CN117358325A - 基因测序芯片及制备方法和基因测序装置，芯片保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基因测序芯片及其制备方法，包括该基因测序芯片的基因测序装置，以及包括该基因测序芯片的保存方法。该基因测序芯片基板，具有第一表面；微孔阵列，位于所述第一表面内；纳米线阵列，由分别包围所述微孔阵列中每个微孔的纳米线形成。本发明的基因测序芯片通过构建高密度的纳米线阵列，使传统的平面测序反应扩展到三维空间测序，大幅提升了测序的通量，同时有效提升测序簇的荧光强度，提高检测灵敏度。
Description
技术领域
本公开涉及一种基因测序芯片及其制备方法，包括该基因测序芯片的基因测序装置，以及包括该基因测序芯片的保存方法。
背景技术
长期以来，DNA测序技术一直是分子生物学相关研究中最常用的技术手段之一，从一定程度上推动了该领域的快速发展。人类基因组计划、转录组分析、微生物基因组重测序、单核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)分析等方面也促进其他生物学领域的研究和发展。每一代测序技术的更替都标志着生物学中基因芯片、数据分析、表面化学、生物工程等技术领域有了新的突破，从而应用在了测序领域，大大降低了测序成本，提高了测序效率，使测序向着高通量、低成本、高安全性和商业化的方向发展。
第二代DNA测序技术又称下一代测序技术，是对第一代测序技术的划时代变革的核心。现有的技术平台主要包括Roche/454GS FLX、Illumina/Sol-exaGenomeAnalyzer、HelicosBioSciences公司的HeliScopeTM Single Molecule Sequencer、美国Dana-herMotion公司推出的Polonator；以及连接法测序(sequencing by ligation)，即通过引物来定位核酸信息，技术平台有Applied Biosystems/SOLiDTM system。以上技术平台所运用的测序原理均为循环微阵列法，目前市场最主流的测序仪(illumina，华大)均需要配合测序芯片使用，每一个测序反应均是在测序芯片上完成，因此测序芯片的通量等性能直接决定了测序的效果。
所有二代测序的平台都需要一个基因文库，这个基因文库包含通过引申或者连接自定义的接头序列。构建好的文库将被固定到测序芯片表面，合成测序法是使用可逆荧光和终止核苷酸的分步整合的方法进行DNA测序，首先在测序芯片中同时加入四种核苷酸，核苷酸结合之后，剩余的DNA碱基就会被洗涤去除。每个基因蔟中荧光信号被读取和记录之后，这个过程一直重复直到测序反应完成。为了使得每个单元的测序反应独立顺利地进行，测序芯片需要划分数亿个独立反应分隔单元，为了支持DNA分子的固定，防止串扰形成噪音，对于微孔阵列的坡度角等参数都有严格的要求，同时高通量测序最重要的因素之一就是成本，因此高密度的测序反应簇可以有效降低测序成本，因此构建高密度反应单元的工艺成为了关键，而芯片的表面修饰降低噪音，提高了测序的准确性也是另一关键技术。
发明内容
本发明提供一种基因测序芯片，通过构建微孔阵列和纳米线阵列，以解决或缓解现有技术中的一项或更多项技术问题。
作为本发明的一个方面，提供一种基因测序芯片，包括：
基板，具有第一表面；
微孔阵列，位于所述第一表面内；
纳米线阵列，由分别包围所述微孔阵列中每个微孔的纳米线形成。
在一些可能的实现方式中，所述纳米线阵列间隔设置。
在一些可能的实现方式中，所述微孔阵列的微孔内部为亲水性，微孔间隔部分为疏水性。
在一些可能的实现方式中，在25mm×65mm的面积内至少具有1G reads的通量。
在一些可能的实现方式中，所述纳米线上连接有测序需要的接头。
在一些可能的实现方式中，所述纳米线的直径为100纳米以下。
作为本发明的另一个方面，提供一种基因测序芯片的制备方法，包括：
在第一基板表面形成微孔材料层，并图案化形成微孔阵列；
在所述微孔阵列表面沉积金属掩模材料层，并图案化形成金属掩模；
刻蚀具有所述金属掩模的微孔阵列，形成围绕所述微孔阵列中每个微孔的纳米线阵列。
在一些可能的实现方式中，所述制备方法还包括在形成微孔阵列和形成金属掩模之间对所述微孔阵列进行表面改性，使得所述微孔阵列的微孔间隔部分为疏水性。
在一些可能的实现方式中，所述表面改性包括在微孔内部分沉积二氧化硅，以进行亲水改性，并在所述微孔间隔部分涂覆硅烷偶联剂层，进行疏水改性。
作为本发明的又一个方面，提供一种基因测序装置，其包括上述基因测序芯片。
