CN117362470A - 北青龙衣多糖PJP80-Ia制备方法及其应用 - Google Patents
北青龙衣多糖PJP80-Ia制备方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117362470A CN117362470A CN202311481246.0A CN202311481246A CN117362470A CN 117362470 A CN117362470 A CN 117362470A CN 202311481246 A CN202311481246 A CN 202311481246A CN 117362470 A CN117362470 A CN 117362470A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pjp80
- polysaccharide
- north
- cells
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 383
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 381
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 381
- 241000317410 Arisaema dracontium Species 0.000 title claims abstract description 95
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 115
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 11
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 69
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 48
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 44
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 31
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 25
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 claims description 23
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 claims description 23
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 21
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 20
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 19
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 19
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 17
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 15
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 14
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 14
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 11
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 11
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 8
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 5
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 abstract description 18
- 239000008103 glucose Substances 0.000 abstract description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 abstract description 9
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 abstract description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 abstract description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 213
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 131
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 123
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 112
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 54
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 53
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 52
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 51
- 101000831567 Homo sapiens Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 description 48
- 102100024333 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 description 48
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 43
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 42
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 42
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 39
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 37
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 37
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 32
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 31
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 31
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 30
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 27
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 27
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 27
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 25
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 23
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 22
- 101000595548 Homo sapiens TIR domain-containing adapter molecule 1 Proteins 0.000 description 22
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 22
- 102100036073 TIR domain-containing adapter molecule 1 Human genes 0.000 description 22
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 22
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 22
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 22
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 21
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 21
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 21
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 21
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 21
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 21
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 21
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 21
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 21
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 108010077432 Myeloid Differentiation Factor 88 Proteins 0.000 description 20
- 102000010168 Myeloid Differentiation Factor 88 Human genes 0.000 description 20
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 20
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 18
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 18
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 17
- HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N dpph Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1[N]N(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- LEEIJTHMHDMWLJ-CQSZACIVSA-N ethyl (6r)-6-[(2-chloro-4-fluorophenyl)sulfamoyl]cyclohexene-1-carboxylate Chemical compound CCOC(=O)C1=CCCC[C@H]1S(=O)(=O)NC1=CC=C(F)C=C1Cl LEEIJTHMHDMWLJ-CQSZACIVSA-N 0.000 description 17
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 17
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 17
- WTGMGRFVBFDHGQ-UHFFFAOYSA-N 3-[(2-hydroxy-3-methoxyphenyl)methylideneamino]-2-methylbenzoic acid Chemical compound OC1=C(C=NC=2C(=C(C(=O)O)C=CC=2)C)C=CC=C1OC WTGMGRFVBFDHGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 101000686031 Homo sapiens Proto-oncogene tyrosine-protein kinase ROS Proteins 0.000 description 14
- 102100023347 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase ROS Human genes 0.000 description 14
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 14
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 14
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 13
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 13
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 13
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 13
- 101001011382 Homo sapiens Interferon regulatory factor 3 Proteins 0.000 description 12
- 102100029843 Interferon regulatory factor 3 Human genes 0.000 description 12
- 102000004399 TNF receptor-associated factor 3 Human genes 0.000 description 12
- 108090000922 TNF receptor-associated factor 3 Proteins 0.000 description 12
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 12
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 12
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 11
- 101000665442 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase TBK1 Proteins 0.000 description 11
- 101000637726 Homo sapiens Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter protein Proteins 0.000 description 11
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 11
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 11
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 11
- 102100038192 Serine/threonine-protein kinase TBK1 Human genes 0.000 description 11
- 102100032120 Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter protein Human genes 0.000 description 11
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 11
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 11
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 11
- 102100040840 C-type lectin domain family 7 member A Human genes 0.000 description 10
- 101000595554 Homo sapiens TIR domain-containing adapter molecule 2 Proteins 0.000 description 10
- 101000649115 Homo sapiens Translocating chain-associated membrane protein 1 Proteins 0.000 description 10
- 102000001284 I-kappa-B kinase Human genes 0.000 description 10
- 108060006678 I-kappa-B kinase Proteins 0.000 description 10
- 102000019145 JUN kinase activity proteins Human genes 0.000 description 10
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 10
- 102100026888 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7 Human genes 0.000 description 10
- 102100027965 Translocating chain-associated membrane protein 1 Human genes 0.000 description 10
- 230000009471 action Effects 0.000 description 10
- 108010025838 dectin 1 Proteins 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 238000002376 fluorescence recovery after photobleaching Methods 0.000 description 10
- 108091008743 testicular receptors 4 Proteins 0.000 description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 9
- 101000977771 Homo sapiens Interleukin-1 receptor-associated kinase 4 Proteins 0.000 description 9
- 102100036342 Interleukin-1 receptor-associated kinase 1 Human genes 0.000 description 9
- 102100023533 Interleukin-1 receptor-associated kinase 4 Human genes 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 9
- 102000003714 TNF receptor-associated factor 6 Human genes 0.000 description 9
- 108090000009 TNF receptor-associated factor 6 Proteins 0.000 description 9
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 9
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 9
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 9
- -1 diaryl heptanes Chemical class 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 9
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 9
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 9
- KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=CC2=C1 KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 8
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 101000852483 Homo sapiens Interleukin-1 receptor-associated kinase 1 Proteins 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 8
