CN117405875A - 用于流式分析的InP量子点编码多色荧光磁性微球 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种制备适用于流式分析的荧光磁性微球的方法以及由此得到的InP量子点编码的多色荧光磁性微球。本发明的荧光磁性微球由内至外可以依次包括聚苯乙烯微球、磁性材料层、InP量子点层、任选的聚合物层和任选的羧基聚合物层。本发明方法制备得到的荧光磁性微球具有高的稳定性，同时实现了流式分析的荧光通道和散射光通道的编码，并且具有更精确分群的荧光编码信号。荧光磁性微球的表面功能化提供了生物分子靶标的连接位点，有助于实现流式高通量细胞分选、药物筛选等用途。

Description

用于流式分析的InP量子点编码多色荧光磁性微球
技术领域
本发明涉及生物检测领域，更具体地涉及一种制备适用于流式分析的磷化铟(InP)量子点编码多色的荧光磁性微球、其制备方法和相关应用。
背景技术
以下描述和示例不应由于包含在本节中而被视为现有技术。
荧光编码磁性微球是一种由微米尺寸的聚合物球体、磁性物质和荧光物质组成且具有磁性和荧光双重性质的微球。目前，荧光编码磁性微球广泛用于各种应用，如肿瘤可视化操作、药物可视化靶向系统、生物标志物分离检测、药物高通量筛选系统等。在肿瘤可视化手术操作中，可以通过磁性引导和荧光成像在体内定位和追踪肿瘤位置，此技术可以提高手术的准确性和精确性，并降低手术时间和副作用。在药物可视化靶向系统中，由于其具有高磁性和较好的荧光性能，可以在体内定位和追踪药物分布情况，并将药物准确释放至靶向组织，因此可提高药物疗效，减少药物副作用和毒性，并为药物研究提供可视化的手段。在细胞、核苷酸和蛋白质分离中，通过在其表面修饰特定的亲和分子，可与目标细胞、核苷酸或蛋白质特异结合，并利用磁性分离技术将其从混合物中分离出来。此外，在生物分子的临床分析中，将其表面功能化后可与特定生物分子高度特异结合，并通过荧光成像和磁性分离技术实现对生物分子的检测和定量，此技术具有高灵敏度、高选择性和快速分析的特点，可用于生物标志物的筛查和临床诊断，提高临床分析的准确性和效率。
目前，流式系统中所用的荧光编码微球主要以有机染料作为荧光信号编码，将匹配激发光源和发射接收信号窗口的有机染料以一定比例吸附在微球表面或渗入微球内部，从而对微球进行荧光编码。然而有机染料存在诸多缺点，例如激发与发射波段宽、易串色，发射波段在不同浓度或不同溶液体系下存在偏移，荧光效率低、易淬灭、光漂白等，因此需要操作人员进行特定的光补偿矩阵调节，对操作人员要求较高。量子点作为一种无机荧光纳米材料，其激发波段在紫外区间与发射波段不重叠，发射波段窄(20～30nm)且与浓度无关，荧光效率高，荧光强度稳定，仅与微球所负载的量子点数量有关。因此使用量子点进行荧光编码微球的构建单元在编码稳定性方面具有独特的优势。然而，在已报道的量子点编码技术中，多数编码微球无法匹配流式系统中的荧光信号接收窗口，且这些量子点编码技术都存在不同程度的量子点泄露而影响荧光强度，这阻碍了这类编码微球在流式技术中的应用。
因此，本领域需要一种具有高的编码稳定性和精确性并且能够严格匹配流式系统的荧光编码微球。
发明内容
本发明人通过筛选合适的磷化铟(InP)量子点，优化荧光磁性微球的制备方法，得到了一种能够严格匹配流式系统中的荧光激发光源与发射信号接收窗口，并且能够在流式系统的散射光通道编码的荧光磁性微球，由此，实现了本发明。
在第一方面，本发明提供了一种用于流式分析的荧光磁性微球，所述荧光磁性微球粒度为4μm至6μm，并且所述荧光磁性微球从内到外依次包括核微球、磁性材料层、磷化铟(InP)量子点层、任选的聚合物层以及任选的羧基聚合物层，所述磷化铟(InP)量子点层包含一个或多个荧光发射波段的磷化铟(InP)量子点，且所述磷化铟(InP)量子点静电吸附于所述核微球和/或所述磁性材料层。
在第二方面，本发明提供了根据第一方面所述的荧光磁性微球在流式分析中的用途。
综上，本发明提供了一种用于流式分析的InP量子点编码的单色或多色荧光磁性微球。在本发明的荧光磁性微球中，量子点与磁性材料聚合物层之间通过静电吸附结合，而无需额外的表面功能化，用另外的聚合物层包覆量子点，能够有效地抑制量子点泄露，使得微球具有更高的稳定性。本发明方法的荧光磁性微球不仅具有能够严格匹配流式系统中的激发光源与发射信号接收窗口的荧光激发与发射波段，而且具有更适合流式细胞仪的上样通道的微球尺寸，使得能够得到更精确分群的荧光编码信号。此外，本发明的荧光磁性微球的表面功能化提供了生物分子靶标连接位点，由此具备广泛用于高通量流式检测如细胞分选、药物筛选等应用的可行性，同时还实现了在流式分析的散射光通道的编码。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示出了具有不同光致发光性能的量子点的PL图谱。