作为本发明的又一个方面，提供一种基因测序芯片的保存方法，所述基因测序芯片包括间隔设置的微孔阵列，所述保持方法包括：
制备水溶性预聚物；
在所述基因测序芯片的表面涂覆所述水溶性预聚物；
使所述预聚物聚合为水溶性聚合物。
在一些可能的实现方式中，所述保存方法还包括去除所述基因测序芯片中微孔间隔部分的水溶性聚合物。
在一些可能的实现方式中，所述水溶性聚合物为丙烯酰胺类预聚物。
在一些可能的实现方式中，制备水溶性预聚物包括将N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺与丙烯酰胺分别在50℃条件下预聚合。
根据本发明的基因测序芯片通过构建高密度的纳米线阵列以及微孔阵列内外的亲水性和疏水性差异，使传统的平面测序反应扩展到三维空间测序，大幅提升了测序的通量，同时有效提升测序簇的荧光强度，提高检测灵敏度。
上述概述仅仅是为了说明书的目的，并不意图以任何方式进行限制。除上述描述的示意性的方面、实施方式和特征之外，通过参考附图和以下的详细描述，本公开进一步的方面、实施方式和特征将会是容易明白的。
附图说明
在附图中，除非另外规定，否则贯穿多个附图相同的附图标记表示相同或相似的部件或元素。这些附图不一定是按照比例绘制的。应该理解，这些附图仅描绘了根据本公开公开的一些实施方式，而不应将其视为是对本公开范围的限制。
图1为根据本发明一实施方式的基因测序芯片的微孔阵列示意图；
图2为根据本发明一实施方式的基因测序芯片的微孔阵列的排列形状示意图；
图3为根据本发明一实施方式的基因测序芯片的纳米线阵列示意图；
图4为根据本发明一实施方式的基因测序芯片的微孔的截面扫描电镜图片；
图5为根据本发明一实施方式的基因测序芯片的纳米线的截面扫描电镜图片；
图6为根据本发明一实施方式制备基因测序芯片的掩模图形示意图；
图7为根据本发明一实施方式制备基因测序芯片的方法流程图；
图8为根据本发明一实施方式的基因测序芯片的保存效果对比图。
具体实施方式
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本公开的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
本发明提供一种基因测序芯片，包括高密度的三维纳米线阵列。具体地，本发明的基因测序芯片包括基板、形成于基板表面的微孔阵列，以及围绕微孔阵列中每个微孔周围形成的纳米线阵列。
本发明所用的基板可采用基因测序芯片领域常用的基板，例如玻璃基板。
如图1所示，本发明基因测序芯片的微孔阵列形成于基板表面，通常可为圆形微米级微孔阵列，且微孔间隔排列。并且，微孔内呈现亲水性，微孔间的间隔部分呈现疏水性，交替密堆排列。每个微孔形成反应单元，且该反应单元内部形成测序试剂反应槽。
上述微孔阵列的排列图形可根据需要设定，例如可如图1和图2所示，呈六边形形状排列，且各六边形阵列之间间隔设置。根据一个具体实施方式，为了方便测序结果读出的时候计数和定位，每个六边形阵列图形中，包含96个微孔，每个微孔和微孔间隔构成一个周期。
根据一个具体实施方式，如图4所示，上述微孔的直径通常可为0.3-5μm，优选1-3μm，且微孔间距可为1-3μm。优选地，微孔内可形成一定坡度角，例如可＞87°。
根据一个具体实施方式，微孔内具有二氧化硅层，由此可具有亲水性；而微孔的间隔部具有硅烷偶联剂层，由此可具有疏水性。
如图3所示，在本发明的基因测试芯片中，围绕上述阵列结构中的每个微孔设置有纳米线，由此形成与微孔阵列对应的间隔设置的纳米线阵列。具体地，如图5所示，纳米线的横向尺寸可在100nm以下，优选50-80nm。本发明对纳米线的纵向尺寸没有限制，但实际工艺中，纳米线的高度可为1-2μm。借由该纳米线阵列，可将测序所需的接头连接在每一根纳米线上，从而将传统发生在平面上的测序反应扩展到三维条件下。在每个微孔形成的反应单元内部形成测序试剂反应槽，围绕反应槽构成这些均匀分布的纳米线，既保证了反应单元内部的反应环境，又保障了反应单元间无串扰。
根据一个具体实施方式，在上述纳米线上连接有测序所需的接头，为测序反应提供条件。此时，每一根纳米线则形成一个测序簇，从而将传统的300nm级的测序簇缩减到100nm以下，从而大幅提升测序的通量，使纵向上的叠加相较于平面分布，可以更有效提升测序簇的荧光强度，提高检测的灵敏度。
基于以上高密度纳米线阵列，本发明的基因测序芯片可实现在25mm×65mm的面积内至少具有1G reads的通量。
如图7所示，根据本发明的另一方面，提供上述基因测序芯片的制备方法，包括微孔阵列形成、微孔阵列改性、金属掩模形成、纳米线阵列形成的步骤。