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 8
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 8
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 8
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 8
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 8
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 102100025354 Macrophage mannose receptor 1 Human genes 0.000 description 7
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 7
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 7
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 7
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 7
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 7
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 7
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 7
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 7
- 150000003214 pyranose derivatives Chemical class 0.000 description 7
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 7
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 7
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 7
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000018745 NF-KappaB Inhibitor alpha Human genes 0.000 description 6
- 108010052419 NF-KappaB Inhibitor alpha Proteins 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 description 5
- 244000157072 Hylocereus undatus Species 0.000 description 5
- 235000018481 Hylocereus undatus Nutrition 0.000 description 5
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- GLEVLJDDWXEYCO-UHFFFAOYSA-N Trolox Chemical compound O1C(C)(C(O)=O)CCC2=C1C(C)=C(C)C(O)=C2C GLEVLJDDWXEYCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 5
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 5
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 5
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 5
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- KMVWNDHKTPHDMT-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine Chemical compound N1=CC=CC=C1C1=NC(C=2N=CC=CC=2)=NC(C=2N=CC=CC=2)=N1 KMVWNDHKTPHDMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FNEHAOQZWPHONV-UHFFFAOYSA-N 9h-carbazole;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 FNEHAOQZWPHONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 4
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 4
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 229940124647 MEK inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 4
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 4
- 102100039337 NF-kappa-B inhibitor alpha Human genes 0.000 description 4
- 101710083073 NF-kappa-B inhibitor alpha Proteins 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 238000001237 Raman spectrum Methods 0.000 description 4
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 4
- 230000007760 free radical scavenging Effects 0.000 description 4
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- XDFNWJDGWJVGGN-UHFFFAOYSA-N 2-(2,7-dichloro-3,6-dihydroxy-9h-xanthen-9-yl)benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC(Cl)=C(O)C=C2OC2=CC(O)=C(Cl)C=C21 XDFNWJDGWJVGGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N D-galactopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N 0.000 description 3
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 235000006468 Thea sinensis Nutrition 0.000 description 3
- 108010060804 Toll-Like Receptor 4 Proteins 0.000 description 3
- 102000008233 Toll-Like Receptor 4 Human genes 0.000 description 3
- 102000008228 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 description 3
- 108010060888 Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 3
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 3
- 235000020333 oolong tea Nutrition 0.000 description 3
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 3
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 102100031480 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710146526 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010016131 Proto-Oncogene Proteins c-jun Proteins 0.000 description 2
- 102000000427 Proto-Oncogene Proteins c-jun Human genes 0.000 description 2
- 241001643412 Sinomenium Species 0.000 description 2
- 241001530209 Swertia Species 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 2
- 239000011449 brick Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N diphenyl-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1N=[N+](C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000000445 field-emission scanning electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- HYBBIBNJHNGZAN-UHFFFAOYSA-N furfural Chemical compound O=CC1=CC=CO1 HYBBIBNJHNGZAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000006303 immediate early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 2
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 2
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 102000007863 pattern recognition receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010089193 pattern recognition receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Substances [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000001243 pseudopodia Anatomy 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 2
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 2
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 2
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 2
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 2
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 2
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- RZPFVRFSYMUDJO-UHFFFAOYSA-N 2h-naphthalen-1-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)CC=CC2=C1 RZPFVRFSYMUDJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFNABHBYVSJWLO-UHFFFAOYSA-N 3,4,4a,5-tetrahydro-2h-naphthalen-1-one Chemical compound C1C=CC=C2C(=O)CCCC21 QFNABHBYVSJWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100397595 Caenorhabditis elegans jnk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100513486 Caenorhabditis elegans mkk-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 241000723418 Carya Species 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000675108 Citrus tangerina Species 0.000 description 1
- 241001391944 Commicarpus scandens Species 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 102100023266 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710146529 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100023275 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100023401 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100023332 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 7 Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 229920000855 Fucoidan Polymers 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 241001071795 Gentiana Species 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 241000251511 Holothuroidea Species 0.000 description 1
- 101001115394 Homo sapiens Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000624426 Homo sapiens Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000624594 Homo sapiens Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 7 Proteins 0.000 description 1
- 101001018064 Homo sapiens Lysosomal-trafficking regulator Proteins 0.000 description 1
- 101000863856 Homo sapiens Shiftless antiviral inhibitor of ribosomal frameshifting protein Proteins 0.000 description 1
- 101000831496 Homo sapiens Toll-like receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000669460 Homo sapiens Toll-like receptor 5 Proteins 0.000 description 1
- 229920000869 Homopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 102000043138 IRF family Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000283162 Inia geoffrensis Species 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 101710199015 Interleukin-1 receptor-associated kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- DKNPRRRKHAEUMW-UHFFFAOYSA-N Iodine aqueous Chemical compound [K+].I[I-]I DKNPRRRKHAEUMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000264601 Juglans mandschurica Species 0.000 description 1
- 235000014075 Juglans mandschurica Nutrition 0.000 description 1
- 208000007976 Ketosis Diseases 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- 102100033472 Lysosomal-trafficking regulator Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 244000038561 Modiola caroliniana Species 0.000 description 1
- 235000010703 Modiola caroliniana Nutrition 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100013786 Mus musculus Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 101000819572 Mus musculus Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101000860173 Myxococcus xanthus C-factor Proteins 0.000 description 1
- 229930192627 Naphthoquinone Natural products 0.000 description 1
- 201000009053 Neurodermatitis Diseases 0.000 description 1
- 229910021586 Nickel(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000010806 PrimeScriptTM RT Reagent kit Methods 0.000 description 1
- 238000012356 Product development Methods 0.000 description 1
- 230000002292 Radical scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024324 Toll-like receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100039357 Toll-like receptor 5 Human genes 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 102000035181 adaptor proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005764 adaptor proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001323 aldoses Chemical class 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N anhydrous n-heptane Natural products CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- PYKYMHQGRFAEBM-UHFFFAOYSA-N anthraquinone Natural products CCC(=O)c1c(O)c2C(=O)C3C(C=CC=C3O)C(=O)c2cc1CC(=O)OC PYKYMHQGRFAEBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004056 anthraquinones Chemical class 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000019606 astringent taste Nutrition 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N benzo-alpha-pyrone Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- HXCHCVDVKSCDHU-LULTVBGHSA-N calicheamicin Chemical compound C1[C@H](OC)[C@@H](NCC)CO[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@@H]2C\3=C(NC(=O)OC)C(=O)C[C@](C/3=C/CSSSC)(O)C#C\C=C/C#C2)O[C@H](C)[C@@H](NO[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](SC(=O)C=3C(=C(OC)C(O[C@H]4[C@@H]([C@H](OC)[C@@H](O)[C@H](C)O4)O)=C(I)C=3C)OC)[C@@H](O)C2)[C@@H]1O HXCHCVDVKSCDHU-LULTVBGHSA-N 0.000 description 1