图2示出了不同表面修饰量子点的zeta表面电位。
图3为溶胀微球的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图4为磁性微球振动样品磁强计(VSM)图谱。
图5为磁性微球与荧光磁性微球磁吸附时间序列图。
图6使用不同表面修饰量子点编码的双色荧光微球的光致发光(PL)图谱。
图7为荧光磁性微球的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图8为羧基化荧光磁性微球在流式检测时散射通道FSC-H与SSC-H信号图。
图9示出了InP量子点编码双色荧光微球的流式荧光通道FL2-H与FL3-H信号图，S1、S2和S3分别对应图8中的初选分群。
图10示出了小尺寸荧光微球与大尺寸荧光微球的PL图谱对比。
图11示出了小尺寸荧光微球与大尺寸荧光微球的流式荧光通道FL2-H与FL3-H信号图对比。
具体实施方式
在下文中，将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，而无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前，提供以下定义以更好地理解本发明。
在提供数值范围的情况中，例如浓度范围、百分比范围或比率范围，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且此类实施方案也包括在所述主题内，受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中，排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。
在本发明的上下文中，很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由……组成”通常情况下可以理解为开放式表述，表示不仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤等外，还包括其他的元素、组分、组件、方法步骤。另外，在本文中，表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述，表示仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤，而不包括任何其他的元素、组分、组件、方法步骤。此时，该表述等同于表述“由……组成”。
为了更好地理解本教导并且不限制本教导的范围，除非另外指出，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此，除非相反地指出，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。
在本发明的第一方面，提供了一种用于流式分析的荧光磁性微球，所述荧光磁性微球粒度为4μm至6μm，并且所述荧光磁性微球从内到外依次包括核微球、磁性材料层、磷化铟(InP)量子点层、任选的聚合物层以及任选的羧基聚合物层，所述磷化铟(InP)量子点层包含一个或多个荧光发射波段的磷化铟(InP)量子点，且所述磷化铟(InP)量子点静电吸附于所述核微球和/或所述磁性材料层。
核微球
在一个具体的实施方案中，所述核微球是聚苯乙烯微球。
在一个优选的实施方案中，所述核微球是粒度为2μm至4μm的聚苯乙烯微球。
在一个更优选的实施方案中，所述核微球是粒度为3.2μm的聚苯乙烯微球。
微米级聚苯乙烯微球的制备可以采用本领域技术人员熟知的方法，例如，首先使用苯乙烯为原料，以分散聚合法制备聚苯乙烯种子微球。然后，使用苯乙烯、二乙烯基苯(DVB)、过氧化苯甲酰为原料以一定的比例，例如10：9：1，以溶胀聚合法制备微米级溶胀微球。分散聚合法和溶胀聚合法均是本领域熟知的聚合方法，本领域技术人员能够根据实际需要的聚苯乙烯对聚合条件进行设置。
