0456以3μM的浓度溶解在50mM缓冲剂MES，HEPES，MOPS或TRICINE中，并将溶液冷冻4周以验证其稳定性。
残余吸光度的结果分别示于表II和III中。
表II还显示了对比实验的结果，其中IRDye 800CW以3μM的浓度溶解在无机缓冲剂PBS 50mM(磷酸盐缓冲盐水)中。在这种情况下，染料缓冲剂制剂不太稳定，并且在+2-8℃下4周后，由于发色团物种的降解，残余吸光度低于80％。
表II-染料IRDye 800CW(3μm)在不同有机缓冲剂中和在PBS中的残余吸光度百分比
表III-染料S0456(3μm)在不同有机缓冲剂中的残余吸光度百分比
检查4周(约1个月)上述溶液的稳定性显示约95％或更高的残余吸光度。
此外，将不同浓度(10和50mM)和不同pH条件的IRDye 800BK染料在MOPS和BES缓冲剂中的3μM溶液在+2-8℃下冷藏，以检查其稳定性。
残余吸光度百分比结果分别示于表IV和V中。这些数据表明，缓冲化合物的浓度和pH的轻微变化不影响体模制剂的稳定性。
表IV-在不同pH和不同缓冲剂浓度下，在MOPS缓冲剂中染料IRDye 800BK(3μM)的残余吸光度百分比
表V-在不同pH和不同缓冲剂浓度下，在BES缓冲剂中染料IRDye 800BK(3μM)的残余吸光度百分比
检查4周(约1个月)上述溶液的稳定性显示约90％的残余吸光度。
实施例6：在添加剂存在下，在+2-8℃下体模溶液的稳定性还研究了添加剂存在对本发明制剂稳定性的影响。
通过在+2-8℃下，在冰箱中储存本发明的一些代表性制剂来进行进一步的稳定性研究，所述代表性制剂包含在50mM HEPES或TRICINE缓冲剂(具有0.04％吐温20或0.02％叠氮化钠)中溶解的3μM IRDye 800CW和包含在10mM HEPES、MOPS或BES缓冲剂(具有10％EtOH)中溶解的3μM IRDye 800BK的制剂。上述缓冲剂的制备如下所述：
50mM HEPES(pH 7.4)+0.04％吐温20：为了制备100mL缓冲溶液，将1.19g HEPES溶解于80mL水中；加入40μL吐温20，并用0.1MHCl将pH调节至7.4。然后用水使缓冲溶液达到100mL体积，并在无菌条件下在0.22μm膜上过滤。
50mM HEPES(pH 7.4)+0.02％叠氮化钠：为了制备100mL缓冲溶液，将1.19g HEPES和20mg叠氮化钠溶于80mL水中，并用0.1M HCl调节至7.4。然后用水使缓冲溶液达到100mL体积，并在无菌条件下，在0.22μm膜上过滤。
10mM HEPES(pH 7.0)+10％EtOH：为了制备100mL缓冲溶液，将0.24g HEPES溶于80mL水中，并用0.1M HCl将pH调节至7.0，然后加入10mL 100％乙醇，然后用水使缓冲溶液体积达到100mL并在无菌条件下，在0.22μm膜上过滤。
对于MOPS、BES和TRICINE缓冲剂，用相同的工序制备类似的溶液。
表VI和VII中以残余吸光度百分比表示的稳定性研究结果表明，添加剂的存在对本发明制剂的稳定性没有显著影响。
表VI-在添加剂吐温20或叠氮化钠存在下，在不同生物缓冲剂中染料IRDye 800CW(3μM)的残余吸光度百分比
表VII-在10％EtOH存在下，在不同生物缓冲剂中染料IRDye 800BK(3μM)的残余吸光度百分比
实施例7：体模溶液在25℃下的稳定性
还研究了制剂在应激条件下的稳定性。特别地，将在HEPES或MOPS缓冲剂(全部50mM)中溶解的3μM IRDye 800CW的样品在25℃下在黑暗条件下在培养箱中储存2周。
实验结果显示在下表VIII中，其中对于本发明的代表性实施方案显示，本发明的制剂也可以在25℃下(例如在工作台上)储存至少两周而没有显著降解。
表VIII-在25℃下储存后，在不同有机缓冲剂中染料IRDye800CW(3μM)的残余吸光度百分比
| 时间(周) | HEPES | MOPS |
| 1 | 100.9％ | 99.7％ |
| 2 | 98.4％ | 97.3％ |
实施例8：在长期储存期间，在+2-8℃下的体模模溶液的稳定性
还研究了制剂在长期储存条件下的稳定性。特别地，将在HEPES缓冲剂中溶解的3μM IRDye 800CW和3μM IRDye 800BK的样品在+2-8℃下冷藏储存，防止光照暴露至少6个月。对于在2-8℃下的长期稳定性研究，的样品。