- 229930195731 calicheamicin Natural products 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000021258 carbohydrate absorption Nutrition 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010047295 complement receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006834 complement receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000002247 constant time method Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- BERDEBHAJNAUOM-UHFFFAOYSA-N copper(I) oxide Inorganic materials [Cu]O[Cu] BERDEBHAJNAUOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000005100 correlation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 description 1
- 239000002178 crystalline material Substances 0.000 description 1
- KRFJLUBVMFXRPN-UHFFFAOYSA-N cuprous oxide Chemical compound [O-2].[Cu+].[Cu+] KRFJLUBVMFXRPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940112669 cuprous oxide Drugs 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000001938 differential scanning calorimetry curve Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- QELUYTUMUWHWMC-UHFFFAOYSA-N edaravone Chemical compound O=C1CC(C)=NN1C1=CC=CC=C1 QELUYTUMUWHWMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000004134 energy conservation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 229940124600 folk medicine Drugs 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 150000002243 furanoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000003919 heteronuclear multiple bond coherence Methods 0.000 description 1
- 238000003929 heteronuclear multiple quantum coherence Methods 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000008975 immunomodulatory function Effects 0.000 description 1
- 230000000091 immunopotentiator Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002584 ketoses Chemical class 0.000 description 1
- 229930013686 lignan Natural products 0.000 description 1
- 150000005692 lignans Chemical class 0.000 description 1
- 235000009408 lignans Nutrition 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000035773 mitosis phase Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002791 naphthoquinones Chemical class 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 231100000587 neutral red assay Toxicity 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L nickel dichloride Chemical compound Cl[Ni]Cl QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000005311 nuclear magnetism Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229930015704 phenylpropanoid Natural products 0.000 description 1
- 125000001474 phenylpropanoid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000008884 pinocytosis Effects 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 235000019633 pungent taste Nutrition 0.000 description 1
- 150000003215 pyranoses Chemical class 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 1
- 235000019615 sensations Nutrition 0.000 description 1
- 102000038416 signaling pathway-associated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091007779 signaling pathway-associated proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002411 thermogravimetry Methods 0.000 description 1
- 229940126680 traditional chinese medicines Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000010023 transfer printing Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SWGJCIMEBVHMTA-UHFFFAOYSA-K trisodium;6-oxido-4-sulfo-5-[(4-sulfonatonaphthalen-1-yl)diazenyl]naphthalene-2-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C1=CC=C2C(N=NC3=C4C(=CC(=CC4=CC=C3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=CC=C(S([O-])(=O)=O)C2=C1 SWGJCIMEBVHMTA-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000003648 triterpenes Chemical class 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000000733 zeta-potential measurement Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及北青龙衣多糖PJP80‑Ia制备方法及其应用。本发明利用闪氏提取技术，结合分级醇沉，提取北青龙衣多糖PJP80，利用AB‑8大孔树脂进行脱色，以DEAE‑52阴离子交换层析柱分离纯化得到北青龙衣多糖PJP80‑I，采用Sephadex G‑50凝胶层析柱进一步纯化，最终得到分子量为11630Da，由甘露糖和葡萄糖组成的单一组分北青龙衣多糖PJP80‑Ia。本发明提供的北青龙衣多糖PJP80‑Ia具有免疫活性、抗肿瘤活性、抗氧化活性，且纯度高等优点。
Description
技术领域
本发明属于中药、食品技术领域，尤其涉及北青龙衣多糖PJP80-Ia制备方法及其应用。
背景技术
青龙衣(Pericarpium Juglandis)为胡桃科植物胡桃楸Jugland mandshuricaMaxim和胡桃Juglans regia L.的未成熟外果皮，主要分布在亚洲东北部。始载于《开宝本草》，在该书中将其称为胡桃青皮。《中华本草》和《中药大辞典》记载其味辛、苦；性平，微寒；有毒；归肝、肺、胃经。“青龙衣”之名始见于《山东中草药手册》，此后多延用此名。黑龙江药品监督管理局为与部颁品种青龙衣区别，而命名北青龙衣，又名胡桃青皮，胡桃壳，是野生山核桃未成熟的外果皮。作为黑龙江省道地药材，“北青龙衣”收录在《黑龙江省中药材标准》中，皱缩的半球形或不规则块片状，边缘多向内弯曲，直径3-6cm，厚约0.7cm。外表面黑棕色或黑黄色，较光滑。密生黄色斑点，一端有一果柄痕。内表面黑黄色，粗糙，附纵向筋络状维管柬。质脆，易折断。气微，味微苦，涩，嚼之有沙粒感。6-8月对未成熟的青胡桃皮进行采收，采集后洗净，削取果肉，即采即用。取原药材，除去杂质，及时晒干或低温干燥保存，是我国传统的民间用药。据《救急方》记载北青龙衣可被用做泡茶或泡酒饮用，起到止痛的功效，现代药理学表明其捣汁外涂，在治疗上火头痛和神经性皮炎方面也有不错疗效。我国的核桃产量和种植面积均居世界第一，其中核桃青皮呈碱性，自然降解对水体及土壤的影响不容小觑。因此，如何有效利用核桃青皮资源已成为亟需解决的问题。
青龙衣的主要化学成分包括醌类(例如萘醌类、蒽醌类、萘酮类、四氢萘酮类)、黄酮类、酚类、二芳基庚烷类、香豆素类、木脂素类、苯丙素类、三萜类、有机酸类及多糖类等，具有良好的清热、解毒、消肿、止痛、止痢、明目等功效。
多糖(Polysaccharide)是生物体中维持生命活动的广泛存在的物质，是一类由醛糖或酮糖脱水聚合，通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，其分子式为(C6H10O5)n。根据单糖的组成，多糖分为同型多糖和杂多糖。前者由相同的单糖组成，后者由两个以上的单糖组成。根据来源，多糖可分为三种，即植物多糖、动物多糖和微生物多糖。目前分离出的活性多糖中，中药多糖占有一定比例，其组成中的单糖分子有葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、半乳糖醛酸(Gal A)、葡萄糖醛酸(Glc A)、岩藻糖(Fuc)和核糖(Rib)等，中药多糖根据单糖种类、排列顺序、主链结构、有无支链及相对分子质量差异等产生不同的分子结构，不同结构决定多糖的各自性质进而影响其生物学活性，对应发挥的药理活性及作用机制也不尽相同。
北青龙衣具有药用价值，但目前研究基础薄弱，制约了北青龙衣的进一步开发利用。多糖传统热水提取法溶剂用量大、提取时间长、提取率低，不够高效节能。多糖中的杂质会对多糖的结构和活性研究造成影响，而初步提取的北青龙衣多糖中通常含有蛋白质、无机盐等大量杂质，因此有必要将其除去。常用方法有酶法、TCA法和Sevag法，酶法除蛋白虽然条件较温和，但是成本相对昂贵，不适合大规模应用；Sevag法的主要原理是使多糖中的游离态蛋白质变性，形成不溶物质同时不会对多糖成分造成破坏，达到分离的效果。此外大多数天然多糖中都含有色素，对多糖后续结构和生物活性可能会产生影响，因此也需要将其除去。采用H2O2氧化法等化学法去除杂质可能会对多糖结构造成破坏。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供北青龙衣多糖PJP80-Ia制备方法及其应用，通过选择合适的制备方法获得的北青龙衣多糖具有纯度高等优点，同时还具有免疫活性、抗肿瘤、抗氧化活性等。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供北青龙衣多糖PJP80-Ia的制备方法，包括以下步骤：采用闪氏提取法提取北青龙衣的上清液，采用分级醇沉的方法制备北青龙衣多糖，收集80％乙醇浓度醇沉后的沉淀，将其冷冻干燥，得到北青龙衣多糖PJP80。
采用上述方案的有益效果包括：本发明试验了不同乙醇浓度醇沉后的产物，发现80％乙醇浓度醇沉后产物获得的多糖含量更多、免疫活性更好。
进一步，北青龙衣的提取液的制备方法包括以下步骤：将北青龙衣的料液闪氏提取。
进一步，北青龙衣的料液包括北青龙衣粉末和水，北青龙衣粉末和水的料液比为1g:30mL，水的温度为90℃。
进一步，闪氏提取的参数包括：5000r/min，30s/次，提取2次。
采用上述方案的有益效果包括：具有提取时间短、高效、操作方便、节能等优点。
进一步，分级醇沉包括以下步骤：将北青龙衣的上清液抽滤后收集滤液；将滤液减压浓缩至原体积的1/3，加入95％乙醇，快速搅拌，使溶液中乙醇浓度达到20％，静置过夜，得到沉淀Ⅰ和上清液Ⅰ；重复上述步骤，在上清液Ⅰ中加入乙醇，使溶液中乙醇终浓度达到40％，静置过夜，得到沉淀Ⅱ和上清液Ⅱ；重复上述步骤，在上清液Ⅱ中加入乙醇，使溶液中乙醇终浓度达到60％，静置过夜，得到沉淀Ⅲ和上清液Ⅲ；重复上述步骤，在上清液Ⅲ中加入乙醇，使溶液中乙醇终浓度达到80％，静置过夜，得到沉淀Ⅳ和上清液Ⅳ；将沉淀Ⅳ用无水乙醇洗涤，冷冻干燥。
采用上述方案的有益效果包括：采用上述方法获得的北青龙衣多糖的多糖含量更高。
进一步，还包括脱色的步骤。
进一步，采用AB-8大孔树脂进行脱色。可以采用以下步骤：称取分级醇沉后获得的北青龙衣粗多糖溶解于蒸馏水中，加入AB-8大孔树脂，搅拌2h进行脱色，真空抽滤，将滤液冷冻干燥，北青龙衣粗多糖、蒸馏水、AB-8大孔树脂的比例为5g：100mL：50g。
采用上述方案的有益效果包括：采用上述方法可以去除提取物中的色素等杂质。
进一步，在脱色后，还包括DEAE-52阴离子交换层析柱分离纯化和Sephadex G-50凝胶层析柱分离纯化步骤。
进一步，DEAE-52阴离子交换层析柱分离纯化包括以下步骤：活化DEAE-52纤维素；装柱、DEAE-52阴离子交换层析柱预处理；配制北青龙衣多糖溶液及上样；配制洗脱液及收集样品，以0-0.5mol/L NaCl溶液作为洗脱液，每个浓度200mL，流速1mL/min、2mL/管收集洗脱液，收集NaCl溶液浓度为0时获得的洗脱液，将其冷冻干燥，得到北青龙衣多糖PJP80-I。
进一步，Sephadex G-50凝胶层析柱分离纯化包括以下步骤：活化Sephadex G-50凝胶；装柱、Sephadex G-50凝胶层析柱预处理；配制PJP80-I溶液及上样，洗脱液采用去离子水，流速1mL/3min，收集洗脱峰，将其冷冻干燥，得到北青龙衣多糖PJP80-Ia。
采用上述方案的有益效果包括：采用上述方法可以进一步提高提取物中多糖的含量，经检测，北青龙衣多糖PJP80-Ia糖含量可以达到97.51±0.19％。
本发明提供北青龙衣多糖PJP80-Ia在(1)至(5)任一项或任几项中的应用，北青龙衣多糖PJP80-Ia采用上述制备方法制备；
(1)单独或作为其中一种组分用于制备免疫调节剂；
(2)单独或作为其中一种组分用于制备抗肿瘤制剂
(3)单独作为新食品原料
(4)单独或作为其中一种组分用于制备具有免疫调剂功能的保健食品；
(5)单独或作为其中一种组分用于制备具有抗氧化功能的保健食品。
采用上述方案的有益效果包括：经检测，北青龙衣多糖PJP80-Ia对人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721以及人乳腺癌细胞MCF-7均具有抑制作用，可以用于肝癌、乳腺癌等防治；北青龙衣多糖PJP80-Ia可以清除DPPH、ABTS自由基，具有还原Fe3+-TPTZ的能力，具有抗氧化性；北青龙衣多糖PJP80-Ia可活化小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞，刺激细胞增殖,增强小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的吞噬功能，并诱导RAW264.7细胞NO及ROS的分泌，增加TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-βmRNA表达量，增强巨噬细胞免疫活性。可以用于制备或作为增强免疫活性、抗肿瘤、或抗氧化的产品，包括药物、食品、保健食品等。
附图说明
图1为北青龙衣粗多糖DEAE-52洗脱曲线。
图2为实施例3中PJP80-Ia抗肿瘤活性检测结果，其中，A为北青龙衣多糖PJP80-Ia对HepG2抑制作用的检测结果，与空白对照组，*：具有显著性P<0.05；**：具有极显著性P<0.01。；B为北青龙衣多糖PJP80-Ia对SMMC-7721抑制作用的检测结果，与空白对照组，*：具有显著性P<0.05；**：具有极显著性P<0.01。；C为北青龙衣多糖PJP80-Ia对MCF-7抑制作用的检测结果，与空白对照组，*：具有显著性P<0.05；**：具有极显著性P<0.01。；D为Trolox、北青龙衣粗多糖、北青龙衣多糖PJP80-Ia的DPPH自由基清除能力的检测结果；E为Trolox、北青龙衣粗多糖、北青龙衣多糖PJP80-Ia的ABTS自由基清除能力的结果；F为北青龙衣多糖Fe3+还原能力的结果。
图3为倒置显微镜检测PJP80-Ia对巨噬细胞RAW264.7细胞形态的影响的结果(放大倍率400×，n＝3)。
图4为流式细胞仪检测PJP80-Ia对巨噬细胞RAW264.7细胞周期的影响的结果(n＝3)。
图5为PJP80-Ia对巨噬细胞RAW264.7细胞周期的影响的结果(n＝3)。
图6为PJP80-Ia对小鼠RAW264.7细胞分泌ROS的影响的结果(n＝3)。
图7为PJP80-Ia对小鼠RAW264.7细胞分泌细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-βmRNA表达的影响的结果(n＝6)，其中，与对照组相比，*：具有显著性P<0.05；**：具有极显著性P<0.01。
图8为TLR2抑制剂(C29)及TLR4抑制剂(TAK-242)对PJP80-Ia诱导的巨噬细胞RAW264.7分泌细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的mRNA表达水平的影响的结果(n＝3)，其中，ns:不显著；与对照组相比，*：具有显著性P<0.05；**：具有极显著性P<0.01；与每组无抑制剂数据相比，##：具有极显著性P<0.01。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明以干燥北青龙衣为原料，通过一系列物理和化学方法获得高纯度的北青龙衣多糖，进一步利用红外光谱、核磁共振波谱、扫描电子电镜等仪器对北青龙衣多糖初、高级结构进行解析，为北青龙衣的构效关系研究和新产品开发提供科学理论依据，并进一步验证了北青龙衣多糖的活性。包括以下内容：
(1)本发明采用闪式提取法、梯度醇沉制备北青龙衣粗多糖PJP80，经AB-8大孔树脂脱色处理，利用DEAE-52纤维素得到北青龙衣多糖PJP80-I，进一步利用葡聚糖凝胶G-50进行分离纯化，得到北青龙衣多糖PJP80-Ia。
(2)对北青龙衣多糖PJP80-Ia的初级结构和高级结构进行分析：利用高效液相色谱(HPLC)、傅里叶红外色谱(FTIR)、拉曼光谱(Ramam)、核磁共振氢谱(NMR)等方法分析精制北青龙衣多糖的纯度、相对分子量、单糖组成、糖苷键类型等；通过刚果红实验、示差扫描量热法、粒径及电位测定、X-射线衍射(XRD)、场发射扫描电镜(FE-SEM)以及原子力显微镜(AFM)观测等方法，分析精制北青龙衣多糖螺旋结构、热稳定性、粒径大小、电荷性质、晶体特性、表观形貌及链构象。
(3)北青龙衣多糖PJP80-Ia肿瘤活性分析：MTT法测定精制北青龙衣多糖PJP80-Ia对人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和人乳腺癌细胞MCF-7增殖影响；DPPH、ABTS和FRAP三种抗氧化方法来测定分析北青龙衣多糖PJP80-Ia体外抗氧化活性。北青龙衣多糖PJP80-Ia能够抑制肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和MCF-7的增殖，对DPPH和ABTS自由基的清除率分别为79.5％和65％，Fe3+还原能力为1.49mg/mL，抗氧化能力强。