本发明人发现，由微米尺寸的核微球制备得到的微米尺寸的荧光磁性微球，尤其是数个微米的荧光磁性微球，与流式细胞仪中的上样通道的尺寸更为匹配，当与待测物如细胞、生物分子、药物分子等结合后，带有荧光标记的待测物能够以单个而非聚集的形式通过激光，由此得到更精确分群的荧光编码信号。尤其是，微米尺寸的荧光磁性微球与细胞尺寸相近，更有利于一个微球结合一个细胞，由此得到的检测信号为单个微球的信号。当微球过小时，则可能发生几个、甚至数十个微球结合一个细胞，由此得到的检测信号为几个或数十个微球的叠加信号，差异较大。
磁性微球
在微米级聚苯乙烯核微球的表面进行磁性材料层的构建，得到磁性微球。
在一个具体的实施方案中，所述磁性材料层包括粒度为10nm至200nm的超顺磁磁性纳米颗粒或超顺磁磁性纳米颗粒的聚集体。
在一个具体的实施方案中，所述超顺磁磁性纳米颗粒可以是铁磁性材料，例如四氧化三铁、氧化铁及锰锌铁氧体磁性材料。
在一个优选的实施方案中，所述磁性材料为油酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒。
在本发明的上下文中，制备铁磁性材料层可以采用本领域熟知的方法。作为示例，首先，可以使用油酸铁、油酸为原料以一定的比例，例如6：1，用溶剂热法制备四氧化三铁纳米颗粒磁性材料。然后，使用聚苯乙烯微球、四氧化三铁纳米颗粒、苯乙烯、二乙烯基苯、过氧化苯甲酰为原料以一定的比例，例如50：5：10：2，在微球表面构建磁性材料层。
根据实际需要，可以配置磁性材料的用量或者说磁性材料层的厚度，以得到呈现不同磁性的编码微球群。
在一个具体的实施方案中，所述磁性材料层的厚度为10nm至1μm。
在一个优选的实施方案中，所述磁性材料层的厚度为0.1μm至0.3μm。
量子点
在一个具体的实施方案中，所述磷化铟(InP)量子点是InP@ZnSe@ZnSeS@ZnS量子点。
本领域技术人员会知道，InP@ZnSe@ZnSeS@ZnS是一种核壳型量子点，其中核壳型量子点的核InP是发出荧光光谱的成分，在本发明的上下文中也被称为“核心量子点”。
在一个具体的实施方案中，所述磷化铟(InP)量子点的荧光发射波段基于在制备磷化铟(InP)核心量子点中使用的In、Zn和P的摩尔比例来调整。
在一个优选的实施方案中，In、Zn和P的摩尔比例为0.75：5：5-10：5：10。
本发明的磷化铟(InP)量子点的方法可以采用本领域技术人员熟知的方法。作为示例，根据下表中列出的摩尔比例配制对应于荧光峰位的In前驱体InCl3、P前驱体如(DMA)3P以及Zn前驱体如ZnCl2，采用热注射法制备InP核心量子点。
作为示例，首先将Zn前驱体如硬脂酸锌(Zn(St)2)和Se前驱体如Se/三正辛基膦(Se/TOP)以合适的摩尔比例如10：1(由此得到的ZnSe壳层中的Zn和Se的比例约为1：1)投入，以生长ZnSe壳层；随后，Zn前驱体如Zn(St)2、Se前驱体如Se/TOP和S前驱体如S/TOP为原料以合适的摩尔比例如31：1：2.3(由此得到的ZnSeS壳层中的Zn、Se和S的比例约为2：1：1)投入，以生长ZnSeS壳层；最后，Zn前驱体如Zn(St)2和S前驱体如S/TOP为原料以合适的摩尔比例如1.58：4(由此得到的ZnS壳层中的Zn和S的比例约为1：1)投入，以生长ZnS壳层，最终形成多壳层InP@ZnSe@ZnSeS@ZnS量子点。
在又一个具体的实施方案中，In前驱体可以包括但不局限于乙酸铟(In(Ac)3)、氯化铟(InCl3)、硫化铟(In2S3)中的一种。
在又一个具体的实施方案中，P前驱体可以包括但不局限于三(三甲基硅基)膦((TMS)3P)、三(二甲胺基)膦((DMA)3P)、三(二乙胺基)膦((DEA)3P)、三(三甲硅烷基)膦((SiMe)3P)中的一种。
在又一个具体的实施方案中，Zn前驱体可以包括但不局限于氯化锌(ZnCl2)、二苯基锌(Zn(Ph)2)、硬脂酸锌(Zn(St)2)中的一种。
在又一个具体的实施方案中，Se前驱体可以包括但不局限于三正辛基膦硒化物(TOPSe)、Se单质中的一种。
在又一个具体的实施方案中，S前驱体包括可以但不局限于三丁基硫膦(TBPS)、二叔丁基二硫(TBDS)、S单质中的一种。
在一个优选的实施方案中，所述磷化铟(InP)量子点的粒度为5nm至20nm。
在又一个优选的实施方案中，所述磷化铟(InP)量子点是通过表面修饰剂修饰从而使zeta电位发生改变的磷化铟(InP)量子点。
在一个进一步优选的实施方案中，所述磷化铟(InP)量子点是具有正电位的磷化铟(InP)量子点。