上述微孔阵列形成步骤包括在基板表面依次涂覆保护胶层，经过刻蚀形成所需微孔阵列，在此基础上沉积二氧化硅层，并进行刻蚀，除去微孔间隔部分处的二氧化硅，保留微孔内和侧壁的二氧化硅。此时，形成的微孔尺寸在上文所述范围内。
根据一个具体实施例，高密度微孔阵列的制备包括以下步骤。
前清洗
先将基板(例如玻璃基板)进行前清洗，该前清洗步骤可采用本领域常规的标准清洗方法。
微孔阵列图形形成
在经过前清洗的玻璃基板表面涂覆粘附层，具体地，该粘附层通常可采用旋涂一层常规的粘附层胶，例如可先涂覆OC胶，再重复涂覆两层PS TG-S509胶经过掩模曝光(掩模图形如图6所示)、显影形成目标微孔图案。该微孔图案由基板表面的粘附层图案化形成，不涉及对基板的刻蚀。
优选地，在涂完OC后的基板上旋涂PS TG-S509胶，300转/分钟，90℃前烘2分钟，重复旋涂PS TG-S509胶一次，通过掩模曝光形成目标微孔图案。其中，曝光强度200mJ，曝光间隙(gap)值100μm，曝光时间15秒，显影液显影45秒，在230℃固化30分钟，得到微米级微孔阵列。
微孔阵列改性
在上述微孔阵列表面沉积SiO2，并经过掩模刻蚀除去微孔间隔处SiO2，而孔内侧壁SiO2得以保留。
根据一个具体实施方式，SiO2层厚度可控制在600-700nm，继而进行电感耦合等离子体(inductively coupled plasma，ICP)刻蚀或者反应离子刻蚀(Reactive IonEtching，RIE)干刻，将微孔内径缩小至1-3μm，孔间距放大至1-3μm，且坡度角＞87°，如图4所示。
在沉积有SiO2层的微孔阵列表面沉积硅烷偶联剂，优选可为双氨基型官能团硅烷偶联剂，例如KH-900，厚度可为100-300nm。进一步，去除微孔内的硅烷偶联剂，保留微孔间隔部分的硅烷偶联剂。硅烷偶联剂层的沉积和图案化可采用本领域的常规方法进行。由此，具有SiO2层的微孔内部分具有亲水性，具有硅烷偶联剂层的微孔间隔部分具有疏水性。
金属掩模形成
在以上经过表面改性的具有微孔阵列的基板表面沉积金属掩模材料层。本发明的金属掩模材料层可包括依次沉积Mo膜、Al膜、Mo膜，或者Ti膜、Al膜、Ti膜，形成300-500nm的Mo-Al-Mo或Ti-Al-Ti镀膜，形成金属保护层。在金属掩模材料层表面旋涂光刻胶，300转/分钟，90℃前烘2分钟，重复旋涂一次，通过掩模、曝光形成目标图案。其中，曝光强度为200mJ，曝光间隙值为100μm，曝光时间15秒，显影液显影45秒，在230℃固化30分钟。
参见图7，金属掩模材料层经上述步骤后，形成图案化金属保护层，例如经过ICP刻蚀，使金属掩模材料层对应微孔间隔部分的部分被图案化，以形成具有与纳米线图形对应图形的金属硬掩模，图案内无残留，剥离掉光刻胶保护层，形成完整的金属掩模。
纳米线阵列形成
对具有上述金属掩模的基板进行干式刻蚀，例如ICP刻蚀，完成纳米线图案化，如图5、图7所示。具体地，刻蚀金属掩模层和二氧化硅层，例如金属掩模层ICP刻蚀100s，SiO2层ICP刻蚀300s，形成所需尺寸要求的纳米线阵列。
本发明的基因测序芯片的制备方法还可进一步包括接头偶联步骤。本发明的接头偶联步骤可采用1:1的EDC：NHS处理，将接头引物与芯片表面的-COOH反应，使得接头共价连接在芯片微孔内。
进一步地，本发明的基因测序芯片的制备方法还可包括芯片封装步骤，例如可采用GE 6585胶水均匀涂布在芯片四周，宽度为1.2mm，覆盖上盖板，100℃烘烤5min后程序升温至150℃，烘烤10min，形成100μm盒厚。
根据本发明的另一方面，提供一种基因测序装置，包括上述基因测序芯片。
根据本发明的又一方面，提供一种基因测序芯片的保存方法，包括：制备水溶性预聚物；在上述基因测序芯片的表面涂覆上述水溶性预聚物；使上述预聚物聚合为水溶性聚合物。
根据一个具体实施方式，上述保存方法可包括：
将N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺与丙烯酰胺分别在50℃条件下预聚合5min；
将上述预聚合的产物涂覆在芯片基板表面，35℃2小时完成完全聚合，再经过灰化或抛光处理掉微孔外的共聚物，仅保留微孔内部分，完全覆盖芯片上已经偶联好的引物。
采用上述保存方法保存的芯片在使用前除去(例如用去离子水洗去)上述水溶性共聚物即可。