(4)北青龙衣多糖PJP80-Ia免疫活性分析：北青龙衣多糖PJP80-Ia可活化小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞，刺激细胞增殖,增强小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的吞噬功能，并诱导RAW264.7细胞NO及ROS的分泌，增加TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-βmRNA表达量；北青龙衣多糖PJP80-Ia可通过巨噬细胞表面Toll样受体(TLR)、模式识别受体(Dectin-1)、补体受体(CR3)、甘露糖受体家族(MR)进一步促进相关通路信号传导，其中对Toll样受体(TLR2/4)蛋白表达较明显；北青龙衣多糖PJP80-Ia可通过MyD88依赖性MAPKs信号通路和NF-κB信号通路协同参与细胞免疫反应，促进细胞释放细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β；北青龙衣多糖PJP80-Ia可通过TRIF依赖性信号通路参与介导免疫细胞增殖成熟，促使巨噬细胞分泌IFN-β发挥细胞免疫功能；TLRs受体拮抗剂可以显著地降低PJP80-Ia促进RAW264.7细胞分泌NO、TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-β的作用，降低NF-κB信号通路相关蛋白的表达水平，证明PJP80-Ia主要通过与细胞膜表面的TLR2/4结合，增强巨噬细胞免疫活性。
下面通过具体实施例进行介绍。各实施例中所使用的实验方法若未经特殊说明均为本领域的常规实验方法。所用材料、试剂、仪器，若未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂和仪器，可通过商业渠道获得或常规方法制备。
实验材料：
北青龙衣干燥果皮(产品为干燥固体，质地硬而脆，洁净无异味)，由黑龙江省中医药科学院鉴定并提供。巨噬细胞RAW264.7细胞：哈尔滨医科大学所赠，公众可获得仅用于非商业目的重复本发明所记载的实施例。人肝癌细胞HepG2、人肝癌细胞SMMC-7721、人乳腺癌细胞MCF-7购自南京科佰生物科技有限公司。
实验仪器：
闪式提取器(型号：SYKES-507)购自宁波贝德尔电讯电机有限公司；紫外可见分光光度计(型号：UV-5200PC)购自港东科技发展股份有限公司；玻璃层析柱(型号：16mm；26mm)购自江苏汉邦科技有限公司；自动收集器(型号：BS-160A)购自上海康华生化仪器制造厂；高效液相色谱仪(型号：2414)购自Waters科技有限公司；傅里叶红外色谱仪(型号：FTIR-650)购自天津港东科技发展股份有限公司；拉曼光谱仪(型号：RA861)购自英国雷尼绍公司；粒度仪(型号：Litesizer-500)购自安东帕(上海)商贸有限公司；X-射线衍射仪(型号：D8，Advance)、核磁共振氢谱仪(型号：600M)、原子力显微镜(型号：Dimension-XR)购自德国BRUKER公司；场发射扫描电镜(型号：G2)购自德国ZEISS公司；DSC-TG热重分析仪(型号：DTG-60)、气相色谱-质谱联用仪(型号：QP2010)购自日本岛津公司；倒置显微镜(型号：CKX53)购自日本奥林巴斯公司；酶标仪(型号：ELx800)购自美国Bio-Tek公司；超微量分光光度计NanoDrop One购自美国Thermo公司；实时荧光定量PCR仪购自美国AppliedBiosystems公司。
实验试剂：
DEAE-52纤维素(批号：9013-34-7)、Sephadex G-50凝胶(批号：17-0043-01)、三羟甲基胺基甲烷(Tris，批号：20200803)、十二烷基硫酸钠SDS(批号：L-5750)、DMSO(批号：D6370)、MTT(批号：M6180)、DMEM/F-12培养基(批号：SH30023.01B)、DEPC处理水(0.1％，批号：0301A22)、青霉素-链霉素双抗(批号：Top0016)、脂多糖(LPS，批号：L2880)、噻唑蓝(MTT，批号：M6180)购自北京博奥拓达科技有限公司；中性红粉末(批号：N8160)、DMEM高糖培养基(批号：20200909)、DMSO(批号：D8370)购自北京索莱宝科技有限公司；脱脂奶粉(批号：0804A20)购自北京雷根生物技术有限公司；甲叉双丙烯酰胺(批号：B0014)、过硫酸胺(批号：A6761)北京化学试剂公司；Tween-20(批号：ST825)、Western细胞及IP裂解液(批号：P0013)、蛋白上样缓冲液(5X)(批号：P0016N)、胰酶EDTA消化液(批号：C0201)、二甲基亚砜(DMSO，批号：ST1276)、NO试剂盒(批号：S0021S)、ROS试剂盒(批号：S0033S)、BCA蛋白定量试剂盒(批号：P0010)购自上海碧云天生物科技有限公司；单糖标准品(AR)购自上海麦克林生化科技有限公司；小鼠GAPDH内参引物(批号：I808KA5803)由上海生工生物工程有限公司合成；葡萄糖标准品(AR)购自天津市冈船化学试剂有限公司；刚果红(AR)购自天津市致远化学试剂有限公司；三氟乙酸(色谱纯)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP，AR)购自厦门安永博科技有限公司；胎牛血清(批号：130118611)、胎牛血清(批号：20190503)购自浙江天杭生物科技股份有限公司；DPPH、ABTS、FRAP购自南京建成生物工程研究所；ECL化学发光试剂盒(批号：MA0186)购自大连美仑生物技术有限公司；TLR2-IN-C29(批号：M9063)、TAK-242(批号：M4838)购自奥默生物技术有限公司；α-萘酚(AR)购自国药集团化学试剂有限公司；预染蛋白Marker(批号：26616)购自Thermo公司；Trizol试剂(批号：182805)购自美国Invitrogen公司；TEMED(批号：TB133)购自Biosharp公司；PrimeScript RT reagent Kit(批号：RR047A)、TB Green Premix Ex Taq(批号：RR420A)购自日本Takara公司；兔抗TRAM1多克隆抗体(批号：A15142)、兔抗TIRAP多克隆抗体(批号：A12606)、兔抗CD11b多克隆抗体(批号：A1581)、兔抗GAPDH多克隆抗体(批号：AC001)购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；兔抗p-c-jun多克隆抗体(批号：AF5782)、兔抗TRIF多克隆抗体(批号：AF8238)、兔抗TBK1多克隆抗体(批号：AF8103)、兔抗IRF3多克隆抗体(批号：AF2485)、兔抗IRAK1多克隆抗体(批号：AF7293)、兔抗TAK1多克隆抗体(批号：AF7422)、兔抗IRAK4多克隆抗体(批号：P0016N)购自上海碧云天生物科技有限公司；兔抗Dectin-1多克隆抗体(批号：bs-2455R)、兔抗MRC1多克隆抗体(批号：bs-4727R)、兔抗p-TAK1多克隆抗体(批号：bs-3438R)、兔抗p-IKKα多克隆抗体(批号：bs-3229R)、兔抗p-IKKβ多克隆抗体(批号：bs-3231R)、兔抗p-MEK1+MEK2多克隆抗体(批号：bs-5414R)、兔抗p-MKK3+MKK6多克隆抗体(批号：bs-3274R)、兔抗p-c-fos多克隆抗体(批号：bs-3153R)、兔抗ikkε多克隆抗体(批号：bs-4114R)、兔抗p-ikkε多克隆抗体(批号：bs-8583R)、兔抗p-TBK1多克隆抗体(批号：bs-3440R)、兔抗p-IRF3多克隆抗体(批号：bs-9278R)购自北京博奥森生物技术有限公司；兔抗TLR4多克隆抗体(批号：WL00196)、兔抗P38多克隆抗体(批号：WLP00764)、兔抗β-actin多克隆抗体(批号：WL01372)、兔抗IKKα/β多克隆抗体(批号：WL01900)、兔抗p-MKK7多克隆抗体(批号：WL03553)、兔抗IκBα多克隆抗体(批号：WL01936)、兔抗NF-κB多克隆抗体(批号：WL01273b)、兔抗ERK多克隆抗体(批号：WL01864)、兔抗TLR2多克隆抗体(批号：WL01747)、兔抗MyD88多克隆抗体(批号：WL02494)、兔抗TRAF6多克隆抗体(批号：WL02086)、兔抗p-IκBα多克隆抗体(批号：WL02495)、兔抗p-NF-κB多克隆抗体(批号：WL02196)、兔抗p-ERK多克隆抗体(批号：WLP1512)、兔抗p-P38多克隆抗体(批号：WLP1576)、兔抗JNK多克隆抗体(批号：WL01295)、兔抗p-JNK多克隆抗体(批号：WL01813)、兔抗GAPDH多克隆抗体(批号：WL01114)、兔抗c-jun多克隆抗体(批号：WL02863)、兔抗c-fos多克隆抗体(批号：WL03699)、兔抗TRAF3多克隆抗体(批号：WL04574)购自沈阳万类生物技术有限公司。
实施例1北青龙衣多糖提取、分离纯化及性质
1.1提取分离纯化
本发明以北青龙衣干燥果皮为研究对象，在传统水提醇沉法上进行改进，使用闪式提取器对北青龙衣成分进行提取，再通过梯度醇沉法得到北青龙衣粗多糖，通过大孔树脂AB-8吸附除色素，选用DEAE-52纤维素层析柱对北青龙衣粗多糖进行初步分离，随后选用Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析柱对多糖进一步纯化、冷冻干燥得到组分单一的北青龙衣多糖。
1.1.1方法
(1)将干燥的北青龙衣粉碎制成北青龙衣粉末，称取北青龙衣粉末100g于烧杯中，按料液比1:30，向烧杯中加入3000mL、90℃蒸馏水，闪式提取器(5000r/min；30s/次)提取两次，过滤得水提液。水提液离心(4500r/min)5分钟，取上清液，抽滤后收集滤液。将滤液减压浓缩至原体积的1/3，缓慢加入95％乙醇，快速搅拌，使溶液中乙醇浓度达到20％，静置过夜，得到沉淀Ⅰ和上清液Ⅰ。重复上述步骤，在上清液Ⅰ中加入乙醇，使溶液中乙醇终浓度达到40％，静置过夜，得到沉淀Ⅱ和上清液Ⅱ。重复上述步骤，在上清液Ⅱ中加入乙醇，使溶液中乙醇终浓度达到60％，静置过夜，得到沉淀Ⅲ和上清液Ⅲ。重复上述步骤，在上清液Ⅲ中加入乙醇，使溶液中乙醇终浓度达到80％，静置过夜，得到沉淀Ⅳ和上清液Ⅳ。将沉淀Ⅰ、沉淀Ⅱ、沉淀Ⅲ、沉淀Ⅳ用无水乙醇洗涤数次，冷冻干燥，分别得到北青龙衣粗多糖PJP20、PJP40、PJP60、PJP80粉末，计算得率。
多糖得率计算公式：多糖得率(％)＝多糖质量/原料质量×100％
(2)脱色：精密称取北青龙衣粗多糖5g，溶解于100mL蒸馏水中，加入50g AB-8大孔树脂，磁力搅拌器搅拌2h进行脱色，真空抽滤，将滤液冷冻干燥。
(3)紫外光谱扫描：称取适量(50-100mg/mL)脱色后的粗多糖，超纯水溶解，紫外可见分光光度计进行全波长扫描(900-190nm)。
(4)北青龙衣粗多糖含量测定：精密称取恒重葡萄糖标准品10mg，超纯水定容至10mL，浓度为1mg/mL，作为母液。用移液枪分别吸取0μL、100μL、200μL、400μL、600μL、800μL、1000μL葡糖糖母液于试管中，加超纯水至体积为1mL，随后向各试管中分别加入苯酚(5％；1mL)溶液和5倍体积浓硫酸，震荡后，沸水浴15min，冷却，波长490nm下测定各试管中溶液吸光值。每组平行测定三次，取平均值，超纯水为空白对照，浓度(mg/mL)为横坐标，吸光值(A)为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。按照上述方法配制0.5mg/mL多糖样品溶液，测定吸光值，将其带入葡萄糖标准曲线中，计算北青龙衣粗多糖中多糖含量。
(5)DEAE-52纤维素层析柱分离脱色后的粗多糖
①DEAE-52纤维素活化：称取干燥的DEAE-52纤维素30g，加入适量超纯水搅拌30分钟充分溶胀，静置后将浮于表面的填料倒掉，抽滤后向填料中加入0.5mol/L的NaOH溶液浸泡2h，超纯水洗至中性，重复上述步骤将填料依次浸泡于同浓度HCl溶液和NaOH溶液中2h，超纯水反复抽洗填料至中性，准备装柱。
②装柱：向层析柱中加入适量超纯水对柱子进行润洗。装柱前应对填料进行排除气泡，然后将纤维素沿柱壁倒入层析柱中，用适量超纯水将柱壁上残留的填料冲干净，打开层析柱下端出水阀，保证填料表面平整，超纯水液面高于填料表面3-5cm时关闭出水阀，静置过夜。
③平衡：将恒流泵与层析柱连接好后，对层析柱进行平衡，打开恒流泵和层析柱出水阀，控制恒流泵的速度为1mL/min，平衡3-5个柱体积，平衡完成后用pH试纸再次检测流出液是否为中性，准备上样。
④上样：精密称取北青龙衣粗多糖(PJP80脱色后)80mg，超纯水溶解，配置成10mg/mL的溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，吸取8mL滤液沿柱壁缓慢加入层析柱中，用适量超纯水将残留在层析柱内壁上的样品冲净，使样品全部分布于填料表面，静置待样品完全进入填料中，打开出水阀，液面与填料表面平齐后，关闭出水阀，加入洗脱液，使液面高于填料表面3-5cm。
⑤洗脱：NaCl溶液梯度洗脱(0-0.5mol/L)，每个浓度200mL，1mL/min、2mL/管收集洗脱液，苯酚-硫酸法检测吸光值，绘制洗脱曲线，合并同浓度洗脱峰，放入透析袋中，流动水中放置24h，透析完成后冷冻干燥，可以得到北青龙衣多糖PJP80-I。
(6)Sephadex G-50凝胶层析柱纯化多糖
①Sephadex G-50凝胶活化：称取适量干燥凝胶干粉，室温下用浓度为50-60％乙醇溶液浸泡24h，不断搅拌使其充分溶胀，静置后倒掉乙醇并用超纯水反复抽洗至无醇味，准备装柱。
②装柱：将装柱器安在层析柱上，并用适量超纯水对柱子进行润洗。将凝胶快速倒入装柱器中，使其缓慢均匀进入到层析柱中，并不断敲打柱子排出填料中的气泡，用适量超纯水将柱壁上残留的填料冲干净，打开层析柱下端出水阀，保证填料表面平整，超纯水液面高于填料表面3-5cm时关闭出水阀，拆下装柱器，静置过夜。
③平衡：选用超纯水作为洗脱液对层析柱进行平衡。打开恒流泵和层析柱出水阀，控制恒流泵的速度为0.3mL/min，平衡5-6个柱体积。
④上样：精密称取北青龙衣多糖PJP80-I 50mg，5mL超纯水溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，吸取5mL滤液沿柱壁缓慢加入层析柱中，用适量超纯水将残留在层析柱内壁上的样品冲净，使样品全部分布于填料表面，静置待样品完全进入填料中，打开出水阀，液面与填料表面平齐后，关闭出水阀，加入洗脱液，使液面高于填料表面3-5cm。
⑤洗脱：自动收集器流速1mL/3min，1mL/管收集洗脱液，绘制洗脱曲线，洗脱液冷冻干燥得北青龙衣精多糖PJP80-Ia。
1.1.2实验结果
(1)制备北青龙衣粗多糖：基于北青龙衣粉末重量，经公式计算，北青龙衣粗多糖的得率为6.97％。其中PJP20得率为4.17％、PJP40得率为1.62％、PJP60得率为0.77％、PJP80得率为0.41％。PJP20和PJP40得率较高原因可能是由于溶液中醇浓度较低导致除多糖外的其他杂质夹杂在沉淀中。
(2)北青龙衣粗多糖紫外光谱分析：北青龙衣粗多糖的紫外全波长扫描图谱显示，在波长260-280nm之间并未出现特征吸收峰，说明北青龙衣粗多糖中不含核酸、蛋白质等杂质。
(3)北青龙衣粗多糖分离纯化：利用DEAE-52层析柱对粗多糖进行分离，洗脱曲线如图1所示。通过洗脱曲线可知，共分离出3种不同的组分，分别命名为PJP80-I、PJP80-Ⅱ、PJP80-Ⅲ，得率分别为35.3％、31.25％、18.75％。由于PJP80-I在超纯水洗脱时有单一对称峰，并且在3个组分中得率较高，因此选择收集该洗脱峰，进行富集、透析、冻干处理，准备进一步纯化。
利用Sephadex G-50凝胶柱层析对PJP80-I进行纯化，绘制洗脱曲线发现，只呈现一个对称洗脱峰，说明多糖纯度较好，无其他杂质，将其命名为PJP80-Ia，富集并冻干，准备进一步研究。
(4)北青龙衣多糖含量测定：葡萄糖浓度(mg/mL)与吸光度(A)的标准曲线方程为Y＝2.5231X+0.0369，R2＝0.9993，说明葡萄糖浓度在0-1.0mg/ml之间与吸光值线性关系良好，具有统计学意义。计算北青龙衣粗多糖PJP20、PJP40、PJP60、PJP80及北青龙衣多糖PJP80-I、PJP80-Ⅱ、PJP80-Ⅲ和PJP80-Ia中糖含量，如表1所示。
由表1可知，北青龙衣粗多糖PJP20、PJP40、PJP60、PJP80糖含量分别为25.06％±0.45％、31.47％±0.38％、45.07％±0.51％、54.55％±0.76％。随醇浓度的提高，北青龙衣多糖沉淀中无机盐、蛋白质等杂质会越来越少，多糖含量也会逐渐增高。北青龙衣多糖PJP80-I、PJP80-Ⅱ、PJP80-Ⅲ糖含量分别为89.98％±0.52％、64.13％±0.06％、59.30％±0.32％。经DEAE-52纤维素层析柱分离、G-50凝胶柱纯化的北青龙衣多糖PJP80-Ia糖含量为97.51％±0.19％，北青龙衣粗多糖经分离纯化后糖含量得到了明显的提高。
表1北青龙衣多糖含量
1.2性质
1.2.1实验方法
(1)I2-KI反应：向配好的碘-碘化钾溶液中加入适量北青龙衣多糖溶液，混合均匀，避光处反应，观察溶液颜色。溶液变为蓝色或紫红色，证明多糖中含有淀粉；颜色无变化，证明多糖中不含有淀粉。
(2)苯酚-硫酸反应：方法与实施例1的1.1.1(4)相同。
(3)Molisch(α-萘酚)反应：Molisch反应是鉴别糖类常用方法，糖在强酸作用下形成糠醛与α-萘酚反应，产物为紫红色。将配好的Molisch试剂与北青龙衣多糖溶液混合，观察是否有紫红色环出现。
(4)FeCl3反应：将FeCl3溶液与适量北青龙衣多糖溶液混合，观察溶液颜色。溶液颜色若呈紫色，证明糖中含有酚类物质；若呈现绿色或兰黑色或生成绿色或兰黑色沉淀，证明多糖中含有鞣质。
(5)斐林试剂反应：斐林试剂可用来鉴别还原糖。将配制好的斐林试剂倒入北青龙衣多糖溶液中，水浴加热，观察反应是否生成砖红色氧化亚铜沉淀，鉴别多糖中是否有还原性糖。
(6)硫酸-咔唑反应：将硫酸-咔唑溶液中加入北青龙衣多糖溶液，观察溶液颜色。溶液呈紫红色，证明多糖中含有糖醛酸；溶液呈蓝绿色，证明多糖中不含有糖醛酸。
(7)北青龙衣多糖溶液的表观粘度测定：将北青龙衣多糖配置成2g/L的溶液，20℃，剪切速率为1r/s-100r/s，测定多糖表观粘度。
1.2.2实验结果及分析
(1)PJP80-Ia理化性质结果如表2所示。由表2可知，苯酚-硫酸和Molish试剂反应两种鉴别糖类物质的方法均使溶液颜色发生了变化，进一步证明所提物质为糖类化合物；北青龙衣多糖溶液与斐林试剂反应没有生成砖红色沉淀，证明多糖中不含有还原糖；与硫酸咔唑反应溶液颜色无变化，推断多糖中不含有糖醛酸，与红外结果一致。与I2-KI反应，溶液颜色无变化，证明多糖中不含有淀粉；溶液与FeCl3反应，溶液既没有呈现紫色也无绿色或兰黑色，证明多糖中不含有酚类及鞣质等杂质。
表2 PJP80-Ia理化性质
(2)PJP80-Ia表观粘度测定：经检测，PJP80-Ia的表观粘度与剪切速率呈负相关性，出现剪切稀释的现象，呈现假塑型行为，证明北青龙衣多糖溶液为“非牛顿流体”。在较低剪切速率下，北青龙衣多糖PJP80-Ia具有较高的粘度，可能是由于多糖分子链相互缠绕，分子间具有较大的摩擦力和静电力，粘性阻力较高；当剪切速率加快时，分子间作用力被破坏，粘性阻力随之减小，多糖表观粘性下降；当剪切速率达到一定程度时，多糖分子链之间形成较稳定结构，表观粘度不再受剪切速率的影响，具有良好的稳定性。
综上所述，本实施例通过闪式提取和醇沉法得到北青龙衣粗多糖PJP20、PJP40、PJP60、PJP80，计算得出粗多糖得率分别为4.17％、1.62％、0.77％、0.41％，糖含量分别为25.06％±0.45％、31.47％±0.38％、45.07％±0.51％、54.55％±0.76％。对糖含量最高的PJP80进行进一步的分离纯化。AB-8大孔树脂吸附脱色，DEAE-52纤维素层析柱对其进行初步分离，NaCl溶液(0-0.5mol/L)作为洗脱液，收集到PJP80-I、PJP80-Ⅱ、PJP80-Ⅲ三个组分，其中PJP80-I洗脱峰单一对称，得率为35.3％，糖含量为89.98％±0.52％。采用SephadexG-50凝胶层析柱对PJP-I进行纯化，超纯水作为洗脱液，根据洗脱曲线可知，在90-110管之间存在单一对称洗脱峰，收集半峰宽洗脱液，冻干后得到北青龙衣多糖PJP80-Ia，得率为59.7％，糖含量为97.51％±0.19％，纯度较好。北青龙衣多糖PJP80-Ia质地为淡黄色粉末状，无味，易溶于水，不溶于有机试剂。理化性质分析表明PJP80-Ia为糖类物质，且不含有淀粉、酚类及糖醛酸等成分。表观粘度的测定发现，PJP80-Ia溶液具有非牛顿假塑性流体的典型特征，稳定性良好。
实施例2北青龙衣多糖PJP80-Ⅰa的初级结构、高级结构
2.1初级结构
多糖是一种资源丰富的生物大分子，由于多糖的单糖种类及连接方式不同，使得多糖结构呈现复杂多样性。受多糖结构影响，多糖具有多种药理作用，多糖结构由一级结构和高级结构组成，初级结构包括多糖相对分子量、单糖组成、糖苷键类型及结合方式等，是探索多糖高级结构的基础。本发明通过高效液相色谱、傅里叶红外色谱(FTIR)、拉曼光谱、核磁共振波谱(NMR)等方法测定北青龙衣多糖PJP80-Ia的纯度、相对分子量、糖苷键类型、结构连接位点等分析北青龙衣多糖PJP80-Ia的初级结构，为后续高级结构以及生物活性分析奠定基础。
2.1.1实验方法
(1)红外光谱测定：精密称取干燥溴化钾粉末100mg和PJP80-Ia 1mg，玛瑙研钵研磨均匀，进行压片，将压片放入提前预热好的红外光谱仪中进行检测，测定范围在400-4000cm-1之间。
(2)拉曼光谱测定：精密称取干燥PJP80-Ia样品4mg，将其均匀分布在载玻片上，置于拉曼光谱仪中进行测定。拉曼光谱仪运行参数：激光功率14mW、激光收集波长785nm、选用50倍长焦距物镜观测、测定范围400-3000cm-1。
(3)纯度鉴定及分子量测定：选用高效液相色谱法测定PJP80-Ia样品的纯度及相对分子量大小。
①纯度测定：称取适量PJP80-Ia样品，超纯水溶解，配制成2mg/mL的多糖溶液，0.45μm微孔水系滤膜过滤后进行测定，仪器参数为：Ultrahygrogel(7.8×300mm)柱、流动相：超纯水、流速：0.8mL/min、检测器：RX、柱温：30℃、进样量：20μL/次。
②分子量测定：精密称取不同分子量葡聚糖标准品(T5、T10、T30、T50、T70、T110)2mg，1mL超纯水溶解，0.45μm微孔水系滤膜过滤测定，仪器参数与纯度测定参数相同。以保留时间为横坐标，分子量对数为纵坐标，绘制葡聚糖标准曲线，计算样品分子量大小。