在又一个优选的实施方案中，所述表面修饰剂是选自油胺(OAm)、二苯基锌(Zn(Ph)2)、正十二烷基硫醇(DDT)和1,16-十六烷基二硫醇(HDD)中的一种或者多种，但不限于此。
在进一步优选的实施方案中，所述表面修饰剂是油胺。
量子点层
使用一个或多个发射波段的InP量子点包覆磁性微球，从而构建荧光编码磁性微球。如前所述，所述磷化铟(InP)量子点通过静电吸附与所述磁性材料层结合。而静电吸附作用是通过磷化铟(InP)量子点经表面修饰后的zeta电位来实现的。
在一个优选的实施方案中，所述磷化铟(InP)量子点层包含两个、三个或者更多个荧光发射波段的磷化铟(InP)量子点。
量子点层所包含的多个荧光发射波段的磷化铟(InP)量子点的浓度比例可以根据以下步骤进行确认：预期荧光编码信号的波长和相对强度，将其转换为InP量子点的发射波长和摩尔浓度，然后根据发射波长确定使用的InP量子点种类(这里，“种类”是指因具有不同比例或量的In、Zn和P而具有不同荧光发射波段的InP量子点)，根据摩尔浓度确定具有不同荧光发射波段的InP量子点的浓度比例。
包括上述InP量子点层的荧光磁性微球可以通过流式细胞仪实现对荧光信号的检测和分群区分。包括上述InP量子点层的荧光磁性微球的荧光发射峰覆盖流式荧光通道信号接收窗口包括：Ex 488nm-Em530/30nm、Ex 488nm-Em 575/25nm、Ex 488nm-Em 620/30nm、Ex488nm-Em 690/50nm、Ex 488nm-Em 780/60nm。其中，PL峰位在680nm的InP核心量子点的发射波长范围可适配Em 780/60nm(即750nm至810nm)通道，且由于该区间自发光干扰小，检测仍具有较高灵敏度。
任选的聚合物层
为了进一步防止的量子点泄露而影响荧光强度，优选地在量子点层外包覆聚合物层。该聚合物层可以采用核微球具有相同的材料，例如聚苯乙烯。在量子点层外包覆聚苯乙烯聚合物层可以采用本领域熟知的方法。作为示例，可以使用磁性微球(外层具有InP量子点层)、苯乙烯、二乙烯基苯、过氧化苯甲酰为原料以一定的比例，例如50：10：2，在磁性微球表面进行原位聚合，以构建聚合物层。
在一个具体的实施方案中，所述聚合物层的厚度为10nm至1μm。
在一个优选的实施方案中，所述聚合物层的厚度为0.1μm至0.3μm。
荧光磁性微球的表面功能化
对本发明的荧光磁性微球的表面功能化，得到表面功能化的聚合物层。
在一个具体的实施方案中，对荧光磁性微球的表面功能化是羧基化，得到羧基聚合物层。经羧基化的荧光磁性微球的表面存在羧基位点，因此可以采用相应的物理吸附和/或化学反应共价连接探针分子、抗体或其他生物材料，由此实现细胞分选、药物筛选等相关应用。
在又一个具体的实施方案中，所述羧基聚合物层是由选自丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸乙二醇酯和甲基丙烯酸己二醇酯中的一种或多种羧基聚合物聚合得到的。
制备羧基聚合物层的方法是本领域熟知的，作为示例，可以使用荧光磁性微球、苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、过氧化苯甲酰为原料以一定的质量比，例如40：10：n：1(n＝1或2或3)，在荧光磁性微球表面进行羧基聚合物层的构建。
本发明人发现，经羧基化的荧光磁性微球不仅提供了连接的生物分子位点，同时还实现了在流式分析的散射光通道的编码。由此，本发明的羧基化荧光磁性微球通过流式细胞仪能实现对散射光信号的检测和分群区分。
在一个具体的实施方案中，所述羧基聚合物层配置成呈现不同流式散射光通道信号的编码微球群。
在一个更具体的实施方案中，通过在羧基聚合物层的制备中调整苯乙烯和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比例来调整羧基聚合物的聚合度以实现不同流式散射光通道信号。
在一个优选的实施方案中，苯乙烯和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比例为7:1-7:5。
在一个具体的实施方案中，所述羧基聚合物层的厚度为10nm至1μm。在一个优选的实施方案中，所述羧基聚合物层的厚度为0.1μm至0.3μm。控制羧基聚合物层厚度的方法可以是本领域技术人员熟知的，例如通过投入的原料量和聚合时间来控制。
荧光磁性微球