根据一个具体实施方式，将经过N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺与丙烯酰胺的水溶性聚合物涂覆保存的芯片每间隔1月进行测试，验证接头有效率，同时采用相同的未涂覆上述水溶性聚合物的芯片作为对照，分别测得的有效率见图8。如图8所示，根据本发明经过上述水溶性共聚物保护的芯片在保存后1-12个月测得的接头有效率基本保持一致，即保持良好的保存时效。而未经上述水溶性共聚物保护的芯片在保存后1-12个月测得的接头有效率降低幅度超过50％。由此可见，根据本发明的芯片保存方法可以有效延长芯片的保存时效。
综上所述，本发明与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的基因测试芯片相较于传统芯片，每一个反应单元由成千上万纳米线组成，测序簇形成在相邻的几根纳米线上，呈三维分布，通量实现飞跃，显著提高；
(2)本发明的基因测试芯片制备方法无需采用纳米压印和玻璃刻蚀，采用传统半导体加工方法即可实现，整个工艺流程快且可有效降低成本；
(3)本发明的基因测试芯片相较于现有技术的同类产品，测序反应簇从微孔的底部变成纳米线，由二维变成三维，有效提高了单位面积上的测序簇密度，提高单位面积的信号强度，从而提高信噪比和分辨率；
(4)本发明的芯片保存方法可有效保护芯片上连接的接头，大幅延长芯片的有效期。
上文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本公开的不同结构。为了简化本公开的公开，上文中对特定例子的部件和设置进行描述。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本公开。此外，本公开可以在不同例子中重复参考数字和/或参考字母，这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身不指示所讨论各种实施方式和/或设置之间的关系。
以上，仅为本公开的具体实施方式，但本公开的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，可轻易想到其各种变化或替换，这些都应涵盖在本公开的保护范围之内。因此，本公开的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (14)
1.一种基因测序芯片，其特征在于，包括：
基板，具有第一表面；
微孔阵列，位于所述第一表面内；
纳米线阵列，由分别包围所述微孔阵列中每个微孔的纳米线形成。
2.根据权利要求1所述的基因测序芯片，其特征在于，所述纳米线阵列间隔设置。
3.根据权利要求1所述的基因测序芯片，其特征在于，所述微孔阵列的微孔内部为亲水性，微孔间隔部分为疏水性。
4.根据权利要求1所述的基因测序芯片，其特征在于，在25mm×65mm的面积内至少具有1G reads的通量。
5.根据权利要求1所述的基因测序芯片，其特征在于，所述纳米线上连接有测序需要的接头。
6.根据权利要求1所述的基因测序芯片，其特征在于，所述纳米线的直径为100nm以下。
7.一种基因测序芯片的制备方法，其特征在于，包括：
在第一基板表面形成微孔材料层，并图案化形成微孔阵列；
在所述微孔阵列表面沉积金属掩模材料层，并图案化形成金属掩模；
刻蚀具有所述金属掩模的微孔阵列，形成围绕所述微孔阵列中每个微孔的纳米线阵列。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括在形成微孔阵列和形成金属掩模之间对所述微孔阵列进行表面改性，使得所述微孔阵列的微孔内部分为亲水性，微孔间隔部分为疏水性。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述表面改性包括在微孔内部分沉积二氧化硅，以进行亲水改性，并在所述微孔间隔部分涂覆硅烷偶联剂层，以进行疏水改性。
10.一种基因测序装置，其特征在于，包括根据权利要求1至6中任一项所述的基因测序芯片。
11.一种基因测序芯片的保存方法，所述基因测序芯片包括间隔设置的微孔阵列，其特征在于，所述保存方法包括：
制备水溶性预聚物；
在所述基因测序芯片的表面涂覆所述水溶性预聚物；
使所述预聚物聚合为水溶性聚合物。
12.根据权利要求11所述的保存方法，其特征在于，还包括去除所述基因测序芯片中微孔间隔部分的水溶性聚合物。
13.根据权利要求11或12所述的保存方法，其特征在于，所述水溶性聚合物为丙烯酰胺类预聚物。
14.根据权利要求11或12所述的保存方法，其特征在于，制备水溶性预聚物包括将N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺与丙烯酰胺分别在50℃条件下预聚合。
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