(4)检测PJP80-Ia单糖组成：采用高效液相法测定北青龙衣多糖PJP80-Ia单糖组成。
①北青龙衣多糖PJP80-Ia水解：精密称取5mg北青龙衣多糖PJP80-Ia于具塞试管中，加入2mol/L三氟乙酸(TFA)溶液2mL，烘箱120℃水解6h，蒸干TFA，加入甲醇反复洗涤，除去残存TFA，干燥后加入适量超纯水溶解，得到多糖水解液。
②PMP衍生化：移取200μL水解液于离心管中，加入等体积PMP甲醇溶液(0.5mol/L)和NaOH(0.3mol/L)溶液，摇匀后70℃水浴100min。待反应结束，等体积HCl(0.3mol/L)溶液中和，适量氯仿进行萃取，重复三次，吸取水层，0.22μm滤膜过滤，得到衍生化多糖样品。精密称取甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖10mg，加入超纯水配置成1mg/mL单糖标准品和混合标准品溶液，进行衍生化。
③绘制单糖标准曲线：将衍生化单糖标准品、混合标准品和多糖样品进样检测，判断北青龙衣中单糖组成，选取对应单糖标准品，按照1、2、4、6、8、10μL进样，单糖浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制单糖标准曲线。
④色谱条件：WatersX-BridgeC18色谱柱，柱温30℃，245nm(UA)，流动相：乙腈-PBS(0.05mol/L、pH6.8)＝20：80，流速0.8mL/min；进样量10μL。
(4)核磁共振测定：将北青龙衣多糖PJP80-Ia样品溶解于重水(D2O)中，减压干燥，重复3-4次。称取冻干样品40mg，0.6mL D2O溶解，在核磁共振波谱仪中进行核磁一维和二维的测定。
2.1.2实验结果分析
(1)红外光谱分析：根据北青龙衣多糖PJP80-Ia红外图谱，推断多糖PJP80-Ia含有表3中所示官能团。北青龙衣多糖PJP80-Ia在波长3402cm-1处有强吸收峰，为O-H伸缩振动；2926cm-1有糖类特征吸收峰，归属为C-H伸缩振动；C-H变角振动位于1423cm-1、1235cm-1左右，属于多糖特征吸收峰；1635cm-1处为多糖水合振动吸收峰；1145、1051cm-1处出现的吸收峰，可能归因于吡喃糖环中C-O伸缩振动，推测样品可能含有吡喃糖环；根据860cm-1、901cm-1的吸收峰，推测样品中可能同时存在α和β两种构型的糖苷键。此外，在1745cm-1左右没有出现吸收峰，推断样品中不含有羧基，与硫酸咔唑实验结果一致。由此判断北青龙衣多糖PJP80-Ia是一种具有α、β两种构型糖苷键且以吡喃糖为骨架的多糖。
表3PJP80-Ia官能团红外吸收
(2)拉曼光谱分析：根据北青龙衣多糖PJP80-Ia拉曼图谱，发现在435cm-1、601cm-1、680cm-1、1080cm-1、1459cm-1出现了糖类物质吸收峰，表明PJP80-Ia为糖类化合物；依据851cm-1和899cm-1处吸收峰推测样品中可能同时存在α和β两种构型的糖苷键；926cm-1处吸收峰表明多糖中存在C-O-C伸缩振动；在1246cm-1、1459cm-1处吸收峰表明多糖中存在C-H变角振动，与北青龙衣多糖PJP80-Ia红外图谱分析结果具有一致性。
(3)纯度及分子量测定结果
①绘制葡聚糖标准曲线:葡聚糖的标准曲线方程为Y＝-0.3131X+8.3688，R2＝0.9982，其中，X为时间(min),Y为Lg(Mw),经检测，分子量测定范围在5000-110000Da之间。
②青龙衣多糖PJP80-Ia纯度及分子量：根据PJP80-Ia色谱图发现样品PJP80-Ia出峰时间为13.744min，只有一个单一对称峰，由此判断PJP80-Ia分子量分布均一，纯度较好。将保留时间带入葡聚糖标准曲线中计算北青龙衣多糖PJP80-Ia分子量为11630Da。
(4)单糖组成：根据甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖以及单糖混合标品和北青龙衣多糖衍生化样品的高效液相色谱图，获得了六种单糖标准品和单糖混标的保留时间，如表4所示。根据保留时间对比，北青龙衣多糖PJP80-Ia由甘露糖和葡萄糖组成。甘露糖标准曲线为Y＝31.68X-2.5703，R2＝0.9997，单糖浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y；葡萄糖标准曲线为Y＝50.131X-2.435，R2＝0.9997，单糖浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y。通过计算得出北青龙衣多糖PJP80-Ⅰa中甘露糖和葡萄糖摩尔比为0.29：0.70。
表4单糖和单糖混合标准品组分保留时间
(5)核磁共振波谱分析
在多糖1H-NMR中，糖环碳上的质子谱峰大多数集中在δ3.0-4.0ppm之间，且重叠严重，无法进行准确解析；异头氢质子化学位移通常集中在4.3-5.5ppm之间，便于解析，可用于判断多糖中糖苷键构型：α构型δ＞4.9ppm、β构型δ＜4.9ppm。根据北青龙衣多糖PJP80-Ia核磁共振氢谱图可知，样品异头氢区域有6种信号峰，化学位移在4.41ppm-5.30ppm之间，按照位移从大到小依次命名为A、B、C、D、E、F，表明多糖PJP80-Ia中存在α和β两种构型糖苷键。此外，3.1-4.2ppm之间的信号峰为吡喃糖环质子的信号峰，说明PJP80-Ia具有吡喃糖环，结果与红外结果一致。
多糖13C-NMR中异头碳化学位移常分布于90-110ppm，用来确定糖残基种类、构型及连接方式等，一般情况下，化学位移小于103ppm的异头碳为α构型，化学位移超过103ppm的异头碳归属为β构型。碳谱还可以对多糖的糖环构型进行区分，吡喃糖C3、C5的化学位移一般处于60-80ppm之间，而呋喃糖则处于δ82-84ppm之间。根据PJP80-Ia核磁共振碳谱可知，在δ60.06-80.65ppm之间出现了吡喃糖C3、C5信号峰，进一步证明PJP80-Ia为吡喃糖环构型的多糖；北青龙衣多糖PJP80-Ia的异头C信号峰在δ91-104ppm之间，说明多糖中存在α、β两种构型。
通过分析北青龙衣多糖PJP80-Ia二维1H-H COSY、HMBC、HMQC图谱得出6种糖残基归属信息，残基A、B、C、D、E、F所对应的H-1、C-1信号分别为5.30/92.18ppm、5.30/92.06ppm、5.13/91.94ppm、5.08/101.44ppm、4.55/95.78ppm、4.41/102.59ppm，经分析得出，残基A归属于[(1→3)-α-D-Manp]、E为β-Reducing-D-Glcp、F归属于[→6)-β-D-Glcp(→1]，残基B、C、D由于信号较弱无法进行归属。表5列出了3种糖残基的1H、13C化学位移。综上所述，推断北青龙衣多糖PJP80-Ⅰa含有α和β构型糖苷键，由[(1→3)-α-D-Manp]、β-Reducing-D-Glcp及[→6)-β-D-Glcp(→1]组成。
表5PJP80-Ia的1H、13C的化学位移
综上所述，本实施例研究了北青龙衣多糖PJP80-Ia的初级结构，结果如下：样品红外光谱和拉曼光谱中均出现了多糖类化合物的特征吸收峰，证明PJP80-Ia是多糖化合物，在850cm-1、901cm-1均出现了吸收峰，证明北青龙衣多糖中可能同时含有α和β构型的糖苷键。利用HPLC对北青龙衣多糖PJP80-Ia的纯度、分子量以及单糖组成进行分析，结果表明，多糖PJP80-Ia纯度较高，分子量为11630Da，由甘露糖和葡萄糖两种单糖组成，摩尔比为0.29：0.70。NMR推断PJP80-Ia糖链主要由[(1→3)-α-D-Manp]、β-Reducing-D-Glcp及[→6)-β-D-Glcp(→1]连接而成。
2.2PJP80-Ⅰa的高级结构
本实施例主要通过刚果红实验、示差扫描量热法、粒径及电位测定、X-射线衍射(XRD)、扫描电镜(SEM)以及原子力显微镜(AFM)观测等方法，对北青龙衣多糖PJP80-Ia的螺旋结构、热稳定性、粒径大小、电荷性质、晶体特性、表观形貌及链构象等高级结构进行分析测定。
2.2.1实验方法
(1)刚果红实验：将刚果红溶液、NaOH溶液、PJP80-Ia多糖溶液加入试管中形成混合液体(3-5mL)，使试管中混合液体的PJP80-Ia多糖终浓度达到1mg/mL，NaOH终浓度由0.0mol/L逐渐增加至0.5mol/L,刚果红终浓度为40μmol/L；另取试管，将多糖溶液换成超纯水，其他条件不变，作为空白对照。将试管中溶液充分混合均匀，室温下静置一段时间，用紫外分光光度计在400-600nm之间进行扫描，记录最大吸收波长。NaOH浓度为横坐标，最大吸收波长为纵坐标，绘制曲线。
(2)热特性测定：实验采用热重及示差扫描量热法来测定PJP80-Ia的热稳定性。精密称取13.84mgPJP80-Ia样品，氮气环境下测定。测定温度范围设置在20-400℃之间，仪器加热速度为10℃/min，待温度降为20℃，得到样品TGA-DSC曲线。
(3)粒径及电位测定：称取PJP80-Ia0.2mg，超纯水溶解，配制成0.1mg/mL的溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，进行测量，测定3次取均值。
(4)X-射线衍射(XRD)测定：精密称取北青龙衣多糖10mg，研磨成细腻均匀粉末后使用X-射线衍射仪进行晶体特性的测定。仪器运行参数为：Cu靶，Kα为辐射源，管压设为40kV，管流量设为50mA，连续扫描角度设为10-80°(2θ)，扫描角度设为3°/min。
(5)场发射扫描电镜(SEM)测定：称取适量PJP80-Ia，样品贴好导电胶，置于样品台上，将试样台置于离子发射装置中，喷金后电镜下观测，15kV加速电压，放大倍数分别为200、1K、5K、19.83K、20K、40K倍。
(6)原子力显微镜(AFM)观测：超纯水配制1mg/mL PJP80-Ia溶液，磁力搅拌2h，保证样品完全溶解。将溶液稀释成10ng/mL，磁力搅拌4h，0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液。滴加适量氯化镍溶液于云母片上，30s后超纯水冲洗干净，移液枪移取滤液20μL滴在新鲜云母片上，30s后超纯水冲洗干净，室温自然干燥后，利用原子力显微镜对样品表观形貌进行观测。
2.2.2实验结果及分析
(1)刚果红结果：刚果红是一种酸性染料，可以测定多糖的三股螺旋结构，三股螺旋结构与刚果红产生配合物，随氢氧化钠浓度的增大，其最大吸收波长减小，并出现明显的红移。根据刚果红实验结果，北青龙衣多糖PJP80-Ia与刚果红形成的配合物随着NaOH浓度增加发生了红移，说明多糖具有螺旋结构，但在NaOH浓度超过0.2mol/L后，最大吸收波长逐渐趋于稳定，并没有急剧下降，由此推断北青龙衣多糖PJP80-Ia不具有三股螺旋结构。
(2)热特性测定结果：根据热特性实验发现，北青龙衣多糖PJP80-Ⅰa样品在20-400℃之间发生了三次失重现象。第一次失重发生在起始温度到140℃之间，失重率为5.7％，在105-140℃之间出现较小吸热峰，吸热峰值为135.48℃，这一阶段可能由于升温使多糖中水分蒸发所导致；第二次失重发生在140-290℃之间，此时多糖质量损失较大，损失率为26％，在140-224℃之间也出现了较大吸热峰，吸热峰值为173.66℃，此时多糖失重速率最快，可能是由于高温破坏了多糖的化学键，导致多糖发生剧烈的分解；第三次失重在290-400℃之间，多糖质量损失较小，失重率为4.5％，这一阶段可能是多糖中剩余物质的转化分解所导致的。实验表明在170℃之内青龙衣多糖具有较好的热稳定性。
(3)粒径及电位测定结果
①北青龙衣多糖PJP80-Ia的粒径分布：多糖在溶液中以聚集体的形式存在，其粒度大小和分散系数，能够体现出在溶液中多糖粒度分散程度。根据PJP80-Ia粒径分布检测结果，北青龙衣多糖PJP80-Ia的平均粒径(Z-Ave)为227.2nm，分散系数(PDI)值为0.254，呈现出窄而对称的信号峰，说明多糖在溶液中粒度分布范围较集中，同时证明北青龙衣多糖PJP80-Ia纯度较高，与HPLC结果相互验证。
②北青龙衣多糖PJP80-Ia的Zeta电位测定：多糖的Zeta电位大小表示多糖表面所带静电荷，可以反映多糖在水溶液中的稳定性。Zeta电位绝对值越高，粒子间排斥力越大，不易发生聚集，粒子在溶液中形态越稳定；反之，多糖在溶液中体系越不稳定，容易发生凝结或聚集。根据北青龙衣多糖PJP80-Ia的Zeta电位检测结果可知，多糖的平均电位为-0.1mV，说明多糖几乎不带电荷，为中性多糖，但由于电位低，推断北青龙衣多糖在溶液中不稳定，易发生聚集。
(4)X-射线衍射(XRD)测定结果：X-射线衍射常用于检测物质是否具有晶体结构，晶体材料中一般会出现窄而尖锐的衍射峰，非晶体则会出现宽衍射峰。检测结果表明(表6)，北青龙衣多糖PJP80-Ia在衍射角10-80°之间PJP80-Ia具有无定形结构，但在28.2°和40.5°出现了两个窄而尖锐的强衍射峰，说明多糖样品中存在部分晶体结构。经过分析，两个衍射峰的晶面间距分别为 晶粒尺寸分别为94.9nm、65.0nm；结晶度分别为64.04％和73.98％。对其晶胞参数进行分析，结果显示晶胞的三个边(a、b、c)等长，长度为/>夹角α、β、γ均为90°，因此推测多糖样品中结晶主要由立方晶系晶胞组成。北青龙衣多糖PJP80-Ia的X-射线衍射图谱相关参数见表6。
表6 PJP80-Ia的X-射线衍射图谱相关参数
(5)场发射扫描电镜(SEM)测定结果：通过场发射扫描电镜可以直观对多糖表面的微观结构进行观察。检测结果表明，北青龙衣多糖PJP80-Ia在放大200倍观察的条件下，北青龙衣多糖PJP80-Ia由大体积不规则的片状和块状聚集体构成，表明多糖中存在无定形结构，与XRD分析具有一致性。高倍镜下(1K倍)观察发现聚集体表面颗粒状突起，将颗粒状突起放大40K倍发现突起表面有少量微小较规整颗粒状聚集体，查阅文献发现，岩藻多糖以及海参内脏多糖在高倍镜下也出现了较为规则的颗粒结构，同时两种多糖的XRD结果显示多糖中也具有结晶结构。推测微小颗粒状聚集体可能为多糖样品中的晶粒，且尺寸大小与X-射线衍射结果相似。
(6)原子力显微镜(AFM)观测结果：多糖PJP80-Ia在云母片上形成了不规则的链状和环状结构，同时伴有分支，立体图像呈大小不一的山峰状，表明多糖分子间具有一定聚集性，推测多糖分子结构中存在支链结构，与平面图结果相一致，同时验证了多糖化学结构高度支化的性质。环状分子链链宽在150nm-250nm之间，链高在4nm-13nm之间，最大环径大约为1250nm。由于单一多糖分子链高度通常在0.1-1.0nm之间，北青龙衣多糖分子链高度远高于单一多糖分子链高度，进一步说明多糖中可能带有支链，相互缠绕堆叠，形成聚集体，与扫描电镜观察结果相对应。导致多糖分子间发生聚集的原因可能为：北青龙衣多糖的羟基使得北青龙衣多糖具有很强亲水性，进一步增强了分子间氢键、范德华力等相互作用力，引起多糖分子发生聚集；其次通过对北青龙衣多糖Zata电位分析得知，北青龙衣多糖在PJP80-Ia溶液中不稳定，易发生聚集，糖链彼此缠绕，构成不规则的、不同尺寸的链状和环形结构。
综上所述，本实施例通过刚果红实验、示差扫描量热法、粒径及电位测定、XRD、SEM以及AFM观测等方法，对北青龙衣多糖PJP80-Ia的螺旋结构、热稳定性、粒径大小、电荷性质、晶体特性、表观形貌及链构象等高级结构进行分析测定。刚果红实验发现，北青龙衣多糖PJP80-Ia不具有三股螺旋结构；热特性分析发现，北青龙衣多糖在20-400℃之间发生了三次失重。第一次失重发生在起始温度到140℃之间，失重率为5.7％，由于升温使多糖中水分蒸发所导致；第二次失重发生在140-290℃之间，损失率为26％，温度达到173.66℃多糖发生剧烈分解，表明在170℃之内青龙衣多糖具有较好的热稳定性。粒径及Zata电位测定显示青龙衣多糖PJP80-Ia的平均粒径(Z-Ave)为227.2nm，分散系数(PDI)值为0.254，说明多糖在溶液中粒度分布范围较集中且纯度较高；Zata电位显示，北青龙衣多糖为中性多糖。X-射线衍射显示，多糖样品中同时存在晶体结构和无定形结构，呈现半结晶结构。扫描电镜观察北青龙衣多糖PJP80-Ia由不规则的片状和块状聚集体构成。高倍镜下观察发现突起表面有少量微小颗粒状聚集体，推测微小颗粒状聚集体可能为多糖样品中的晶粒。链构象表征发现北青龙衣多糖PJP80-Ia分子间发生了聚集，糖链间缠绕堆叠，形成了不规整且大小不一的链形和环形结构。
实施例3PJP80-Ⅰa活性研究
为了探究青龙衣多糖的抗肿瘤活性，本实施例以人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和人乳腺癌细胞MCF-7三种癌细胞为研究对象，测定北青龙衣多糖PJP80-Ia的抗肿瘤活性。通过DPPH、ABTS和FRAP三种抗氧化方法来测定分析北青龙衣多糖PJP80-Ia的体外抗氧化活性，以利于后续北青龙衣多糖的应用。
3.1实验方法
(1)HepG2、SMMC-7721、MCF-7细胞的培养
①DMEM/F-12培养基的配制：将灭活后的胎牛血清和DMEM/F-12培养基按照体积比1:9的比例，混合均匀后，经0.22μm滤膜过滤后，封口膜密闭，4℃冰箱保存。
②PBS的配制：精密称取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸氢二钾0.24g，超纯水配置成1000mL，高压灭菌，用封口膜密封瓶口，4℃冷藏。
③MTT溶液的配制：PBS缓冲液配置MTT溶液(5mg/mL)，避光，4℃冷藏。
④北青龙衣多糖PJP80-Ia溶液的配制：精密称取适量PJP80-Ia，加入超纯水溶解，配制成1mg/mL的母液。按照倍半稀释法，将母液稀释为500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、32.25μg/mL、15.625μg/mL，备用。使用前0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
⑤细胞复苏：取出冻存细胞，迅速放入37℃水浴锅内，摇晃使其快速融化。细胞和培养基移至离心管中，离心(1000rmp/5min)，弃上清。加适量培养基，吹匀后接种于培养瓶中，CO2恒温培养箱中培养。
⑥细胞传代：将培养瓶中原液倒掉，加入PBS缓冲液3mL，培养瓶横向摇动，润洗细胞2-3次，吸出PBS，1mL胰酶消化液进行消化。显微镜观察细胞逐渐变圆，快速加入培养基停止消化。吹打成细胞悬液，加入到离心管中，1000rmp/5min，吸出上清液。加适量培养基，吹匀后接种于培养瓶中，CO2恒温培养箱中培养。
(2)测定北青龙衣多糖PJP80-Ia抗肿瘤活性：按上述步骤对对数生长期细胞进行消化。细胞悬液离心，弃上清，加入培养基，将细胞浓度稀释成4×104个/mL，加到96孔板中，每孔100μL，孔板边缘一圈用PBS缓冲液填充。CO2恒温培养箱中培养24h，准备给药。24h后进行给药。依次加入1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、32.25μg/mL、15.625μg/mL的PJP80-Ia溶液100μL，每个浓度6组平行试验，培养基为空白对照。给药后培养72h。每孔加入10μLMTT溶液，4h后吸出，加入150μL DMSO溶液，振荡至结晶完全溶解后，在波长570nm下测定各孔吸光值，计算细胞抑制率。
抑制率(％)＝(1-给药组平均OD值/空白组平均OD值)×100％
(3)测定北青龙衣多糖PJP80-Ia对DPPH自由基清除能力
①北青龙衣粗多糖PJP80和多糖PJP80-Ia溶液的配制：精密称取PJP80和PJP80-Ia样品25mg，超纯水定容至10mL。样品溶液梯度稀释为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL溶液，备用。
②DPPH溶液的配制：精密称取DPPH 2.5mg，无水乙醇溶解，配制成浓度为0.05mg/mL溶液，室温避光放置。
③阳性对照品溶液的配制：将阳性对照品溶液配制成2.5mg/mL，再经梯度稀释为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL溶液，避光放置，备用。
④将各浓度PJP80、PJP80-Ia样品溶液与DPPH溶液等体积混匀，室温暗处静置30min后，在波长517nm下测定各组吸光值。无水乙醇为空白对照，Trolox为阳性对照，每组平行测定3次，取平均值，计算清除率。计算公式如下：
DPPH自由基清除率(％)＝(1-(A测定-A对照)/A空白)×100％
(3)测定北青龙衣多糖PJP80-Ia对ABTS自由基清除能力
①北青龙衣粗多糖PJP80和多糖PJP80-Ia溶液的配制：精密称取PJP80和PJP80-Ia样品25mg，超纯水定容至10mL。样品溶液梯度稀释为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL溶液，备用。
②阳性对照品溶液的配制：将阳性对照品溶液配制成2.5mg/mL，再经梯度稀释为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL溶液，避光放置，备用。
③分别取各浓度PJP80和PJP80-Ia样品溶液10μL，加入ABTS溶液190μL，混匀，室温反应6min，波长405nm下测定各组吸光值。超纯水为空白对照，Trolox作阳性对照，平行测定3次，取均值，计算清除率。计算公式如下：
ABTS自由基清除率(％)＝(A空白-A测定)/A空白×100％
(4)FRAP法测定北青龙衣多糖PJP80-Ia总抗氧化能力
①北青龙衣粗多糖PJP80和多糖PJP80-Ia溶液的配制：精密称取PJP80和PJP80-Ia样品25mg，超纯水定容至10mL。样品溶液梯度稀释为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL溶液，备用。
②标准品溶液的配制：精密称取25mg标准品FeSO4-7H2O，配制成2.5mg/mL溶液。梯度稀释成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL溶液。标准品溶液现用现配，避免氧化。
③绘制标准曲线：分别取各浓度标准品溶液，加入FRAP工作液180μL，混匀，37℃反应5min后，在波长593nm下测定各组吸光值。超纯水为空白对照，每组平行测定3次，取平均值，以标准品OD值作为横坐标，浓度作为纵坐标，绘制标准曲线。
④分别取各浓PJP80和PJP80-Ia样品溶液5μL，加入FRAP工作液180μL，混匀，37℃反应5min后，在波长593nm下测定各组吸光值。超纯水为空白对照，每组平行测定3次，取平均值。根据标准曲线，计算各组FRAP值。
3.2实验结果及分析