在一个具体的实施方案中，所述荧光磁性微球的粒度为4μm至6μm。在一个优选的实施方案中，所述荧光磁性微球的粒度为4.5μm至5μm。如前所述，将荧光磁性微球的尺寸控制在微米级，尤其是几个微米级，一方面能够更匹配流式细胞仪的上样通道的尺寸，避免待测细胞的聚集，另一方面也避免了由于微球过小而引起的几个甚至数十个微球结合一个细胞，由此能够得到更精确的荧光编码信号。
又一个具体的实施方案中，所述荧光磁性微球包含磁性信号编码、荧光信号编码、散射光信号编码中的二级或多级编码。
在本发明的第二方面，提供了由第一方面所述的荧光磁性微球在流式分析中的用途。
如前所述，本发明的荧光磁性微球不仅具有能够严格匹配流式系统中的激发光源与发射信号接收窗口的荧光激发与发射波段，而且具有更适合流式细胞仪的上样通道的微球尺寸，使得能够得到更精确分群的荧光编码信号。此外，本发明的荧光磁性微球的表面功能化提供了生物分子靶标连接位点，由此具备广泛用于高通量流式检测如细胞分选、药物筛选等应用的可行性，同时还实现了在流式分析的散射光通道的编码。
实施例
在下述实施例中，示出了本发明的荧光磁性微球的制备方法与相关性质的表征。如无特殊说明，其中采用的试验方法均为常规方法，并且如无特殊说明，下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
应注意，本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。
实施例1：InP量子点的制备与表征
(1)Se/TOP前驱体溶液：称取12mg Se粉，加入1mL TOP，超声分散后加热至80℃，待溶液变为澄清透明无色后待用。
(2)Se、S/TOP前驱体溶液：称取4mg Se粉、64mg S粉，加入1.5mL TOP，超声分散后缓慢加热至200℃，待溶液变为澄清透明无色后待用。
(3)S/TOP前驱体溶液：称取128mg S粉，加入2mL TOP，超声分散后缓慢加热至200℃，待溶液变为澄清透明无色后待用。
(4)Zn(St)2/ODE前驱体溶液：称取3g Zn(St)2粉末，加入12mL ODE，超声分散后缓慢加热至220℃，待溶液变为澄清透明无色后待用。
(5)称取0.078g InCl3、0.3g ZnCl2和6mL油酸(OA)加入50mL四颈烧瓶中，在真空状态和搅拌状态下缓慢加热至150℃，在达到150℃后，反复进行通氮气和抽真空操作循环三次，以去除溶解在OA中的微量H2O和空气。保持氮气氛围并继续缓慢加热至240℃。量取0.45mL三(三甲基硅基)膦((DMA)3P)快速注入反应液，维持240℃温度20min后，获得InP核心(PL为550nm)。此外，根据下表1中给出的InCl3和(DMA)3P的量重复该步骤，分别得到具有不同发光峰位(PL分别为530nm、550nm、575nm、600nm、620nm、650nm、665nm和680nm)的InP核心。
表1：具有不同发射峰位的InP核心量子点
(6)量取1mL步骤(1)的Se/TOP前驱体溶液注入上述InP核心反应液中，维持240℃温度20min。量取4mL步骤(4)的Zn(St)2/ODE前驱体溶液注入上述InP核心反应液中，升高温度至260℃，并维持30min，完成第一壳层的包覆，形成InP@ZnSe量子点。
(7)量取1.5mL步骤(2)的Se、S/TOP前驱体溶液注入反应液，升高温度至280℃，并维持30min。量取4mL步骤(4)的Zn(St)2/ODE前驱体溶液注入反应液中，升高温度至305℃，并维持30min。实现第二层壳层的生长包覆，形成InP@ZnSe@ZnSeS量子点。
(8)称取2mL步骤(3)的S/TOP前驱体溶液注入反应液中，升高温度至320℃，并维持30min。量取4mL步骤(4)的Zn(St)2/ODE前驱体溶液注入反应液，升高温度至330℃，并维持60min。实现第三层壳层的生长包覆，形成InP@ZnSe@ZnSeS@ZnS量子点。
(9)降温至60℃后，量取20mL正己烷加入反应液中。将所得溶液以10000rpm离心5min，留取上清液。加入与上清液等体积的无水乙醇，以10000rpm离心5min后留取沉淀产物。所得产物溶于三氯甲烷中并定量为0.01g/mL。在充满氮气的密封容器中储存待后续使用。
(10)使用荧光分光光度计对所制备的具有不同发射峰位、不同壳层包覆的量子点进行光致发光性能的检测，如图1所示，PL发射峰位分别为530nm、550nm、575nm、600nm、620nm、650nm、665nm和680nm，经壳层包覆后PL强度得到增强，有利于提高后续检测应用中的灵敏度。
实施例2：量子点的表面修饰