实验结果显示在下表IX中，其中对于本发明的一些代表性实施方案，显示本发明的制剂也可以在2-8℃下储存至少六个月而没有显著的降解。
表IX-在+2-8℃下储存长达6个月后，染料IRDye 800CW(3μM)和IRDye 800BK在HEPES缓冲剂中的残余吸光度百分比
参考文献：
1.US 9,167,240
2.Gorpas et al.,J.Biomed.Opt.2017,22(1):016009
3.US2006-056580
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7.Ter Weele et al.,Eur.J.Pharm.Biopharm.2016,104:226-34
8.EP1113822
Claims (15)
1.包含式(I)的染料的制剂作为用于验证荧光成像装置性能的体模的用途：
其中
R7选自氢，氯，苯基和-O-苯基，其任选地被基团-SO3H,-COOH,-CONH-Y,-烷基-COOH或-烷基-CONH-Y取代，其中
Y是被-SO3H或至少两个羟基基团取代的二价烷基；
R1，R2，R3和R4各自独立地选自氢，-SO3H,-COOH和-CONHY，其中Y是被-SO3H或至少两个羟基基团取代的二价烷基，或
R1与R2一起且R3与R4一起分别形成任选地被至少一个-SO3H基团取代的苯并基团；和
R5和R6各自独立地为任选地被选自-SO3H，-COOH和-CONH2的基团取代的二价烷基；
所述式(I)的染料被溶解在Good’s缓冲剂中，所述制剂任选地包含至少一种添加剂。
2.根据权利要求1所述的制剂的用途，其中所述染料是式(Ia)的化合物：
其中R1和R4各自独立地选自氢，-SO3H,-COOH和-CONHY，其中Y是被-SO3H或至少两个羟基基团取代的二价烷基，且R5，R6和R7如在权利要求1中所定义。
3.根据权利要求2所述的制剂的用途，其中R1和R4是-SO3H，R5和R6各自独立地为任选地被-SO3H或-COOH取代的二价烷基，且R7是氯或任选地被基团-SO3H取代的-O-苯基。
4.根据权利要求3所述的制剂的用途，其中所述染料是选自sulfo-Cy7，S0456，IRDye800CW和IRDye 800BK的化合物。
5.根据权利要求1所述的制剂的用途，其中所述染料是式(Ib)的化合物：
其中R5，R6和R7如在权利要求1中所定义，且R8各自独立地为氢或-SO3H。
6.根据权利要求5所述的制剂的用途，其中所述染料是IR-820或其衍生物。
7.根据权利要求1所述的制剂的用途，其中所述Good’s缓冲剂是包含被基团-SO3H和/或-COOH取代的二价C1-C4烷基的兼性离子生物缓冲剂。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述Good’s缓冲剂选自MOPS,MES,TRICINE,HEPES,BES,TES,TAPSO和PIPES。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述Good’s缓冲剂是MOPS,BES,HEPES或TRICINE。
10.根据权利要求1所述的制剂的用途，其中任选的添加剂选自表面活性剂，有机溶剂和抗微生物化合物。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述表面活性剂选自吐温20，吐温80，PEG 40,PEG 100,PEG 300,PEG 400,PEG 4000,硬脂酸钠，月桂基硫酸钠，Triton X-100和NP-40。
12.根据权利要求10所述的用途，其中所述有机溶剂选自乙醇，甲醇，二甲亚砜，甲酰胺，二甲基甲酰胺和N-甲基甲酰胺。
13.根据权利要求10所述的用途，其中所述抗微生物化合物选自叠氮化钠和苄醇。
14.用于校准荧光成像装置的验证试剂盒，所述验证试剂盒包含如权利要求1中所定义的制剂，所述制剂包含在用于荧光检测的初级包装中，所述初级包装选自管，小瓶，安瓿，注射器，比色杯，具有合适盖子的多孔板。
15.校准荧光成像装置的方法，包括以下步骤：
a)将权利要求14至16中任一项所定义的验证试剂盒暴露于荧光系统的合适的激发源下；
b)用合适的检测系统收集荧光发射；
c)用合适的计算机化系统记录荧光数据。
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