(1)北青龙衣多糖PJP80-Ia对人肝癌细胞HepG2增殖影响：MTT法测定PJP80-Ia对HepG2细胞增殖影响如图2A所示。PJP80-Ia对肝癌细胞HepG2具有抑制作用，在药物浓度为15.625μg/mL-500μg/mL之间呈现剂量依赖性，浓度为500μg/mL时，多糖对HepG2的抑制率为31.8％，具有显著性差异(P＜0.01)。
(2)北青龙衣多糖PJP80-Ia对人肝癌细胞SMMC-7721增殖影响：MTT法测定北青龙衣多糖PJP80-Ia对SMMC-7721细胞增殖影响如图2B所示。北青龙衣多糖PJP80-Ia对肝癌细胞SMMC-7721具有抑制作用，呈现剂量依赖性，给药浓度越高，对细胞抑制率越高，高剂量下抑制率为39.8％，具有显著性差异(P＜0.01)。
(3)北青龙衣多糖PJP80-Ia对人乳腺癌细胞MCF-7增殖影响：北青龙衣多糖PJP80-Ia对MCF-7细胞增殖影响如图2C所示。PJP80-Ia对SMMC-7721人乳腺癌细胞具有抑制作用，呈现剂量依赖性，给药浓度在1000μg/mL时，抑制率为40.3％,具有显著性差异(P＜0.01)。
(4)北青龙衣多糖PJP80-Ia对DPPH自由基清除能力测定结果：DPPH在波长517nm处有强吸收，醇溶液为紫色。加入抗氧化剂，吸收逐渐消失，吸光值降低，来判断待测样品对DPPH自由基清除能力。由图2D可知，北青龙衣粗多糖PJP80和PJP80-Ia对DPPH自由基均具有清除能力，抗氧化能力随样品浓度增大而增大，且在相同浓度下，PJP80-Ia对DPPH自由基的清除能力大于PJP80的清除能力。
(5)北青龙衣多糖PJP80-Ia对ABTS自由基清除能力测定结果：ABTS氧化生成绿色的ABTS+，抗氧化剂可抑制ABTS+产生，在波长405nm下测定其吸光值，计算样品抗氧化能力。Trolox、北青龙衣粗多糖PJP80和北青龙衣多糖PJP80-Ia对ABTS自由基的清除能力如图2E。如图2E所示，PJP-80、PJP80-Ia的清除能力与浓度呈正相关，同一浓度，PJP80-Ia对ABTS自由基的清除能力大于北青龙衣粗多糖的清除能力。
(6)FRAP法测定北青龙衣多糖PJP80-Ia总抗氧化能力结果：酸性环境下，抗氧化物质可将Fe3+-TPTZ还原成Fe2+-TPTZ，在波长593nm下测定其吸光值计算样品还原能力。用FeSO4标准溶液浓度表示样品还原能力。绘制FeSO4标准曲线，计算标准曲线方程为Y＝10.806X-0.342，R2＝0.9954，其中，x为标准品OD值，y为标准品浓度(mg/mL)。将样品组吸光值带入方程计算出，样品各浓度的FRAP值，如图2F所示。FRAP值为每毫克样品还原能力，即多少物质量FeSO4的还原能力，北青龙衣粗多糖PJP80和PJP80-Ia对Fe3+-TPTZ均具有还原能力，还原能力随着样品浓度增大而增大，且在相同浓度下，北青龙衣多糖PJP80-Ia的还原能力大于北青龙衣粗多糖的还原能力。
综上所述，本实施例通过MTT法测定了北青龙衣多糖PJP80-Ia对人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721以及人乳腺癌细胞MCF-7的抗肿瘤活性，结果表明，青龙衣多糖对上述三种肿瘤细胞均具有抑制作用，在一定的剂量之内(15.625-1000μg/mL)呈现剂量依赖性。北青龙衣粗多糖和北青龙衣多糖PJP80-Ia均可以清除DPPH、ABTS自由基，具有还原Fe3+-TPTZ的能力，具有抗氧化性。其中PJP80-Ia对DPPH自由基的清除率为79.5％、北青龙衣粗多糖的DPPH自由基清除率为59.8％；北青龙衣多糖PJP80-Ia对ABTS自由基的清除率为65.0％、北青龙衣粗多糖ABTS清除率为57.0％。实验证明北青龙衣多糖PJP80-Ia的抗氧化性大于北青龙衣粗多糖的抗氧化性。
实施例4PJP80-Ia活性
4.1PJP80-Ia对RAW264.7细胞增殖的影响
本发明选用MTT法、倒置显微镜法和流式细胞仪法考察不同浓度的北青龙衣多糖PJP80-Ia对巨噬细胞增殖，形态及细胞周期的影响，为后续确定北青龙衣多糖PJP80-Ia对巨噬细胞的免疫活性研究及免疫调节机制研究奠定基础。
实验试剂的配制
PJP80-Ia溶液：称取北青龙衣多糖PJP80-Ia 10mg加入10mL DMEM高糖培养基使其成为1mg/mL的PJP80-Ia母液。实验开始前，将PJP80-Ia母液取出稀释成不同浓度供实验研究。
LPS溶液：配制1mg/mL LPS母液，-20℃保存；使用前将LPS母液取出加入一定体积的DMEM培养液使其浓度为1μg/m L，4℃保存。
PBS缓冲液：取一灭菌洁净的容量瓶，按照配方分别加入称量好的固体粉末，用超纯水定容至500mL，充分摇匀。121℃灭菌30min，取出后置于超净操作台内平衡，降至室温后除菌过滤，分装密封存放在4℃冰箱。
MTT溶液：称取20mg MTT，加入4mL PBS溶液使其浓度为5mg/mL，避光密封存放在4℃冰箱。
4.1.1实验方法
(1)巨噬细胞RAW264.7培养：将高压灭菌后的枪头盒、离心管于紫外照射操作台灭菌30min，将配制好的完全培养基置于37℃水浴锅回温。将细胞从培养箱中取出置于显微镜下观察，若细胞密度未超过60％，但培养液呈现明亮黄色时，无需传代，更换新完全培养基即可；若细胞密度在80％-90％，则进行细胞传代。操作为：首先吸除旧培养液，加入3mL PBS清洗细胞3次，吸去PBS。另加3mL DMEM完全培养基轻轻吹打贴壁细胞，动作切勿过猛，减少泡沫产生。将吹打后的细胞悬液按照实验需求转移至新的无菌培养瓶，放置细胞培养箱中培养，设置条件：温度37℃，CO2浓度为5％。注意培养瓶的取出及送回需严格杀菌消毒，防止细胞污染。
(2)MTT法检测PJP80-Ia对巨噬细胞RAW264.7细胞增殖的影响：取生长良好的RAW264.7细胞制成细胞悬液，接种于96孔板使得每孔细胞密度为5×104个/mL，体积100μL/孔，为防止细胞自然沉降应吹打均匀，接种后放置细胞培养箱进行适应性培养，一段时间后细胞完全贴壁。实验分为空白对照组和PJP80-Ia多糖处理组，每组平行6个复孔。空白对照组加入100μL培养基，PJP80-Ia多糖处理组各组加入100μL PJP80-Ia溶液至其终浓度依次为6.25、12.5、25、50、100、200、400μg/mL。继续培养24h。吸去细胞上清后向每孔加入20μL5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h，小心吸去上清，加入150μL DMSO溶液，新增调零组，向每孔加入150μL DMSO溶液，避光震荡10分钟，溶解结晶，测定各孔OD值(490nm)，计算细胞活性(细胞存活率＝(OD药物处理组-OD调零组)/(OD空白对照组-OD调零组)×100％)。
(3)倒置显微镜检测PJP80-Ia对巨噬细胞RAW264.7细胞形态的影响：实验分组为空白对照组、阳性(LPS)对照组和PJP80-Ia处理组，每组3个平行，将位于对数生长期的RAW264.7细胞用完全培养基制成悬液，密度为1.0×106个/mL，接种于6孔板中，每孔1mL吹打均匀。培养24h后细胞贴壁，吸去RAW264.7细胞上清液，PJP80-Ia处理组加入浓度为50、100、200μg/mL PJP80-Ia溶液1mL，空白对照组按照1mL/孔加入DMEM，阳性对照组加入1mL 1μg/mL LPS，培养24h后用倒置显微镜40倍放大观察RAW264.7细胞的形态变化。
(4)流式细胞仪检测PJP80-Ia对巨噬细胞RAW264.7细胞周期的影响：实验分组及给药同方法(3)。继续培养48h，参照细胞周期与细胞凋亡检测说明书收集RAW264.7细胞，加入70％的预冷乙醇溶液1mL，于4℃环境下固定，次日离心RAW264.7细胞5min(1500r/min)，向RAW264.7细胞沉淀中加入1mL预冷PBS溶液混合均匀，再次离心RAW264.7细胞沉淀，向其中加入0.5mL预先配制的碘化丙啶(PI)染色液避光染色30min，用流式细胞仪检测荧光强度，激发波长为488nm。
(5)数据处理与分析：本实验设置3组平行，采用SPSS统计软件进行单因素ANOVA检验分析实验数据，实验所有结果用平均值±标准差(Mean±SD)表示，P<0.05代表显著差异，P<0.01代表高度显著差异，P<0.05具有统计学意义。
4.1.2实验结果
(1)PJP80-Ia多糖对巨噬细胞RAW264.7细胞增殖的影响
本实验采用MTT法测定不同浓度(6.25、12.5、25、50、100、200、400μg/mL)PJP80-Ia多糖对RAW264.7巨噬细胞增殖的影响。如表7所示，与空白对照组比较，PJP80-Ia在6.25μg/mL-400μg/mL范围内对RAW264.7细胞不具备细胞毒作用，且随着PJP80-Ia浓度的增加，促进细胞增殖作用愈加明显，同时在200μg/mL时达到峰值，出现先升高后降低的趋势，可能由于PJP80-Ia在400μg/mL时诱导的细胞增殖过度导致存活率下降，其中50、100、200μg/mL的PJP80-Ia多糖可以显著提高RAW264.7细胞的存活率且呈剂量依赖性，说明50、100、200μg/mL的PJP80-Ia多糖可促进巨噬细胞增殖，因此筛选出此三种浓度作为后续试验的给药浓度。
表7MTT法检测PJP80-Ia多糖对巨噬细胞RAW264.7细胞的存活率(n＝6)
注：与对照组相比，*：具有显著性差异P<0.05；**：具有极显著性差异P<0.01
(2)PJP80-Ia对巨噬细胞RAW264.7细胞形态的影响
结果如图3所示，正常状况下RAW264.7细胞处于未激活状态细胞体积小其形态呈圆形。经1μg/mL LPS处理24h后，RAW264.7细胞活化，出现伪足，细胞呈现不规则梭形，与空白对照组具有明显的形态差异。不同浓度PJP80-Ia(50,100,200μg/mL)作用于RAW264.7细胞24h后，也出现与LPS处理组较为相似的形态变化，细胞体积增大，形状变为长梭形或棱形，伪足伸长，但变形细胞比例小于LPS处理组。该实验结果表明，PJP80-Ia对RAW264.7细胞能够活化巨噬细胞从而促进巨噬细胞增殖，具有潜在的免疫调节活性。
(3)PJP80-Ia对巨噬细胞RAW264.7细胞周期的影响
细胞周期分为DNA合成期(S)、有丝分裂期(M)及细胞间期(G1和G2)，其分裂顺序为G1-S-G2-M。北青龙衣多糖PJP80-Ia作用小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞24h后，细胞周期发生变化(如图4和图5所示)，LPS组的G0/G1期百分比由63％下降至53.88％，S期细胞比例由19.33％上升至33.62％，而200μg/mL北青龙衣多糖PJP80-Ia的G0/G1期百分比由63％下降至53.33％，S期细胞比例由19.33％上升至27.65％。以上结果说明一定浓度的北青龙衣多糖可促进巨噬细胞RAW264.7细胞周期进程，即由G1期转向S期，促进细胞增殖，这与MTT结果一致。
综上所述，通过上述实验可以得出以下结论(1)MTT法结果表明在6.25μg/mL-400μg/mL浓度范围内，PJP80-Ia可促进RAW264.7巨噬细胞增殖，同时确定后续实验浓度。(2)倒置显微镜结果表明PJP80-Ia可促进巨噬细胞活化，从静息状态向激发状态转变，其形态变化有助于提高与外界物质的接触面积，有助于细胞吞噬。(3)流式细胞仪检测细胞周期结果表明PJP80-Ia可促进RAW264.7细胞由G1期向S期转移，促进细胞增殖。这些结论可初步确定PJP80-Ia多糖可促进RAW264.7细胞增殖、活化，而活化的巨噬细胞可启动特定的防御机制，并在免疫系统中发挥关键作用，由此说明北青龙衣多糖PJP80-Ia具有潜在的免疫调节功能。
4.2PJP80-Ia对RAW264.7细胞免疫调节活性的影响
巨噬细胞是免疫系统中的重要细胞。巨噬细胞被激活后，产生NO并释放各种细胞因子，包括肿瘤坏死因子和白细胞介素。这些细胞因子作为免疫反应的介质，调节免疫并参与促炎和抗炎作用。此外，这些细胞因子显著促进巨噬细胞的功能。NO可增强巨噬细胞的裂解和吞噬作用，是评估巨噬细胞活化的一个标志性的生物标志物。TNF-α是炎症反应的早期介质，可以促进巨噬细胞的活性。IL-1β在巨噬细胞活化中发挥重要作用，并与炎症中的TNF-α发挥协同作用。IFN-β刺激巨噬细胞引发抗病毒反应，涉及TRIF抗病毒途径，并且还具有抗肿瘤活性。IL-6可以调节细胞和体液免疫，并参与吞噬、抗原呈递和炎症调节作用。巨噬细胞被用作评估生物活性化合物的免疫调节活性的潜在细胞模型。作为巨噬细胞家族的一员，小鼠RAW264.7细胞已广泛用于免疫活性研究。在上述研究中，PJP80-Ia显著促进了巨噬细胞的活力，使细胞处于增殖迅速的活化状态。本发明从巨噬细胞的吞噬功能和分泌功能着手，考察北青龙衣多糖PJP80-Ia对巨噬细胞免疫功能的影响，包括PJP80-Ia对RAW264.7细胞吞噬能力和NO，ROS，IL-1β，IL-6，TNF-α，IFN-β的分泌水平及mRNA表达的影响，以期为北青龙衣多糖的免疫活性能力及作用提供一定的参考。
实验试剂的配制
0.1％中性红溶液：中性红0.01g溶于10mL PBS，过滤除菌，37℃保温，现用现配。
细胞裂解液：量取等体积冰醋酸和无水乙醇，充分混匀，4℃保存备用。
4.2.1实验方法
(1)中性红法检测PJP80-Ia对巨噬细胞RAW264.7细胞吞噬能力的影响：将生长状态良好的RAW264.7细胞制成细胞悬液接种于96孔板，接种密度为1×105个/mL，接种体积为100μL/孔，吹打均匀，培养24h保证细胞贴壁，弃去上清液。实验分为空白对照组、阳性对照组和PJP80-Ia多糖处理组，每组6个复孔。PJP80-Ia多糖处理组加入50、100、200μg/mLPJP80-Ia溶液各100μL，空白对照组则给予100μL培养基，阳性对照组加入100μL 1μg/mLLPS，培养24h。弃上清，用PBS溶液轻轻洗涤细胞两次，向实验组各孔加入100μL0.1％的中性红溶液，培养4h，小心吸去细胞上清液，避免影响实验结果。再次用PBS溶液洗涤细胞2次，吸干PBS，向各孔加入100μL细胞裂解液，另设调零组，每孔100μL细胞裂解液，室温过夜，酶标仪测定OD值(540nm)，计算巨噬细胞吞噬率(吞噬率＝(OD药物处理组-OD调零组)/(OD空白对照组-OD调零组)×100％)。
(2)Griess法检测PJP80-Ia对巨噬细胞RAW264.7分泌NO的影响：实验分组和给药同方法“4.2.1(1)”，培养24h后，每孔吸出收集RAW264.7上清液50μL，按Griess说明书执行操作，酶标仪测量各孔的光吸收值(540nm)，绘制NO标准曲线，计算6h、24h、48h巨噬细胞的NO含量。
(3)流式细胞仪法检测PJP80-Ia对巨噬细胞RAW264.7分泌ROS的影响：实验分组和给药同方法“4.1.1(3)”，培养24h后，收集RAW264.7细胞于DCFH-DA(10μmol/L)溶液中使其均匀，继续培养20min，每5分钟混匀RAW264.7细胞悬液保证探针装载在细胞内。用DMEM清洗RAW264.7，反复清洗3次，除去未能成功装载的DCFH-DA。用流式细胞仪检测荧光强度其中激发波长为488nm，发射波长为525nm。
(4)qPCR检测PJP80-Ia对巨噬细胞RAW264.7分泌细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的mRNA表达水平的影响：以1.0×106个细胞每孔接种于在6孔板中，实验分组及给药同“4.1.1(3)”，培养24h后检测各组细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的mRNA表达。
(5)提取RAW264.7总RNA：将生长状态良好的RAW264.7细胞悬液接种于6孔板中，细胞密度为：1.0×106个/孔，每组平行三次；24h后细胞贴壁，每孔加入1mL PBS十字交叉清洗一遍，吸除上清液，每孔加入1mL TRIzol，作用时间5min，待细胞充分裂解后，将贴壁细胞吹打完全，按照实验分组将含有细胞的TRIzol移至不同的离心管；向其中加入200μL CHCl3，涡旋30s后静置3min，离心机参数设置，时间15min，转速12,000g，温度4℃，离心后取上清液300μL，加入500μL异丙醇，静置10min。相同参数继续离心10min，弃上清。加入75％乙醇1mL，剧烈涡旋，离心机更改时间5min，转速7500g，离心两次后弃上清，倒扣晾干；向离心管中加入20μL的0.1％DEPC处理水充分溶解管底沉淀，测量RNA浓度及A260/A280光吸收值，-80℃保存备用。
(6)逆转录获总cDNA：按照TakaRa公司试剂盒PrimeScript RT(RR047A)说明书进行，依次加入:5×gDNA Eraser 2.0μL，gDNA Eraser 1.0μL，Total RNA 1.0μg，用DEPC处理水定容至10μL，混合过程在冰上进行，持续5min；继续加入5×PrimeScript 4.0μL，PrimeScript逆转录复合酶和复合引物各加1.0μL，DEPC 4.0μL；离心混匀后，设置逆转录条件：37℃保持15min，升温至85℃反应5s，降温至4℃保持，得到cDNA，-20℃冷冻保存备用。PCR反应条件：升温至95℃高温保持30s后开始循环，每次循环先95℃高温5s，再降温至60℃保持34s，循环40次。计算方法：以小鼠GAPDH基因为内参，每组样品设立复孔3个，平行测量3次，数据采用2-△△CT法计算IL-6、TNF-α、IL-1β及IFN-β(△CT＝CT目的基因-CTGAPDH，△△CT＝△CT实验组-△CT空白组)。
(7)引物设计与合成：Gene Bank数据库查找鼠源IL-6、TNF-α、IL-1β及IFN-β基因对应的的mRNA序列，采用Primer5设计各自的特异性引物，引物序列如表8。
表8目的基因序列及引物序列
Real-time PCR试剂组成(25μL体系)：SYBR Premix Ex TaqII(2×)12.5μL、PCRForward Primer(10M)1.0μL、PCR Reverse Primer(10M)1.0μL、cDNA溶液2.0μL、RNaseFree dH2O8.5μL。
(8)数据处理与分析
同方法“4.1”进行数据处理和分析。
4.2.2实验结果
(1)PJP80-Ia对巨噬细胞RAW264.7细胞吞噬能力的影响：前部分实验结果表明PJP80-Ia可激活巨噬细胞RAW264.7，为此，本实验进一步研究PJP80-Ia对巨噬细胞RAW264.7细胞吞噬能力的影响，巨噬细胞对中性红具有胞饮作用，中性红可与酸性的溶酶体产生红色的物质，通过计算吞噬率评估PJP80-Ia的免疫活性。从表9可以看出，1μg/mLLPS可以提升RAW264.7细胞的吞噬能力，经过不同浓度PJP80-Ia(50、100、200μg/mL)刺激RAW264.7细胞24h后，PJP80-Ia促进RAW264.7细胞吞噬中性红能力增强，并具有剂量依赖性，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明，PJP80-Ia能增强巨噬细胞的吞噬能力。
表9中性红法检测PJP80-Ia对巨噬细胞RAW264.7细胞吞噬能力的影响(n＝6)
(2)PJP80-Ia对小鼠RAW264.7细胞分泌NO的影响：通过考察PJP80-Ia对小鼠RAW264.7细胞分泌NO的影响可以判断PJP80-Ia对小鼠RAW264.7细胞免疫功能的影响。本实验通过测定6h、24h、48h不同时间观察不同浓度的PJP80-Ia对巨噬细胞分泌NO含量的影响，如表10所示，在同一时间点，与空白对照组比较，PJP80-Ia给药组和LPS均显著促进NO含量分泌，且呈现剂量依赖性(P<0.05)；同时PJP80-Ia给药组对巨噬细胞NO生成的促进作用明显低于LPS处理组，说明NO的分泌与炎症刺激无关，而与免疫功能的改善有关。因此PJP80-Ia可通过诱导NO的产生来提高RAW264.7的免疫能力。
表10 PJP80-Ia对小鼠RAW264.7细胞分泌NO的影响(n＝3)
(3)PJP80-Ia对小鼠RAW264.7细胞分泌ROS的影响
DCFH-DA探针可进入细胞被胞内物质水解成DCFH，此时DCFH并不显示荧光，但随着细胞内ROS的生成，DCFH被氧化成DCF，显示绿色荧光，荧光强度的强弱就可有效反映细胞ROS的含量，其荧光强度越强则代表细胞ROS的含量越高。如图6所示，与空白对照组比较，不同浓度的PJP80-Ia给药组均显著促进ROS含量分泌，且呈剂量依赖性(P<0.05)；LPS作为阳性对照组显著刺激巨噬细胞分泌ROS，且分泌水平高于PJP80-Ia给药组。说明北青龙衣多糖可通过促进巨噬细胞释放ROS参与免疫调节。
(4)PJP80-Ia对小鼠RAW264.7细胞分泌细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-βmRNA表达的影响
在受到外界刺激后，巨噬细胞将分泌多种细胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-β等参与免疫反应并发挥重要作用。经过50、100、200μg/mLPJP80-Ia作用于RAW264.7巨噬细胞后，收集细胞提取总RNA，采用qPCR对RAW264.7细胞IL-1β、IL-6、TNF-α及IFN-βmRNA表达量进行定量分析。如图7所示，与空白组比较，50、100、200μg/mL PJP80-Ia显著促进巨噬细胞IL-6、TNF-αmRNA表达，且呈现剂量依赖性，而100和200μg/mL PJP80-Ia显著促进IL-1β及IFN-βmRNA表达(P<0.05)，说明北青龙衣PJP80-Ia具有较强的免疫调节作用。
综上所述，本实施例通过上述实验得出如下结论：(1)中性红法检测结果表明PJP80-Ia多糖能增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能并呈剂量依赖性。(2)Griess法结果表明PJP80-Ia多糖促进细胞分泌NO。(3)流式细胞仪结果表明PJP80-Ia多糖促进细胞分泌ROS。(4)qPCR检测结果表明PJP80-Ia多糖促进巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α及IFN-βmRNA表达。因此，北青龙衣PJP80-Ia具有促进巨噬细胞吞噬功能和分泌细胞因子的免疫活性，并显示出成为天然免疫增强剂的强大潜力。
4.3PJP80-Ia对RAW264.7细胞表面受体的影响
配制实验试剂：
30％Acrylamide(AB)：称取Acrylamide 14.5g，Bis-acrylamide 0.5g于容量瓶中，用超纯水定容至50mL，4℃避光储存。
1.5M Tris-HCL(8.8)：称取Tris 4.54g于容量瓶中，用超纯水定容到50mL，缓慢地加入浓盐酸至其pH值为8.8，过滤，4℃储存。
0.5M Tris-HCL(6.8)：称取Tris 3.028g于容量瓶中，用超纯水定容到50mL，缓慢地加入浓盐酸至其pH值为6.8，过滤，4℃储存。