取实施例1中制备的InP@ZnSe@ZnSeS@ZnS量子点，加入等体积的表面修饰配体溶液，分别为：二苯基锌(Zn(Ph)2)、油胺(OAm)、正十二烷基硫醇(DDT)和1,16-十六烷基二硫醇(HDD)。升温至60℃，冷凝回流180min。降温至室温后，加入等体积的无水乙醇，以10000rpm离心5min后留取沉淀产物，并将产物溶于三氯甲烷中在充满氮气的密封容器中储存待后续使用。表面配体修饰前的量子点记为InP-OA，修饰后的量子点分别记为InP-Ph(经二苯基锌(Zn(Ph)2)进行表面修饰)、InP-OAm(经油胺(OAm)进行表面修饰)、InP-DDT(经正十二烷基硫醇(DDT)进行表面修饰)、InP-HDD(经1,16-十六烷基二硫醇(HDD)进行表面修饰)，未经量子点吸附的微球记为PS。使用动态光散射分析仪对不同表面修饰的量子点进行表面zeta电位测量，如图2所示，量子点经不同表面修饰后表面电位改变。发明人发现，由于PS表面电位为负电位，因此更容易吸附正电位的量子点InP-OAm、InP-DDT和InP-Ph，尤其是InP-OAm，而不容易吸附负电位的量子点InP-OA和InP-HDD。
实施例3：聚苯乙烯微球的制备与表征
下面以聚苯乙烯微球的制备为例，对本发明的实施作示例性说明。
(1)称取0.75g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入40mL乙醇中，超声溶解后，氮气鼓泡10min。
(2)称取7.5g苯乙烯(St)、0.1g偶氮二异丁腈(AIBN)，超声溶解后加入，300rpm搅拌升温至70℃维持1h。
(3)称取0.1g偶氮二异丁腈(AIBN)加入10mL乙醇中，超声溶解后加入，70℃反应温度维持1h。
(4)称取0.1g偶氮二异丁腈(AIBN)加入10mL乙醇中，超声溶解后加入，70℃反应温度维持22h，关闭加热自然冷却。
(5)反应终止后，反应液经10000rpm离心5min，留取沉淀产物，即聚苯乙烯种子微球，放入真空干燥箱中，常温下干燥12h。
(6)称取步骤(5)获得的0.25g聚苯乙烯种子微球加入10mL0.25％十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液，超声分散5min，置于圆底烧瓶中300rpm搅拌。
(7)量取20mL 0.25％十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液、0.25mL甲苯、1mL邻苯二甲酸二丁酯(DBP)，用细胞粉碎仪粉碎至乳液均匀，加入圆底烧瓶300rpm搅拌12h。
(8)称取0.05g过氧化苯甲酰(BPO)、0.5g苯乙烯(St)、0.45g二乙烯基苯(DVB)、15mL十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液，用细胞粉碎仪粉碎至乳液均一后，加入圆底烧瓶300rpm搅拌12h。
(9)量取10mL 4％聚乙烯醇(PVA)水溶液，加入圆底烧瓶中，升温并维持温度在70℃，500rpm搅拌18h后，关闭加热自然冷却。
(10)反应终止后，反应液经10000rpm离心5min，留取沉淀产物即溶胀微球，放入真空干燥箱中，常温下干燥12h。
(11)使用扫描电子显微镜对制备的聚苯乙烯微球进行形貌表征，如图3所示，聚苯乙烯微球的尺寸平均值为3.2μm。
实施例4：磁性微球的制备与表征
(1)称取3.6g油酸铁(Fe(OA)3)、0.6g油酸(OA)、20g 1-十八烯(ODE)超声溶解后加入圆底烧瓶，搭装抽真空通氮气装置。
(2)以5℃/min速度梯度升温。升温至80℃，维持15min，抽真空，通氮气。升温至120℃，维持15min，抽真空，通氮气。升温至160℃，维持15min，抽真空，通氮气。升温至320℃，维持30min，关闭加热，自然降温至室温。
(3)反应终止后，移取至分液漏斗中，加入20mL三氯甲烷和50mL乙醇溶解15min。再加入200mL超纯水萃取，静置30min后，收集Fe3O4/三氯甲烷溶液。经定量后收集在玻璃瓶中保存备用。
(4)称取1g实施例3中制备的聚苯乙烯微球加入15mL掺杂液中(40％丙醇，60％三氯甲烷)，超声分散10min。
(5)加入含100mg Fe3O4的Fe3O4/三氯甲烷溶液，超声混合15min，震荡12h。
(6)加入等量乙醇，以8000rpm离心5min，留取沉淀并将其重分散于40mL 0.25％十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液。
(7)称取0.02g过氧化苯甲酰(BPO)、0.2g苯乙烯(St)、0.04g二乙烯基苯(DVB)加入15mL 0.25％十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液超声乳化，加入反应液300rpm搅拌12h。
(8)加入10mL 4％聚乙烯醇(PVA)水溶液，升温并维持温度在70℃，500rpm搅拌18h后，关闭加热自然冷却。
(9)反应终止后，反应液经10000rpm离心5min，留取沉淀产物即磁性微球，放入真空干燥箱中，常温下干燥12h。
(10)使用振动样品磁强计对制备的磁性微球进行磁感应强度表征，如图4所示，磁性微球的饱和磁化强度为4.37emu/g，剩余磁化强度为0.03emu/g，矫顽力为3.29Oe。
实施例5：量子点双色编码荧光磁性微球的制备与表征
(1)称取0.5g实施例4中制备的磁性微球，加入15mL掺杂液中(40％丙醇，60％三氯甲烷)，超声分散10min。
(2)加入浓度比例范围为1：32至32：1(由浓度分别为0.3125mg/mL、0.625mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL的两种量子点的正交比例制备)的发射峰位分别为550nm和680nm的实施例2制备的InP@ZnSe@ZnSeS@ZnS量子点的三氯甲烷溶液，超声混合15min，震荡12h。
(3)加入等量乙醇，以8000rpm离心5min，留取沉淀并将其重分散于20mL 0.25％十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液。
(4)称取0.01g过氧化苯甲酰(BPO)、0.1g苯乙烯(St)、0.02g二乙烯基苯(DVB)加入10mL 0.25％十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液超声乳化，加入反应液300rpm搅拌12h。
(5)加入10mL 4％聚乙烯醇(PVA)水溶液，升温并维持温度在70℃，500rpm搅拌18h后，关闭加热自然冷却。
(6)反应终止后，反应液经10000rpm离心5min，留取沉淀产物，即荧光磁性微球，分散在50mL超纯水中保存待用。
(7)使用数码照相机对实施例4制备的磁性微球和本实施例制备的荧光磁性微球进行磁吸附能力表征，如图5所示，磁性微球和荧光磁性微球均能在15min内完成磁吸附。
(8)将本实施例的步骤(1)中使用的磁性微球更换为实施例3步骤(5)制备的小尺寸的聚苯乙烯种子微球，重复步骤(2)-(7)，制备尺寸为1μm的小尺寸无磁性荧光微球，作为对照。
(9)将本实施例的步骤(2)中使用的量子点更换为实施例2制备的发射峰位分别为550nm和680nm并且具有不同表面修饰的量子点(InP-DDT、InP-Ph、InP-OA和InP-HDD)，在两种量子点比例均为1：1下重复步骤(3)-(6)制备双色编码荧光磁性微球，以与InP-OAm量子点进行比较。使用荧光分光光度计对该步骤所制备的微球进行光致发光性能进行表征，结果如图6所示，采用InP-OAm量子点制备的微球具有较大的发光强度，表明较大的正电位的InP-OAm量子点更容易结合在微球表面。
实施例6：羧基化荧光磁性微球的制备与表征
(1)称取实施例5的步骤(2)-(6)中制备的多种浓度比例的InP-OAm量子点结合的荧光磁性微球20mL，加入0.05g十二烷基硫酸钠(SDS)溶解。
(2)称取0.005g过氧化苯甲酰(BPO)、0.05g苯乙烯(St)、0.01g甲基丙烯酸缩水甘油酯加入10mL 0.25％十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液超声乳化，加入反应液300rpm搅拌12h。改变甲基丙烯酸缩水甘油酯的用量分别为0.02g或0.005g，以实现荧光磁性微球表面不同羧基功能化程度和不同散射光通道编码。
(3)加入10mL 4％聚乙烯醇(PVA)水溶液，升温并维持温度在70℃，500rpm搅拌18h后，关闭加热自然冷却。
(4)反应终止后，反应液经10000rpm离心5min，留取沉淀产物即羧基化荧光磁性微球，分散在20mL超纯水中保存待用。
(5)使用扫描电子显微镜对制备的羧基化荧光磁性微球进行形貌表征，如图7所示，荧光磁性微球的尺寸平均值为4.5μm。
(6)使用流式细胞仪对由此制备的本发明的羧基化荧光磁性微球进行上样分析，结果如图8所示，羧基化荧光磁性微球在散射光通道中得到了3种分群的分布图，这说明本发明的荧光磁性微球能够实现在散射光通道的编码。
(7)使用流式细胞仪对由此制备的本发明的羧基化荧光磁性微球进行上样分析，结果如图9所示，在散射通道分群基础上，本发明的羧基化荧光磁性微球分别在FL2和FL3通道中各得到了12组分群共计36组分群的分布图，分群之间区分明显且无拖尾现象。
(8)使用荧光分光光度计和流式细胞仪对实施例5步骤(8)制备的小尺寸荧光微球和实施例5中制备的掺杂相同量子点比例的大尺寸荧光微球进行光致发光和流式荧光信号分群表征。结果分别如图10和图11所示。在图10的光致发光图谱中，小尺寸荧光微球与大尺寸荧光微球中表现出相近的荧光信号强度。在图11的流式荧光信号图中，小尺寸荧光微球散点杂乱无法产生明显的分群，大尺寸荧光微球则为集中分群。

Claims (9)

1.一种用于流式分析的荧光磁性微球，所述荧光磁性微球的粒度为4μm至6μm，优选为4.5μm至5μm，并且所述荧光磁性微球从内到外依次包括核微球、磁性材料层、磷化铟(InP)量子点层、任选的聚合物层以及任选的羧基聚合物层，所述磷化铟(InP)量子点层包含一个或多个(例如两个、三个或者更多个)荧光发射波段的磷化铟(InP)量子点，且所述磷化铟(InP)量子点静电吸附于所述核微球和/或所述磁性材料层。
2.根据权利要求1所述的荧光磁性微球，其中，所述磷化铟(InP)量子点是InP@ZnSe@ZnSeS@ZnS量子点；
优选地，所述磷化铟(InP)量子点的粒度为5nm至20nm；
优选地，所述磷化铟(InP)量子点是通过表面修饰剂修饰从而zeta电位发生改变的磷化铟(InP)量子点；
优选地，所述表面修饰剂是选自二苯基锌、油胺、正十二烷基硫醇和1,16-十六烷基二硫醇中的一种或者多种，更优选为油胺。
3.根据权利要求1或2所述的荧光磁性微球，其中，所述磷化铟(InP)量子点的荧光发射波段基于在制备磷化铟(InP)核心中使用的In、Zn和P的摩尔比例来调整，优选的摩尔比例为0.75：5：5-10：5：10。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的荧光磁性微球，其中，所述核微球是聚苯乙烯微球；优选地，所述聚苯乙烯微球的粒度为2μm至4μm。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的荧光磁性微球，其中，所述磁性材料层包括粒度为10nm至200nm的超顺磁磁性颗粒或超顺磁磁性颗粒的聚集体；
优选地，所述超顺磁磁性颗粒是铁磁性材料，例如四氧化三铁、氧化铁及锰锌铁氧体磁性材料，优选为油酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒；
优选地，所述磁性材料层的厚度为10nm至1μm，优选为0.1μm至0.3μm。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的荧光磁性微球，其中，所述聚合物层是聚苯乙烯层，其厚度为10nm至1μm，优选为0.1μm至0.3μm。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的荧光磁性微球，其中，所述羧基聚合物层是由选自丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸乙二醇酯和甲基丙烯酸己二醇酯中的一种或多种羧基聚合物聚合得到的；
优选地，所述羧基聚合物层的厚度为10nm至1μm，优选为0.1μm至0.3μm。
优选地，所述羧基聚合物层配置成呈现不同流式散射光通道信号的编码微球群，更具体地，通过在制备中调整苯乙烯和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比例，优选7:1至7:5，来调整羧基聚合物的聚合度以实现不同流式散射光通道信号。
8.权利要求1-7中任一项所述的荧光磁性微球，其中，所述荧光磁性微球包含磁性信号编码、荧光信号编码、散射光信号编码中的二级或多级编码。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的荧光磁性微球在流式分析中的用途。
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