1M Tris-HCl(7.5)：称量Tris 11.365g于容量瓶中，用超纯水定容到50mL，缓慢地加入浓盐酸至其pH值为7.5，过滤，4℃储存。
10％ SDS：称取5g SDS于容量瓶中，用超纯水定容到50mL，50℃加热溶解，过滤，室温保存。
10％过硫酸铵(AP)：在EP管中加入AP 0.1g，临用时用1mL超纯水溶解，每次均需重新配制。
20％吐温(Tween 20)：量取吐温10mL于容量瓶中，用超纯水定容到50mL，4℃保存。
TBS缓冲液：称取NaCL 4.4g，吸取Tris-HCl(7.5)5mL，用超纯水定容到500mL，4℃保存。
TBST：取100mL TBST于烧杯中，吸取240μL Tween20加入至装有100mL TBST烧杯中混匀，现用现配。
封闭液：称取脱脂奶粉5g，用100mL TBST溶解。
电泳液：称取Tris1.818g、甘氨酸11.262g、SDS0.6g，用600mL超纯水溶解，4℃保存。
电转液：称量Tris1.5g、甘氨酸7.2g和Tris7.2g置于容量瓶中，加入100mL甲醇，用超纯水定容到500mL，使其完全溶解，4℃保存。
12％分离胶(15mL)：依次吸取4.9mL超纯水、3.8mL1.5 mol/L Tris·HCl(8.8)、6.0mL 30％AB、150μL 10％SDS、150μL 10％AP，6μL TEMED放入烧杯中，充分混匀。
浓缩胶(6mL)：吸取4.2mL超纯水、0.9mL的30％AB、0.8mL的0.5mol/L Tris·HCl(pH 6.8)、0.06mL的10％ SDS、0.06mL的10％ AP，6μL TEMED于烧杯中，充分混匀。
4.3.1实验方法
(1)巨噬细胞RAW264.7细胞培养，方法同“4.1”。
(2)Western blot法检测巨噬细胞TLR4、TLR2、Dectin-1、CD11b、MRC1蛋白的表达水平
①给药处理：实验分组及给药同方法“4.1.1(3)”。
②提取细胞总蛋白：吸除细胞培养液，每孔加入PBS清洗3次，使用细胞刮刮下贴壁细胞，将悬液放入离心管中，15min，12000rpm/min，吸除上清，每管加入0.5mL细胞裂解液，反复吹打，处理时间30min，使细胞充分裂解，整个实验过程在冰上进行，-80℃保存。
③蛋白定量：以BCA说明书为准执行实验操作得到蛋白的标准曲线，计算出实验样品组的蛋白浓度，用PBS将不同浓度的蛋白样品调为同一个浓度。
④蛋白变性：取出配制好的蛋白样品向其中加入总体积1/4的上样缓冲液，吹打均匀，水浴加热10min(100℃)，-80℃低温冻存。
⑤电泳：将清洗完毕后的玻璃板整齐安装在制胶架上，将凹槽中注满水，检验玻璃板液封是否良好，若液面不下降则可进行实验。根据具体实验目标蛋白的分子量，配制相应的分离胶以达到较好的分离效果，快速注入分离胶于玻璃板内，注入的液面与边缘距离以梳子齿长度为基准，使用无水乙醇赶去板内气泡。待玻璃板中出现明显折痕现象时，证明分离胶完全凝固，去除无水乙醇，立即加入浓缩胶，浓缩胶液面距离玻璃板边缘0.5cm时插入梳子(1.5mm)，可防止浓缩胶溢出影响电泳，注意避免气泡产生。浓缩胶凝固完全即可加入新配制的电泳液，注意玻璃板内外存在液面差，将梳子缓慢拔出并摆正上样孔，依次加入5×loading buffer上样缓冲液、预染蛋白Ladder、空白对照组、LPS组、北青龙衣多糖PJP80-I给药组(50,100,200μg/mL)、5×loading buffer上样缓冲液。连接电泳仪开始电泳(恒压80V)，观察电泳槽内是否有气泡生成，出现气泡证明电泳开始，待样品跑至分离胶后，可升高电压继续电泳(恒压120V)至分离胶底部，停止电泳。
⑥转印：根据彩色预染蛋白Marker分子量确定目标蛋白所在位置进行切胶，用电转液浸泡海绵垫和滤纸以及NC膜，按正极-浸泡好的海绵-三层滤纸-NC膜-凝胶-三层滤纸-海绵-负极的顺序放至电转槽中并加入电转缓冲液，注意排除NC膜与凝胶间的气泡。电转模式设置：恒流200mA、90min冰浴。
⑦封闭：将转印后的NC膜放入封闭液中封闭1-2h，放置摇床上摇动。
⑧一抗孵育：封闭结束，TBST清洗1次，10min，根据目标蛋白说明书按比例配制一抗稀释液，分辨目标条带放入一抗孵育盒中，4℃孵育至次日。二抗孵育：取出一抗孵育好的NC膜，每次用TBST洗3次，每次10min。按照说明书选择稀释浓度按比例配制后与NC膜一起放入二抗孵育盒中，放置摇床室温孵育，总计2h。
⑨ECL显色：用TBST洗液洗膜，每次10min，总计3次，等体积混合化学发光试剂A液与B液，在NC膜上滴加显色液，调节设备参数，避光显色2min。
(3)数据处理与分析：同方法“4.1”进行数据处理和分析。
4.3.2实验结果
TLR2/4、Dectin-1、CD11b、MRC1表面受体是多糖发挥免疫作用的主要识别受体，因此本实施例首先考察PJP80-Ia对巨噬细胞表面受体蛋白表达水平的影响，实验结果如表11、表12所示，与对照组比较，PJP80-Ia可以升高TLR4、TLR2、Dectin-1、CD11b和MRC1蛋白的表达。50μg/mL的PJP80-Ia可显著上调RAW264.7细胞的CD11b的表达水平(P<0.05)，极显著上调MRC1的表达水平(P<0.01)；100和200μg/mL PJP80-Ia可极显著上调RAW264.7细胞的TLR4、TLR2、Dectin-1、CD11b和MRC1的表达水平(P<0.01)；实验浓度范围内随PJP80-Ia浓度的增加，RAW264.7细胞TLR4、TLR2和CD11b的表达都呈升高的趋势，呈现剂量依赖性；LPS组RAW264.7细胞TLR4、TLR2、Dectin-1、CD11b和MRC1的蛋白表达水平均极显著提高；200μg/mLPJP80-Ia对RAW264.7细胞TLR4的表达升高趋势高于其他受体的表达，具有统计学意义。实验结果表明，PJP80-Ia可以通过巨噬细胞表面受体TLR4、TLR2、Dectin-1、CD11b和MRC1进行信号通路传导。
表11 PJP80-Ia对巨噬细胞中TLR2和TLR4受体蛋白表达的影响(n＝3)
表12 PJP80-Ia对巨噬细胞中Dectin-1、CD11b和MRC1受体蛋白表达的影响(n＝3)
综上所述，通过上述实验得出如下结论，Western blot检测结果表明不同浓度的PJP80-Ia均可促进RAW264.7细胞中TLR2/4、Dectin-1、CD11b、MRC1的蛋白含量表达，说明PJP80-Ia发挥免疫作用与RAW264.7细胞表面受体TLR2/4、Dectin-1、CD11b及MRC1有关。Toll样受体是巨噬细胞表面高表达型受体，PJP80-Ia对RAW264.7细胞中TLR4表达的促进效果相对强于其对RAW264.7细胞中其他受体表达，因此进一步选取Toll样受体(TLR2/4)探究其介导的信号传导通路。
4.4PJP80-Ia对RAW264.7细胞MyD88依赖性通路的影响
TLR家族(TLR1、TLR2、TLR4、TLR5等)可根据接头蛋白的不同分为髓样分化蛋白88(MyD88)依赖性和β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)依赖性途径。其中MyD88信号通路中的TRAF6的活化可分别激活下游的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子-κB(NF-κB)两条不同的信号转导途径。上述研究结果表明PJP80-Ia能促进巨噬细胞吞噬能力，可通过TLR2/4增加巨噬细胞分泌细胞因子的释放量，进而发挥免疫作用。然而，北青龙衣多糖发挥免疫调节作用的具体机制未被阐明。为了进一步阐明北青龙衣多糖发挥免疫调节功能的作用机制，本发明采用Westernblot技术研究北青龙衣多糖对MyD88依赖性信号传导通路的影响，从而揭示北青龙衣多糖免疫调节的作用机制。
配制实验试剂：方法同“4.3”。
4.4.1实验方法
(1)巨噬细胞RAW264.7细胞培养：方法同“4.1”。
(2)Western blot法检测巨噬细胞MyD88依赖性通路相关蛋白的表达水平：方法同“4.3”。
(3)数据处理与分析：方法同“4.1”进行数据处理和分析。
4.4.2实验结果
(1)PJP80-Ia对RAW264.7细胞中TIRAP和MyD88蛋白表达的影响
MyD88和TIRAP是TLR2/4通路的重要成员，多糖识别受体后形成复合物，启动信号通路，TIR结构域的接头蛋白TIRAP为底物使MyD88与TLR2/4结合向下游传递信号。为检测北青龙衣多糖PJP80-Ia对RAW264.7细胞MyD88信号传导通路的活化的影响，本实验考察三种不同浓度的PJP80-Ia作用巨噬细胞24h，检测PJP80-Ia对RAW264.7细胞TIRAP，MyD88蛋白表达的影响。实验结果表明，与空白对照组比较，PJP80-Ia可以升高TIRAP和MyD88蛋白表达；50、100和200μg/mL PJP80-Ia极显著上调RAW264.7细胞TIRAP及MyD88的表达(P<0.01)，其中对MyD88具有剂量依赖性；LPS组极显著上调TIRAP及MyD88蛋白表达；实验结果表明，PJP80-Ia可激活TLR2/4/TIRAP/MyD88信号通路进行信号传导。
(2)PJP80-Ia对RAW264.7细胞中IRAK4和IRAK1及其磷酸化蛋白表达的影响
实验结果表明，与对照组比较，PJP80-Ia可以升高p-IRAK4/IRAK4及p-IRAK1/IRAK1蛋白的相对表达，50、100和200μg/mL的PJP80-Ia对RAW264.7细胞的p-IRAK4和p-IRAK1具有极显著差异(P<0.01)，且呈剂量依赖性，对IRAK1及IRAK4蛋白表达量无显著变化，LPS组p-IRAK4/IRAK4及p-IRAK1/IRAK1蛋白相对表达显著上升(P<0.01)。实验结果表明，PJP80-Ia可以促进RAW264.7细胞IRAK4和IRAK1的磷酸化，由此判断北青龙衣多糖可通过(TLR2/4/TIRAP/MyD88/IRAK4/IRAK1)信号通路传递信号，诱导巨噬细胞发挥免疫作用。
(3)PJP80-Ia对RAW264.7细胞中TRAF6蛋白表达的影响
实验结果表明，与对照组比较，PJP80-Ia可升高RAW264.7细胞TRAF6蛋白的表达，100和200μg/mL PJP80-Ia对RAW264.7细胞TRAF6的表达极显著影响(P<0.01)，且具有剂量依赖性，LPS阳性对照组极显著促进TRAF6蛋白表达。实验结果表明，PJP80-Ia可以促进RAW264.7细胞TRAF6的表达，进一步完善了PJP80-Ia的作用信号通路(TLR2/4/TIRAP/MyD88/IRAK4/IRAK1/TRAF6)。
(4)PJP80-Ia对RAW264.7细胞中TAK1和p-TAK1蛋白表达的影响
实验结果表明，与对照组比较，PJP80-Ia可升高p-TAK1/TAK1蛋白相对表达，100μg/mL的PJP80-Ia对RAW264.7细胞的p-TAK1的表达显著增加(P<0.05)，200μg/mL PJP80-I对RAW264.7细胞p-TAK1的表达极显著增加(P<0.01)，TAK1蛋白表达量无显著变化，但100、200μg/mL的PJP80-Ia极显著上调RAW264.7细胞的p-TAK1/TAK1相对表达，LPS组p-TAK1及p-TAK1/TAK1极显著增加(P<0.01)，TAK1无显著性差异。实验结果表明PJP80-Ia可以促进RAW264.7细胞p-TAK1/TAK1的表达，促进TAK1磷酸化，同时说明PJP80-Ia可经过(TLR2/4/TIRAP/MyD88/IRAK4/IRAK1/TRAF6/TAK1/p-TAK1)这一信号通路发挥免疫调节作用。
(5)PJP80-Ia对RAW264.7细胞中NF-кB信号通路相关蛋白表达的影响
实验结果表明，与对照组比较，PJP80-Ia可以升高p-IKKα/IKKα/β、p-IKKβ/IKKα/β、p-IкBα/IкBα及p-NF-кB/NF-кB蛋白的相对表达；三种浓度的PJP80-Ia对RAW264.7细胞的IKKα/β，NF-кB的表达并无明显变化，对RAW264.7细胞的IкBα蛋白的表达呈剂量依赖性抑制，三种不同浓度的PJP80-Ia均促进IKKα/β，IкBα，NF-кB磷酸化，且促进此三种蛋白磷酸化水平能力增强；LPS阳性对照组显著促进p-IKKα/IKKα/β、p-IKKβ/IKKα/β、p-IкBα/IкBα及p-NF-кB/NF-кB的相对表达。实验结果表明，PJP80-Ia可以激活RAW264.7细胞IKKα/β，促进IкBα活化，使活化的NF-кB进入细胞核促进RAW264.7细胞分泌细胞因子，也说明北青龙衣多糖PJP80-Ia可通过MyD88依赖性NF-кB信号通路(IKKα/β/p-IKKα/p-IKKβ/IкBα/p-IкBα/NF-кB/p-NF-кB)传递信号。
(6)PJP80-Ia对RAW264.7细胞中MAPKs信号通路相关蛋白表达的影响
TAK1磷酸化也可激活下游MAPKs信号通路，MAPKs家族成员主要有ERK信号通路、P38信号通路和JNK信号通路。ERK1/2由MEK1/2激活；P38由MKK3/6激活；JNK由MKK4/7激活。AP-1是细胞内的一个转录激活因子是由c-Fos和c-Jun组成的异二聚体。磷酸化的JNK、ERK1/2、P38使c-Fos和c-Jun激活，活化AP-1。此三种信号通路参与机体免疫调节、信号传导等重要的免疫过程。因此本实施例主要判断北青龙衣多糖PJP80-I是否通过MAPKs信号通路传递信号。实验结果表明，与对照组比较，PJP80-Ia可升高巨噬细胞p-ERK/ERK蛋白的相对表达，200μg/mL PJP80-Ia对RAW264.7细胞p-MEK1/2蛋白水平的表达具有极显著提升效果(P<0.01)，三种不同浓度的PJP80-I对RAW264.7细胞ERK1/2蛋白水平的影响无明显差别，PJP80-Ia对p-ERK蛋白表达有极显著差别，并呈现剂量依赖性(P<0.01)，LPS阳性对照组极显著上调p-MEK1/2、p-ERK、p-ERK/ERK蛋白表达水平，表明北青龙衣多糖PJP80-Ia可通过ERK信号通路(P-MEK1/2/ERK/PERK)进行信号传导。与对照组比较，PJP80-Ia可升高巨噬细胞p-P38/P38蛋白的相对表达，具有剂量依赖性，200μg/mL PJP80-I可促进RAW264.7细胞p-MKK3/6极显著表达(P<0.01)，三种不同浓度的北青龙衣多糖对RAW264.7细胞P38蛋白水平无明显影响，50、100、200μg/mL PJP80-Ia对RAW264.7细胞p-P38表达极显著影响(P<0.01)，LPS阳性对照组极显著上调p-MKK3/6、p-P38、p-P38/P38蛋白表达水平，结果表明北青龙衣多糖PJP80-Ia可通过P38信号通路(p-MKK3/6/P38/p-P38)进行信号传导。与对照组比较，PJP80-Ia可升高巨噬细胞p-JNK/JNK蛋白的相对表达，50μg/mL PJP80-Ia可显著促进RAW264.7细胞p-MKK7表达(P<0.05)，100、200μg/mL PJP80-Ia可极显著促进RAW264.7细胞p-MKK7表达(P<0.01)，三种不同浓度的北青龙衣多糖对RAW264.7细胞JNK蛋白水平无明显影响，但可极明显促进RAW264.7细胞p-JNK表达(P<0.01)，LPS阳性对照组极显著上调p-MKK7、p-JNK、p-JNK/JNK蛋白表达水平，结果表明北青龙衣多糖PJP80-Ia可通过JNK信号通路(p-MKK7/JNK/p-JNK)进行信号传导。与对照组比较，PJP80-Ia可升高巨噬细胞p-c-fos/c-fos及p-c-jun/c-jun蛋白的相对表达，三种不同浓度的北青龙衣多糖对RAW264.7细胞c-fos、c-jun蛋白水平无明显影响，50μg/mL PJP80-Ia可显著促进RAW264.7细胞p-c-fos表达(P<0.05)，100、200μg/mL PJP80-Ia对RAW264.7细胞p-c-fos、p-c-jun表达极显著影响(P<0.01)，50μg/mL PJP80-Ia对RAW264.7细胞p-c-jun表达极显著影响(P<0.01)，LPS阳性对照组极显著上调p-c-fos、p-c-jun、p-c-fos/c-fos及p-c-jun/c-jun蛋白表达水平。实验结果表明，PJP80-Ia可通过MyD88依赖性信号通路MAPKs(p-MEK1/2/ERK/p-ERK、p-MEK3/6/P38/p-P38、P-MKK7/JNK/p-JNK、AP-1)进行信号传导促进巨噬细胞RAW264.7分泌细胞因子。
综上所述，本实施例通过上述实验得出如下结论，PJP80-Ia北青龙衣多糖能够激活TIRAP/MyD88/IRAK4/p-IRAK4/IRAK1/p-IRAK1/TRAF-6信号通路，随后促使TAK磷酸化使NF-кB(IKK复合物、IкBα、NF-кB)和MAPKs(MEK1/2、MKK3/6、MKK7、ERK1/2、p38以及JNK1/2)磷酸化，促进细胞内AP-1(c-fos、c-jun)的表达及磷酸化，促进巨噬细胞分泌细胞因子(如NO、IL-6、IL-1β和TNF-α等)进而增强免疫能力，说明北青龙衣多糖调节免疫作用具体机制可以通过TLR2/4MyD88依赖性NF-кB(IKKα/β/p-IKKα/p-IKKβ/IкBα/p-IкBα/NF-кB/p-NF-кB)和MAPKs(p-MEK1/2/ERK/p-ERK、p-MKK3/6/P38/p-P38、p-MKK7/JNK/p-JNK、c-fos/p-c-fos/c-jun/p-c-jun)信号通路传递信号，进而促进巨噬细胞分泌细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α。为更加全面的阐述PJP80-I参与免疫反应过程的具体机制，进行TRIF依赖性信号通路的考察具有重要意义。
4.5PJP80-I对RAW264.7细胞TRIF依赖性通路的影响
MyD88非依赖通路通过TLR3/4的结构域与TRAM结合活化，招募TRIF并活化，激活的TRIF与TRAF3相互作用并促进其活化，TRAF3募集IKK家族的TBK1和IKKε激酶及磷酸化，两者可作为IRF3/7激酶，并与之结合形成复合体，进而使IRF3磷酸化并活化，诱导一系列基因的转录。因此本实施例采用Westernblot技术研究北青龙衣多糖PJP80-Ia对MyD88非依赖性信号传导通路的影响，从而揭示北青龙衣多糖免疫调节的具体作用机制。
实验试剂的配制：方法同“4.3”。
4.5.1实验方法
(1)巨噬细胞RAW264.7细胞培养：方法同“4.1”。
(2)Westernblot法检测巨噬细胞TRIF依赖性通路蛋白的表达水平：方法同“4.3”
(3)数据处理与分析：方法同“4.1”进行数据处理和分析。
4.5.2实验结果
(1)PJP80-Ia对巨噬细胞中TRAM和TRIF蛋白表达的影响
TRAM是TIR结构域中的接头蛋白，可激活下游信号TRIF进行信号转导。因此本部分实验采用三种不同浓度的PJP80-Ia作用巨噬细胞24h，检测PJP80-I对RAW264.7细胞TRAM和TRIF蛋白表达的影响。实验结果表明，与对照组比较，PJP80-Ia可以升高TRAM和TRIF蛋白的表达，100μg/mLPJP80-Ia对RAW264.7细胞TRAM表达具有明显影响(P<0.05)，200μg/mLPJP80-Ia则影响极明显(P<0.01)；三种不同浓度的PJP80-Ia对RAW264.7细胞TRIF表达极明显影响并呈剂量依赖性(P<0.01)，LPS阳性对照组显著促进TRAM及TRIF蛋白表达水平，实验结果表明，PJP80-Ia以TRIF依赖性通路传递信号参与免疫反应。
(2)PJP80-Ia对巨噬细胞中TRAF3、TBK1和p-TBK1蛋白表达的影响
TRIF被活化后可与激活下游信号TRAF3，进而激活TBK1使其磷酸化进行信号传导，因此本部分实验采用三种不同浓度的PJP80-Ia作用巨噬细胞24h，检测PJP80-Ia对RAW264.7细胞中TRAF3，TBK和p-TBK1蛋白水平的影响。实验结果表明，与对照组比较，PJP80-Ia可以升高TRAF3、p-TBK1/TBK1蛋白的表达，并呈现剂量依赖性(P<0.01)，50、100μg/mL PJP80-Ia对RAW264.7细胞TBK1表达并无明显影响，但是可极明显促进RAW264.7细胞TRAF3和p-TBK1的表达，并呈现剂量依赖性(P<0.01)，LPS阳性对照组极显著促进TRAF3、p-TBK1、TBK1及p-TBK1/TBK1蛋白表达水平，实验结果表明，PJP80-Ia可活化RAW264.7细胞TRAF3蛋白，促进RAW264.7细胞TBK1磷酸化。
(3)PJP80-Ia对巨噬细胞中ikkε及p-ikkε、IRF3及p-IRF3蛋白表达的影响
TBK1磷酸化后可激活下游信号ikkε及IRF3使其磷酸化进行信号传导，因此本部分实验采用三种不同浓度的PJP80-I作用巨噬细胞24h，检测PJP80-Ia对RAW264.7细胞IRF3/p-IRF3、ikkε/p-ikkε表达水平。实验结果表明，PJP80-Ia可升高p-IRF3/IRF3、p-ikkε/ikkε蛋白的相对表达，50μg/mL PJP80-Ia对IRF3蛋白表达水平无显著性差异，三种不同浓度的PJP80-Ia均可极明显促进RAW264.7细胞p-IRF3表达(P<0.01)；三种不同浓度的PJP80-Ia对RAW264.7细胞ikkε表达水平无明显差异，100、200μg/mL PJP80-Ia对p-ikkε蛋白表达具有极显著性差异，并呈现剂量依赖性，LPS阳性对照组极显著促进p-IRF3、p-ikkε、p-IRF3/IRF3及p-ikkε/ikkε蛋白表达水平，实验结果表明，PJP80-Ia可活化RAW264.7细胞ikkε及IRF3蛋白使其磷酸化，也说明了北青龙衣多糖PJP80-I可通过TLR2/4TRIF依赖性通路(TLR2/4/TRAM/TRIF/TRAF3/TBK1/p-TBK1/IRF3/p-IRF3)促进巨噬细胞分泌细胞因子。
综上所述，本实施例通过上述实验得出如下结论，PJP80-Ia可活化RAW264.7巨噬细胞TRAM，TRIF，TRAF3，促进TBK1、ikkε及IRF3磷酸化，说明PJP80-Ia也可通过TLR2/4TRIF依赖性信号通路(TLR2/4/TRAM/TRIF/TRAF3/TBK1/p-TBK1/IRF3/p-IRF3/ikkε/p-ikkε)活化巨噬细胞，PJP80-Ia对巨噬细胞RAW264.7细胞免疫活性初探研究结果证明PJP80-Ia可促进巨噬细胞分泌细胞因子IFN-β，发挥这一免疫调节活性的主要原因是PJP80-Ia通过TLR2/4TRIF依赖性信号通路激活了巨噬细胞促进了其分泌功能。
4.6PJP80-Ia对TLR2/4抑制剂干预下RAW264.7细胞免疫活性的影响
多糖与巨噬细胞表面PRRs结合，触发免疫信号通路，包括TLRs-MyD88-MAPK/NF-κB依赖性信号通路及TLRs-TRIF依赖性信号通路，增强细胞活性，促进细胞因子、NO的释放等，提高巨噬细胞免疫活性。在上述实验中，我们的研究结果证实PJP80-Ia在体外可激活巨噬细胞RAW264.7增强其免疫活性，上述机制是否是PJP80-Ia发挥免疫调节的作用机理有待进一步研究。因此为了探究TLRs是否是PJP80-Ia体外免疫增强作用的上游信号，本实施例进行特异性受体拮抗实验，通过对比TLR2和TLR4受体拮抗剂作用前后，PJP80-Ia对巨噬细胞免疫作用的影响(测定NO释放量，IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-β的mRNA表达量)，研究了PJP80-Ia与巨噬细胞受体结合的情况(采用Westernblot法检测经TLR2和TLR4受体拮抗剂作用后，PJP80-Ia对巨噬细胞NF-κB信号通路中的关键蛋白及其相应磷酸化的表达水平)，验证PJP80-Ia与巨噬细胞膜表面TLRs的互相作用。
实验试剂的配制：方法同“4.3”
4.6.1实验方法
(1)巨噬细胞RAW264.7细胞培养，方法同“4.1”。
(2)TLR2/4抑制剂对PJP80-Ia调节巨噬细胞RAW264.7分泌NO能力的影响：取对数生长期细胞，以1×105个/mL密度接种于96孔板中，每孔100μL，培养24h后，分别给予TLR2抑制剂C29、TLR4抑制剂TAK-242处理细胞4h，除上清液，PBS洗涤3次，加入PJP80-I培养液24h，收集上清液，按Griess说明书执行操作，方法同4.2.1。实验具体分组如表13所示。
表13 TLR2抑制剂及TLR4抑制剂对PJP80-Ia调节巨噬细胞RAW264.7分泌NO能力影响实验分组及细胞处理
(3)TLR2/4抑制剂对PJP80-Ia调节巨噬细胞RAW264.7细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的mRNA表达水平的影响：实验分组及给药方法同“4.6.1(2)”。
(4)TLR2/4抑制剂对PJP80-Ia调节巨噬细胞RAW264.7的NF-кB信号通路相关蛋白表达的影响给药方法如“4.6.1(2)”，实验分组如表14，实验操作同“4.3.1(2)”。
表14 TLR2抑制剂及TLR4抑制剂对PJP80-Ia调节巨噬细胞RAW264.7中NF-кB信号通路相关蛋白表达实验分组及细胞处理
(5)数据处理与分析：同方法“4.1.1”进行数据处理和分析。
4.6.2实验结果
(1)TLR2/4抑制剂对PJP80-Ia调节巨噬细胞RAW264.7分泌NO的影响
为进一步探究TLR2/4是否为PJP80-Ia激活巨噬细胞RAW264.7的作用受体，采用C29、TAK-242对RAW264.7细胞进行预处理，通过分析抑制剂对PJP80-Ia刺激巨噬细胞分泌NO的影响来验证多糖主要受体。实验结果如表15所示，与对照组比较，单一C29和TAK-242抑制剂处理组的NO分泌量明显减少，差异具有显著性(P<0.01)；而LPS阳性对照组和PJP80-Ia多糖处理组可极显著促进巨噬细胞分泌NO(P<0.01)；TLR2抑制剂(C29)预处理细胞后，极显著抑制LPS阳性药及PJP80-Ia多糖NO的分泌(P<0.01)；TLR4抑制剂(TAK-242)预处理后，LPS阳性药和PJP80-Ia多糖的NO分泌量有极显著下降(P<0.01)，且抑制作用较TLR2抑制剂效果较好，实验结果表明PJP80-Ia促进RAW264.7细胞分泌NO作用与TLR2、TLR4信号通路有关。
表15 TLR2、TLR4通路抑制剂干预PJP80-Ia对小鼠RAW264.7细胞分泌NO的影响(n＝3)
(2)TLR2/4抑制剂对PJP80-Ia调节巨噬细胞RAW264.7细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的mRNA表达水平的影响
IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-β是宿主先天免疫反应相关的重要促炎细胞因子，具有清除病原微生物的作用。先前我们用qPCR检测了PJP80-Ia诱导巨噬细胞IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-βmRNA的转录水平，结果表明，PJP80-Ia增强4种细胞因子的表达，且呈现剂量依赖性。为了进一步研究Toll样受体在诱导炎性细胞因子表达中的作用，采用TLR2及TLR4受体抑制剂对巨噬细胞进行预处理，探究IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-βmRNA的表达水平。实验结果如图8所示，与对照组相比，单一C29和TAK-242抑制剂处理组的TNF-αmRNA表达量极显著减少(P<0.01)，单一TAK-242抑制剂处理组的IFN-βmRNA的表达水平显著降低；而LPS阳性对照组和PJP80-I多糖处理组可促进巨噬细胞IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-βmRNA的表达水平(P<0.01)，TLR2抑制剂(C29)预处理细胞后，LPS阳性药及PJP80-I多糖TNF-αmRNA表达量无显著性差异，IL-6、IL-1β和IFN-βmRNA的表达水平显著下降，差异具有显著性(P<0.01)；TLR4抑制剂(TAK-242)预处理后，LPS阳性药和PJP80-I多糖的IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-βmRNA表达水平均受到了显著抑制(P<0.01)，且TAK-242的抑制作用较C29显著。实验结果表明，Toll样受体的激活是PJP80-I促进巨噬细胞RAW264.7促炎细胞因子表达上调的关键受体通路。
(3)TLR2/4抑制剂对PJP80-I调节巨噬细胞RAW264.7中NF-кB信号通路相关蛋白表达的影响
本部分实验采用C29、TAK-242抑制剂预处理RAW264.7细胞后进一步考察PJP80-Ia作用下对细胞NF-кB通路的影响。实验结果如表16至表19所示，与对照组比较，TAK-242抑制剂处理组极显著降低IKKα/β、p-IKKα、p-IкBα及p-NF-кB表达(P<0.01)，极显著增强IкBα表达(P<0.01)；C29抑制剂处理组极显著降低p-IKKα、p-IкBα及p-NF-кB(P<0.01)，显著降低p-IKKβ表达(P<0.05)，极显著增强IкBα表达(P<0.01)；PJP80-Ia组极显著增强RAW264.7细胞的p-IKKα、p-IKKβ、p-IкBα、p-NF-кB表达，极显著抑制IкBα表达(P<0.01)，这也与之前的实验结果一致；TLR2抑制剂(C29)预处理细胞后，PJP80-Ia调节的p-IKKβ、p-IкBα及p-NF-кB蛋白的表达减少，IкBα蛋白的表达增加，差异具有显著性(P<0.01)；TLR4抑制剂(TAK-242)处理细胞后，PJP80-I调节的p-IKKα、p-IKKβ及p-NF-кB蛋白的表达极显著减少(P<0.01)，IкBα蛋白的表达显著增加(P<0.05)，实验结果表明，PJP80-Ia处理RAW264.7细胞后促进TLR2/4受体下游关键信号通路NF-кB相关蛋白的表达，但此作用也随着RAW264.7细胞表面TLR2/4受体的抑制而减弱。此外PJP80-I诱导IкBα蛋白降解，但随着TLR2/4受体的抑制，PJP80-Ia诱导IкBα蛋白降解的作用也减弱。应用特异性抑制剂实验结果证实，北青龙衣多糖激活RAW264.7巨噬细胞产生免疫活性与细胞表面TLR2/4受体介导的MyD88依赖性NF-кB信号通路密切相关。
表16 TLR2抑制剂(C29)及TLR4抑制剂(TAK-242)对PJP80-Ia诱导的巨噬细胞中IKKα/β、p-IKKα蛋白表达的影响(n＝3)
表17 TLR2抑制剂(C29)及TLR4抑制剂(TAK-242)对PJP80-I诱导的巨噬细胞中IKKα/β、p-IKKβ蛋白表达的影响(n＝3)
表18 TLR2抑制剂(C29)及TLR4抑制剂(TAK-242)对PJP80-I诱导的巨噬细胞中IкBα、p-IкBα蛋白表达的影响(n＝3)
表19 TLR2抑制剂(C29)及TLR4抑制剂(TAK-242)对PJP80-I诱导的巨噬细胞中NF-кB、p-NF-кB蛋白表达的影响(n＝3)
综上所述，通过上述实验得出如下结论，当RAW264.7细胞表面的TLR2/4受体被抑制后，北青龙衣多糖PJP80-Ia促进NO分泌作用减弱，细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的mRNA表达水平下调。此外TLR2/4抑制剂减弱PJP80-I对NF-кB(IKK复合物，IкBα，NF-кB)及其磷酸化蛋白表达的调节作用。实验结果表明，PJP80-Ia调节RAW264.7细胞免疫活性与细胞表面受体TLR2/4介导的下游NF-кB信号通路相关。
北青龙衣多糖PJP80-Ia对小鼠巨噬细胞RAW264.7发挥免疫调节作用机制可能是北青龙衣多糖PJP80-I与小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞表面TLR2/4受体结合，通过TLR2/4MyD88依赖性NF-κB(IKKα/β/p-IKKα/p-IKKβ/IкBα/p-IкBα/NF-кB/p-NF-кB)信号通路和MAPKs信号通路(p-MEK1/2/ERK/p-ERK、p-MKK3/6/P38/p-P38、p-MKK7/JNK/p-JNK、c-fos/p-c-fos、c-jun/p-c-jun)协同促进小鼠巨噬细胞RAW264.7释放细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β，通过TRIF依赖性信号通路(TRAM/TRIF/TRAF3/p-TBK1/IRF3/p-IRF3/ikkε/p-ikkε)促使RAW264.7分泌IFN-β，使其吞噬作用、免疫功能变强。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.北青龙衣多糖PJP80-Ia的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将北青龙衣的上清液采用分级醇沉的方法提取，收集80％乙醇浓度醇沉后的沉淀。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，北青龙衣的上清液的制备方法包括以下步骤：将北青龙衣的料液闪氏提取。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，北青龙衣的料液包括北青龙衣粉末和水，北青龙衣粉末和水的料液比为1g:30mL，水的温度为90℃。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，闪氏提取的参数包括：5000r/min，30s/次，提取2次。
5.根据权利要求1-4任一项所述制备方法，其特征在于，分级醇沉包括以下步骤：将北青龙衣的上清液抽滤后，收集滤液；将滤液减压浓缩至原体积的1/3，加入95％乙醇，快速搅拌，使溶液中乙醇终浓度达到20％，静置过夜，得到沉淀Ⅰ和上清液Ⅰ；重复上述步骤，在上清液Ⅰ中加入乙醇，使溶液中乙醇终浓度达到40％，静置过夜，得到沉淀Ⅱ和上清液Ⅱ；重复上述步骤，在上清液Ⅱ中加入乙醇，使溶液中乙醇终浓度达到60％，静置过夜，得到沉淀Ⅲ和上清液Ⅲ；重复上述步骤，在上清液Ⅲ中加入乙醇，使溶液中乙醇终浓度达到80％，静置过夜，得到沉淀Ⅳ和上清液Ⅳ；将沉淀Ⅳ用无水乙醇洗涤，冷冻干燥，得到北青龙衣多糖PJP80。
6.根据权利要求1-4任一项所述制备方法，其特征在于，还包括脱色的步骤；采用AB-8大孔树脂进行脱色包括以下步骤：称取分级醇沉后获得的北青龙衣粗多糖，溶解于蒸馏水中，加入AB-8大孔树脂，搅拌2h进行脱色，真空抽滤，将滤液冷冻干燥；北青龙衣粗多糖、蒸馏水、AB-8大孔树脂的比例为5g：100mL：50g。
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，在脱色后，还包括DEAE-52阴离子交换层析柱分离纯化和Sephadex G-50凝胶层析柱分离纯化步骤。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，DEAE-52阴离子交换层析柱分离纯化包括以下步骤：活化DEAE-52纤维素；装柱、DEAE-52阴离子交换层析柱预处理；配制北青龙衣多糖溶液及上样；配制洗脱液及收集样品，以0-0.5mol/L NaCl溶液作为洗脱液，每个浓度200mL，流速1mL/min、2mL/管收集洗脱液，收集NaCl溶液浓度为0时获得的洗脱液，将其冷冻干燥，得到北青龙衣多糖PJP80-I。
9.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，Sephadex G-50凝胶层析柱分离纯化包括以下步骤：活化Sephadex G-50凝胶；装柱、Sephadex G-50凝胶层析柱预处理；配制PJP80-I溶液及上样，洗脱液采用去离子水，流速1mL/3min，收集洗脱峰，将其冷冻干燥，得到北青龙衣多糖PJP80-Ia。
10.北青龙衣多糖PJP80-Ia在(1)至(5)任一项或任几项中的应用，北青龙衣多糖PJP80-Ia采用权利要求1-9任一项所述制备方法制备；
(1)单独或作为其中一种组分用于制备免疫调节剂；
(2)单独或作为其中一种组分用于制备抗肿瘤制剂；
(3)单独作为食品原料；
(4)单独或作为其中一种组分用于制备具有免疫调剂功能的保健食品；
(5)单独或作为其中一种组分用于制备具有抗氧化功能的保健食品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311481246.0A CN117362470A (zh) | 2023-11-08 | 2023-11-08 | 北青龙衣多糖PJP80-Ia制备方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311481246.0A CN117362470A (zh) | 2023-11-08 | 2023-11-08 | 北青龙衣多糖PJP80-Ia制备方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117362470A true CN117362470A (zh) | 2024-01-09 |
Family
ID=89389190
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311481246.0A Pending CN117362470A (zh) | 2023-11-08 | 2023-11-08 | 北青龙衣多糖PJP80-Ia制备方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117362470A (zh) |
-
2023
- 2023-11-08 CN CN202311481246.0A patent/CN117362470A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tian et al. | Structural characterization of a novel neutral polysaccharide from Lentinus giganteus and its antitumor activity through inducing apoptosis | |
| Ren et al. | Chemical characterization of a novel polysaccharide ASKP-1 from Artemisia sphaerocephala Krasch seed and its macrophage activation via MAPK, PI3k/Akt and NF-κB signaling pathways in RAW264. 7 cells | |
| Liu et al. | Isolation and structural characterization of a novel polysaccharide from Hericium erinaceus fruiting bodies and its arrest of cell cycle at S-phage in colon cancer cells | |
| Zhou et al. | Extraction, structural analysis and antioxidant activity of aloe polysaccharide | |
| RU2587784C2 (ru) | Композиции и способы полисахаридов алоэ | |
| Zhao et al. | The algal polysaccharide ulvan suppresses growth of hepatoma cells | |
| Lian et al. | Characterization of a novel polysaccharide from Moutan Cortex and its ameliorative effect on AGEs-induced diabetic nephropathy | |
| Liu et al. | Preparation, characterization and immunoregulatory activity of derivatives of polysaccharide from Atractylodes lancea (Thunb.) DC | |
| Bai et al. | Physicochemical, morpho-structural, and biological characterization of polysaccharides from three Polygonatum spp | |
| Liao et al. | A novel Hericium erinaceus polysaccharide: Structural characterization and prevention of H2O2-induced oxidative damage in GES-1 cells | |
| Jiang et al. | Structure and potential anti-fatigue mechanism of polysaccharides from Bupleurum chinense DC | |
| Liu et al. | Sulfated Chinese yam polysaccharide enhances the immunomodulatory activity of RAW 264.7 cells via the TLR4-MAPK/NF-κB signaling pathway | |
| Zheng et al. | Structural characterization and antioxidant activity of polysaccharides extracted from Porphyra haitanensis by different methods | |
| Guo et al. | Polysaccharides from Nostoc commune Vaucher activate macrophages via NF-κB and AKT/JNK1/2 pathways to suppress colorectal cancer growth in vivo | |
| Chen et al. | Okra polysaccharide-2 plays a vital role on the activation of RAW264. 7 cells by TLR2/4-mediated signal transduction pathways | |
| Liu et al. | Structure characterization and in vitro immunomodulatory activities of carboxymethyl pachymaran | |
| Yu et al. | A novel polysaccharide from Boletus edulis: Extraction, purification, characterization and immunologic activity | |
| Hu et al. | Inhibition of human cervical cancer development through p53-dependent pathways induced by the specified triple helical β-glucan | |
| Liu et al. | Comparison of two kinds of Agrocybe cylindracea polysaccharides: Structural characteristic and antitumor activity | |
| Xie et al. | Structure-specific antitumor effects and potential gut microbiota-involved mechanisms of ginseng polysaccharides on B16F10 melanoma-bearing mice | |
| Wang et al. | Structural characterization and immunomodulatory activity of an acidic polysaccharide from walnut green husk | |
| Yang et al. | In vitro and in vivo immuno-enhancing effect of fucoidan isolated from non-edible brown seaweed Sargassum thunbergii | |
| Cui et al. | Structure analysis and anti‐inflammatory effect of a polysaccharide from Hippocampus mohnikei | |
| WO2019052119A1 (zh) | 具有免疫调节活动性的均一多糖及其制备方法 | |
| CN117362470A (zh) | 北青龙衣多糖PJP80-Ia制备方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |