CN117355333A - 包含抗tm4sf1抗体和免疫治疗药剂的组合及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

描述了抗TM4SF1抗体及其抗原结合片段，和包含它们的抗体药物缀合物，以及此类抗体和ADC与免疫疗法如免疫调节剂的组合。

Description

包含抗TM4SF1抗体和免疫治疗药剂的组合及其使用方法
交叉引用
本申请要求2021年3月26日提交的美国临时专利申请号63/166,805的权益，该申请通过引用整体并入本文。
背景技术
本领域仍然需要癌症治疗剂，特别是具有可以消退原发性肿瘤以及侵袭性肿瘤细胞和转移的改善的治疗范围的治疗剂。
旨在破坏肿瘤血管的癌症疗法过去由于毒性而在临床试验中失败。实例包括血管破坏剂，如考布他汀(Combretastatin)(CA4P)。参见，例如，Grisham等人.Clinical trialexperience with CA4P anticancer therapy:focus on efficacy,cardiovascularadverse events,and hypertension management.Gynecol Oncol Res Pract.2018；5:1。在II期FALCON研究中，CA4P将总生存期从16.2个月降低到13.6个月，并且有7名患者在接受CA4P治疗时经历了心脏病发作。同上。由于冠心病和中风是导致死亡的主要原因，因此任何靶向血管的毒性治疗都可能导致致命毒性的风险。
TM4SF1是在血管生成中具有功能性作用的内皮标志物。参见，例如，Shih等人.TheL6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumorangiogenesis.Cancer Res.2009；69(8):3272-7。
发明内容
一个实施方案提供了一种组合，其包含：a.抗TM4SF1结合蛋白；以及b.免疫治疗药剂。在一些实施方案中，免疫治疗药剂是细胞因子、佐剂或免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，免疫治疗药剂是抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，免疫治疗药剂是针对存在于髓系细胞、肿瘤细胞、淋巴系细胞中的靶标或存在于肿瘤微环境中的蛋白质的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，免疫治疗药剂是针对PD-1、CTLA-4、CD40、CSF1/CSF1R、SIRPα、CLEC-1中的至少一种的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，免疫治疗药剂是针对以下中的至少一种的抗体或其抗原结合片段：CCR4、CTLA-4、A1R、A2AR、A3R、TIM-3、BTLA、VISTA、TIGIT、LAG-3、ILRa/CD25、ITGB1/CD29、Ly 24/CD44、CD48、CEACAM1/CD66a、Nt5e/CD73、CD94/NKG2A、FAS/CD95、SLAF1/CD150、NRP1/CD304、GITR/CD357、ICOS、Tnfrs4/OX40、Folr4/JUNO、P2X7、ANXA2、IDO、B7-H6、KIR、GARP(LRRC32)、TNFR2。在一些实施方案中，免疫治疗药剂是针对PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CD47、TDO、DcR3中的至少一种的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，免疫治疗药剂是针对外泌体、细胞因子、白介素或趋化因子中的至少一种的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，免疫治疗药剂是针对PS、PD-L1、STING中的至少一种的抗体或其抗原结合片段。
一个实施方案提供了一种组合，其包含：a.抗TM4SF1结合蛋白；以及b.选自以下的免疫治疗药剂：伊匹单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、信迪利单抗(sintilimab)、特瑞普利单抗(toripalimab)、MGA012、MGD013、MGD019、依诺妥珠单抗(enoblituzumab)、MGD009、MGC018、MEDI0680、PDR001、FAZ053、TSR022、MBG453、瑞拉利单抗(relatlinab)(BMS986016)、LAG525、IMP321、REGN2810(西米普利单抗(cemiplimab))、REGN3767、培西达替尼(pexidartinib)、LY3022855、FPA008、BLZ945、GDC0919、艾卡哚司他(epacadostat)、吲哚莫德(indoximid)、BMS986205、CPI-444、MEDI9447、PBF509、利瑞鲁单抗(lirilumab)、IMC-001、莫那利珠单抗(Monalizumab)及其组合。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包含：重链可变结构域，该重链可变结构域包含CDR3结构域，该CDR3结构域包含与SEQ ID NO:8、20、32、44、56、68、80、96、118、119、120、121或162具有至少75％同一性的氨基酸序列；CDR2结构域，该CDR2结构域包含与SEQ ID NO:7、19、31、43、55、67、79、95、116、117或161具有至少75％同一性的氨基酸序列；和CDR1结构域，该CDR1结构域包含与SEQID NO:6、18、30、42、54、66、78、94、115或160具有至少75％同一性的氨基酸序列；以及轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含CDR3结构域，该CDR3结构域包含与SEQ ID NO:14、26、38、50、62、74、86、110、129或159具有至少75％同一性的氨基酸序列；CDR2结构域，该CDR2结构域包含与SEQ ID NO:13、25、37、49、61、73、85或109、128或158具有至少75％同一性的氨基酸序列；和CDR1，该CDR1包含与SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72、84、107、108、124、125、126、127或157具有至少75％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包含IgG Fc区，并且其中所述IgG Fc区在以下位置中的至少一个处包含突变：E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250Q、T256E、D265、N297、K322、P331、M428和N434；如通过如Kabat中所述的EU索引编号的。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含以下突变中的至少一个：E233P、L234A、L235A、G237A、M252Y、S254T、T250Q、T256E、D265A、N297C、K322A、P331G、M428L、N434A和N434S；如通过如Kabat中所述的EU索引编号的。
在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白与治疗性分子缀合，形成抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，治疗性分子选自蛋白酶体抑制剂、卡奇霉素(calicheamicin)、吡咯并苯二氮(pyrrolobenzodiazepine)、澳瑞他汀(auristatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、美登醇(maytansinoid)及其任何组合。在一些实施方案中，治疗性分子包含蛋白酶体抑制剂，并且其中蛋白酶体抑制剂选自硼替佐米(bortezomib)(Velcade、PS-341)、PR-171(卡非佐米(carfilzomib))、伊沙佐米(ixazomib)德兰佐米(delanzomib)、马里佐米(marizomib)、奥泼佐米(oprozomib)、VR23、PI-1840、(苄氧基羰基)-Leu-Leu-苯丙氨醛、2,3,5a,6-四氢-6-羟基-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3a,10a-联二硫桥-吡嗪并[1,2α]吲哚-1,4-二酮、4-羟基-3-硝基苯基乙酰基-Leu-Leu-Leu-乙烯基砜、sapojargon、Ac-hFLFL-环氧化物、阿克拉霉素A(aclacinomycin A)、阿柔比星(aclarubicin)、ACM、AdaK(Bio)Ahx3L3VS、AdaLys(Bio)Ahx3L3VS、金刚烷-乙酰基-(6-氨基己酰基)-3-(亮氨酰基)-3-乙烯基-(甲基)-砜、ALLM、ALLN、钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、苄氧羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨醛、苄氧羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-正缬氨醛、胶霉毒素(gliotoxin)、异戊酰-L-酪氨酰-L-缬氨酰-DL-酪氨醛、裂体-乳胞素-β-内酯(clasto-lactacystin-β-lactone)、Z-LL-Nva-CHO、泛素醛、YU101、MP-LLL-VS、LDN-57444、Z-GPFL-CHO、Z-LLL-CHO、洛伐他汀(lovastatin)、α-甲基-裂体-乳胞素-β-内酯、美维诺林(mevinolin)、MK-803、NIP-L3VS、NP-LLL-VS、NPI-0052(salinosporamide A)、MLN519(PS-519)、NLVS(三亮氨酸乙烯基砜)、利托那韦(ritonavir)、Ro106-9920、Z-LLF-CHO、Z-LL-B(OH)2、RRRPRPPYLPR、Tyropeptin A、ZL3VS、PR-11、PR-39、0106-9920、蛋白酶体抑制剂I、蛋白酶体抑制剂II、蛋白酶体抑制剂III、蛋白酶体抑制剂IV、AdaAhx3L3VS、肽抑制素(efrapeptin)、MG-132、MG-262、MG-115、α-甲基omuralide(α-methylomuralide)、MG-101、艾泼米辛(epoxomicin)、omuralide、乳胞素(lactacystin)和NEOSH101。
一个实施方案提供了一种试剂盒，其包含上述实施方案中的任一者的组合以及用于向对象施用抗TM4SF1结合蛋白和免疫治疗药剂的说明书。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白和免疫治疗药剂在单一组合物中。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白和免疫治疗药剂在单独的组合物中。
一个实施方案提供了一种试剂盒，其包含上述实施方案中的任一者的组合以及用于向对象施用抗TM4SF1结合蛋白和免疫治疗药剂的说明书。在一些实施方案中，结合蛋白和免疫治疗药剂在单一组合物中。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白和免疫治疗药剂在单独的组合物中。一个实施方案提供了一种试剂盒，其包含以下中的任一者：a.包含治疗有效量的抗TM4SF1结合蛋白的组合物，和b.包含治疗有效量的免疫治疗药剂的组合物；以及用于向对象顺序或同时施用a.和b.的说明书。
一个实施方案提供了一种试剂盒，其包含以下中的任一者：a.包含治疗有效量的抗TM4SF1结合蛋白的组合物，和b.包含治疗有效量的免疫治疗药剂的组合物，该免疫治疗药剂选自：伊匹单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗、阿替利珠单抗、度伐利尤单抗、曲美木单抗、斯巴达珠单抗、阿维鲁单抗、信迪利单抗、特瑞普利单抗、MGA012、MGD013、MGD019、依诺妥珠单抗、MGD009、MGC018、MEDI0680、PDR001、FAZ053、TSR022、MBG453、瑞拉利单抗(BMS986016)、LAG525、IMP321、REGN2810(西米普利单抗)、REGN3767、培西达替尼、LY3022855、FPA008、BLZ945、GDC0919、艾卡哚司他、吲哚莫德、BMS986205、CPI-444、MEDI9447、PBF509、利瑞鲁单抗、IMC-001、莫那利珠单抗及其组合；以及用于向对象顺序或同时施用a.和b.的说明书。
一个实施方案提供了一种药物组合物，其包含根据上述实施方案中的任一者的组合或根据上述实施方案中的任一者的试剂盒，以及药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或其任何组合中的至少一种。一个实施方案提供了一种治疗对象的方法，该方法包括施用一种组合，该组合包含：a.抗TM4SF1结合蛋白；以及b.免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白和免疫治疗药剂同时施用于对象。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白和免疫治疗药剂顺序施用于对象。在一些实施方案中，首先施用抗TM4SF1结合蛋白，其次施用免疫治疗药剂。在一些实施方案中，首先施用免疫治疗药剂，其次施用抗TM4SF1结合蛋白。在一些实施方案中，首先施用和其次施用间隔1、2、3、6、12、24、48小时或更多小时。在一些实施方案中，施用导致改善的T细胞功能。在一些实施方案中，改善的T细胞功能包括肿瘤微环境(TME)中的增加的T细胞浸润。在一些实施方案中，改善的T细胞功能包括肿瘤血管中ICAM-1和VCAM-1的增加的表达。
一个实施方案提供了一种治疗对象的方法，该方法包括施用一种组合，该组合包含：a.抗TM4SF1结合蛋白；以及b.选自以下的免疫治疗药剂：伊匹单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗、阿替利珠单抗、度伐利尤单抗、曲美木单抗、斯巴达珠单抗、阿维鲁单抗、信迪利单抗、特瑞普利单抗、MGA012、MGD013、MGD019、依诺妥珠单抗、MGD009、MGC018、MEDI0680、PDR001、FAZ053、TSR022、MBG453、瑞拉利单抗(BMS986016)、LAG525、IMP321、REGN2810(西米普利单抗)、REGN3767、培西达替尼、LY3022855、FPA008、BLZ945、GDC0919、艾卡哚司他、吲哚莫德、BMS986205、CPI-444、MEDI9447、PBF509、利瑞鲁单抗、IMC-001、莫那利珠单抗及其组合。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白和免疫治疗药剂同时施用于对象。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白和免疫治疗药剂顺序施用于对象。在一些实施方案中，首先施用抗TM4SF1结合蛋白，其次施用免疫治疗药剂。在一些实施方案中，首先施用免疫治疗药剂，其次施用抗TM4SF1结合蛋白。在一些实施方案中，首先施用和其次施用间隔1、2、3、6、12、24、48小时或更多小时。在一些实施方案中，施用导致改善的T细胞功能。在一些实施方案中，改善的T细胞功能包括肿瘤微环境(TME)中的增加的T细胞浸润。在一些实施方案中，改善的T细胞功能包括肿瘤血管中ICAM-1和VCAM-1的增加的表达。
一个实施方案提供了一种在对象中改善T细胞应答的方法，其包括施用根据上述实施方案中的任一者的组合，其中改善的应答与改善的T细胞功能相关。在一些实施方案中，改善的T细胞功能包括肿瘤微环境(TME)中的增加的T细胞浸润。在一些实施方案中，改善的T细胞功能包括肿瘤血管中ICAM-1和VCAM-1的增加的表达。在一些实施方案中，施用组合疗法包括第一治疗和第二治疗。在一些实施方案中，第一治疗包含抗TM4SF1结合蛋白，并且其中第二治疗包含免疫检查点抑制剂药剂。在一些实施方案中，第一治疗包含抗TM4SF1结合蛋白，并且其中第二治疗包含治疗药剂。在一些实施方案中，第一治疗和第二治疗在1、2、3、4、5或7天内进行。在一些实施方案中，每周、每两周、每月或每两年施用该组合。
在一些实施方案中，对象正经历可能诱导转移的治疗。在一些实施方案中，治疗包括手术、放射治疗和化学治疗。在一些实施方案中，对象患有癌症。在一些实施方案中，癌症是前列腺癌、肝癌、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰腺癌、胃部(胃)癌、宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、尿路上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌(鳞状细胞癌和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌、淋巴瘤(NHL或HL)、急性髓细胞白血病(AML)、T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、食道癌、梅克尔细胞癌、MSI-高癌症、KRAS突变肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤和骨髓增生异常综合征(MDS)。在一些实施方案中，根据权利要求26-55中任一项所述的方法，其中所述对象是人类。
附图说明
本发明的新颖性特征在所附权利要求中具体地阐述。通过参考阐述其中利用本公开的原理的说明性实施方案的以下详细描述以及如下附图，将获得对本公开的特征和优点的更好理解：
图1图示了在小鼠肿瘤和内皮细胞中与示例性抗体1组的加帽的抗TM4SF1抗体的结合亲和力。通常，在基于细胞的测定中，示例性抗体1组中抗体的结合亲和力为3-7nMEC50。
图2A-2B图示了使用单独的示例性抗体1-L1抗TM4SF1抗体药物缀合物或与免疫检查点抑制剂抗PD-1抗体(克隆RMP1-14；BioXCell)组合的体内B16F10(与C57Bl/6小鼠同基因；图2A)和CT26(与BALB/c小鼠同基因；图2B)肿瘤消退活性的结果。在两种同基因肿瘤模型中，单独的抗PD-1抗体不显示肿瘤消退活性，而当它们被共注射时，该抗体增强了示例性抗体1-L1的肿瘤消退活性。
图3图示了在小鼠肿瘤和内皮细胞中与示例性抗体1组的加帽的抗TM4SF1抗体的结合亲和力。
图4A-4H图示了通过单次注射媒介物或同种型匹配对照(IS-Ctl)，或使用单独的示例性抗体1-L1抗TM4SF1抗体药物缀合物或与免疫检查点抗小鼠CTLA-4抗体(克隆9H10)组合，体内CT26(与BALB/c小鼠同基因)肿瘤生长活性的结果。图4A表示在媒介物对照和同种型匹配对照抗体药物缀合物(IS-Ctl)中的肿瘤生长，而图4E指示在示例性抗体1-L1抗TM4SF1抗体药物缀合物的存在下的肿瘤生长。图4B-4D图示了来自三种不同剂量(2.5、5或10mpk)的单独的抗小鼠CTLA-4抗体的结果，而图4F-4H示出了来自使用示例性抗TM4SF1抗体1-L1与三种不同剂量的抗小鼠CTLA-4抗体的组合的结果。
图5A-5D图示了用新鲜制备的CT26肿瘤细胞再激发在初次给药后第60-70天显示无肿瘤(TF)的BALB/c小鼠(如图4A-4H所示)的结果。8周大的初始的BALB/c小鼠和6-8个月大的退役的BALB/c繁殖者都被用作肿瘤生长对照，并且接受与再激发的小鼠相同数量的CT26肿瘤细胞。
图6A-6F图示了使用单独的示例性抗体1-L1抗TM4SF1抗体药物缀合物或与免疫检查点抗小鼠CTLA-4抗体(克隆9H10)组合的体内Renca(与BALB/c小鼠同基因)肿瘤消退活性的结果。图6A表示在媒介物对照和同种型匹配对照抗体药物缀合物(IS-Ctl)中的肿瘤生长，而图6D指示在示例性抗体1-L1抗TM4SF1抗体药物缀合物的存在下的肿瘤生长。图6B-6C图示了来自两种不同剂量(5或10mpk)的单独的抗小鼠CTLA-4抗体的结果，而图6E-6F示出了来自使用示例性抗TM4SF1抗体1-L1与两种不同剂量的抗小鼠CTLA-4抗体的组合的结果。
图7A-7D图示了用Renca再激发显示无肿瘤(TF)的BALB/c小鼠(如图6A-6H所示)和退役的BALB/c繁殖者的结果。
图8A-8H图示了使用单独的示例性抗体1-L1抗TM4SF1抗体药物缀合物或与免疫检查点CTLA-4抗体(克隆9H10)组合的体内B16F10(与C57Bl/6小鼠同基因)肿瘤消退活性的结果。图8A表示在媒介物对照和同种型匹配对照抗体药物缀合物(IS-Ctl)中的肿瘤生长，而图8E指示在示例性抗体1-L1抗TM4SF1抗体药物缀合物的存在下的肿瘤生长。图8B-8D图示了来自三种不同剂量(2.5、5或10mpk)的单独的抗小鼠CTLA-4抗体的结果，而图8F-8H示出了来自使用示例性抗TM4SF1抗体1-L1与三种不同剂量的抗小鼠CTLA-4抗体的组合的结果。
图9A-9H图示了使用单独的示例性抗体1-L1抗TM4SF1抗体药物缀合物或与免疫检查点CTLA-4抗体(克隆9H10)组合的体内LLC(与C57Bl/6小鼠同基因)肿瘤消退活性的结果。图9A表示在媒介物对照和同种型匹配对照抗体药物缀合物(IS-Ctl)中的肿瘤生长，而图9E指示在示例性抗体1-L1抗TM4SF1抗体药物缀合物的存在下的肿瘤生长。图9B-9D图示了来自三种不同剂量(2.5、5或10mpk)的单独的抗小鼠CTLA-4抗体的结果，而图9F-9H示出了来自使用示例性抗TM4SF1抗体1-L1与三种不同剂量的抗小鼠CTLA-4抗体的组合的结果。
具体实施方式
跨膜-4L六家族成员-1(transmembrane-4L six family member-1，TM4SF1)是一种具有四次跨膜蛋白(tetraspanin)拓扑结构的小膜糖蛋白，其在大多数实体瘤起源的人类肿瘤和内皮细胞中，尤其是在血管生成血管中的活化内皮细胞中高度表达。
本文在一个实施方案中提供了一种组合，该组合可以通过使用血管靶向疗法(例如，与内皮细胞生物标志物相互作用的抗体，如抗血管生成抗体，如抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，并与有效负载，例如细胞毒性有效负载缀合)和免疫治疗药剂(例如，免疫检测点抑制剂、细胞因子、佐剂)来改善肿瘤消退。这种组合可以包括各种有吸引力的特征。例如，抗血管生成抗体可以提供一些优点，这至少是因为：(1)血管生成是癌症的标志，并且破坏血管生成血管的疗法可以是用于实体瘤的通用疗法；(2)血管内皮是未突变的宿主系统，并且不能对疗法产生抗性；因此，血管靶向疗法可能能够克服肿瘤细胞靶向治疗的常见问题，其中靶组织进化并且变得对疗法有抗性；(3)肿瘤的血管内皮直接暴露于静脉内(IV)输注的药物，因此对于不能到达肿瘤细胞的药物是可及的；以及(4)肿瘤血管破坏促进了用于伤口愈合的免疫细胞浸润。免疫检查点受体充当T细胞受体(TCR)共信号传导伴侣，其向T淋巴细胞递送负性信号。例如，程序性死亡蛋白-1(PD-1)是一种负性共刺激受体，并且向细胞毒性T淋巴细胞递送负性信号。虽然PD-1在正常情况下对自身耐受至关重要，然而，当与在肿瘤细胞上表达的其配体PD-L1和PD-L2相互作用时，PD-1可以允许肿瘤逃避抗肿瘤免疫应答，并且导致T细胞衰竭增加和抗肿瘤应答减弱。经由抗PD-1抗体阻断PD-1或经由抗PD-L1/L2抗体阻断PD-L1/L2可以阻断负性信号，并且帮助细胞毒性T细胞恢复其免疫功能。阻断如PD-L1的抗体到达肿瘤细胞的不可及性可能是靶向实体瘤的主要挑战，特别是对于那些类似胰腺癌的表型的肿瘤，其具有限制药物到达肿瘤细胞的致密的纤维化基质。因此，使用抗血管生成抗体引起肿瘤血管损伤并增强白细胞浸润或递送免疫阻断抗体以帮助T细胞靶向肿瘤细胞的联合疗法是使冷肿瘤变热以改善免疫疗法的有利方法。在另一实施方案中，本公开提供了一种包含抗体药物缀合物(ADC)和免疫治疗药剂(例如免疫检查点抑制剂)的组合，该抗体药物缀合物包含抗血管生成ADC(例如，与有效负载(例如，细胞毒性有效负载)缀合的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段)。在一些实例中，本公开包括使用上述组合用于治疗或预防癌症的方法。
I.定义
除非在本文中另有定义，否则与本公开关联使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。术语的含义和范围应当是清楚的，然而，如果存在任何潜在歧义，则本文提供的定义优先于任何词典或外部定义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语将包括复数，并且复数术语将包括单数。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式如“包含”和“含有”的使用不是限制性的。
通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交关联使用的命名及其技术是本领域公知且常用的。除非另有规定，否则本公开的方法和技术通常根据本领域公知的以及如本说明书通篇引用和论述的各种通用的和更具体的参考文献中描述的常规方法来进行。酶反应和纯化技术按照制造商的说明书进行，以本领域通常实现的方式进行，或如本文所述进行。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学关联使用的命名及其实验室程序和技术是本领域公知且常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及治疗患者。
如本文所用的术语“跨膜-4L六家族成员-1”或“TM4SF1”是指跨膜4超家族/四跨膜蛋白家族的多肽，其在血管内皮细胞(EC)、发育中视网膜血管的EC上表达，在肿瘤EC、肿瘤细胞(TC)和血管生成血管中具有较高的表达。TM4SF1具有两个细胞外环(ECL1和ECL2)，它们由四个跨膜结构域(M1、M2、M3和M4)、N-末端和C-末端以及细胞内环(ICL)分隔。ECL2含有两个N-糖基化位点。人TM4SF1(hTM4SF1)的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:166中描述(也参见NCBI参考序列号NP_055035.1)。
如本文所用的术语“抗体”意指包含与特定抗原(例如TM4SF1)特异性结合或相互作用的至少一个互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子。术语“抗体”包括免疫球蛋白分子及其多聚体(例如IgM)，该免疫球蛋白分子包含四条多肽链，即通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含CH1、CH2和CH3三个结构域。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH区和VL区可进一步细分为超变区，被称为互补决定区(CDR)，其中散布有更保守的区域，被称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。在本公开的不同实施方案中，抗TMS4F1抗体(或其抗原结合部分)的FR可与人种系序列相同，或者可被天然地或人工地修饰。可以基于对两个或更多个CDR的并排分析来确定氨基酸共有序列。
术语“完整抗体”是指一种抗体，该抗体包含四条多肽链，即通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。在一个实施方案中，该抗TM4SF1抗体是完整抗体。在一个实施方案中，该完整抗体是完整的人IgG1、IgG2或IgG4同种型。在某些实施方案中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人IgG1、IgG2或IgG4同种型。
如本文所用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、可以酶法获得的、合成的或遗传工程化的多肽或糖蛋白。例如，抗体的抗原结合片段可使用任何合适的标准技术从完整抗体分子衍生，所述技术例如是蛋白水解消化，或涉及对编码抗体可变结构域和任选的恒定结构域的DNA的操作和表达的重组遗传工程技术。这样的DNA是已知的，并且/或者易于从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)获得，或者可以合成获得。可对DNA进行测序，并且以化学方式或通过使用分子生物学技术进行操作，例如用以将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型，或者用以引入密码子，创建半胱氨酸残基，修饰、添加或缺失氨基酸，等等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的超变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如，分离的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)，或受约束的FR3-CDR3-FR4肽。
如本文所用的术语抗体或其片段的“可变区”或“可变结构域”是指抗体分子的轻链和重链的部分，其包括互补决定区(CDR；即CDR-1、CDR-2和CDR-3)和框架区(FR)的氨基酸序列。VH是指重链的可变结构域。VL是指轻链的可变结构域。根据本公开中使用的方法，分配给CDR和FR的氨基酸位置可根据Kabat(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991))来确定。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号也按照Kabat的编号。
如本文所用的术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在三个CDR，对于每个可变区，这些CDR被指定为CDR1、CDR2和CDR3。如本文所用的术语“CDR集”是指存在于单一可变区中的能够结合抗原的一组三个CDR。这些CDR的精确边界已根据不同系统以不同方式限定。由Kabat(Kabat等人,Sequencesof Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)和(1991)))描述的系统不仅提供适用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且还提供界定三个CDR的确切残基边界。这些CDR可被称为Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)和Chothia等人,Nature 342:877-883(1989))发现，Kabat CDR内的某些子部分尽管在氨基酸序列水平上具有极大多样性，但却采用几乎相同的肽骨架构象。这些子部分被指定为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链区域和重链区域。这些区域可被称为Chothia CDR，它们具有与Kabat CDR重叠的边界。界定与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界已由Padlan(FASEB J.9:133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5):732-45(1996))描述。其他CDR边界界定可能不严格遵循以上系统之一，但仍然与Kabat CDR重叠，尽管鉴于特定残基或残基组乃至整个CDR不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以是缩短的或延长的。本文所用的方法可利用根据这些系统中的任何系统所确定的CDR，但优选实施方案使用Kabat或Chothia确定的CDR。
如本文所用的术语“框架区”(在下文中称为FR)是指除CDR残基以外的那些可变结构域残基。每个可变结构域一般具有四个FR，被标识为FR1、FR2、FR3和FR4。抗体或其功能片段的可变区之间的共同结构特征是本领域公知的。编码特定抗体的DNA序列通常可按照公知方法来获得，所述方法例如是通过引用并入本文中的Kabat等人1987Sequence ofProteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and HumanServices,Bethesda MD中描述的那些方法。另外，用于从抗体克隆功能性可变区的一般方法可见于通过引用并入本文中的Chaudhary,V.K.等人,1990Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1066中。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(被称为“Fab”片段)和残留的“Fc”片段，该名称反映了容易结晶的能力。Fab片段由完整的L链和H链的可变区结构域(VH)以及一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。就抗原结合而言，每个Fab片段都是单价的，即它具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大的F(ab’)2片段，其大致对应于两个具有二价抗原结合活性的二硫键连接的Fab片段，并且仍然能够交联抗原。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基末端处具有额外的少量残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基团的Fab’的名称。F(ab’)2抗体片段最初作为Fab’片段对产生，在Fab’片段对之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。Fc片段包含由二硫化物保持在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列决定，该区也是由在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。本文的术语“Fc区”用来定义抗体重链的C末端区域，包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变异Fc区。尽管抗体重链的Fc区的边界可能变化，但人IgG重链Fc区常常被定义为从位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230伸展至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据Kabat等人中的EU编号系统的残基447)可以例如在抗体的产生或纯化期间去除，或通过重组工程化编码抗体重链的核酸而被去除。因此，完整抗体的组合物可包含已去除所有K447残基的抗体群体，没有去除K447残基的抗体群体，以及具有含K447残基的抗体和不含K447残基的抗体的混合物的抗体群体。此外，本公开中完整抗体的组合物可包含在C末端赖氨酸K447之后具有残基延伸的抗体群体。
“变体Fc区”包含与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列，其不同之处在于至少一个如本文所定义的“氨基酸修饰”。与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸置换，例如，在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中约1至约10个氨基酸置换，约1至约5个氨基酸置换。在一个实施方案中，本文的变体Fc区可以具有与天然序列Fc区具有至少约80％同源性、至少约85％同源性、至少约90％同源性、至少约95％同源性或至少约99％同源性的序列。根据另一实施方案，本文的变体Fc区可以具有与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性、至少约85％同源性、至少约90％同源性、至少约95％同源性或至少约99％同源性的序列。
如本文所用的术语“人源化抗体”是指与目的抗原(例如人TM4SF1)免疫特异性结合并且包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)的抗体或其变体、衍生物、类似物或片段。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白。通常，人源化抗体将包含基本上全部或至少一个、通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且全部或基本上全部FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白共有序列的至少一部分。抗体人源化方法是本领域已知的。参见，例如，Riechmann等人,1988,Nature332:323-7；Queen等人的美国专利号：5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370；EP239400；PCT公布WO 91/09967；美国专利号5,225,539；EP592106；EP519596；Padlan,1991,Mol.Immunol.,28:489-498；Studnicka等人,1994,Prot.Eng.7:805-814；Roguska等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.91:969-973；以及美国专利号5,565,332，所述文献全部均通过引用整体并入本文。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能少量存在的可能的突变，例如天然发生的突变外，构成该群体的各个抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”将抗体的特性指示为不是离散抗体的混合物。在某些实施方案中，这样的单克隆抗体通常包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中靶标结合性多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单一靶标结合性多肽序列的过程来获得。例如，选择过程可以是从多个克隆，例如从杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的库中选择独特的克隆。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个表位。
如本文所用的术语“嵌合抗体”是指抗体(免疫球蛋白)，其具有重链和/或轻链的部分，该部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现所需的生物活性即可(美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
如本文所用的术语“表位”是指与抗体分子的可变区中被称为互补位的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单一抗原可具有超过一个表位。因此，不同抗体可与抗原上的不同区域结合，并且可具有不同的生物效应。表位可被定义为结构性的或功能性的。功能性表位通常是结构性表位的子集，并且具有对相互作用的亲和力作出直接贡献的那些残基。表位还可以是构象性的，即，由非线性(非连续)氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可包括作为分子的化学活性表面基团诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的决定簇，并且在某些实施方案中，可具有特定的三维结构特性和/或特定的电荷特性。表位可以由连续氨基酸(通常是线性表位)或由蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸(通常是构象表位)形成。由连续氨基酸形成的表位通常但不总是在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包括独特空间构象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。用于确定给定抗体结合哪些表位的方法(即表位作图)是本领域熟知的，并且包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定，其中测试来自(例如来自TREM-1)的重叠肽或连续肽与给定抗体(例如抗TREM-1抗体)的反应性。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术和本文所述的技术，例如，X射线晶体学、抗原突变分析、二维核磁共振和HDX-MS(参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷,G.E.Morris编著(1996))。
如本文可互换使用的术语“有效负载”、“药物有效负载”、“治疗性分子”、“治疗有效负载”、“治疗药剂”、“治疗部分”是指与抗TMSF1抗体或抗原结合片段(例如，本文公开的抗TM4SF1抗体或抗原结合片段)缀合的化学或生物部分，并且可以包括任何治疗药剂或诊断药剂，例如但不限于用于癌症和用于非癌症血管生成适应症两者的小分子；V-ATP酶抑制剂；促凋亡剂；Bcl2抑制剂；MCL1抑制剂；HSP90抑制剂；IAP抑制剂；mTor抑制剂；微管稳定剂；微管去稳定剂；澳瑞他汀；多拉司他汀(dolastatin)；美登醇；MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)；蛋白质CRM1的核输出的抑制剂；DPPIV抑制剂；蛋白酶体抑制剂；线粒体中磷酰基转移反应的抑制剂；蛋白质合成抑制剂；激酶抑制剂(如，CDK2抑制剂、CDK9抑制剂)；驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA破坏剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂、DHFR抑制剂、核酸、CRISPR酶；降解剂(如诱导蛋白质降解的药剂，(例如，HSP90抑制剂、选择性雌激素受体降解剂(SERD)、选择性雄激素受体降解剂(SARD)；疏水性标签，其可以用于募集感兴趣蛋白质的伴侣，例如金刚烷、Arg-Boc3；E3连接酶募集配体，例如，Nutlin-3a(MDM2配体)、贝司他丁(Bestatin)(cIAP配体)、VHL配体、泊马度胺(Pomalidomide)(CRBN配体)；蛋白水解-靶向嵌合体(PROTAC)，其可以利用不同的D3连接酶以靶向感兴趣蛋白用于降解))(参见，例如LaiAC,Crews CM.Induced protein degradation:an emerging drug discoveryparadigm.Nat Rev Drug Discov.2016；16(2):101-114)；反义寡核苷酸；RNAi药剂(如siRNA)、CRISPR-Cas9基因编辑系统；RNA分子；DNA，例如质粒；抗癌药剂、抗炎药剂、抗感染药剂(例如，抗真菌药剂、抗细菌药剂、抗寄生虫药剂、抗病毒药剂)、麻醉药剂；RNA聚合酶II抑制剂；DNA嵌入剂、DNA交联剂；抗微管蛋白药剂；细胞毒性药物、肿瘤疫苗、抗体、肽、肽体、化学治疗药剂、细胞毒性药剂；细胞生长抑制剂；免疫调节剂、干扰素、白介素、免疫刺激生长激素、细胞因子、维生素、矿物质、芳香酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、HDAC抑制剂；包封一种或多种治疗性分子的脂质纳米颗粒。
术语“药物-抗体比”或“DAR”可以指本文公开的ADC中附着于抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的药物(本文中也被称为治疗性分子、治疗药剂或治疗部分)的数量。ADC的DAR通常在1至12的范围内，尽管根据抗体上连接位点的数量或多价连接的使用(其中多个药物有效负载连接到一个连接位点上)，更高的加载量(例如16)也是可能的。术语DAR可以用于指加载到个体抗体上的药物分子的数量，或者可替代地可以用于指一组ADC的平均值或平均DAR，以反映平均药物加载量。多个ADC的组合物、批次和/或制剂可以通过平均DAR来表征。DAR和平均DAR可以通过各种常规手段如UV光谱法、质谱法、ELISA测定、辐射测定方法、疏水作用色谱法(HIC)、电泳和HPLC来确定。
术语“结合亲和力”通常是指分子(例如结合蛋白，如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。结合分子X(例如抗TM4SF1抗体)对其结合配偶体Y(例如人TM4SF1)的亲和力通常可用解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法来测量，所述方法包括本文所述的那些方法。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快结合抗原并倾向于更久地保持结合。各种测量结合亲和力的方法是本领域已知的，其中任何方法均可用于本公开。具体的说明性实施方案包括以下。在一个实施方案中，“KD”或“KD值”可通过本领域已知的测定，例如通过结合测定来测量。KD可在例如用目的抗体的Fab变化形式及其抗原进行的RIA中测量(Chen等人,1999,J.Mol Biol 293:865-81)。KD还可以通过以下方式测量：使用FACS，或使用例如BIACORE 2000或BIACORE 3000通过BIACORE进行的表面等离子体共振测定，或通过使用例如OCTET QK384系统进行的生物层干涉测量法。在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体的KD通过使用采用HUVEC细胞进行的标准流式细胞术测定来确定。“结合速率”或“缔合的速率”或“缔合速率”或“kon”和“脱离速率”或“解离速率”或“解离的速率”或“koff”还可使用例如BIACORE 2000或BIACORE 3000或OCTET QK384系统，通过以上所述的相同表面等离子体共振或生物层干涉测量技术来确定。
如本文所用的，术语“kon”旨在表示如本领域已知，抗体与抗原缔合以形成抗体/抗原复合物的结合速率常数。
如本文所用的，术语“koff”旨在表示如本领域已知，抗体从抗体/抗原复合物上解离的解离速率常数。
术语“抑制”当在本文中使用时是指部分(如1％、2％、5％、10％、20％、25％、50％、75％、90％、95％、99％)或完全(即100％)抑制。
如本文所用的术语“癌症”是指或描述哺乳动物中的生理状况，该状况的特征一般是不受调节的细胞生长。
如本文所用的术语“与高转移风险相关的癌症”是指与已知会增加患有癌症的对象发生转移性癌症的风险的至少一种因素相关的癌症。与转移风险增加相关的因素的实例包括但不限于对象在初始癌症诊断时具有的癌性淋巴结的数目、肿瘤的大小、组织学分级，以及在初始诊断时癌症的分期。
如本文所用的术语“血行转移”是指癌细胞穿透血管壁的能力，之后它们能够通过血流循环(循环肿瘤细胞)到身体中的其他部位和组织。
如本文所用的术语“淋巴转移”是指癌细胞穿透淋巴管并且排入血管中的能力。
在本公开的背景下，如本文所用的术语“治疗”或“处理”意指逆转、减轻、预防应用这种术语的病症或病况或这种病症或病况的一种或多种症状或抑制其进展。如本文所用的术语“治疗癌症”意指抑制癌细胞的生长和/或增殖。在一个实施方案中，本文所述的组合物和方法用来治疗患有转移性癌症的对象中的转移。
术语“预防癌症”或“癌症的预防”是指延迟、抑制或预防哺乳动物中癌症的发作，在该哺乳动物中，肿瘤形成或肿瘤发生的发作未经证实，但癌症倾向得到确认，无论是通过例如遗传筛查还是以其他方式确定。该术语还涵盖治疗具有恶化前状况的哺乳动物，以使恶化前状况向恶性病的进展停止，或导致恶化前状况的消退。恶化前状况的实例包括增生、发育不良和化生。在一些实施方案中，预防癌症针对处于癌症缓解期的对象来使用。
各种癌症，包括恶性或良性和/或原发性或继发性癌症，可用本公开的方法来治疗或预防。此类癌症的实例是本领域技术人员已知的，并且在标准教科书如Merck Manual ofDiagnosis and Therapy(由Merck出版)中列出。
如本文所用的术语“对象”是指哺乳动物(例如人)。
如本文所用的术语“施用”是指向对象给予一定剂量的抗体或其片段或组合物(例如药物组合物)的方法。施用方法可根据各种因素(例如，所施用的结合蛋白或药物组合物，以及所治疗的病况、疾病或病症的严重程度)而不同。
如本文所用的术语“有效量”是指本文提供的抗体或药物组合物的足以导致所需结果的量。
术语“约”和“大约”意指在给定值或范围的20％以内、15％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内或更小百分比内。
如在本文中可互换使用的术语“同一性”或“同源性”可以是两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列之间的“同一性”、“同源性”或“同源性百分比”的计算，其可以通过为了最佳比较目的而对序列进行比对来确定(例如，可以在第一序列的序列中引入空位)。然后可以比较相应位置处的核苷酸，并且两个序列之间的同一性百分比可以是序列共有的相同位置数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/位置的总数目x 100)。例如，如果第一序列中的位置可以被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据，则分子在该位置处是相同的。两个序列之间的同源性百分比可以是序列共有的相同位置的数目的函数，其中考虑为了两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数目和每个空位的长度。在一些实施方案中，为了比较目的而比对的序列的长度可以是参考序列长度的至少约：30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或95％。搜索可以确定两个序列之间的同源性。这两个序列可以是基因、核苷酸序列、蛋白质序列、肽序列、氨基酸序列或其片段。对两个序列的实际比较可以通过公知的方法来完成，例如，使用数学算法。这样的数学算法的非限制性实例可描述于Karlin,S.和Altschul,S.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90-5873-5877(1993)中。如Altschul,S.等人,NucleicAcids Res.,25:3389-3402(1997)中所述，这样的算法可以并入NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，NBLAST)的任何相关参数。例如，用于序列比较的参数可设置为分数＝100，字长＝12，或可变化(例如，W＝5或W＝20)。其他实例包括Myers和Miller的算法、CABIOS(1989)、ADVANCE、ADAM、BLAT和FASTA。在另一实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用例如GCG软件包(Accelrys,Cambridge,UK)中的GAP程序来完成。
如本文所用的术语“可制备性”是指特定蛋白质在该蛋白质的重组表达和纯化期间的稳定性。可制备性被认为是由于在表达和纯化条件下分子的内在性质。改善的可制备性特性的实例包括蛋白质的均一糖基化，在蛋白质的重组产生期间增加的细胞效价、生长和蛋白质表达，改善的纯化性质，较低的聚集或不聚集倾向，以及改善的稳定性，包括但不限于热稳定性和在低pH下的稳定性。在一些实施方案中，提供了与其他TM4SF1抗体相比展示出可制备性以及体外和体内活性的保留的TM4SF1结合蛋白。在一些实施方案中，通过在CDR或框架区中进行氨基酸置换对亲本TM4SF1结合蛋白进行人源化可赋予额外的可制备性益处。
在一些实施方案中，提供了展示出改善的可开发性特性的TM4SF1结合蛋白，所述特性包括但不限于例如在蛋白A纯化或尺寸排阻色谱法之后改善的纯化产率、在纯化之后改善的均质性、改善的热稳定性。在一些情况下，改善是对于由杂交瘤小鼠细胞系8G4-5-13-13F(PTA-120523)产生的抗TM4SF1抗体而言的，如通过HLA分子结合所确定的。
在一些实例中，结合亲和力通过Scatchard分析来确定，该分析包括产生Scatchard图，Scatchard图是结合的配体与未结合的配体的浓度比相对于结合的配体浓度的图。
术语“血管毒性”是指抗TM4SF1抗体-治疗性分子缀合物(本文中也被称为抗TM4SF1 ADC或TM4SF1靶向ADC)的任何效应，其直接由于抗体或治疗性分子对携带抗原的细胞的作用或间接通过免疫系统的激活和导致的炎症而导致血管损伤。此类血管损伤可以包括但不限于影响血管内皮细胞或下层平滑肌细胞或周细胞或任何血管的基底膜(包括心内膜(心脏的衬里))的损伤或炎症。此类血管损伤可能影响动脉，包括大动脉，例如主动脉，弹性动脉(例如主动脉)，不同大小的肌动脉，例如冠状动脉、肺动脉、颈动脉、小动脉、毛细血管、脑或视网膜动脉；静脉；或它可能影响血管生成性血管，包括供应毛囊、消化道和骨髓的血管。此类血管损伤可以包括在心脏、肺、肾脏、视网膜、脑、皮肤、肝脏、消化道、骨髓、内分泌腺、睾丸或卵巢、子宫内膜和其他靶器官中的微血管功能障碍或损伤，并且可以包括肾脏的、视网膜的或脑血管的循环功能障碍。
如本文所用的术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)”是指由细胞毒性效应细胞通过非吞噬过程杀伤抗体包被的靶细胞，该非吞噬过程的特征在于释放细胞毒性颗粒的内含物或表达诱导细胞死亡的分子。ADCC通过靶标结合的抗体(属于IgG或IgA或IgE类别)与某些Fc受体(FcR)的相互作用来触发，所述Fc受体是存在于效应细胞表面上的结合免疫球蛋白(Ig)的Fc区的糖蛋白。介导ADCC的效应细胞包括天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和树突状细胞。ADCC是一种快速效应子机制，其有效性依赖于许多参数(靶细胞表面上的抗原的密度和稳定性；抗体亲和力和FcR结合亲和力)。基于PBMC的ADCC测定和基于天然杀伤细胞的ADCC测定可用于检测ADCC。这些测定中的读出数据是终点驱动的(靶细胞裂解)。
术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体的存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活由补体系统的第一组分(C1q)与(适当子类的)抗体的结合引发，所述抗体与其同源抗原结合。为了评估补体激活，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人,1996,J.Immunol.Methods 202:163)。已经描述了具有改变的Fc区氨基酸序列(具有变异Fc区的多肽)以及增加或降低的C1q结合能力的多肽变体(参见例如美国专利号6,194,551；WO1999/51642；Idusogie等人,2000,J.Immunol.164:4178-84)。可以选择不具有或具有极低CDC活性的抗体(或片段)进行使用。
如本文所用的术语“效应子功能”是指由IgG的Fc效应结构域(例如免疫球蛋白的Fc区)所贡献的功能。此类功能可以通过例如Fc效应结构域与具有吞噬或裂解活性的免疫细胞上的Fc受体结合，或通过Fc效应结构域与补体系统的组分结合而受到影响。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬(ADCP)；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；以及B细胞激活。
如本文所用的术语“降低”或“消除”是指能够导致优选20％或更大，更优选50％或更大，最优选75％、85％、90％、95％或更大的总体减低。降低或消除可指两个分子的结合亲和力，例如免疫球蛋白与C1q或Fc受体的结合；或者可指正在治疗的病症(例如癌症)的症状，如转移的存在或大小或原发性肿瘤的大小。
如本文所用的术语“降低的ADCC/CDC功能”是指与对照(例如具有不包括突变的Fc区的抗体)相比，特定效应子功能例如ADCC和/或CDC降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更大。
对于本公开中讨论的所有氨基酸位置，在抗体或其抗原结合片段的背景下，编号是根据EU索引。“EU索引”或“Kabat等人中的EU索引”或“EU编号方案”是指EU抗体的编号(参见，Edelman等人，1969；Rabat等人，1991)。
II.抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段
在一些实施方案中，本文提供了一种包含抗血管生成抗体或其抗原结合片段的组合，其中该抗血管生成抗体或其抗原结合片段包含如本文所述的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。
TM4SF1是一种具有四次穿膜蛋白拓扑结构而没有同源性的小质膜糖蛋白(NCBI参考序列号NP_055035.1)(Wright等人,Protein Sci.9:1594-1600,2000)。它在质膜上形成富含TM4SF1的结构域(TMED)，在该结构域中，如同真正的四次穿膜蛋白一样，它充当募集功能上相关的膜和胞质分子的分子促进剂(Shih等人,Cancer Res.69:3272-3277,2009；Zukauskas等人,Angiogenesis.14:345-354,2011)，并且在癌细胞生长(Hellstrom等人,Cancer Res.46:391 7-3923,1986)、运动性(Chang等人,Int J Cancer.116:243-252,2005)和转移(Richman等人,Cancer Res.5916s-5920s,1995)中起重要作用。人TM4SF1蛋白的氨基酸序列(NCBI参考序列号NP_055035.1)在以下显示为SEQ ID NO:165。MCYGKCARCIGHSLVGLALL CIAANILLYF PNGETKYASE NHLSRFVWFF SGIVGGGLLM LLPAFVFIGL EQDDCCGCCGHENCGKRCAM LSSVLAALIG IAGSGYCVIV AALGLAEGPLCLDSLGQWNYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHI VEWNVSLFSILLALG GIEFILCLIQVINGVLGGIC GFCCSHQQQYDC(SEQ ID NO:165)
在一些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体及其抗原结合片段对TM4SF1的ECL2结构域是特异性的。人TM4SF1 ECL2结构域的氨基酸序列是EGPLCLDSLGQWNYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHIVEWNVSLFS(SEQ ID NO:166)。
作为本文提供的组合的一部分的示例性抗体包括表2中提供的TM4SF1特异性抗体。表2中描述的示例性抗TM4SF1抗体是单克隆鼠抗体AGX-A03、AGX-A04、AGX-A05、AGX-A07、AGX-A08、AGX-A09和AGX-A11，它们可以结合TM4SF1的ECL2区。在下表2中进一步提供了这些抗体中的一些抗体的人源化版本，h AGX-A07和h AGX-A01。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG重链恒定区，该IgG重链恒定区包含SEQ ID NO:87或88所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:87或88具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列。
在另一实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:89具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性或100％同一性的序列。
在另一实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63或75所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63或75具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性或100％同一性的序列。
在另一实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链，该重链包含SEQ ID NO:90或92所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:90或92具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性或100％同一性的序列。
在另一实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链，该重链包含SEQ ID NO:112或114所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:112或114具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性或100％同一性的序列。
在另一实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69或81所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69或81具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性或100％同一性的序列。
在另一实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQ ID NO:97、99、101、103或105所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:97、99、101、103或105具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性或100％同一性的序列。在另一实施方案中，该抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQ ID NO:97、99或101所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:97、99或101具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性或100％同一性的序列。
在另一实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQ ID NO:122所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:122具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性或100％同一性的序列。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链CDR1，该重链CDR1包含与SEQ ID NO:6、18、30、42、54、66、78、94、115或160具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链CDR2，该重链CDR2包含与SEQ ID NO:7、19、31、43、55、67、79、95、116、117或161具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链CDR3，该重链CDR3包含与SEQ ID NO:8、20、32、44、56、68、80、96、118、119、120、121或162具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR1，该轻链CDR1包含与SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72、84、107、108、124、125、126、127或157具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR2，该轻链CDR2包含与SEQ ID NO:13、25、37、49、61、73、85、109、128或158具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR3，该轻链CDR3包含与SEQ ID NO:14、26、38、50、62、74、86、110、129或159具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链CDR1，该重链CDR1包含与SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:115具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链CDR2，该重链CDR2包含与SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:116或SEQID NO:117具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链CDR3，该重链CDR3包含与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:121具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链CDR1，该轻链CDR1包含与SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126或SEQ ID NO:127具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，包含轻链CDR2，该轻链CDR2包含与SEQ ID NO:109或SEQ ID NO:128具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链CDR3，该轻链CDR3包含与SEQ ID NO:110、SEQ IDNO:111或SEQ ID NO:129具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链CDR3，该轻链CDR3包含与SEQ ID NO:110或SEQ ID NO:129具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链CDR1，该轻链CDR1包含与SEQ ID NO:157具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，包含轻链CDR2，该轻链CDR2包含与SEQ ID NO:158具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链CDR3，该轻链CDR3包含与SEQ ID NO:159具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链CDR1，该重链CDR1包含与SEQ ID NO:160具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，包含重链CDR2，该重链CDR2包含与SEQ ID NO:161具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链CDR3，该重链CDR3包含与SEQ ID NO:162具有至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％同一性的氨基酸序列。
鼠单克隆抗体AGX-A03的氨基酸序列在表2中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQID NO:6、7和8(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO:12、13和14(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:6、7和8的氨基酸序列所示的CDR，该轻链可变区包含如SEQ ID NO:12、13和14的氨基酸序列所示的CDR。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，该人源化抗体或抗原结合片段包含AGX-A03的CDR。此外，AGX-A03的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:3和9描述。
鼠单克隆抗体AGX-A04的氨基酸序列在表1中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQID NO:18、19和20(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO:24、25和26(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:18、19和20的氨基酸序列所示的CDR，该轻链可变区包含如SEQ ID NO:24、25和26的氨基酸序列所示的CDR。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，该人源化抗体或抗原结合片段包含AGX-A04的CDR。此外，AGX-A04的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:15和21描述。
鼠单克隆抗体AGX-A05的氨基酸序列在表1中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQID NO:30、31和32(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO:36、37和38(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:30、31和32的氨基酸序列所示的CDR，该轻链可变区包含如SEQ ID NO:36、37和38的氨基酸序列所示的CDR。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，该人源化抗体或抗原结合片段包含AGX-A05的CDR。此外，AGX-A05的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:27和33描述。鼠单克隆抗体AGX-A07的氨基酸序列在表1中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQ ID NO:42、43和44(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO:48、49和50(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:42、43和44的氨基酸序列所示的CDR，该轻链可变区包含如SEQ ID NO:48、49和50的氨基酸序列所示的CDR。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，该人源化抗体或抗原结合片段包含AGX-A07的CDR。此外，AGX-A07的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ IDNO:39和45描述。
在一个实施方案中，提供了一种人源化的AGX-A07(h AGX-A07)抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:90的氨基酸序列所示的重链序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07(hm AGX-A07)抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:90的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的重链序列。如表1中所示，SEQ ID NO:90所示的重链序列在本文中也称为AGX-A07 H2。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:90的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的重链序列，其中该一个或多个置换处于SEQ ID NO:90的氨基酸位置1、44和80处。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含E1Q(在SEQ ID NO:90重链的位置1处谷氨酸被置换为谷氨酰胺)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含D44G(在SEQ ID NO:90重链的位置44处天冬氨酸被置换为甘氨酸)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含F80Y(在SEQ ID NO:90重链的位置80处苯丙氨酸被置换为酪氨酸)。在一些实施方案中，提供了一种人源化的突变AGX-A07抗体或抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:92的氨基酸序列所示的重链序列。如表1中所示，SEQ IDNO:92所示的重链序列在本文中也称为AGX-A07 H2v1。在一些实施方案中，提供了人源化的AGX-A07抗体或抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:97的氨基酸序列所示的轻链序列。如表1中所示，SEQ ID NO:97所示的轻链序列在本文中也称为AGX-A07 L5。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:97的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的轻链序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:97的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的轻链序列，其中该一个或多个置换处于SEQ ID NO:97的氨基酸位置3、26、62和90处。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含I3V(在SEQ ID NO:97轻链的位置3处异亮氨酸被置换为缬氨酸)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含N26Q(在SEQ ID NO:97轻链的位置26处天冬酰胺被置换为谷氨酰胺)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含N26S(在SEQ ID NO:97轻链的位置26处天冬酰胺被置换为丝氨酸)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含G62S(在SEQ ID NO:97轻链的位置62处甘氨酸被置换为丝氨酸)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含W90Y(在SEQ ID NO:97轻链的位置90处色氨酸被置换为酪氨酸)。在一些实施方案中，提供了人源化的突变AGX-A07抗体或抗原结合片段，其包含如选自SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:105中的氨基酸序列所示的轻链序列。如表1中所示，SEQ ID NO:99所示的轻链序列在本文中也称为AGX-A07 L5v1，SEQ ID NO:101所示的轻链序列在本文中也称为AGX-A07 L5v2，SEQ IDNO:103所示的轻链序列在本文中也称为AGX-A07 L5v3，而SEQ ID NO:105所示的轻链序列在本文中也称为AGX-A07 L5v4。人源化AGX-A07抗体或其抗原结合片段的重链的示例性编码序列以SEQ ID NO:91提供。人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段的重链的示例性编码序列以SEQ ID NO:93提供。人源化AGX-A07抗体或其抗原结合片段的轻链的示例性编码序列以SEQ ID NO:98(AGX-A07 L5)提供。人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段的轻链的示例性编码序列以SEQ ID NO:100(AGX-A07 L5v1)、SEQ ID NO:102(AGX-A07L5v2)、SEQ ID NO:104(AGX-A07 L5v3)和SEQ ID NO:106(AGX-A07 L5v4)提供。
在一个实施方案中，提供了一种人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:132的氨基酸序列所示的重链可变结构域序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:132的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的重链可变结构域序列。在一个实施方案中，提供了一种人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:131或SEQ ID NO:133的氨基酸序列所示的轻链可变结构域序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:131或SEQ ID NO:133的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的轻链可变结构域序列。
在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变结构域序列和重链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包含如SEQ ID NO:131的氨基酸序列所示的序列，该重链可变结构域序列包含如SEQ ID NO:130的氨基酸序列所示的序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变结构域序列和重链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列在如SEQ ID NO:131的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换，该重链可变结构域序列在如SEQ ID NO:130的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变结构域序列和重链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包含如SEQ ID NO:133的氨基酸序列所示的序列，该重链可变结构域序列包含如SEQ ID NO:132的氨基酸序列所示的序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变结构域序列和重链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列在如SEQ ID NO:133的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换，该重链可变结构域序列在如SEQ ID NO:132的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含重链序列，该重链序列包含如SEQ ID NO:156的氨基酸序列所示的序列，或在SEQ ID NO:156的氨基酸序列中包含一个或多个置换的序列。
在一些情况下，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:94、95和96(CDR1、CDR2和CDR3)所示的重链CDR序列，或在如SEQ ID NO:94、95和96(CDR1、CDR2和CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:94、95和96(CDR1、CDR2和CDR3)所示的重链CDR序列，或在如SEQ ID NO:94、95和96(CDR1、CDR2和CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。
在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:94所示的重链CDR1序列，或在如SEQ ID NO:94所示的序列中包含一个或多个置换的重链CDR1序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:95所示的重链CDR2序列，或在如SEQ ID NO:95所示的序列中包含一个或多个置换的重链CDR2序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:96所示的重链CDR3序列，或在如SEQ ID NO:96所示的序列中包含一个或多个置换的重链CDR3序列。
在一些情况下，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:107、109和110(CDR1、CDR2和CDR3)所示的轻链CDR序列，或在如SEQ ID NO:107、109和110(CDR1、CDR2和CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。在一些情况下，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:107、109和111(CDR1、CDR2和CDR3)所示的轻链CDR序列，或在如SEQ ID NO:107、109和111(CDR1、CDR2和CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。在一些情况下，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQID NO:108、109和110(CDR1、CDR2和CDR3)所示的轻链CDR序列，或在如SEQ ID NO:108、109和110(CDR1、CDR2和CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。在一些情况下，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:108、109和111(CDR1、CDR2和CDR3)所示的轻链CDR序列，或在如SEQ ID NO:108、109和111(CDR1、CDR2和CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。
在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:107或108所示的轻链CDR1序列，或在如SEQ ID NO:107或108所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR1序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:109所示的轻链CDR2序列，或在如SEQ ID NO:109所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR2序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:110或111所示的轻链CDR3序列，或在如SEQ ID NO:110或111所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR1序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:110所示的轻链CDR3序列，或在如SEQ ID NO:110所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR1序列。
在一些实施方案中，人源化的突变AGX-A07包含在SEQ ID NO:132(在本文中也称为AGX-A07 H2)中包含以下氨基酸置换的重链可变区：Q1E、D44G、F80Y，以及在SEQ ID NO:133(在本文中也称为AGX-A07 L5)中包含以下氨基酸置换的轻链可变区：I3V、N26Q、G62S。在一些实施方案中，人源化的突变AGX-A07包含在SEQ ID NO:132中包含以下氨基酸置换的重链可变区：Q1E、D44G、F80Y，以及在SEQ ID NO:133中包含以下氨基酸置换的轻链可变区：I3V、N26Q、G62S，其中该重链包含CDR1(SEQ ID NO:94)、CDR2(SEQ ID NO:95)和CDR3(SEQID NO:96)，并且该轻链包含CDR1(SEQ ID NO:108)、CDR2(SEQ ID NO:109)和CDR3(SEQ IDNO:110)。在一些实施方案中，人源化的突变AGX-A07是AGX-A07 H2v1L5v2，并且包含重链和轻链，该重链包含如SEQ ID NO:130(在本文中也称为AGX-A07 H2v1)所示的氨基酸序列，该轻链包含如SEQ ID NO:131(在本文中也称为AGX-A07 L5v2)所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，人源化的突变AGX-A07包含重链和轻链，该重链包含如SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列，该轻链包含如SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列。
鼠单克隆抗体AGX-A08的氨基酸序列在表1中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQID NO:54、55和56(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO:60、61和62(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:54、55和56的氨基酸序列所示的CDR，该轻链可变区包含如SEQ ID NO:60、61和62的氨基酸序列所示的CDR。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，该人源化抗体或抗原结合片段包含AGX-A08的CDR。此外，AGX-A08的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:51和57描述。
鼠单克隆抗体AGX-A09的氨基酸序列在表1中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQID NO:66、67和68(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO:72、73和74(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:66、67和68的氨基酸序列所示的CDR，该轻链可变区包含如SEQ ID NO:72、73和74的氨基酸序列所示的CDR。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，该人源化抗体或抗原结合片段包含AGX-A09的CDR。此外，AGX-A09的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:63和69描述。
鼠单克隆抗体AGX-A11的氨基酸序列在表1中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQID NO:78、79和80(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO:84、85和86(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:78、79和80的氨基酸序列所示的CDR，该轻链可变区包含如SEQ ID NO:84、85和862的氨基酸序列所示的CDR。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，该人源化抗体或抗原结合片段包含AGX-A11的CDR。此外，AGX-A11的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ IDNO:75和81描述。
人源化抗体AGX-A01(h AGX-A01)的氨基酸序列在表1中描述。如表1中所示，SEQID NO:112所示的重链序列在本文中也称为AGX-A01 H1。具体来说，重链CDR序列如SEQ IDNO:115、116和118(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO:124、128和129(CDR1、CDR2和CDR3)所示。此外，人源化的AGX-A01的示例性重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列分别以SEQ ID NO:112和122描述。人源化的AGX-A01的重链和轻链的示例性编码序列分别以SEQ ID NO:113和123描述。
在一些实施方案中，人源化的AGX-A01抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A01(hm AGX-A01)抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:112的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的重链序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A01抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:112的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的重链序列，其中该一个或多个置换处于SEQ ID NO:112的氨基酸位置63和106处。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含G63S(在SEQ ID NO:112重链的位置63处甘氨酸被置换为丝氨酸)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含D106E(在SEQ ID NO:112重链的位置106处天冬氨酸被置换为谷氨酸)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含D106S(在SEQ ID NO:112重链的位置106处天冬氨酸被置换为丝氨酸)。在一些实施方案中，提供了一种人源化的突变AGX-A01抗体或抗原结合片段，其包含如SEQID NO:114的氨基酸序列所示的重链序列。如表1中所示，SEQ ID NO:114所示的重链序列在本文中也称为AGX-A01 H1v1。
在一些实施方案中，提供了人源化的AGX-A01抗体或抗原结合片段，其包含如SEQID NO:122的氨基酸序列所示的轻链序列。如表1中所示，SEQ ID NO:122所示的轻链序列在本文中也称为AGX-A01 L10。在一些实施方案中，人源化的AGX-A01抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:122的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的轻链序列。在一些实施方案中，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQID NO:122的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的轻链序列，其中该一个或多个置换处于选自SEQ ID NO:122的氨基酸位置1、33、42、51、86和90中的一个或多个氨基酸位置处。在一些实施方案中，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:122的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的轻链序列，其中该一个或多个置换处于选自SEQ ID NO:122的氨基酸位置1、33、42、51和86中的一个或多个氨基酸位置处。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含A1E(在SEQ ID NO:122轻链的位置1处丙氨酸被置换为谷氨酸)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含N33S(在SEQ ID NO:122轻链的位置33处天冬酰胺被置换为丝氨酸)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含M42Q(在SEQ ID NO:122轻链的位置42处甲硫氨酸被置换为谷氨酰胺)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含V51L(在SEQ ID NO:122轻链的位置51处缬氨酸被置换为亮氨酸)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含D86E(在SEQ ID NO:122轻链的位置86处天冬氨酸被置换为谷氨酸)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含I90V(在SEQ ID NO:122轻链的位置90处异亮氨酸被置换为缬氨酸)。
在一些情况下，人源化的AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:115(CDR1)；116(CDR2)；和118(CDR3)所示的重链CDR序列，或在如SEQ ID NO:115(CDR1)；116(CDR2)；和118(CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:115(CDR1)；116或117(CDR2)；和118、119、120或121(CDR3)所示的重链CDR序列，或在如SEQ ID NO:115(CDR1)；116或117(CDR2)；和118、119、120或121(CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。
在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:115所示的重链CDR1序列，或在如SEQ ID NO:115所示的序列中包含一个或多个置换的重链CDR1序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:116所示的重链CDR2序列，或在如SEQ ID NO:116所示的序列中包含一个或多个置换的重链CDR2序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:117所示的重链CDR2序列，或在如SEQ ID NO:117所示的序列中包含一个或多个置换的重链CDR2序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如选自SEQ IDNO:118、119、120和121中的序列所示的重链CDR3序列，或在选自SEQ ID NO:118、119、120和121中的序列中包含一个或多个置换的重链CDR3序列。
在一些情况下，人源化的AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:124(CDR1)；128(CDR2)；和129(CDR3)所示的轻链CDR序列，或在如SEQ ID NO:124(CDR1)；128(CDR2)；和129(CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:124、125、126或127(CDR1)；128(CDR2)；和129(CDR3)所示的轻链CDR序列，或在如SEQ ID NO:124、125、126或127(CDR1)；128(CDR2)；和129(CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。
在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:125、126、127或128所示的轻链CDR1序列，或在如SEQ ID NO:125、126、127或128所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR1序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:129所示的轻链CDR2序列，或在如SEQ ID NO:129所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR2序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:130所示的轻链CDR3序列，或在如SEQ ID NO:130所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR1序列。
在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:3所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO:9所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:15所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO:21所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:27所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO:33所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:39所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO:45所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:51所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO:57所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:63所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO:69所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:75所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO:81所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:90所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO:97所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:90所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO:99所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:90所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO:101所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:90所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO:103所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:90所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO:105所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:92所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO:97所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:92所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ IDNO:99所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:92所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO:101所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:92所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO:103所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:92所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO:105所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。
在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其具有与选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:114中的氨基酸序列具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的重链可变结构域序列；并且具有与选自SEQ ID NO:9、SEQID NO:21、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:81、SEQID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105或SEQ ID NO:122中的氨基酸序列具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其具有与选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:114中的氨基酸序列具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的重链可变结构域序列；并且具有与选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ IDNO:101或SEQ ID NO:122中的氨基酸序列具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的轻链可变结构域序列。
在一个实施方案中，本公开包括一种抗TM4SF1抗体，该抗TM4SF1抗体是IgG，并且包含四条多肽链，包括两条各自包含重链可变结构域和重链恒定区CH1、CH2和CH3的重链，以及两条各自包含轻链可变结构域和轻链恒定区(CL)的轻链。在某些实施方案中，该抗体是人IgG1、IgG2或IgG4。在某些实施方案中，该抗体是人IgG1。在其他实施方案中，该抗体是IgG2。重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列可含有如表1所示的CDR。
互补决定区(CDR)被称为轻链可变结构域与重链可变结构域两者中的超变区。可变结构域的更高度保守的部分被称为框架(FR)。给定抗体的CDR和框架区(FR)可使用由Kabat等人(同上)、Lefranc等人(同上)和/或Honegger和Pluckthun(同上)描述的系统来鉴定。本领域技术人员还熟悉Kabat等人(1991,NIH Publication 91-3242,NationalTechnical Information Service,Springfield,Va.)描述的编号系统。就此而言，Kabat等人定义了一种针对可变结构域序列，包括用于鉴定CDR的编号系统，该编号系统适用于任何抗体。
一个或多个CDR可共价地或非共价地并入分子中，以使其成为抗原结合蛋白。
抗原结合蛋白可并有CDR作为较大多肽链的部分，可使CDR共价连接至另一多肽链，或者可非共价地并有CDR。CDR允许抗原结合蛋白与特定目的抗原特异性结合。特别是，已知CDR3在抗体或抗体片段的抗原结合中起重要作用。
在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链，该重链包含如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:20、SEQID NO:32、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:80中任一个所示的CDR3结构域，并且包含可变结构域，该可变结构域包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQID NO:27、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:75中任一个所示的序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链，该轻链包含如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:26、SEQID NO:38、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:86中任一个所示的CDR3结构域，并且具有轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:81中任一个所示的序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的氨基酸序列。因此，在某些实施方案中，CDR3结构域保持恒定，而可向重链和/或轻链的其余CDR和/或框架区中引入可变性，同时该抗体或其抗原结合片段保留结合TM4SF1的能力，并且保留亲本的功能特性，例如结合亲和力，或与亲本相比具有改善的功能特性，例如结合亲和力。
在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链，该重链包含如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQID NO:31、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:79中任一个所示的CDR2结构域，并且包含可变结构域，该可变结构域包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQID NO:27、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:75中任一个所示的序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链，该轻链包含如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:25、SEQID NO:37、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:85中任一个所示的CDR2结构域，并且具有轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:81中任一个所示的序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的氨基酸序列。因此，在某些实施方案中，CDR2结构域保持恒定，而可向重链和/或轻链的其余CDR和/或框架区中引入可变性，同时该抗体或其抗原结合片段保留结合TM4SF1的能力，并且保留亲本的功能特性，例如结合亲和力，或与亲本相比具有改善的功能特性，例如结合亲和力。
在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链，该重链包含如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18、SEQID NO:30、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:78中任一个所示的CDR1结构域，并且包含可变结构域，该可变结构域包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQID NO:27、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:81中任一个所示的序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链，该轻链包含如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:24、SEQID NO:36、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:84中任一个所示的CDR1结构域，并且具有轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:81中任一个所示的序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的氨基酸序列。因此，在某些实施方案中，CDR1结构域保持恒定，而可向重链和/或轻链的其余CDR和/或框架区中引入可变性，同时该抗体或其抗原结合片段保留结合TM4SF1的能力，并且保留亲本的功能特性，例如结合亲和力。
在一些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体包含含有Fc区的重链，其中所述Fc区包含选自SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQID NO:145、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:153中的序列：或者其中所述Fc区包含在选自SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQID NO:145、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:153中的序列中包含一个或多个置换的序列。例如，在一些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体包含Fc区，其中所述Fc区包含与选自SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQID NO:145、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:153中的序列具有至少约70％至约100％，如至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、在至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的序列。
在一些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体包含重链，该重链包含选自SEQ IDNO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:156中的序列：或者其中所述重链包含在选自SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:154、SEQ IDNO:155和SEQ ID NO:156中的序列中包含一个或多个置换的序列。例如，在一些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体包含重链，该重链包含与选自SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155和SEQ IDNO:156中的序列具有至少约70％至约100％，如至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、在至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的序列。
还可以对表1中所述的抗TM4SF1抗体和片段进行人源化。对非人抗体进行人源化的各种方法是本领域已知的。例如，人源化抗体可具有从非人类来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常常被称为“输入”残基，这些残基通常取自“输入”可变结构域。例如，可按照Jones等人,1986、Nature 321:522-25；Riechmann等人,1988、Nature 332:323-27；以及Verhoeyen等人,1988、Science 239:1534-36的方法，通过用超变区序列置换人抗体的相应序列来进行人源化。
在一些情况下，通过CDR移植来构建人源化抗体，其中将亲本非人抗体(例如啮齿动物)的六个CDR的氨基酸序列移植到人抗体框架上。例如，Padlan等人确定CDR中仅有约三分之一的残基实际上接触抗原，并且将这些残基称为“特异性决定残基”或SDR(Padlan等人,1995,FASEB J.9:133-39)。在SDR移植技术中，仅将SDR残基移植到人抗体框架上(参见，例如，Kashmiri等人,2005,Methods 36:25-34)。
选择在制备人源化抗体中使用的人轻链可变结构域和重链可变结构域对于降低抗原性而言都可能是重要的。例如，根据所谓的“最佳匹配”方法，相对于已知人类可变结构域序列的整个文库来筛查非人(例如啮齿动物)抗体的可变结构域的序列。可将与啮齿动物序列最接近的人类序列选择为人源化抗体的人框架(Sims等人,1993,J.Immunol.151:2296-308；以及Chothia等人,1987,J.Mol.Biol.196:901-17)。另一种方法使用衍生自具有特定轻链或重链子组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同框架可用于若干不同人源化抗体(Carter等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89；以及Presta等人,1993,J.Immunol.151:2623-32)。在一些情况下，框架衍生自最丰富的人子类——VL6子组I(VL6I)和VH子组III(VHIII)的共有序列。在另一种方法中，使用人种系基因作为框架区的来源。
通常更理想的是，使抗体在保留它们对抗原的亲和力和其他有利生物性质的情况下人源化。为了实现这个目标，根据一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且为本领域技术人员所熟悉。可获得用来说明并展示所选候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序。这些程序包括例如WAM(Whitelegg和Rees,2000,Protein Eng.13:819-24)、Modeller(Sali和Blundell,1993,J.Mol.Biol.234:779-815)和Swiss PDB Viewer(Guex和Peitsch,1997,Electrophoresis 18:2714-23)。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，例如分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可从接受序列和输入序列中选择并组合FR残基，以便实现所需抗体特性，如增加的对靶抗原的亲和力。通常，超变区残基直接并最实质性地参与影响抗原结合。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳匹配”方法选择的框架区(参见例如Sims等人,J.Immunol.151(1993)2296)；衍生自具有轻链可变区或重链可变区的特定子组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89(1992)4285；以及Presta等人,J.Immunol.,151(1993)2623)；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；以及通过筛查FR文库获得的框架区(参见例如Baca等人,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684以及Rosok等人,J.Biol.Chem.271(1996)22611-22618)。
人源化抗体及其制备方法例如综述于Almagro和Fransson,Front.Biosci.13(2008)1619-1633中，并且还描述于例如Riechmann等人,Nature 332(1988)323-329；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36(2005)25-34(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等人,Methods36(2005)43-60(描述“FR改组”)；以及Osbourn等人,Methods 36(2005)61-68和Klimka等人,Br.J.Cancer,83(2000)252-260(描述FR改组的“指导选择”方法)中。
在一个实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x10-6M或更低的KD与食蟹猴TM4SF1结合。
在某些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x10-8M或更低的KD与人TM4SF1的ECL2环上的表位结合，如在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中所确定的。
在某些实施方案中，在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x10-8M或更低的KD与人TM4SF1结合。
在某些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x10-3M至约1x10-4M、约1x10-4M至约1x10-5M、约1x10-5M至约1x10-6M、约1x10-6至约1x10-7M、约1x10-7至约1x10-8M、约1x10-8M至约1x10-9M、约1x10-9M至约1x10-10M、约1x10-10M至约1x10-11M、约1x10-11M至约1x10-12M、约2x10-3M至约2x10-4M、约2x10-4M至约2x10-5M、约2x10-5M至约2x10-6M、约2x10-6至约2x10-7M、约2x10-7至约2x10-8M、约2x10-8M至约2x10-9M、约2x10-9M至约2x10-10M、约2x10-10M至约2x10-11M、约2x10-11M至约2x10-12M、约3x10-3M至约3x10-4M、约3x10-4M至约3x10- 5M、约3x10-5M至约3x10-6M、约3x10-6至约3x10-7M、约3x10-7至约3x10-8M、约3x10-8M至约3x10- 9M、约3x10-9M至约3x10-10M、约3x10-10M至约3x10-11M、约3x10-11M至约3x10-12M、约4x10-3M至约4x10-4M、约4x10-4M至约4x10-5M、约4x10-5M至约4x10-6M、约4x10-6至约4x10-7M、约4x10-7至约4x10-8M、约4x10-8M至约4x10-9M、约4x10-9M至约4x10-10M、约4x10-10M至约4x10-11M、约4x10-11M至约4x10-12M、约5x10-3M至约5x10-4M、约5x10-4M至约5x10-5M、约5x10-5M至约5x10-6M、约5x10-6至约5x10-7M、约5x10-7至约5x10-8M、约5x10-8M至约5x10-9M、约5x10-9M至约5x10-10M、约5x10-10M至约5x10-11M、约5x10-11M至约5x10-12M、约5x10-7M至约5x10-11M、约5x10-7M、约1x10- 7M、约5x10-8M、约1x10-8M、约5x10-9M、约1x10-9M、约5x10-10M、约1x10-10M、约5x10-11M或约1x10-11M的KD与人TM4SF1结合。在一些实施方案中，该KD在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中确定。
在某些实施方案中，在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x10-10M或更低的KD与人TM4SF1结合。
在某些实施方案中，在使用过度表达HEK293的细胞的标准流式细胞术测定中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x10-6M或更低的KD与食蟹猴TM4SF1结合。在一个实施方案中，HEK293细胞被转染以表达食蟹猴TM4SF1。在进一步的实施方案中，HEK293细胞以约600个mRNA拷贝/106个18S rRNA拷贝表达食蟹猴TM4SF1。
测定抗体或抗体片段的KD的方法是本领域已知的。例如，表面等离子体共振可用于测定抗体对抗原的KD(例如，在25℃下使用BIACORE 2000或BIACORE 3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)，其中抗原或Fc受体以约10个应答单位(RU)固定在CM5芯片上)。在某些实施方案中，使用FACS或流式细胞术测定KD，由此使用表达TM4SF1的细胞如HEK293细胞或HUVEC细胞来结合抗体或片段，并根据标准方法测量KD。使用流式细胞术测定抗体的亲和力例如描述于Geuijen等人(2005)J Immunol Methods.302(1-2):68-77中。在某些实施方案中，使用FACS来测定抗体的亲和力。
在一个实施方案中，本公开表征了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段具有含有保守性氨基酸置换的本文所述的CDR氨基酸序列，以使得该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含与表1所示的CDR氨基酸序列具有至少95％同一性(或至少96％同一性，或至少97％同一性，或至少98％同一性，或至少99％同一性)的CDR的氨基酸序列。“保守性氨基酸置换”是其中某一氨基酸残基被具有化学性质(例如电荷或疏水性)类似的侧链(R基团)的另一氨基酸残基代替的置换。通常，保守性氨基酸置换基本上不改变蛋白质的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列因保守性置换而彼此不同的情况下，序列同一性百分比或相似性程度可以向上调整，以校正该置换的保守性质。用于进行这种调整的手段是本领域技术人员公知的。参见，例如，Pearson(1994)MethodsMol.Biol.24:307-331，通过引用并入本文。具有化学性质类似的侧链的氨基酸的群组的实例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。
在一方面，本公开进一步表征了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，如在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中所确定的，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x10-8M或更低的KD与人TM4SF1的ECL2环上的表位结合，其中该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有人IgG框架区的轻链可变区，并且包含含有人IgG框架区的重链可变区。在一个实施方案中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的。在一个实施方案中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段与食蟹猴TM4SF1交叉反应。
在本公开的另一方面，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，如在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中所确定的，该人源化抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x10-8M或更低的KD与人TM4SF1的ECL2环上的表位结合。在一个实施方案中，在使用过度表达HEK293的细胞的标准流式细胞术测定中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x10-6M或更低的KD与食蟹猴TM4SF1结合。在一个实施方案中，在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x10- 8M或更低的KD与人TM4SF1结合。在一个实施方案中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以1x10-3M至约1x10-4M、约1x10-4M至约1x10-5M、约1x10-5M至约1x10-6M、约1x10-6至约1x10-7M、约1x10-7至约1x10-8M、约1x10-8M至约1x10-9M、约1x10-9M至约1x10-10M、约1x10-10M至约1x10-11M、约1x10-11M至约1x10-12M、约2x10-3M至约2x10-4M、约2x10-4M至约2x10-5M、约2x10-5M至约2x10-6M、约2x10-6至约2x10-7M、约2x10-7至约2x10-8M、约2x10-8M至约2x10-9M、约2x10-9M至约2x10-10M、约2x10-10M至约2x10-11M、约2x10-11M至约2x10-12M、约3x10-3M至约3x10-4M、约3x10- 4M至约3x10-5M、约3x10-5M至约3x10-6M、约3x10-6至约3x10-7M、约3x10-7至约3x10-8M、约3x10- 8M至约3x10-9M、约3x10-9M至约3x10-10M、约3x10-10M至约3x10-11M、约3x10-11M至约3x10-12M、约4x10-3M至约4x10-4M、约4x10-4M至约4x10-5M、约4x10-5M至约4x10-6M、约4x10-6至约4x10-7M、约4x10-7至约4x10-8M、约4x10-8M至约4x10-9M、约4x10-9M至约4x10-10M、约4x10-10M至约4x10-11M、约4x10-11M至约4x10-12M、约5x10-3M至约5x10-4M、约5x10-4M至约5x10-5M、约5x10-5M至约5x10-6M、约5x10-6至约5x10-7M、约5x10-7至约5x10-8M、约5x10-8M至约5x10-9M、约5x10-9M至约5x10-10M、约5x10-10M至约5x10-11M、约5x10-11M至约5x10-12M、约5x10-7M至约5x10-11M、约5x10-7M、约1x10-7M、约5x10-8M、约1x10-8M、约5x10-9M、约1x10-9M、约5x10-10M、约1x10-10M、约5x10-11M或约1x10-11M的KD与人TM4SF1结合。在一些实施方案中，该KD在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中确定。在一个实施方案中，在使用表达TM4SF1的HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x10-10M或更低的KD与人TM4SF1结合。
在一个实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体或抗原结合片段与人TM4SF1的结合不依赖于对人TM4SF1的ECL2环的糖基化，即抗体的结合不依赖于在ECL2环(SEQ ID NO:77)内TM4SF1的糖基化。
本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可以是任何同种型(例如但不限于IgG、IgM和IgE)中的任一种。在某些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段是IgG同种型。在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段是IgG1、IgG2或IgG4同种型。在某些实施方案中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人IgG1、人IgG2或人IgG4同种型。
在ADCC和/或CDC活性方面，IgG2是天然最低的(An等人,MAbs.2009年11月-12月；1(6):572–579)。因此，在某些实施方案中，有利地使用IgG2。然而，IgG2具有两个额外半胱氨酸(导致4个铰链间二硫键)，这使其倾向于通过形成抗体间二硫键而聚集。在相关实施方案中，对IgG2半胱氨酸进行突变以减少聚集。
本公开提供了与TM4SF1结合的抗体片段。在某些情况下，使用抗体片段而非完整抗体存在优势。片段的较小尺寸允许快速清除，并且可导致改进的细胞、组织或器官可及性。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人,2003,Nature Med.9:129-34。
已开发了用于产生抗体片段的各种技术。在传统上，这些片段通过蛋白水解消化完整抗体而获得(参见例如Morimoto等人,1992,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-17；以及Brennan等人,1985,Science 229:81-83)。然而，这些片段现在可以直接由重组宿主细胞产生。Fab、Fv和scFv抗体片段全部可在大肠杆菌或酵母细胞中表达并从大肠杆菌或酵母细胞分泌，由此允许轻松产生大量这些片段。可从以上讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，Fab’-SH片段可以直接从大肠杆菌中回收，并且化学偶联以形成F(ab’)2片段(Carter等人,1992,Bio/Technology 10:163-67)。根据另一方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab’)2片段。例如，美国专利号5,869,046中描述了包含补救受体结合表位残基的具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段。产生抗体片段的其他技术对熟练技术人员来说是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)(参见，例如，WO93/16185；美国专利号5,571,894和5,587,458)。Fv和scFv具有完整的组合位点，其没有恒定区；因此，它们可能适合在体内使用过程中减少的非特异性结合。可以构建scFv融合蛋白，以在scFv的氨基或羧基末端产生效应蛋白的融合(参见，例如，Borrebaeck编，同上)。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如，如以上引用的参考文献所述。此类线性抗体可以是单特异性的或多特异性的，如双特异性的。
在某些实施方案中，抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和scFv。
例如，对人TM4SF1具有高亲和力的抗TM4SF1抗体(和片段)可使用本领域已知的筛选技术来鉴定。例如，单克隆抗体可使用首先由Kohler等人,1975,Nature 256:495-97描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。
在杂交瘤方法中，例如使用人TM4SF1的ECL2环或表达TM4SF1的细胞(由此在细胞表面上表达ECL2环)来使小鼠或其他适当的宿主动物(如仓鼠)免疫，以引发淋巴细胞，其产生或能够产生将与用于免疫的蛋白质特异性结合的抗体。或者，可在体外使淋巴细胞免疫。在免疫后，分离淋巴细胞，然后使用合适的融合剂如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice59-103(1986))。
接种由此制备的杂交瘤细胞，并使其在合适的培养基中生长，在某些实施方案中，该培养基含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质(也被称为融合配偶体)。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的选择性培养基一般将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，它们阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
示例性融合配偶体骨髓瘤细胞是高效融合，支持由所选抗体生产细胞稳定高水平产生抗体，并且对针对未融合的亲本细胞进行选择的选择性培养基敏感的细胞。示例性骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，如SP-2和衍生物，例如可从美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection，Manassas,Va.)获得的X63-Ag8-653细胞，以及来源于可从SalkInstitute Cell Distribution Center(San Diego,Calif.)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系。还已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(Kozbor,1984,Immunol.133:3001-05；以及Brodeur等人,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications 51-63(1987))。
测定杂交瘤细胞生长所在的培养基针对抗原的单克隆抗体的产生。通过免疫沉淀或通过体外结合测定如RIA或ELISA来测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson等人,1980,Anal.Biochem.107:220-39中所述的Scatchard分析来测定。
一旦鉴定出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，即可通过有限稀释程序对克隆进行亚克隆，并且通过标准方法使其生长(Goding，同上)。用于该目的的合适的培养基包括例如DMEM或RPMI-1640培养基。另外，例如通过将细胞腹膜内注射到小鼠中，可使杂交瘤细胞在动物中体内生长为腹水肿瘤。
通过常规抗体纯化程序，例如亲和色谱法(例如使用蛋白A或蛋白G-琼脂糖)或离子交换色谱法、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析等，从培养基、腹水或血清中适当地分离由亚克隆分泌的单克隆抗体。
使用常规程序(例如通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，易于对编码单克隆抗体的DNA进行分离和测序。杂交瘤细胞可充当此类DNA的来源。一旦分离，即可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或者否则不产生抗体蛋白质的骨髓瘤细胞中，以获得在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等人,1993,Curr.Opinion in Immunol.5:256-62以及Pluckthun,1992,Immunol.Revs.130:151-88。
在进一步的实施方案中，单克隆抗体或抗体片段可从使用例如在Antibody PhageDisplay:Methods and Protocols(O’Brien和Aitken编,2002)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离。在原则上，通过筛查含有展示与噬菌体外壳蛋白融合的抗体可变区(Fv)的各种片段的噬菌体的噬菌体文库来选择合成抗体克隆。针对所需抗原筛查此类噬菌体文库。使表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆吸附于抗原，因此与文库中的非结合克隆分离。然后将结合克隆从抗原中洗脱下来，并且可通过额外的抗原吸附/洗脱循环来进一步富集。
可使可变结构域功能性地在噬菌体上展示为单链Fv(scFv)片段，其中VH和VL通过短柔性肽而共价连接，或展示为Fab片段，其中VH和VL各自与恒定结构域融合并且非共价地相互作用，如例如Winter等人,1994,Ann.Rev.Immunol.12:433-55中所述。
VH和VL基因的储库(Repertoiry)可通过PCR单独地克隆，并且在噬菌体文库中随机重组，然后可搜索噬菌体文库中的抗原结合克隆，如Winter等人(同上)所述。来自经免疫的来源的文库提供对免疫原具有高亲和力的抗体，而无需构建杂交瘤。或者，可以克隆天然储库以提供单一来源的针对广泛范围的非自身抗原以及自身抗原的人抗体，而不进行任何免疫，如Griffiths等人,1993,EMBO J 12:725-34所述。最后，还可以通过以下方式合成制备天然文库：从干细胞克隆未重排的V基因区段，以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变CDR3区域并实现体外重排，如例如Hoogenboom和Winter,1992,J.Mol.Biol.227:381-88所述。
对文库的筛查可通过本领域中已知的各种技术来实现。例如，可使用TM4SF1(例如ECL2环的可溶性形式或表达所述环的细胞)包被吸附板的各孔，在固定于吸附板的或在细胞分选中使用的宿主细胞上表达，缀合至生物素以供用链霉亲和素包被的珠子捕集，或者在用于淘选展示文库的其他任何方法中使用。通过使用如Bass等人,1990,Proteins 8:309-14以及WO 92/09690所述的长时间洗涤和单价噬菌体展示，以及通过使用如Marks等人,1992,Biotechnol.10:779-83所述的低抗原包被密度，可以促进对具有缓慢解离动力学(例如良好结合亲和力)的抗体的选择。
抗TM4SF1抗体可通过以下方式获得：设计适于选择目的噬菌体克隆的抗原筛选程序，随后使用来自目的噬菌体克隆的VH和/或VL序列(例如Fv序列)或来自VH和VL序列的各种CDR序列以及Kabat等人(同上)所述的适当恒定区(例如Fc)序列来构建全长抗TM4SF1抗体克隆。
可使用本领域中已知以及本文所述的结合测定对抗TM4SF1抗体进行筛选，以确定抗体是否对TM4SF1的ECL2环具有治疗性亲和力。抗体抑制或降低转移性细胞活性的能力可使用本领域中的标准测定以及本文所述的测定来测量。临床前测定需要使用通常属于以下三种类型之一的动物转移模型：(i)通常通过用以产生肺转移的尾静脉注射，通过用以产生肝转移的门静脉或脾内注射，或通过用以产生骨转移和其他转移的左心室心脏注射，将转移性小鼠肿瘤细胞如B16F10黑素瘤TC注射至小鼠中；(ii)将转移性肿瘤细胞或完整肿瘤片段正位移植至小鼠中，所述方法常常需要稍后手术切除原发性肿瘤以预防与原发性肿瘤生长相关的发病；和(iii)自发性转移的遗传工程化小鼠模型，其中最常见的是MMTV-Pyt(小鼠乳腺肿瘤病毒-多瘤病毒中间T抗原)小鼠乳腺癌模型，该模型提供人类癌症转移的一种高度真实的小鼠模型；超过85％的半合子MMTV-PyMT雌性自发地发生可触知的乳腺肿瘤，所述肿瘤在8-16周龄时转移至肺。通过随TM4SF1免疫阻断程度而变化的，处死动物的肺中转移性结节的活体动物成像或直接计数来量化肺中的转移性负荷，以及实现例如肺转移降低至少50％的治疗水平，将指示例如治疗性抗体可以在本公开的方法中使用。此外，跨物种反应性测定在本领域中是已知的。可使用的测定的实例例如描述于Khanna和Hunter(Carcinogenesis.2005年3月；26(3):513-23)以及Saxena和Christofori(Mol Oncol.2013年4月；7(2):283-96)中，这些文献通过引用而整体并入本文。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体及其抗原结合片段可以用于例如治疗或预防癌症。在某些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体和抗原结合片段可以用于防止肿瘤细胞转移。在一些实例中，本公开的抗TM4SF1抗体及其抗原结合片段通过干扰肿瘤细胞和血管内皮细胞之间的相互作用来防止肿瘤细胞转移。
本公开的一个实施方案提供了包含抗血管生成抗体如抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和免疫治疗药剂的组合，其中抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含经修饰的Fc区，如包含一个或多个突变的经修饰的IgG区(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。在一些情况下，Fc区中的所述一个或多个突变导致包含此类经修饰的Fc区的药物的改进，如在以下方面中的改进：1)效应子功能的降低，2)半衰期调节，3)稳定性，和4)下游过程。在一些情况下，经修饰的Fc区可以包含一个或多个突变，这些突变将减少或消除抗体和免疫系统之间的相互作用。关键的相互作用可以包括抗体Fc与白细胞和血小板上的Fcγ受体的相互作用，以及与补体系统的C1q的相互作用，导致补体依赖性细胞毒性。
在一些情况下，本公开提供了一种包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的组合，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含例如在Fc区中的免疫消除突变，在此类情况下，该Fc区是经修饰的Fc区，例如经修饰的IgG Fc区。在一些实施方案中，经修饰的Fc区包含在位置N297处的修饰。在一些实施方案中，经修饰的Fc区包含经修饰的IgG Fc区(例如，经修饰的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其包含在位置E233、L234或F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、N297、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434和H435或其任何组合处的一个或多个突变。在一些实施方案中，Fc区在其C末端处包含残基的延伸，使得正电荷保持在C末端(例如，在一些情况下，如果抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含两条重链，则至少一条重链包含C末端处的残基的延伸)。残基的此类延伸可以包括添加一个或多个氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、脯氨酸或其任何组合。在一些实例中，Fc区的延伸的C末端导致抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段、包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的CDC功能降低。在一些情况下，通过在IgG1或IgG4中的Fc的K447之后添加KP残基，单独或与其他突变(例如K322A、P331G-IgG1)组合，看到此类效果。
在一些实施方案中，提供了一种包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的组合，可以包含具有降低的效应子功能的抗体，包括Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的置换(参见，例如，美国专利号6,737,056)。在一些情况下，Fc区中的此类突变可以包含在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处的置换，例如，残基265和297置换为丙氨酸(DANA突变，即D265A和N297A)(参见，例如，美国专利号7,332,581)。在一些情况下，Fc区中的突变可以包含在一个或多个氨基酸位置E233、L234、L235、G237、D265、N297、K322和P331处的置换。在一些情况下，Fc区中的突变可以包含E233P、L234A、L235A、G237A、D265A、N297A、K322A和P331G中的至少一种，或其任何组合。例如，Fc区中的突变可以包含L234A/L235A/G237A(IgG1)或F234A/L235E(IgG4)，并且包含此类突变的抗TM4SF1抗体或抗原结合片段可以表现出改变的FcgRI相互作用。
在一些实施方案中，提供了一种包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的组合，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可以包括包含以下突变的Fc变体：在位置M428和N434处的氨基酸置换(M428L，N434S)(参见，例如，US 9803023)。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可以包括包含以下突变的Fc变体：在位置T250和M428处的氨基酸置换(T250Q，M428L)(参见，例如，US 9803023)。
在一些实施方案中，提供了一种包含TM4SF1抗体或其抗原结合片段的组合，该TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含突变D265A和N297A。在一些情况下，在野生型人Fc区的位置329处的脯氨酸(P329)可以被甘氨酸或精氨酸或足够大以破坏Fc/Fcy受体界面内的脯氨酸夹心结构的氨基酸残基置换，该夹心结构在Fc的P329与FcgRIII的色氨酸残基W87和W110之间形成(参见，例如Sondermann等人,Nature 406,267-273(2000年7月20日))。在另外的实施方案中，Fc区中的突变可以包含一个或多个氨基酸置换，如S228P(IgG4)、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S，并且在其他实施方案中：人IgG1 Fc区的L234A和L235A或人IgG 4Fc区的S228P和F234A、L235A或L235E。
在一些实施方案中，提供了一种包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的组合，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含经修饰的Fc区，该经修饰的Fc区为野生型人IgG Fc区的Fc变体，其中人IgG Fc区的P329被甘氨酸置换，并且其中该Fc变体包含在人IgG 1Fc区的L234A和L235A处或人IgG4 Fc区的S228P和L235E处的至少两个另外的氨基酸置换，并且其中该残基根据EU编号进行编号(参见，例如，US 8969526)。包含P329G、L234A和L235A置换的多肽可以表现出对人FcyRIIIA和FcyRIIA的降低的亲和力，用于将ADCC下调至由包含野生型人IgG Fc区的多肽诱导的ADCC的至少20％，并且/或者用于下调ADCP(参见，例如，US8969526)。
在一些实施方案中，提供了一种包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的组合，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包括包含三重突变的Fc变体：在位置P329处的氨基酸置换、L234A和L235A突变(P329/LALA)(参见，例如，US 8969526)。
在本文提供的组合的一些实施方案中，本公开的某些抗TM4SF1抗体或抗原结合片段可以包含表现出与FcR的结合增强或减弱的突变。(参见，例如，US 6737056；WO 2004/056312和Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在一些情况下，提供了一种包含抗TM4SF1抗体或抗原结合片段的组合，该抗TM4SF1抗体或抗原结合片段可以包括Fc区，该Fc区具有一个或多个改善ADCC的氨基酸置换(例如，在Fc区的位置298、333和/或334处的置换)。可以在Fc区进行改变，这导致改变的(即，改善的或减弱的)Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如在US 6194551、WO99/51642和Idusogie等人.(2000)J.Immunol.164:4178-4184中所描述的。
在组合的一些实施方案中，本文还提供了具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)结合的抗体。FcRn(以其将母体IgG转移到胎儿的功能命名)还用于通过将抗体捕获在内体中并将它们返回到循环中来防止抗体在溶酶体中降解。(参见，例如，Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))，在US2005/0014934中描述。不受任何特定理论的束缚，预期具有改善的与FcRn结合的抗体从TM4SF1中脱离并结合至FcRn，然后FcRn将抗体再循环回到循环，从而降低血管毒性。在本文的一些实施方案中，提供了一种包含抗TM4SF1抗体或抗原结合片段的组合，该抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含Fc区，该Fc区具有一个或多个增强FcRn再循环的置换。在本文的一些实施方案中，提供了一种包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的组合，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含Fc区，该Fc区中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个置换，例如，在以下一个或多个位置处的置换：根据EU编号的238、250、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、428、424、434和435，例如，Fc区残基434的置换(US 7371826)。还参见涉及Fc区变体的其他实例的Duncan&amp；Winter,Nature322:738-40(1988)；US 5648260；US 5624821；US2005/0014934和WO 94/29351，它们的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本文提供了包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的组合，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段具有pH依赖性FcRn结合亲和力。不受任何特定理论的束缚，预期具有pH依赖性FcRn结合亲和力的抗体或其抗原结合片段在pH>7时与FcRn分离，并且在pH 6时结合至FcRn。因此，酸性pH亚细胞器(例如内体)中的FcRn结合此类抗体并且将抗体携带回到细胞膜，并且在pH>7时将抗体释放到血浆中，从而使抗体再循环。
在某些实施方案中，本文提供了包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的组合，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含Fc区，该Fc区中具有调节FcRn再循环的一个或多个置换。在本文的一些实施方案中，提供了包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的组合，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含在酸性pH(例如pH 6)下增强FcRn结合并且在中性或碱性pH(例如pH 7)下不影响FcRn结合的一个或多个置换。在一些实施方案中，如本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含在根据EU编号的位置250、252、254、256、428和434中的一个或多个处的置换。在一些实施方案中，如本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含Fc变体，该Fc变体包含置换T250Q、M252Y、S254T、T256E、M428L和N434S中的一个或多个。在一些实施方案中，如本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG1 Fc变体，该IgG1 Fc变体包含置换T250Q和M428L(“QL突变体”)。在一些实施方案中，如本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可以包括IgG4 Fc变体，该IgG4 Fc变体包含置换T250Q和M428L(“QL突变体”)。在一些实施方案中，如本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG1 Fc变体，该IgG1 Fc变体包含置换M252Y、S254T和T256E(“YTE突变体”)。在一些实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG1 Fc变体，该IgG1 Fc变体包含置换M428L和N434S(“LS突变体”)。在一些实施方案中，如本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG4 Fc变体，该IgG4 Fc变体包含置换M428L和N434S(“LS突变体”)。Fc区中的调节FcRn再循环的氨基酸置换的作用描述于例如Hamblett等人,Mol.Pharm.13(7):2387-96(2016)；Dall’Acqua等人,J.Biol.Chem.281(33):23514-24(2006)、Hinton等人,J.Biol.Chem.279(8):6213-6(2003)、Hinton等人,J.Immunol.,176(1):346-56(2006)、US20080181887、US 7361740和EP2235059中，它们的全部内容通过引用并入本文。
在某些实施方案中，如本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含Fc区，该Fc区包含选自T250Q、M252Y、S254T、T256E、M428L和N434S的一个或多个置换。在一些实施方案中，如本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型并且包含Fc区，该Fc区包含选自T250Q、M252Y、S254T、T256E、M428L和N434S的一个或多个置换。在一些实施方案中，如本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型并且包含含有置换T250Q和M428L的Fc区。在一些实施方案中，如本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型并且包含含有置换M252Y、S254T和T256E的Fc变体。在一些实施方案中，如本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型并且包含含有置换M252Y、S254T和T256E的Fc变体。在一些实施方案中，如本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型并且包含含有置换M428L和N434S的Fc变体。在一些实施方案中，如本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型并且包含含有置换M428L和N434S的Fc变体。
在一些实施方案中，本文公开的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含具有增加的FcRn结合亲和力和增加的血清半衰期的突变Fc区。在某些实施方案中，如本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含具有至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天、至少100天或更长时间的血清半衰期的突变Fc区。
在某些实施方案中，该组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段表现出降低的血管毒性、改善的治疗范围或两者。在某些实施方案中，本公开的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含突变的Fc区，与具有与本公开的抗体相同的氨基酸序列但不包含对Fc区的至少一个氨基酸残基的添加、置换或缺失的抗体(在本文中也被称为“未修饰的抗体”)相比，该突变的Fc区对负责促进效应子功能的Fc配体具有降低的或消除的亲和力。
在一个实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含Fc区，该Fc区包含减少或消除该抗体或其抗原结合片段的ADCC和/或CDC效应子功能的至少两个突变。在另外的实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含Fc区，该Fc区包含减少或消除抗体或其抗原结合片段的ADCC和/或CDC效应子功能的至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或更多个突变。
在某些实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型并且包含Fc区，该Fc区包含选自E233P、L234V、L234A、L235A、G236δ(缺失)、G237A、V263L、N297A、N297D、N297G、N297Q、K322A、A327G、P329A、P329G、P329R、A330S、P331A、P331G和P331S的一个或多个突变。
在一个实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型并且包含Fc区，该Fc区包含L234A/L235A突变，具有或不具有G237A突变。在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型并且包含Fc区，该Fc区包含L234A、L235A和G237A突变。
在一个实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型并且包含含有A327G/A330S/P331S突变的Fc区。
在一个实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型并且包含Fc区，该Fc区包含E233P/L234V/L235A/δG236(缺失)突变，该突变提供降低的与FcγRI(在本文中也被称为FcgRI)、FcγRIIA(在本文中也被称为FcgRIIA)、FcγRIIIA(在本文中也被称为FcgRIIIAI)的结合以及降低的ADCC和CDC效应子功能，如例如An Z等人，Mabs 2009Nov-Ec；1(6):572-9中所述，其通过引用以其整体并入本文。
在一个实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型并且包含含有N297x突变的Fc区，其中x＝A、D、G、Q。
在一个实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型并且包含含有A327G/A330S/P331S突变的Fc区。
在一个实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型并且包含含有K322A、P329A和P331A中的一个或多个突变的Fc区，该突变提供降低的与C1q的结合，如例如Canfield&Morrison.J ExpMed(1991)173(6):1483–91.10.1084中所述，其通过引用以其整体并入本文。
在一个实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型并且包含含有V263L突变的Fc区，该V263L突变提供增强的与FcγRIIB(在本文中也被称为FcgRIIB)的结合和增强的ADCC，例如如Hezareh等人.J Virol.2001年12月；75(24):12161-8中所述，其通过引用以其整体并入本文。
在其他实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型并且包含含有L234A/L235A、G237A或L235E突变的Fc区。
在其他实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型并且包含含有L234F、L235E或P331S突变的Fc区。
在某些实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG2同种型并且包含含有选自V234A、G237A、P238S、H268A或H268Q、V309L、A330S和P331S的一个或多个突变的Fc区。
在一个实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG2同种型并且包含含有A330S/P331S突变的Fc区。
在一个实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG2同种型并且包含含有A330S/P331S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S或H268Q/V309L/A330S/P331S突变的Fc区。
在其他实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型并且包含含有选自S228P、E233P、F234A、F234V、L235E、L235A、G236δ(缺失)、N297A、N297D、N297G、N297Q、P329G、P329R的一个或多个突变的Fc区。
在某些实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型并且包含含有S228P突变的Fc区，该S228P突变提供减少的Fab-臂交换和减少的聚集，如例如Chappel等人，Proc Natl Acad Sci U S A(1991)88(20):9036–40中所述，其通过引用以其整体并入本文。
在一个实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型并且包含含有S228P/L235E突变的Fc区。
在一个实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型并且包含含有S228P/E233P/F234V/L235A/δG236(缺失)突变的Fc区。
在一个实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型并且包含含有N297x突变的Fc区，其中x＝A、D、G、Q。
在一个实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型并且包含含有S228P/F234A/L235A突变的Fc区。
在一个实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型并且包含含有L235E突变的Fc区，该突变提供降低的与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA的结合以及降低的ADCC和CDC效应子活性，如例如Saxena等人，Front Immunol.2016年12月12日；7:580中所述。
在其他实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型并且包含含有S228P/F234A/L235A或E233P/L235A/G236D突变的Fc区。
在一个实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型并且包含含有至少S228P突变的Fc区。参见，例如，Angal等人(Mol Immunol.1993年1月；30(1):105-8)描述了对人IgG4重链的铰链序列的分析，以将在残基241(根据EU编号系统，并且现在对应于Kabat编号中的残基228)处丝氨酸的存在确定为在一定比例的分泌型人IgG4中的铰链区中重链间二硫桥的异质性的原因。参见Silva等人(J Biol Chem.2015年2月27日；290(9):5462-9)描述了人IgG4中的阻止体内和体外IgG4 Fab-臂交换的S228P突变。
在其他实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型并且包含含有L235E或S228P突变的Fc区。
在其他实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4或IgG1同种型，并且包含含有N297A、N297D或N297G突变的Fc区。
在其他实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4或IgG1同种型，并且包含含有P329G、P329R突变的Fc区。
在一个示例性的实施方案中，任何IgG同种型的突变的Fc区包含在位置234、235、236、237、297、318、320、322处的一个或多个突变(如WO1988007089中所述，其通过引用以其整体并入本文)。Fc区中其他可能的突变，包括置换、缺失和添加也描述于例如US20140170140、WO2009100309、US20090136494和US8969526中，其通过引用以其整体并入本文。
可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以证实CDC和/或ADCC活性的降低或消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的初级细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362中(参见，例如，Hellstrom,I.等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 83(1986)7059-7063)和Hellstrom,I.等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。可替代地，可以采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTI.TM.非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,Calif.)；以及CytoTox96.RTM.非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,Wis.)。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可以在体内，例如在诸如Clynes等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中公开的动物模型中评估感兴趣分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定，以证实抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202(1996)163；Cragg,M.S.等人,Blood 101(2003)1045-1052；以及Cragg,M.S.和Glennie,M.J.,Blood103(2004)2738-2743)。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期确定(参见例如Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12)(2006)1759-1769)。
在一些实施方案中，任何IgG同种型的突变的Fc区包含在位置L328处的突变，例如L328M、L328D、L328E、L328N、L328Q、L328F、L328I、L328V、L328T、L328H、L328A(参见，例如，US20050054832)。
在一个实施方案中，与未修饰的抗体相比，本公开中提供的组合的抗体或其抗原结合片段表现出降低的或消除的ADCC效应子功能。在另一实施方案中，本公开中提供的组合的抗体或其抗原结合片段表现出是未修饰的抗体的至多1/2、至多1/3、至多1/5、至多1/10、至多1/50或至多1/100的降低的ADCC效应子功能。在另一实施方案中，相对于未修饰的抗体，本公开中提供的组合的抗体或其抗原结合片段显示出降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％或至少100％的ADCC效应子功能。在本公开中提供的组合的另外的方面中，由本公开的抗体或其抗原结合片段诱导的ADCC效应子功能的降低或下调是降低至针对由未修饰的抗体诱导ADCC所观察到的值的0、2.5％、5％、10％、20％、50％或75％。在某些实施方案中，ADCC活性的降低和/或消除可以归因于本公开的抗体或其抗原结合片段对Fc配体和/或受体的亲和力降低。
本公开的一个实施方案提供了包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和免疫治疗药剂的组合，其中抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段对TM4SF1表现出pH依赖性结合亲和力。在一些情况下，与其他pH范围相比，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在某些pH范围以更高的亲和力结合至TM4SF1。例如，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可以在酸性pH下以不同于在中性pH或碱性pH下的亲和力结合至TM4SF1。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在酸性pH下相比于在中性或碱性pH下以更高的亲和力结合至TM4SF1。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在酸性pH下相比于在中性或碱性pH下以更低的亲和力结合至TM4SF1。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在酸性pH下结合至TM4SF1，并且在中性或碱性pH下从TM4SF1解离。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在pH7或更高pH下结合至TM4SF1并且在pH6或更低pH下从TM4SF1分离。在亚细胞区室(例如血浆、细胞溶胶和细胞核)中，pH为中性或碱性。在溶酶体或内体中，pH为酸性。不受任何理论的束缚，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段结合至抗原并且随后被内化到内体的膜中。pH依赖性抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可以在内体中从TM4SF1分离并且在内体内结合至FcRn受体，并且可以通过FcRn受体被再循环返回至循环中，而不是在内体进展成的溶酶体中降解。因此，pH依赖性抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可以多次结合至TM4SF1抗原。因此，pH依赖性抗TM4SF1抗体和相关的治疗性分子或有效负载可以通过FcRn受体被再循环，而不释放溶酶体中的有效负载。
本文还公开了制备用于本文提供的组合的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的方法，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段通过以pH依赖性方式调节抗体-TM4SF1结合亲和力而具有增加的半衰期和/或药效学效果，该方法包括选择抗体CDR组氨酸残基或优化影响抗体的pKa的微环境的其他残基，使得抗体-TM4SF1结合在pH6.0/pH7.4下的Kd比和/或Koff比为至少2、3、4、8、10、16或更高，或在2、3、4、8、10、16或更高之间的范围。在一些实施方案中，该方法包括将氨基酸置换引入到抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段中以实现TM4SF1亲和力，其中在pH 7.4下的KD为至少100nM，如在25℃下测量的。在某些实施方案中，所述方法包括产生在CDR残基中或优化影响pKa的微环境的其他残基中富含组氨酸的抗体文库。在一些实施方案中，抗体文库包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其中将组氨酸残基引入到CDR位置中。在一些实施方案中，抗体文库包含一系列抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其中抗体文库中的每个抗TM4SF1抗体包含在不同CDR位置处的单个组氨酸置换。在一些实施方案中，抗体文库包含一系列抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其各自包含组氨酸残基的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个突变。在一些实施方案中，在抗体文库的TM4SF1抗体或抗原片段中的至少一个中，每个CDR位置均被突变成组氨酸。
在一些实施方案中，本文提供的组合包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在CDR区中包含1、2、3、4、5或更多个组氨酸置换。可以将组氨酸残基工程改造到抗TM4SF1抗体轻链(LC)或重链(HC)的不同位置中以获得pH依赖性结合亲和力。因此，在一些实施方案中，本文提供了具有组氨酸工程改造的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的组合。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在轻链可变区(VL)的CDR1、CDR2和/或CDR3中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在轻链可变区(VL)的CDR1中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在轻链可变区(VL)的CDR2中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在轻链可变区(VL)的CDR3中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在重链可变区(VH)的CDR1、CDR2和/或CDR3中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在重链可变区(VH)的CDR1中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在重链可变区(VH)的CDR2中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在重链可变区(VH)的CDR3中包含一个或多个组氨酸残基。因此，在一些实施方案中，本公开的组合包含经组氨酸工程改造的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中，例如在SEQ ID No.101或SEQ ID No.131的位置30(S30H)、92(S92H)和93(N93H)中的一个或多个中，包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在重链的CDR1、CDR2和/或CDR3中，例如在SEQ ID No.92或SEQ ID No.130的位置28(T28H)、31(N31H)、32(Y32H)、52(N52H)、54(Y54H)、57(N57H)、100(Q100H)和101(Y101H)中的一个或多个中包含一个或多个组氨酸残基。
III.抗体药物缀合物
在一个实施方案中，本文提供了包含免疫治疗药剂以及连接至有效负载的抗血管生成抗体或其抗原结合片段的组合。在一些实施方案中，抗体是抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，有效负载是小分子、蛋白质、肽、抗体或其任何组合。在一些实施方案中，提供了包含ADC的组合，该ADC包含与治疗药剂或诊断药剂缀合的抗血管生成抗体(例如抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段)。
在一些实施方案中，治疗药剂为生物活性部分。在一些实施方案中，生物活性部分包括放射性同位素、细胞毒性药剂、化学治疗药剂、蛋白质、肽、抗体、生长抑制剂、前药活化酶和抗激素药剂。在一些实施方案中，治疗性分子可以是小分子(例如，用于癌症和非癌症血管生成适应症两者)；V-ATP酶抑制剂；促凋亡剂；Bcl2抑制剂；MCL1抑制剂；HSP90抑制剂；IAP抑制剂；mTor抑制剂；微管稳定剂；微管去稳定剂；澳瑞他汀；多拉司他汀；美登醇；MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)；蛋白质CRM1的核输出的抑制剂；DPPIV抑制剂；蛋白酶体抑制剂；线粒体中磷酰基转移反应的抑制剂；蛋白质合成抑制剂；激酶抑制剂(如CDK2抑制剂、CDK9抑制剂)；驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂、DHFR抑制剂、核酸、CRISPR酶；降解剂(如诱导蛋白质降解的药剂)(例如HSP90抑制剂、选择性雌激素受体降解剂(SERD)、选择性雄激素受体降解剂(SARD)；可以用于募集感兴趣蛋白质的伴侣的疏水性标签，例如金刚烷、Arg-Boc3；E3连接酶募集配体，例如，Nutlin-3a(MDM2配体)、贝司他丁(cIAP配体)、VHL配体、泊马度胺(CRBN配体)；蛋白水解-靶向嵌合体(PROTAC)，其可以利用不同的D3连接酶以靶向感兴趣蛋白以用于降解))(参见，例如LaiAC,Crews CM.Induced protein degradation:an emerging drug discoveryparadigm.Nat Rev Drug Discov.2016；16(2):101-114)；反义寡核苷酸；RNAi药剂(如siRNA)、CRISPR-Cas9基因编辑系统；RNA分子；DNA，例如质粒；抗癌药剂、抗炎药剂、抗感染药剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂)、麻醉药剂；RNA聚合酶II抑制剂；DNA嵌入剂、DNA交联剂；抗微管蛋白剂；细胞毒性药物、肿瘤疫苗、抗体、肽、肽体、化学治疗药剂、细胞毒性药剂；细胞生长抑制剂；免疫调节剂、干扰素、白介素、免疫刺激生长激素、细胞因子、维生素、矿物质、芳香酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、HDAC抑制剂；包封一种或多种治疗性分子的脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，放射性同位素可以是选自211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P和Lu的放射性同位素中的一种或多种，但不限于此。在一些实施方案中，前药活化酶是选自碱性磷酸酶、芳基硫酸酯酶、胞嘧啶脱氨酶、蛋白酶、D-丙氨酰羧肽酶、碳水化合物裂解酶、P-内酰胺酶和青霉素酰胺酶中的一种或多种，但不限于此。
在一些实施方案中，细胞毒性药剂包含选自以下中的一种或多种：蓖麻毒蛋白、皂草毒蛋白、白树毒蛋白、苦瓜毒蛋白、debouganin、白喉毒素、假单胞菌毒素等，但不限于此。在一些情况下，细胞毒性药剂是选自以下中的一种或多种：顺铂、卡铂、奥沙利铂、紫杉醇、美法仑(melphalan)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、依托泊苷(etoposide)、氮芥、环磷酰胺、博来霉素(bleomycin)、加利车霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)、单端孢霉烯(trichothene)、CC1065、白喉A链、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素(enomycin)、单端孢霉烯类、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶，但不限于此。在一些实施方案中，细胞毒性药剂是选自以下中的一种或多种：倍癌霉素、一甲基澳瑞他汀E(MMAE)、一甲基澳瑞他汀F(MMAF)、N2’-脱乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)美登素(DM1)、PBD(吡咯并苯并二氮杂)二聚体、倍癌霉素、一甲基澳瑞他汀E(MMAE)、一甲基澳瑞他汀F(MMAF)，但不限于此。在一些实施方案中，细胞毒性药剂包括核糖体失活蛋白、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、微管蛋白抑制剂、烷化剂、抗生素、抗肿瘤药剂、抗增生药剂、抗代谢物、拓扑异构酶I或II抑制剂、激素激动剂或拮抗剂、免疫调节剂、DNA小沟结合剂和放射性药剂。在某些实施方案中，核糖体失活蛋白是皂草毒蛋白。在一些实施方案中，该诊断药剂是标记物。在一些实施方案中，该标记物是荧光标记物、发色标记物或放射性标记物。在一些实施方案中，该药剂被直接缀合至抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。在其他实施方案中，该药剂任选地通过接头被间接缀合至抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开的ADC包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以及一种或多种药剂(例如1、2、3或4种或更多种药剂)，如治疗药剂，该药剂在治疗与病理性血管生成相关的病症如癌症中，与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以累加方式或以协同方式作用，例如以杀伤或抑制肿瘤细胞(TC)和/或肿瘤血管结构内皮细胞(EC)。例如，该治疗药剂可以是生物活性部分，如细胞毒性药剂、化学治疗药剂、蛋白质、肽、抗体、生长抑制剂和/或抗激素药剂。
可以直接或间接缀合至抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的微管蛋白抑制剂的实例可以包括不限于聚合抑制剂(例如长春花碱、长春新碱、长春瑞滨(vinorelbine)、长春氟宁(vinflunine)、念珠藻素52(cryptophycin 52)、软海绵素(hallchondrin)、多拉司他汀、可以结合至微管蛋白的长春结构域的hemiasterlin；秋水仙碱、考布他汀(combretastatin)、2-甲氧基-雌二醇、可以结合至微管蛋白的秋水仙碱结构域的E7010；解聚抑制剂，如紫杉醇、多西他赛(docetaxel)、埃博霉素(epothilon)、可以结合至紫杉烷位点的盘皮海绵内酯)。
示例性的化学治疗药剂包括但不限于氨甲蝶呤、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂；酶及其片段，如核分解酶、抗生素、以及毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶促活性毒素，包括它们的片段和/或变体。可以使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合性活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、篦麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯类。
此外，多种放射性核素可以用于将抗TM4SF1抗体或抗原结合片段缀合至治疗药剂，以生成本公开的ADC。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Sm153、Bi212、P32，以及Lu的放射性同位素。可替代地，抗TM4SF1抗体或抗原结合片段可以缀合至一个或多个较小的分子毒素，如加利车霉素、美登醇、多拉司他汀、澳瑞他汀(aurostatin)、单端孢霉烯和CC1065，并且本文还预期了这些毒素的具有毒素活性的衍生物。在各种实例中，可以缀合至本公开的TM4SF1结合蛋白的其他治疗药剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱和5-氟尿嘧啶等。
在一些实施方案中，用于缀合的诊断药剂是标记物，如荧光标记物、发色标记物或放射性标记物。因此，标记物可以用于检测目的，并且可以是荧光化合物、酶、辅基、发光材料、生物发光材料或放射性材料。例如，放射性标记物可以包含用于闪烁照相研究的放射性原子，例如Tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也被称为磁共振成像，MRI)的自旋标记物，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
一种或多种药剂(例如治疗药剂和/或诊断药剂)可以直接缀合至抗TM4SF1抗体或抗原结合片段(例如通过直接共价或非共价相互作用的方式)，使得药剂直接缀合至蛋白质。药剂可以例如通过直接肽键而直接缀合至本公开的结合蛋白。在其他情况下，直接缀合是通过直接非共价相互作用，如抗TM4SF1抗体或抗原结合片段与特异性地结合至该抗TM4SF1抗体或抗原结合片段的药剂之间的相互作用。
在一些实施方案中，治疗药剂包含选自以下的蛋白酶体抑制剂：硼替佐米(Velcade、PS-341)、PR-171(卡非佐米)、伊沙佐米德兰佐米、马里佐米、奥泼佐米、VR23、PI-1840、(苄氧基羰基)-Leu-Leu-苯丙氨醛、2,3,5a,6-四氢-6-羟基-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3a,10a-联二硫桥-吡嗪并[1,2α]吲哚-1,4-二酮、4-羟基-3-硝基苯基乙酰基-Leu-Leu-Leu-乙烯基砜、sapojargon、Ac-hFLFL-环氧化物、阿克拉霉素A、阿柔比星、ACM、AdaK(Bio)Ahx3L3VS、AdaLys(Bio)Ahx3L3VS、金刚烷-乙酰基-(6-氨基己酰基)-3-(亮氨酰基)-3-乙烯基-(甲基)-砜、ALLM、ALLN、钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、苄氧羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨醛、苄氧羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-正缬氨醛、胶霉毒素、异戊酰-L-酪氨酰-L-缬氨酰-DL-酪氨醛、裂体-乳胞素-β-内酯、Z-LL-Nva-CHO、泛素醛、YU101、MP-LLL-VS、LDN-57444、Z-GPFL-CHO、Z-LLL-CHO、洛伐他汀、α-甲基-裂体-乳胞素-β-内酯、mevinolin、MK-803、NIP-L3VS、NP-LLL-VS、NPI-0052(salinosporamide A)、MLN519(PS-519)、NLVS(三亮氨酸乙烯基砜)、利托那韦、Ro106-9920、Z-LLF-CHO、Z-LL-B(OH)2、RRRPRPPYLPR、Tyropeptin A、ZL3VS、PR-11、PR-39、0106-9920、蛋白酶体抑制剂I、蛋白酶体抑制剂II、蛋白酶体抑制剂III、蛋白酶体抑制剂IV、AdaAhx3L3VS、肽抑制素、MG-132、MG-262、MG-115、α-甲基omuralide、MG-101、艾泼米辛、omuralide、乳胞素、NEOSH101或其类似物。在一个具体实施方案中，所述蛋白酶体抑制剂是卡非佐米。
在一些实施方案中，治疗药剂为AKT激酶抑制剂，其中AKT激酶抑制剂可以包括但不限于ATP竞争性AKT激酶抑制剂、异喹啉-5-磺酰胺(H-8、H-89和NL-71-101)、氮杂环庚烷衍生物(衍生自(-)-巴拉诺(balanol))、氨基呋咱类(GSK690693)、杂环(7-氮杂吲哚衍生物、6-苯基嘌呤衍生物、吡咯并[2,3-d]嘧啶衍生物、CCT128930、3-氨基吡咯烷、苯胺基三唑衍生物、螺吲哚啉衍生物、AZD5363、帕他色替(ipatasertib)(GDC-0068、RG7440)、A-674563和A-443654)、苯基吡唑衍生物(AT7867、AT13148)、噻吩甲酰胺衍生物(阿氟瑞色替(afuresertib)(GSK2110183)、优普色替(uprosertib)(GSK2141795)、2-嘧啶基-5-氨基噻酚衍生物(DC120))、变构AKT激酶抑制剂、2,3-二苯基喹喔啉类似物(2,3-二苯基喹喔啉衍生物、三唑并[3,4-f][1,6]萘啶-3(2H)-酮衍生物(MK-2206))、烷基磷脂(依地福新(Edelfosine)(1-O-十八烷基-2-O-甲基-rac-甘油-3-磷酸胆碱，ET-18-OCH3)、伊莫福新(ilmofosine)(BM 41.440)、米替福新(miltefosine)(十六烷基磷酸胆碱，HePC)、瓢儿菜基磷酸胆碱(erucylphosphocholine)(ErPC)、erufosine(ErPC3)、erucylphosphohomocholine、磺酰胺衍生物(PH-315、PHT-427)、吲哚-3-甲醇类似物(吲哚-3-甲醇、3-氯乙酰吲哚、二吲哚甲烷、OSU-A9、6-甲氧基-5,7-二氢吲哚并[2,3-b]咔唑-2,10-二甲酸二乙酯(SR13668))、硫脲衍生物(N-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)羰基]-N’-(3-溴苯基)-硫脲、PIT-1、PIT-2、DM-PIT-1)、嘌呤衍生物(曲西立滨(triciribine)(TCN，NSC154020)、曲西立滨单磷酸酯活性类似物(TCN-P)、4-氨基-吡啶并[2,3-d]嘧啶衍生物API-1、ARQ 092、3-苯基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶衍生物)、BAY 1125976、3-甲基-黄嘌呤、喹啉-4-甲酰胺、2-[4-(环己-1,3-二烯-1-基)1H-吡唑-3-基]苯酚、3-氧代-蒂鲁卡酸(3-oxo-tirucallic acid)、3α-和3β-乙酰氧基-蒂鲁卡酸、乙酰氧基-蒂鲁卡酸、不可逆抑制剂(乳醌霉素(lactoquinomycin)、富伦菌素B(Frenolicin B)、卡拉芬净(kalafungin)、曼得尔霉素(medermycin)、Boc-Phe-乙烯基酮、4-羟基壬烯醛(4-HNE)、1,6-萘啶酮衍生物、咪唑并-1,2-吡啶衍生物)等。小分子AKT抑制剂的一些实例是GSK690693、卡帕塞替尼(Capiversertib)、帕他色替、阿氟瑞色替、优普色替、Miransertib、米替福新、曲西立滨、哌立福新(Perifosine)、Tehranolide、(E)-1-(2,4-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)丙-2-烯-1-酮(异甘草素)、7-(β-D-吡喃葡萄糖酰氧基)-5,6-二羟基-2-(4-羟基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(野黄芩苷)、7a,20-环氧-1a,6b,7,14-四羟基-Kaur-16-烯-15-酮(冬凌草甲素)、3,5,7,8-四羟基-2-(4-羟基苯基)色烯-4-酮(草棉黄素)、(E)-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)癸-4-烯-3-酮([6]-姜烯酚)。
在一些实施方案中，治疗药剂是抗有丝分裂四肽。在一些实施方案中，抗有丝分裂四肽可以包括但不限于微管溶素(Tubulysin)A-I、U、V、Y、z和前微管溶素(pretubulysin)及其衍生物。如本文所用，术语“微管蛋白的衍生物”通常指微管溶素的类似物，包括但不限于其中噁唑环取代噻唑环的微管溶素的噁唑类似物。在一些实施方案中，抗有丝分裂四肽是微管溶素A或D，或其衍生物。不受理论的束缚，预期缀合至微管溶素及其衍生物的抗TM4SF1抗体将降低药物相关毒性。
IV.多核苷酸
在一些实施方案中，还提供了编码抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸分子作为DNA构建体提供。在其他实施方案中，多核苷酸分子作为信使RNA转录物提供。
在一些实例中，本公开的抗TM4SF1抗体包含由如SEQ ID NO:4、16、28、40、52、64或76中的任一者所示的核酸序列编码的重链可变结构域。在一些实例中，本公开的抗TM4SF1抗体包含由如SEQ ID NO:10、22、34、46、58、70或82中的任一者所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，提供了核酸序列，该核酸序列被密码子优化以用于在宿主细胞中表达，该宿主细胞例如细菌，如大肠杆菌，或真核细胞，如CHO细胞。在一些实例中，核酸序列被密码子优化以用于在CHO细胞中表达。在一些实例中，本公开的抗TM4SF1抗体包含由如SEQ ID NO:5、17、29、41、53、65或77中的任一者中所示的密码子优化的核酸序列编码的重链可变结构域。在一些实例中，本公开的抗TM4SF1抗体包含由如SEQ ID NO:11、23、35、47、59、71或83中的任一者中所示的密码子优化的核酸序列编码的轻链可变结构域。在某些情况下，SEQ ID NO:5、17、29、41、53、65或77中的任一者的核酸序列是被密码子优化以用于在CHO细胞中表达的核酸序列。在某些情况下，SEQ ID NO:11、23、35、47、59、71或83中的任一者的核酸序列是被密码子优化以用于在CHO细胞中表达的核酸序列。
多核苷酸分子通过已知方法构建，例如通过将编码结合蛋白的基因并入到连接至合适的启动子和任选地合适的转录终止子的遗传构建体中，并且在细菌或其他合适的表达系统如例如CHO细胞中表达。取决于所利用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包括组成型启动子和诱导型启动子。选择启动子，使得它驱动多核苷酸在相应宿主细胞中的表达。
在一些实施方案中，将如本文所述的多核苷酸插入到载体(优选地表达载体)中，其代表另外的实施方案。该重组载体可以根据已知方法构建。特别感兴趣的载体包括质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒等)和黏粒。
多种表达载体/宿主系统可以用于包含和表达编码所描述的TM4SF1结合蛋白的多肽的多核苷酸。用于在大肠杆菌中表达的表达载体的实例是用于在哺乳动物细胞中表达的pSKK(Le Gall等人,J Immunol Methods.(2004)285(1):111-27)或pcDNA5(Invitrogen)。
因此，在一些实施方案中，如本文所述的TM4SF1结合蛋白通过将编码如上所述的蛋白的载体引入到宿主细胞中并且在表达蛋白结构域的条件下培养所述宿主细胞而产生，可以分离并且任选地进一步纯化。
V.免疫治疗药剂
在一些实施方案中，本公开的组合包含i)与细胞毒性有效负载缀合的抗TM4SF1抗体，以及ii)免疫治疗药剂。抗血管生成ADC和免疫治疗药剂的组合可以改善免疫治疗药剂的治疗效果。抗血管生成ADC可以促进免疫细胞向肿瘤微环境的浸润，从而通过将冷肿瘤转变为热肿瘤来改善免疫治疗药剂的治疗结果。此类治疗结果可以包括但不限于增加的免疫细胞浸润或T-reg细胞群体的减少。在一些情况下，ADC也可以用于血管损伤的情况下，用于伤口愈合。
在一些实施方案中，免疫治疗药剂是针对存在于髓系细胞、肿瘤细胞、淋巴系细胞中、存在于肿瘤微环境中的分子中的靶标的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，免疫治疗药剂是针对PD-1、CTLA-4、CD40、CSF1/CSF1R、SIRPα、CLEC-1中的至少一种的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，免疫治疗药剂是针对以下中的至少一种的抗体或其抗原结合片段：CCR4、CTLA-4、A1R、A2AR、A3R、TIM-3、BTLA、VISTA、TIGIT、LAG-3、ILRa/CD25、ITGB1/CD29、Ly 24/CD44、CD48、CEACAM1/CD66a、Nt5e/CD73、CD94/NKG2A、FAS/CD95、SLAF1/CD150、NRP1/CD304、GITR/CD357、ICOS、Tnfrs4/OX40、Folr4/JUNO、P2X7、ANXA2、IDO、B7-H6、KIR、GARP(LRRC32)、TNFR2。在一些实施方案中，免疫治疗药剂是针对PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CD47、TDO、DcR3中的至少一种的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，免疫治疗药剂是针对外泌体、细胞因子、白介素或趋化因子中的至少一种的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，免疫治疗药剂是针对PS、STING中的至少一种的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，免疫治疗药剂是细胞因子，如IL-2和IL-15，该细胞因子可以起到帮助B细胞、T细胞和NK细胞的增殖和分化的作用。在一些实施方案中，免疫治疗药剂包括细胞疗法、癌症疫苗、激素、表位、细胞因子、肿瘤抗原、CD4细胞刺激剂、ΝKΤ细胞激动剂或佐剂。例如，免疫治疗药剂可以是干扰素、白介素、肿瘤坏死因子、卵白蛋白、Neuvenge、Oncophage、CimaVax-EGF、Mobilan、a-Gal糖脂、a-半乳糖神经酰胺(a-GalCer)、β-甘露糖神经酰胺(β-ManCer)、腺病毒递送疫苗、Celldex’s CDX1307和CDX1401；GRNVAC1、基于病毒的疫苗、MVA-BN、Advaxis’；ADXS11-001、ADXS31-001、ADXS31-164、BiovaxID、叶酸结合蛋白(E39)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(有和没有E75(NeuVax)或OncoVEX)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、Ae-37、IMA901、SC1B 1、Stimuvax、可以引发细胞毒性淋巴细胞应答的肽、肽疫苗，包括端粒酶肽疫苗(GV1001)、生存素肽、MUC1肽、ras肽、TARP 29-37-9V肽表位增强肽、具有合成肽E-PRA和E-PSM的DNA载体pPRA-PSM。
在一些实施方案中，免疫治疗药剂包括过继免疫疗法，其涉及转移离体产生的自体抗原特异性T细胞。用于过继免疫疗法的T细胞可以通过抗原特异性T细胞的扩增或通过基因工程重定向T细胞来产生。肿瘤特异性T细胞的分离和转移已经被证明在治疗黑色素瘤中是成功的。通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的基因转移，已经成功地在T细胞中产生了新的特异性。CAR是由靶向部分组成的合成受体，该靶向部分与单个融合分子中的一个或多个信号传导结构域缔合。一般而言，CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，包括通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻链和可变片段。基于受体或配体结构域的结合部分也已经被成功使用。第一代CAR的信号传导结构域来源于CD3ζ或Fc受体γ链的细胞质区域。CAR已经成功地允许T细胞针对在来自各种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞的表面处表达的抗原进行重新定向。
在一些实施方案中，免疫治疗药剂是免疫检查点分子的抑制性分子的抑制剂。术语“免疫检查点”是指CD4 T细胞和CD8 T细胞的细胞表面上的一组分子。这些分子可以有效地充当“刹车”，以下调或抑制抗肿瘤免疫应答。抑制性分子的抑制可以通过在DNA、RNA或蛋白质水平上的抑制来进行。在实施方案中，抑制性核酸(例如，dsRNA、siRNA或shRNA)可以用于抑制抑制性分子的表达。在其他实施方案中，抑制性信号的抑制剂是结合至抑制性分子的多肽，例如可溶性配体，或抗体或其抗原结合片段。免疫检查点抑制剂可以抑制抗肿瘤免疫和/或增强肿瘤新抗原的可见性。
在一些实施方案中，免疫治疗药剂可以是免疫检测点抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是针对在髓样细胞、淋巴样细胞、肿瘤细胞或肿瘤微环境的其他小颗粒上表达的靶标的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，肿瘤微环境的小颗粒包括外泌体、细胞因子、白介素或趋化因子。在髓样细胞上表达的示例性靶标可以是但不限于PD-1、CD40、CSF1、CSF1-R、SIRPα和/或CLEC1。在淋巴样细胞上表达的示例性靶标可以是但不限于CCR4、CTLA-4、A1R、A2AR、A3R、TIM-3、BTLA、VISTA、TIGIT、LAG-3、ILRa/CD25、ITGB1/CD29、Ly24/CD44、CD48、CEACAM1/CD66a、Nt5e/CD73、CD94/NKG2A、FAS/CD95、SLAF1/CD150、NRP1/CD304、GITR/CD357、ICOS、Tnfrs4/OX40、Folr4/JUNO、P2X7、ANXA2、IDO、B7-H6、KIR、GARP(LRRC32)或TNFR2。在肿瘤细胞上表达的示例性靶标可以是但不限于PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CD47、TDO或DcR3。肿瘤微环境中的示例性小颗粒可以是但不限于PS或STING。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抑制T细胞活化的蛋白质，例如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、GITR和LAG-3、半乳糖凝集素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳糖凝集素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、B7-H3、B7-H4、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1、TIM-3和TIM-4。在一些实施方案中，抗LAG-3抗体是BMS-986016。BMS-986016(也被称为BMS986016；Bristol-MyersSquibb)是一种结合至LAG-3的单克隆抗体。BMS-986016和其他人源化抗LAG-3抗体在US2011/0150892、WO2010/019570和WO2014/008218中公开。
其他示例性免疫治疗药剂可以是，但不限于阿伦单抗(alemtuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托西莫单抗(tosituimomab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、替伊莫单抗(ibitumomab tiuxetan)、地努图希单抗(dinutuximab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、达雷妥尤单抗(daratumumab)、艾沙妥昔单抗(isatuximab)、伊匹单抗、伊沙妥昔单抗(satuximab-irfc)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumb)、卡妥索单抗(catumaxomab)、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗(pertuzumab)、奥拉单抗(olaratumab)、贝伐珠单抗(bevacizmab)、雷莫芦单抗(ramucinumab)、咪喹莫特(imiquimod)、塔西单抗(tocilzumab)、纳武单抗、帕博利珠单抗、伊匹木单抗(ipilmumub)、曲美木单抗、纳武单抗、西米普利单抗、帕博利珠单抗、阿维鲁单抗、阿替利珠单抗、度伐利尤单抗、曲美木单抗、斯巴达珠单抗、阿维鲁单抗、信迪利单抗、特瑞普利单抗、NKTR-214、司利弗明(tisageniecluecel)、阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel)、阿地白介素(aldesleukin)、干扰素α-3a/2b、培瑞达阿替尼(peridaratinib)、普列威-T(sipuleucel-T)、HIOI、Talimogene laherparepvec、MGA012、MGD013、MGD019、依诺妥珠单抗、MGD009、MGC018、MEDI0680、PDR001、FAZ053、TSR022、MBG453、瑞拉利单抗(BMS986016)、LAG525、IMP321、REGN2810(西米普利单抗)、REGN3767、培西达替尼、LY3022855、FPA008、BMS-986226、BMS-986207、BLZ945、BMS-986315、GDC0919、艾卡哚司他、吲哚莫德、BMS986205、CPI-444、MEDI9447、PBF509、利瑞鲁单抗、IMC-001、莫那利珠单抗及其组合。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。免疫治疗药剂可以是抗体药物缀合物。示例性的抗体药物缀合物可以包括但不限于莫塞妥莫单抗(moxetumomab)、本妥昔单抗(bretuximab)、曲妥珠单抗、奥英妥珠单抗(inotuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、tagraxofusp-erza、泊洛妥珠单抗(polatuzumab)、恩诺单抗(enfortumab vedotin-ejfv)、德喜曲妥珠单抗(trastuzumab deruxtecan)、戈沙妥珠单抗(sacituzumab govitecan-hziy)。
示例性的免疫治疗药剂还包括但不限于：(伊匹单抗)或曲美木单抗(针对CTLA-4)、加利昔单抗(galiximab)(针对B7.1)、BMS-936558(针对PD-1)、MK-3475(针对PD-1)、阿替利珠单抗AMP224(针对B7DC)、BMS-936559(针对B7-H1)、MPDL3280A(针对B7-H1)、MEDI-570(针对ICOS)、AMG557(针对B7H2)、MGA271(针对B7H3)、IMP321(针对LAG-3)、BMS-663513(针对CD137)、PF-05082566(针对CD137)、CDX-1127(针对CD27)、抗OX40(Providence Health Services)、huMAbOX40L(针对OX40L)、阿塞西普(Atacicept)(针对TACT)、CP-870893(针对CD40)、鲁卡木单抗(Lucatumumab)(针对CD40)、达西组单抗(Dacetuzumab)(针对CD40)、莫罗单抗(Muromonab-CD3)(针对CD3)；抗GITR抗体MK4166、TRX518、Medi1873、INBRX-110、LK2-145、GWN-323、GITRL-Fc或其任何组合。
示例性的免疫治疗药剂还可包括但不限于伊匹单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗、阿替利珠单抗、度伐利尤单抗、曲美木单抗、斯巴达珠单抗、阿维鲁单抗、信迪利单抗、特瑞普利单抗、MGA012、MGD013、MGD019、依诺妥珠单抗、MGD009、MGC018、MEDI0680、PDR001、FAZ053、TSR022、MBG453、瑞拉利单抗(BMS986016)、LAG525、IMP321、REGN2810(西米普利单抗)、REGN3767、培西达替尼、LY3022855、FPA008、BLZ945、GDC0919、艾卡哚司他、吲哚莫德、BMS986205、CPI-444、MEDI9447、PBF509、利瑞鲁单抗、IMC-001、莫那利珠单抗及其组合。
VI.治疗方法
本文提供了治疗方法，其包括施用包含抗TM4SF1抗体或抗原结合片段或含有此类抗体的ADC以及免疫治疗药剂的组合。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于抑制内皮细胞(EC)所特有的细胞-细胞相互作用的方法，该相互作用例如是但不限于EC-EC、EC-间充质干细胞、EC-成纤维细胞、EC-平滑肌细胞、EC-肿瘤细胞、EC-白细胞、EC-脂肪细胞和EC-神经元细胞相互作用。
“组合”或“与......组合”不旨在意味着疗法或治疗药剂必须同时施用和/或一起配制用于递送(例如，在同一组合物中)，尽管这些方法和组合物在本文所述的范围内。免疫调节剂和第二种治疗药学可以与一种或多种其他另外的疗法或治疗药剂同时、之前或之后施用。组合中的药剂可以以任何顺序施用。一般来说，每种药剂将以针对该药剂确定的剂量和/或时间表施用。如将进一步理解的，在该组合中使用的另外的治疗药剂可以以单一组合物一起施用，或者以不同的组合物分别施用。一般来说，预期组合使用的另外的治疗药剂的使用水平可以不超过它们单独使用时的水平。在一些实施方案中，组合使用的水平可以低于单独使用的水平。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括与一种或多种免疫治疗药剂(例如，抗PD-1或PD-L1抗体分子、抗LAG-3或抗TIM-3抗体分子)联合施用如本文所述的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段或ADC。
在一些情况下，将该组合的组分、抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段、或含有此类抗体的ADC与免疫治疗药剂组合同时施用。同时施用意指每种组分彼此同时或在8-12小时内施用。在第一种组分后超过12小时施用第二种组分可以被认为是顺序施用。在一些情况下，将该组合的组分、抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段、或含有此类抗体的ADC与免疫治疗药剂组合以任何顺序和任何组合顺序施用(例如，间隔一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天或九天；间隔一、二、三或四周；间隔一、二、三、四、五、六、七、八或九周；或者间隔一年、两年、三年、四年、五年、六年或更多年；等等)。在一些实施方案中，当顺序施用时，首先施用抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，或含有此类抗体的ADC，其次施用免疫治疗药剂。在其他实施方案中，首先施用免疫治疗药剂，其次施用抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，或含有此类抗体的ADC。
另外的药剂
在一些实施方案中，该组合可以进一步包含另外的药剂，如酪氨酸激酶抑制剂。示例性的酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于表皮生长因子(EGF)途径抑制剂(例如，表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂)、血管内皮生长因子(VEGF)途径抑制剂(例如，血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂(例如，VEGFR-1抑制剂、VEGFR-2抑制剂、VEGFR-3抑制剂))、血小板衍生生长因子(PDGF)途径抑制剂(例如，血小板衍生生长因子受体(PDGFR)抑制剂(例如，PDGFR-β抑制剂))、RAF-1抑制剂、KIT抑制剂和RET抑制剂。在一些实施方案中，与hedgehog抑制剂组合使用的抗癌药剂选自：阿昔替尼(axitinib)(AG013736)、博舒替尼(bosutinib)(SKI-606)、西地尼布(cediranib)(RECENTINTM、AZD2171)、达沙替尼(dasatinib)(BMS-354825)、厄洛替尼(erlotinib)吉非替尼(gefitinib)伊马替尼(imatinib)(CGP57148B、STI-571)、拉帕替尼(lapatanib) 来他替尼(lestaurtinib)(CEP-701)、来那替尼(neratinib)(HKI-272)、尼洛替尼(nilotinib)司马沙尼(semaxanib)(SU5416)、舒尼替尼(sunitinib)(SU11248)、妥拉尼布(toceranib)凡德他尼(vandetanib)(ZD6474)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787、PTK/ZK)、曲妥珠单抗贝伐珠单抗(bevacizumab)利妥昔单抗西妥昔单抗帕尼单抗雷尼株单抗(ranibizumab)尼洛替尼索拉非尼(sorafenib)阿伦单抗吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)ENMD-2076、PCI-32765、AC220、多韦替尼乳酸盐(dovitiniblactate)(TKI258、CHIR-258)、BIBW 2992(TOVOKTM)、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF 1120(V)、AP24534、JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-690154、CEP-11981、替沃扎尼(tivozanib)(AV-951)、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647、XL228、AEE788、AG-490、AST-6、BMS-599626、CUDC-101、PD153035、培利替尼(pelitinib)(EKB-569)、凡德他尼(zactima)、WZ3146、WZ4002、WZ8040、ABT-869(利尼伐尼(linifanib))、AEE788、AP24534(普纳替尼(ponatinib))、AV-951(替沃扎尼)、阿昔替尼、BAY 73-4506(瑞戈非尼(regorafenib))、丙氨酸布立尼布(brivanibalaninate)(BMS-582664)、布立尼布(brivanib)(BMS-540215)、西地尼布(AZD2171)、CHIR-258(多韦替尼(dovitinib))、CP 673451、CYC116、E7080、马赛替尼(masitinib)(ABIOIO)、MGCD-265、二磷酸莫替沙尼(motesanib diphosphate)(AMG-706)、MP-470、OSI-930、盐酸培唑帕尼(Pazopanib Hydrochloride)、PD173074、索拉非尼甲苯磺酸盐(Bay 43-9006)、SU 5402、TSU-68(SU6668)、瓦他拉尼、XL880(GSK1363089、EXEL-2880)。Hedgehog抑制剂的另外的实例包括但不限于维莫地尼(vismodegib)(2-氯-N-[4-氯-3-(2-吡啶基)苯基]-4-(甲磺酰基)-苯甲酰胺，GDC-0449，描述于PCT公开号WO 06/028958中)；1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-3-((3-(4-氟苯基)-3,4-二氢-4-氧代-2-喹唑啉基)甲基)-脲(CAS330796-24-2)；N-[(2S,3R,3’R,3aS,4’aR,6S,6’aR,6’bS,7aR,12’aS,12’bS)-2’,3’,3a,4,4’,4’a,5,5’,6,6’,6’a,6’b,7,7’,7a,8’,10’,12’,12’a,12’b-二十氢-3,6,11’,12’b-四甲基螺[呋喃并[3,2-b]吡啶-2(3H),9’(1’H)-萘并[2,1-a]薁]-3’-基]-甲磺酰胺(IPI926，CAS 1037210-93-7)；和4-氟-N-甲基-N-[1-[4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-酞嗪基]-4-哌啶基]-2-(三氟甲基)-苯甲酰胺(LY2940680，CAS 1258861-20-9)；以及索尼吉布(Erismodegib)(LDE225)。选定的酪氨酸激酶抑制剂选自吉非替尼；盐酸厄洛替尼利尼伐尼(N-[4-(3-氨基-1H-吲唑-4-基)苯基]-N’-(2-氟-5-甲基苯基)脲，也被称为ABT 869，可从Genentech获得)；苹果酸舒尼替尼博舒替尼(4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基]喹啉-3-腈，也被称为SKI-606，描述于美国专利号6,780,996中)；达沙替尼帕唑帕尼(pazopanib)索拉非尼凡德他尼(ZD6474)；以及伊马替尼和伊马替尼甲磺酸盐(和)。
在一些实施方案中，该组合可以进一步包含另外的药剂，如血管内皮生长因子(VEGF)受体抑制剂。VEGF抑制剂的实例可以包括但不限于贝伐珠单抗阿昔替尼丙氨酸布立尼布(BMS-582664、(5)-((R)-1-(4-(4-氟-2-甲基-1H-吲哚-5-基氧基)-5-甲基吡咯并[2,1-/][1,2,4]三嗪-6-基氧基)丙-2-基)2-氨基丙酸酯)；索拉非尼帕唑帕尼苹果酸舒尼替尼西地尼布(AZD2171、CAS288383-20-1)；尼达尼布(Vargatef)(BIBF1120、CAS 928326-83-4)；福瑞替尼(Foretinib)(GSK1363089)；替拉替尼(Telatinib)(BAY57-9352、CAS 332012-40-5)；阿帕替尼(Apatinib)(YN968D1、CAS 811803-05-1)；伊马替尼普纳替尼(AP24534、CAS 943319-70-8)；替沃扎尼(AV951、CAS 475108-18-0)；瑞戈非尼(BAY73-4506、CAS 755037-03-7)、二盐酸瓦他拉尼(PTK787、CAS212141-51-0)；布立尼布(BMS-540215、CAS 649735-46-6)；凡德他尼(或AZD6474)；二磷酸莫替沙尼(AMG706、CAS 857876-30-3、N-(2,3-二氢-3,3-二甲基-1H-吲哚-6-基)-2-[(4-吡啶基甲基)氨基]-3-吡啶甲酰胺，描述于PCT公开号WO 02/066470中)；多韦替尼二乳酸(TKI258、CAS 852433-84-2)；利尼伐尼(ABT869、CAS 796967-16-3)；卡博替尼(Cabozantinib)(XL184、CAS849217-68-1)；来他替尼(CAS 111358-88-4)；N-[5-[[[5-(1,1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-哌啶甲酰胺(BMS38703、CAS 345627-80-7)；(3R,4R)-4-氨基-1-((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)；N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aa,5p,6aa)-八氢-2-甲基环戊并[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647、CAS 781613-23-8)；4-甲基-3-[[1-甲基-6-(3-吡啶基)-1h-吡唑并[3,4-J]嘧啶-4-基]氨基]-N-[3-三氟甲基]苯基]-苯甲酰胺(BHG712、CAS 940310-85-0)；和阿柏西普(Aflibercept)示例性的抗VEGF抗体包括但不限于与由杂交瘤ATCC HB 10709产生的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合至相同表位的单克隆抗体；根据Presta等人(1997)Cancer Res.57:4593-4599产生的重组人源化抗VEGF单克隆抗体。在一个实施方案中，抗VEGF抗体是贝伐珠单抗(BV)，也被称为rhuMAbVEGF或它包含突变的人IgG1框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1的抗原结合互补决定区，该鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1阻断人VEGF与其受体的结合。贝伐珠单抗和其他人源化抗VEGF抗体在2005年2月26日发布的美国专利号6,884,879中进一步描述。另外的抗体包括G6或B20系列抗体(例如，G6-31、B20-4.1)，如PCT公开号WO2005/012359、PCT公开号WO2005/044853中所述，这些专利申请的内容通过引用明确并入本文。对于另外的抗体，参见美国专利号7,060,269、6,582,959、6,703,020、6,054,297、W098/45332、WO 96/30046、WO94/10202、EP 0666868B1、美国专利申请公开号2006009360、20050186208、20030206899、20030190317、20030203409和20050112126；以及Popkov等人,Journal of Immunological Methods 288:149-164(2004)。其他抗体包括结合至人VEGF上的功能性表位的那些抗体，该表位包含残基F17、M18、D19、Y21、Y25、Q89、191、K101、E103和C104，或者可替代地包含残基F17、Y21、Q22、Y25、D63、183和Q89。
在一些实施方案中，该组合可以进一步包含另外的药剂，如PI3K抑制剂。PI3K抑制剂的实例是PI3K的δ和γ异构体的抑制剂。PI3K抑制剂的另外的实例包括但不限于4-[2-(1H-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基]甲基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基]吗啉(也被称为GDC 0941，描述于PCT公开号WO 09/036082和WO 09/055730中)；2-甲基-2-[4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈(也被称为BEZ235或NVP-BEZ 235，描述于PCT公开号WO 06/122806中)；4-(三氟甲基)-5-(2,6-二吗啉代嘧啶-4-基)吡啶-2-胺(也被称为BKM120或NVP-BKM120，描述于PCT公开号WO2007/084786中)；陶扎色替(Tozasertib)(VX680或MK-0457，CAS 639089-54-6)；(5Z)-5-[[4-(4-吡啶基)-6-喹啉基]亚甲基]-2,4-噻唑烷二酮(GSK1059615，CAS 958852-01-2)；(1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(乙酰氧基)-1-[(二-2-丙烯基氨基)亚甲基]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-八氢-11-羟基-4-(甲氧基甲基)-4a,6a-二甲基-环戊二烯并[5,6]萘并[1,2-c]吡喃-2,7,10(1H)-三酮(PX866，CAS 502632-66-8)；8-苯基-2-(吗啉-4-基)-色烯-4-酮(LY294002，CAS 154447-36-6)；2-氨基-8-乙基-4-甲基-6-(1H-吡唑-5-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(SAR 245409或XL 765)；1,3-二氢-8-(6-甲氧基-3-吡啶基)-3-甲基-1-[4-(1-哌嗪基)-3-(三氟甲基)苯基]-2H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮、(2Z)-2-丁烯二酸酯(1:1)(BGT226)；5-氟-3-苯基-2-[(1S)-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基]-4(3H)-喹唑啉酮(CAL101)；2-氨基-N-[3-[N-[3-[(2-氯-5-甲氧基苯基)氨基]喹喔啉-2-基]氨磺酰基]苯基]-2-甲基丙酰胺(SAR 245408或XL 147)；和(S)-吡咯烷-1,2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)(B YL719)。
在一些实施方案中，该组合可以进一步包含另外的药剂，如mTOR抑制剂，例如，选自以下中的一者或多者的一种或多种mTOR抑制剂：雷帕霉素(rapamycin)、替西罗莫司AZD8055、BEZ235、BGT226、XL765、PF-4691502、GDC0980、SF1126、OSI-027、GSK1059615、KU-0063794、WYE-354、Palomid 529(P529)、PF-04691502或PKI-587、地磷莫司(ridaforolimus)(正式名称为deforolimus，(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,1SR,19R,21R,23S,24E,26E,2SZ,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-1 9,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-1 1,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04’9]三十六烷(hexatriaconta)-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯，也被称为AP23573和MK8669并且描述于PCT公开号WO 03/064383中)；依维莫司(everolimus)(或RAD001)；雷帕霉素(AY22989、)；simapimod(CAS 164301-51-3)；西罗莫司(emsirolimus)、(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-JJ嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[iraw5,-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-JJ嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502、CAS 1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-a-天冬氨酰-丝氨酸-，内盐(SF1126、CAS 936487-67-1)、(1r,4r)-4-(4-氨基-5-(7-甲氧基-1H-吲哚-2-基)咪唑并[1,5-f][1,2,4]三嗪-7-基)环己烷甲酸(OSI-027)；以及XL765。
在一些实施方案中，该组合可以进一步包含另外的药剂，如BRAF抑制剂，例如GSK2118436、RG7204、PLX4032、GDC-0879、PLX4720和索拉非尼甲苯磺酸盐(Bay 43-9006)。在另外的实施方案中，BRAF抑制剂包括，但不限于，瑞戈非尼(BAY73-4506、CAS 755037-03-7)；tuvizanib(AV951、CAS 475108-18-0)；维莫非尼(vemurafenib)(PLX-4032、CAS 918504-65-1)；恩考芬尼(encorafenib)(也被称为LGX818)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265、CAS 927880-90-8)；5-[1-(2-羟乙基)-3-(吡啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]-2,3-二氢茚-1-酮肟(GDC-0879、CAS 905281-76-7)；5-[2-[4-[2-(二甲基氨基)乙氧基]苯基]-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]-2,3-二氢-1H-茚-1-酮肟(GSK2118436或SB590885)；(+/-)-甲基(5-(2-(5-氯-2-甲基苯基)-1-羟基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基)氨基甲酸酯(也被称为XL-281和BMS908662)以及N-(3-(5-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺(也被称为PLX4720)。
在一些实施方案中，该组合可以进一步包含另外的药剂，如MEK抑制剂。可以组合使用任何MEK抑制剂，包括但不限于司美替尼(selumetinib)(5-[(4-溴-2-氯苯基)氨基]-4-氟-N-(2-羟基乙氧基)-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-甲酰胺，也被称为AZD6244或ARRY142886，描述于PCT公开号WO2003077914中)；曲马替尼二甲基亚砜(GSK-1120212、CAS1204531-25-80)；RDEA436；N-[3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-6-甲氧基苯基]-1-[(2R)-2,3-二羟基丙基]-环丙烷磺酰胺(也被称为RDEA119或BAY869766，描述于PCT公开号WO2007014011中)；AS703026；BIX 02188；BIX 02189；2-[(2-氯-4-碘苯基)氨基]-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟-苯甲酰胺(也被称为CI-1040或PD184352，描述于PCT公开号WO2000035436中)；N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺(也被称为PD0325901并且描述于PCT公开号WO2002006213中)；2’-氨基-3’-甲氧基黄酮(也被称为PD98059，可从Biaffin GmbH&Co.,KG,Germany获得)；2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫基]亚甲基]-丁二腈(也被称为U0126并且描述于美国专利号2,779,780中)；XL-518(也被称为GDC-0973，Cas No.1029872-29-4，可从ACC Corp.获得)；G-38963；以及G02443714(也被称为AS703206)，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。MEK抑制剂的另外的实例公开在WO 2013/019906、WO 03/077914、WO 2005/121142、WO 2007/04415、WO 2008/024725和WO 2009/085983中，它们的内容通过引用并入本文。MEK抑制剂的另外的实例包括但不限于贝美替尼(benimetinib)(6-(4-溴-2-氟苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-甲酸(2-羟乙氧基)-酰胺，也被称为MEK162，CAS 1073666-70-2，描述于PCT公开号WO2003077914中)；2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫基]亚甲基]-丁二腈(也被称为U0126并且描述于美国专利号2,779,780中)；(3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(乙基氨基)-8,9,16-三羟基-3,4-二甲基-3,4,9,19-四氢-1H-2-苯并六环十四烯-1,7(8H)-二酮](也被称为E6201，描述于PCT公开号WO2003076424中)；维莫非尼(PLX-4032、CAS 918504-65-1)；(R)-3-(2,3-二羟基丙基)-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯基氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,7(3H,8H)-二酮(TAK-733，CAS 1035555-63-5)；pimasertib(AS-703026、CAS 1204531-26-9)；2-(2-氟-4-碘苯基氨基)-N-(2-羟基乙氧基)-1,5-二甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺(AZD8330)；以及3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-N-(2-羟基乙氧基)-5-[(3-氧代-[1,2]噁嗪-2-基)甲基]苯甲酰胺(CH 4987655或Ro 4987655)。
在一些实施方案中，该组合可以进一步包含另外的药剂，如JAK抑制剂。例如，示例性的JAK抑制剂包括但不限于，r CEP-701、INCB18424、CP-690550(托法替尼(tasocitinib))、鲁索利替尼(uxolitinib)托法替尼(tofacitinib)(CP690550)；阿昔替尼(AG013736、CAS 319460-85-0)；5-氯-N2-[(1S)-1-(5-氟-2-嘧啶基)乙基]-N4-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-12,4-嘧啶二胺(AZD1480，CAS 935666-88-9)；(9E)-15-[2-(1-吡咯烷基)乙氧基]-7,12,26-三氧杂-19,21,24-三氮杂四环[18.3.1.12,5.114,18]-二十六烷-1(24),2,4,9,14,16,18(25),20,22-壬烯(SB-1578，CAS 937273-04-6)；莫洛替尼(momelotinib)(CYT 387)；巴瑞替尼(baricitinib)(INCB-028050或LY-3009104)；帕克替尼(pacritinib)(SB1518)；(16E)-14-甲基-20-氧杂-5,7,14,27-四氮杂四环[19.3.1.12,6.18,12]二十七烷-1(25),2,4,6(27),8,10,12(26),16,21,23-癸烯(SB1317)；甘多替尼(gandotinib)(LY 2784544)；以及N,N-双环丙基-4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-6-乙基-1,6-二氢-1-甲基-咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-7-甲酰胺(BMS 911543)。
在一些实施方案中，该组合可以进一步包含另外的药剂，如抗杀伤细胞免疫球蛋白样受体的抗体(在本文中也被称为“抗KIR抗体”)。在一些实施方案中，该组合可以进一步包括施用细胞免疫疗法(例如，普罗文奇(Provenge)(例如，普列威(Sipuleucel)))，并且任选地与环磷酰胺组合。在一些实施方案中，该组合可以进一步包含另外的药剂，如疫苗，例如树突细胞肾癌(DC-RCC)疫苗。在一些实施方案中，该组合可以进一步包含另外的药剂，如紫杉醇或紫杉醇药剂，例如蛋白结合型紫杉醇(例如)。示例性的紫杉醇药剂包括但不限于纳米颗粒白蛋白结合的紫杉醇(ABRAXANE，由AbraxisBioscience销售)、二十二碳六烯酸结合的紫杉醇(DHA-紫杉醇，Taxoprexin，由Protarga销售)、聚谷氨酸盐结合的紫杉醇(PG-紫杉醇，聚谷氨酸紫杉醇(paclitaxel poliglumex)，CT-2103，XYOTAX，由Cell Therapeutic销售)、肿瘤活化前药(TAP)、ANG105(结合至三个紫杉醇分子的Angiopep-2，由ImmunoGen销售)、紫杉醇-EC-1(结合至erbB2识别肽EC-1的紫杉醇；参见Li等人,Biopolymers(2007)87:225-230)，和葡萄糖缀合的紫杉醇(例如，紫杉醇甲基2-吡喃葡萄糖基琥珀酸酯，参见Liu等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters(2007)17:617-620)。
在一些实施方案中，该组合可以进一步包含另外的药剂，如化学疗法和/或免疫疗法。例如，包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段或包含其的ADC的组合与免疫治疗药剂的组合可以单独或与以下中的一种或多种组合用于治疗骨髓瘤：化学疗法或其他抗癌药剂(例如，沙利度胺类似物，例如，来那度胺)、肿瘤抗原脉冲的树突细胞、肿瘤细胞和树突细胞的融合体(例如，电融合体)、或用通过恶性浆细胞产生的免疫球蛋白独特型进行的疫苗接种。
癌症
在该方法的一些实施方案中，用该组合治疗的癌症选自前列腺癌、肝癌、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰腺癌、胃部(胃)癌、宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、尿路上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、肉瘤(软组织肉瘤和骨肉瘤)、黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌、淋巴瘤(NHL或HL)、急性髓细胞白血病(AML)、T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、食道癌、梅克尔细胞癌、MSI-高癌症、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤和骨髓增生异常综合征(MDS)。在该方法的一些实施方案中，癌症选自癌症三阴性乳腺癌、胃部(胃)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、梅克尔细胞癌、MSI-高癌症、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤和骨髓增生异常综合征(MDS)。在该方法的一些实施方案中，癌症选自癌症三阴性乳腺癌、胃部(胃)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、梅克尔细胞癌和MSI-高癌症。在某些实施方案中，癌症包括BRAF突变(例如，BRAFV600E突变)、BRAF野生型突变、KRAS野生型突变或活化KRAS突变。癌症可能处于早期、中期或晚期。
在一个实施方案中，本文提供的组合进一步与化学疗法组合以治疗肺癌，例如非小细胞肺癌。在一个实施方案中，该组合与铂双重疗法一起用于治疗肺癌。在另一实施方案中，该组合用于治疗肾癌，例如肾细胞癌(RCC)(例如透明细胞肾细胞癌(CCRCC)或转移性RCC。该组合与另外的药剂联合施用，该另外的药剂包括以下中的一种或多种：基于免疫的策略(例如，白介素-2或干扰素-a)、靶向药剂(例如，VEGF抑制剂，如针对VEGF的单克隆抗体)；VEGF酪氨酸激酶抑制剂，如舒尼替尼、索拉非尼、阿昔替尼和帕唑帕尼；RNAi抑制剂)或VEGF信号传导的下游介质的抑制剂，例如哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)的抑制剂，例如依维莫司和替西罗莫司。用于组合治疗小细胞肺癌的合适的治疗剂的实例包括但不限于化学治疗药剂，例如依托泊苷、卡铂、顺铂、伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)、吉西他滨、脂质体SN-38、苯达莫司汀(bendamustine)、替莫唑胺(temozolomide)、贝洛替康(belotecan)、NK012、FR901228、夫拉平度(flavopiridol))；酪氨酸激酶抑制剂(例如，EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼、吉非替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗)；多激酶抑制剂(例如，索拉非尼、舒尼替尼)；VEGF抑制剂(例如贝伐珠单抗、凡德他尼)；癌症疫苗(例如GVAX)；Bcl-2抑制剂(例如，oblimersen钠、ABT-263)；蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米(Velcade)，NPI-0052)，紫杉醇或紫杉醇药剂；多西他赛；IGF-1受体抑制剂(例如AMG 479)；HGF/SF抑制剂(例如，AMG 102、MK-0646)；氯喹；极光激酶抑制剂(例如，MLN8237)；放射免疫疗法(例如TF2)；HSP90抑制剂(例如，他那霉素(tanespimycin)，STA-9090)；mTOR抑制剂(例如依维莫司)；Ep-CAM-/CD3-双特异性抗体(例如，MT110)；CK-2抑制剂(例如CX-4945)；HDAC抑制剂(例如，贝利司他(belinostat))；SMO拮抗剂(例如BMS 833923)；肽癌症疫苗和放射疗法(例如，强度调控放射治疗(IMRT)、低分割放射疗法(hypofractionated radiotherapy)、低氧引导放射疗法)、手术及其组合。
与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段或包含此类抗体的ADC一起使用的、与免疫治疗药剂组合的用于治疗非小细胞肺癌的另外的药剂的实例包括但不限于化学治疗药剂，例如长春瑞滨、顺铂、多西他赛、培美曲塞二钠(pemetrexed disodium)、依托泊苷、吉西他滨、卡铂、脂质体SN-38、TLK286、替莫唑胺、拓扑替康、培美曲塞二钠、阿扎胞苷、伊立替康、替加氟-吉美嘧啶-奥替拉西钾(tegafur-gimeracil-oteracil potassium)、沙帕他滨(sapacitabine))；酪氨酸激酶抑制剂(例如，EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼、吉非替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、PF-00299804、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、RO5083945)、MET抑制剂(例如，PF-02341066、ARQ 197)、PDK激酶抑制剂(例如，XL147、GDC-0941)、Raf/MEK双重激酶抑制剂(例如，R05126766)、PI3K/mTOR双重激酶抑制剂(例如XL765)、SRC抑制剂(例如达沙替尼)、双重抑制剂(例如，BIBW 2992、GSKl363089、ZD6474、AZD0530、AG-013736、拉帕替尼、MEHD7945A、利尼伐尼)、多激酶抑制剂(例如，索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼、AMG 706、XL184、MGCD265、BMS-690514、R935788)、VEGF抑制剂(例如，恩度(endostar)、内皮抑素(endostatin)、贝伐珠单抗、西地尼布、BIBF1120、阿昔替尼、替沃扎尼、AZD2171)、癌症疫苗(例如，BLP25脂质体疫苗、GVAX、重组DNA和表达L523S蛋白的腺病毒)、Bcl-2抑制剂(例如，oblimersen钠)、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米、卡非佐米、NPI-0052、MLN9708)、紫杉醇或紫杉醇药剂、多西他赛、IGF-1受体抑制剂(例如，西妥木单抗(cixutumumab)、MK-0646、OSI 906、CP-751,871、BIIB022)、羟氯喹、HSP90抑制剂(例如，坦螺旋霉素(tanespimycin)、STA-9090、AUY922、XL888)、mTOR抑制剂(例如，依维莫司、替西罗莫司、地磷莫司)、Ep-CAM-/CD3-双特异性抗体(例如，MT110)、CK-2抑制剂(例如，CX-4945)、HDAC抑制剂(例如，MS275、LBH589、伏立诺他(vorinostat)、丙戊酸、FR901228)、DHFR抑制剂(例如，普拉曲沙(pralatrexate))、类视黄醇(例如，贝沙罗汀(bexarotene)、维甲酸)、抗体-药物缀合物(例如，SGN-15)、二膦酸盐(例如，唑来膦酸)、癌症疫苗(例如，belagenpumatucel-L)、低分子量肝素(LMWH)(例如，替扎肝素(tinzaparin)、依诺肝素(enoxaparin))、GSK1572932A、褪黑素、乳铁蛋白(talactoferrin)、地美司钠(dimesna)、拓扑异构酶抑制剂(例如，氨柔比星(amrubicin)、依托泊苷、karenitecin)、奈非那韦(nelfinavir)、西仑吉肽(cilengitide)、ErbB3抑制剂(例如，MM-121、U3-1287)、生存素抑制剂(例如，YM155、LY2181308)、甲磺酸艾日布林(eribulin mesylate)、COX-2抑制剂(例如，塞来昔布(celecoxib))、聚乙二醇非格司亭(pegfilgrastim)、Polo样激酶1抑制剂(例如BI 6727)、TRAIL受体2(TR-2)激动剂(例如，CS-1008)、CNGRC肽-TNFα缀合物、二氯乙酸盐(DC A)、HGF抑制剂(例如，SCH 900105)、SAR240550、PPAR-γ激动剂(例如，CS-7017)、γ分泌酶抑制剂(例如，RO4929097)、表观遗传疗法(例如，5-氮杂胞苷)、硝酸甘油、MEK抑制剂(例如，AZD6244)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如，UCN-01)、胆固醇-Fusl、抗微管蛋白药剂(例如，E7389)、法尼基-OH-转移酶抑制剂(例如，洛那法尼(lonafarnib))、免疫毒素(例如，BB-10901、SSI(dsFv)PE38)、磺达肝癸钠、血管破坏剂(例如，AVE8062)、PD-L1抑制剂(例如，MDX-1105、MDX-1106)、β-葡聚糖、NGR-hTNF、EMD 521873、MEK抑制剂(例如GSKl 120212)、埃坡霉素(epothilone)类似物(例如伊沙匹隆(ixabepilone))、驱动蛋白纺锤体抑制剂(例如4SC-205)、端粒靶向剂(例如KML-001)、P70途径抑制剂(例如LY2584702)、AKT抑制剂(例如MK-2206)、血管生成抑制剂(例如，来那度胺)、Notch信号传导抑制剂(例如，OMP-21M18)、放射疗法、手术及其组合。用于组合治疗卵巢癌的合适的治疗剂的实例包括但不限于化学治疗药剂(例如，紫杉醇或紫杉醇药剂；多西他赛；卡铂；吉西他滨；多柔比星；拓扑替康；顺铂；伊立替康、TLK286、异环磷酰胺、奥拉帕尼(olaparib)、奥沙利铂(oxaliplatin)、美法仑、培美曲塞二钠、SJG-136、环磷酰胺、依托泊苷、地西他滨)；生长素释放肽拮抗剂(ghrelin antagonist)(例如，AEZS-130)、免疫疗法(例如，APC8024、奥戈伏单抗(oregovomab)、OPT-821)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，EGFR抑制剂(例如，埃罗替尼)、双重抑制剂(例如，E7080)、多激酶抑制剂(例如，AZD0530、JI-101、索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼)、ON 01910.Na)、VEGF抑制剂(例如，贝伐珠单抗、BIBF 1120、塞地拉尼、AZD2171)、PDGFR抑制剂(例如，IMC-3G3)、紫杉醇、拓扑异构酶抑制剂(例如，karenitecin、伊立替康)、HDAC抑制剂(例如，丙戊酸盐、伏立诺他)、叶酸受体抑制剂(例如，法来珠单抗)、血管生成素抑制剂(例如，AMG 386)、埃坡霉素类似物(例如，伊沙匹隆)、蛋白酶体抑制剂(例如，卡非佐米)、IGF-1受体抑制剂(例如，OSI 906、AMG 479)、PARP抑制剂(例如，维利帕尼(veliparib)、AG014699、伊尼帕尼(iniparib)、MK-4827)、极光激酶抑制剂(例如，MLN8237、ENMD-2076)、血管生成抑制剂(例如，来那度胺)、DHFR抑制剂(例如，普拉曲沙)、放射免疫治疗药剂(例如，Hu3S193)、他汀类(例如，洛伐他汀)、拓扑异构酶1抑制剂(例如，NKTR-102)、癌症疫苗(例如，p53合成长肽疫苗、自体OC-DC疫苗)、mTOR抑制剂(例如，替西罗莫司、依维莫司)、BCR/ABL抑制剂(例如，伊马替尼)、ET-A受体拮抗剂(例如，ZD4054)、TRAIL受体2(TR-2)激动剂(例如，CS-1008)、HGF/SF抑制剂(例如，AMG 102)、EGEN-001、Polo样激酶1抑制剂(例如，BI 6727)、γ-分泌酶抑制剂(例如，RO4929097)、Wee-1抑制剂(例如，MK-1775)、抗微管蛋白药剂(例如，长春瑞滨、E7389)、免疫毒素(例如，地尼白介素(denileukin diftitox))、SB-485232、血管破坏剂(例如，AVE8062)、整联蛋白抑制剂(例如，EMD 525797)、驱动蛋白-纺锤体抑制剂(例如，4SC-205)、瑞复美(revlimid)、HER2抑制剂(例如，MGAH22)、ErrB3抑制剂(例如，MM-121)、放射疗法；及其组合。
与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段或含有此类抗体的ADC一起使用的、与免疫治疗药剂组合的用于治疗骨髓瘤的另外的药剂的实例包括但不限于：化学治疗药剂或其他抗癌药剂(例如，沙利度胺类似物，例如，来那度胺)、HSCT(Cook，R.(2008)J Manag CarePharm.14(7增刊):19-25)、抗TIM3抗体(Hallett,WHD等人.(2011)/of American Societyfor Blood and Marrow Transplantation 17(8):1133-145)、肿瘤抗原脉冲的树突细胞、肿瘤细胞和树突细胞的融合体(例如，电融合体)、或用由恶性浆细胞产生的免疫球蛋白独特型接种(综述于Yi,Q.(2009)Cancer J.15(6):502-10中)。
与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段或含有此类抗体的ADC一起使用的、与免疫治疗药剂组合的用于治疗肾细胞癌或转移性肾细胞癌的另外的药剂的实例包括但不限于化学治疗药剂，其实例在上文中提供。
该抗PD-1抗体分子可以与以下中的一种或多种联合施用：基于免疫的策略(例如，白介素-2或干扰素-a)、靶向剂(例如，VEGF抑制剂，如针对VEGF的单克隆抗体，例如，贝伐珠单抗(Rini,B.I.等人,(2010)J.Clin.Oncol.28(13):2137-2143))；VEGF酪氨酸激酶抑制剂，如舒尼替尼、索拉非尼、阿昔替尼和帕唑帕尼(在Pal.S.K.等人.(2014)Clin.Advancesin Hematology&Oncology 12(2):90-99)中综述)；RNAi抑制剂)，或VEGF信号传导的下游介质的抑制剂，例如，哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)的抑制剂，例如，依维莫司和替西罗莫司(Hudes,G.等人.(2007)N.Engl.J.Med.356(22):2271-2281,Motzer,R.J.等人(2008)Lancet 372:449-456)。
根据本发明，与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段或含有此类抗体的ADC一起使用的、与免疫治疗药剂组合的用于治疗慢性髓性白血病(AML)的另外的药剂的实例包括但不限于化学治疗剂(例如，阿糖胞苷、羟基脲、氯法拉滨、美法仑、噻替派、氟达拉滨、白消安、依托泊苷、虫草素、喷司他丁、卡培他滨、阿扎胞苷、环磷酰胺、克拉屈滨、拓扑替康)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，BCR/ABL抑制剂(例如伊马替尼、尼洛替尼)、ON 01910.Na、双重抑制剂(例如，达沙替尼、博舒替尼)、多激酶抑制剂(例如，DCC-2036、泊那替尼、索拉非尼、舒尼替尼、RGB-286638))、干扰素α、类固醇、凋亡剂(例如，高三尖杉酯碱(omacetaxinemepesuccinat))、免疫疗法(例如，同种异体CD4+记忆TH1样T细胞/微粒结合的抗CD3/抗CD28、自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、AHN-12)、CD52靶向剂(例如，阿仑珠单抗)、HSP90抑制剂(例如，坦螺旋霉素、STA-9090、AUY922、XL888)、mTOR抑制剂(例如依维莫司)、SMO拮抗剂(例如BMS 833923)、核糖核苷酸还原酶抑制剂(例如3-AP)、JAK-2抑制剂(例如INCB018424)、羟氯喹、类视黄醇(例如芬维A胺(fenretinide))、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如UCN-01)、HDAC抑制剂(例如贝利司他、伏立诺他、JNJ-26481585)、PARP抑制剂(例如维利帕尼)、MDM2拮抗剂(例如RO5045337)、Aurora B激酶抑制剂(例如TAK-901)、放射免疫疗法(例如锕-225标记的抗CD33抗体HuM195)、hedgehog抑制剂(例如PF-04449913)、STAT3抑制剂(例如OPB-31121)、KB004、癌症疫苗(例如AG858)、骨髓移植、干细胞移植、放射疗法及其组合。
与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段或含有此类抗体的ADC一起使用的、与免疫治疗药剂组合的用于治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的另外的药剂的实例包括但不限于化学治疗药剂(例如，氟达拉滨、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、苯丁酸氮芥、苯达莫司汀、苯丁酸氮芥、白消安、吉西他滨、美法仑、喷司他丁、米托蒽醌、5-氮胞苷、培美曲塞二钠)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼)、BTK抑制剂(例如，PCI-32765)、多激酶抑制剂(例如，MGCD265、RGB-286638)、CD-20靶向剂(例如，利妥昔单抗、奥法木单抗、RO5072759、LFB-R603)、CD52靶向剂(例如，阿伦单抗)、泼尼松龙(prednisolone)、达泊汀α(darbepoetin alfa)、来那度胺、Bcl-2抑制剂(例如，ABT-263)、免疫疗法(例如，同种异体CD4+记忆Th1样T细胞/微粒结合的抗CD3/抗CD28、自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK))、HDAC抑制剂(例如，伏立诺他、丙戊酸、LBH589、JNJ-26481585、AR-42)、XIAP抑制剂(例如，AEG35156)、CD-74靶向剂(例如，米拉组单抗(milatuzumab))、mTOR抑制剂(例如，依维莫司)、AT-101、免疫毒素(例如，CAT-8015、抗Tac(Fv)-PE38(LMB-2))、CD37靶向剂(例如，TRU-016)、放射免疫疗法(例如，131-托西莫单抗(tositumomab))、羟氯喹、哌立福辛(perifosine)、SRC抑制剂(例如达沙替尼)、沙利度胺、PI3Kδ抑制剂(例如CAL-101)、类视黄醇(例如芬维A胺)、MDM2拮抗剂(例如RO5045337)、普乐沙福(plerixafo)、极光激酶抑制剂(例如MLN8237、TAK-901)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)、CD-19靶向剂(例如MEDI-551、MOR208)、MEK抑制剂(例如ABT-348)、JAK-2抑制剂(例如INCB018424)、低氧活化前药(例如TH-302)、紫杉醇或紫杉醇药剂、HSP90抑制剂、AKT抑制剂(例如MK2206)、HMG-CoA抑制剂(例如辛伐他汀(simvastatin))、GNKG186、放射疗法、骨髓移植、干细胞移植及其组合。
与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段或包含此类抗体的ADC一起使用的、与免疫治疗药剂组合的用于治疗急性淋巴细胞性白血病(ALL)的另外的药剂的实例包括但不限于化学治疗药剂(例如，泼尼松龙、地塞米松、长春新碱、天冬酰胺酶、柔红霉素、环磷酰胺、阿糖胞苷、依托泊苷、硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、氯法拉滨、脂质体安纳霉素、白消安、依托泊苷、卡培他滨、地西他滨、阿扎胞苷、拓扑替康、替莫唑胺)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，BCR/ABL抑制剂(例如，伊马替尼、尼洛替尼)、ON 01910.Na、多激酶抑制剂(例如索拉非尼)、CD-20靶向剂(例如利妥昔单抗)、CD52靶向剂(例如阿仑单抗)、HSP90抑制剂(例如STA-9090)、mTOR抑制剂(例如依维莫司、雷帕霉素)、JAK-2抑制剂(例如INCB018424)、HER2/neu受体抑制剂(例如曲妥珠单抗)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)、甲氨蝶呤、天冬酰胺酶、CD-22靶向剂(例如，依帕珠单抗(epratuzumab)、奥英妥珠单抗)、免疫疗法(例如，自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、AHN-12)、博纳吐单抗、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如，UCN-01)、CD45靶向剂(例如，BC8)、MDM2拮抗剂(例如，RO5045337)、免疫毒素(例如，CAT-8015、DT2219ARL)、HDAC抑制剂(例如，JNJ-26481585)、JVRS-100、紫杉醇或紫杉醇药剂、STAT3抑制剂(例如，OPB-31121)、PARP抑制剂(例如，维利帕尼)、EZN-2285、放射疗法、类固醇、骨髓移植、干细胞移植或其组合。
与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段或包含此类抗体的ADC一起使用的、与免疫治疗药剂组合的用于治疗急性髓性白血病(AML)的另外的药剂的实例包括但不限于化学治疗药剂(例如，阿糖胞苷、柔红霉素、伊达比星、氯法拉滨、地西他滨、vosaroxin、阿扎胞苷、氯法拉滨、利巴韦林、CPX-351、曲奥舒凡(treosulfan)、依西他滨(elacytarabine)、阿扎胞苷)、酪氨酸激酶抑制剂(例如BCR/ABL抑制剂(如伊马替尼、尼洛替尼)、ON 01910.Na、多激酶抑制剂(例如，米哚妥林(midostaurin)、SU 11248、奎扎替尼(quizartinib)、索拉非尼))、免疫毒素(例如，吉妥珠单抗奥唑米星)、DT388IL3融合蛋白、HDAC抑制剂(例如，伏立诺他、LBH589)、普乐沙福、mTOR抑制剂(例如，依维莫司)、SRC抑制剂(例如，达沙替尼)、HSP90抑制剂(例如，STA-9090)、类视黄醇(例如，贝沙罗汀)、极光激酶抑制剂(例如，BI811283)、JAK-2抑制剂(例如，INCB018424)、Polo样激酶抑制剂(例如，BI 6727)、cenersen、CD45靶向剂(例如，BC8)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如，UCN-01)、MDM2拮抗剂(例如，RO5045337)、mTOR抑制剂(例如，依维莫司)、LY573636-钠、ZRx-101、MLN4924、来那度胺、免疫疗法(例如，AHN-12)、二盐酸组胺、放射疗法、骨髓移植、干细胞移植及其组合。
与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段或包含此类抗体的ADC一起使用的、与免疫治疗药剂组合的用于治疗多发性骨髓瘤(MM)的另外的药剂的实例包括但不限于化学治疗药剂(例如，美法仑、氨磷汀(amifostine)、环磷酰胺、多柔比星、氯法拉滨、苯达莫司汀、氟达拉滨、阿霉素(adriamycin)、SyB L-0501)、沙利度胺、来那度胺、地塞米松、泼尼松、泊马度胺、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米、卡非佐米、MLN9708)、癌症疫苗(例如GVAX)、CD-40靶向剂(例如SGN-40、CHIR-12.12)、哌立福新、唑来膦酸、免疫疗法(例如MAGE-A3、NY-ESO-1、HuMax-CD38)、HDAC抑制剂(例如伏立诺他、LBH589、AR-42)、普立肽(aplidin)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如PD-0332991、dinaciclib)、三氧化二砷、CB3304、HSP90抑制剂(例如KW-2478)、酪氨酸激酶抑制剂(例如EGFR抑制剂(例如西妥昔单抗)、多激酶抑制剂(例如AT9283))、VEGF抑制剂(例如贝伐珠单抗)、普乐沙福r、MEK抑制剂(如AZD6244)、IPH2101、阿托伐他汀(atorvastatin)、免疫毒素(例如BB-10901)、NPI-0052、放射免疫治疗剂(如钇Y90替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan))、STAT3抑制剂(例如OPB-31121)、MLN4924、极光激酶抑制剂(例如ENMD-2076)、IMGN901、ACE-041、CK-2抑制剂(例如CX-4945)、放射疗法、骨髓移植、干细胞移植及其组合。
与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段或含有此类抗体的ADC一起使用的、与免疫治疗药剂组合的用于治疗前列腺癌的另外的药剂的实例包括但不限于化学治疗药剂(例如，多西他赛、卡铂、氟达拉滨)、阿比特龙、激素疗法(例如，氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特、醋酸环丙孕酮、酮康唑、氨基鲁米特、阿倍瑞克(abarelix)、地加瑞克(degarelix)、亮脯利特(leuprolide)、戈舍瑞林(goserelin)、曲普瑞林(triptorelin)、布舍瑞林(buserelin))、酪氨酸激酶抑制剂(例如，双重激酶抑制剂(例如，拉帕替尼)、多激酶抑制剂(例如，索拉非尼、舒尼替尼))、VEGF抑制剂(例如，贝伐珠单抗)、TAK-700、癌症疫苗(例如，BPX-101、PEP223)、来那度胺、TOK-001、IGF-1受体抑制剂(例如西妥木单抗)、TRC105、Aurora A激酶抑制剂(例如MLN8237)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)、OGX-011、放射免疫疗法(例如HuJ591-GS)、HDAC抑制剂(例如丙戊酸、SB939、LBH589)、羟氯喹、mTOR抑制剂(例如依维莫司)、多韦替尼乳酸盐(dovitinib lactate)、二吲哚甲烷、依法韦仑(efavirenz)、OGX-427、染料木素(genistein)、IMC-3G3、巴非替尼(bafetinib)、CP-675,206、放射疗法、手术或其组合。
VII.药物组合物
在一些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体、ADC、免疫治疗药剂可以被包含在单一或单独的组合物(例如，药物组合物)中。本公开的药物组合物可以进一步包括药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
如本文所用的术语“药物组合物”是指含有与药学上可接受的载体一起配制的本文所述的TM4SF1结合蛋白，并且在政府监管机构批准下作为用于治疗哺乳动物疾病的治疗方案的一部分制造或销售的组合物。例如，可以将药物组合物配制成以单位剂型(例如，片剂、胶囊、囊片、软胶囊(gel cap)或糖浆)口服施用；局部施用(例如，作为乳膏、凝胶、洗剂或软膏)；静脉内施用(例如，作为无颗粒栓子的无菌溶液并在适合静脉内使用的溶剂系统中)；或本文所述的其他任何制剂。
如本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指对于所治疗的哺乳动物(例如人)在生理学上可接受，同时维持与其一起施用的蛋白质的治疗性质的载体。一种示例性的药学上可接受的载体为生理盐水。其他生理学上可接受的载体及其制剂是本领域技术人员已知的，并且例如在通过引用并入本文的Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版,A.Gennaro,1990,Mack Publishing Company,Easton,PA)中描述。
在一些实施方案中，药物组合物被制备成溶液，在甘油、液体聚乙二醇中的分散体，及其在油中的任何组合，固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型，或它们的任何组合。
在一些实例中，药学上可接受的赋形剂是Handbook of PharmaceuticalExcipients,American Pharmaceutical Association(1986)中描述的赋形剂。合适的赋形剂的非限制性实例包括缓冲剂、防腐剂、稳定剂、黏合剂、压实剂、润滑剂、螯合剂、分散增强剂、崩解剂、调味剂、甜味剂、着色剂。
在一些实施方案中，赋形剂是缓冲剂。合适的缓冲剂的非限制性实例包括柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙和碳酸氢钙。在一些实施方案中，作为缓冲剂，碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化镁、乳酸镁、葡糖酸镁、氢氧化铝、柠檬酸钠、酒石酸钠、乙酸钠、碳酸钠、多磷酸钠、多磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钠、磷酸三钾、偏磷酸钾、氧化镁、氢氧化镁、碳酸镁、硅酸镁、乙酸钙、甘油磷酸钙、氯化钙、氢氧化钙和其他钙盐或其组合在本公开的药物组合物中使用。
在一些实施方案中，赋形剂包括防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例包括抗氧化剂，如α-生育酚和抗坏血酸盐，以及抗微生物剂，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚。在一些实例中，抗氧化剂进一步包括但不限于EDTA、柠檬酸、抗坏血酸、丁羟甲苯(BHT)、丁羟茴醚(BHA)、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽、没食子酸丙酯、半胱氨酸、甲硫氨酸、乙醇和N-乙酰半胱氨酸。在一些情况下，防腐剂包括有效霉素A、TL-3、原钒酸钠、氟化钠、N-a-甲苯磺酰基-Phe-氯甲基酮、N-a-甲苯磺酰基-Lys-氯甲基酮、抑肽酶、苯甲基磺酰氟、氟磷酸二异丙酯、激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、粒酶抑制剂、细胞黏附抑制剂、细胞分裂抑制剂、细胞周期抑制剂、脂质信号传导抑制剂、蛋白酶抑制剂、还原剂、烷化剂、抗微生物剂、氧化酶抑制剂或其他抑制剂。
在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物包含黏合剂作为赋形剂。合适的黏合剂的非限制性实例包括淀粉、预胶化淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯基噁唑烷酮、聚乙烯醇、C12-C18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖类、寡糖及其组合。在一些实例中，在药物制剂中使用的黏合剂选自淀粉，如马铃薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉；糖，如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖糊精；天然树胶和合成树胶；明胶；纤维素衍生物，如微晶纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)；聚乙二醇(PEG)；蜡类；碳酸钙；磷酸钙；醇类，如山梨醇、木糖醇、甘露醇，以及水，或其任何组合。
在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物包含润滑剂作为赋形剂。合适的润滑剂的非限制性实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、sterotex、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁和轻质矿物油。在一些实施方案中，在药物制剂中使用的润滑剂选自金属硬脂酸盐(如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸铝)、脂肪酸酯(如硬脂酰富马酸钠)、脂肪酸(如硬脂酸)、脂肪醇、山萮酸甘油酯、矿物油、石蜡、氢化植物油、亮氨酸、聚乙二醇(PEG)、金属十二烷基硫酸盐(如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁)、氯化钠、苯甲酸钠、乙酸钠和滑石，或它们的组合。
在一些实施方案中，药物制剂包含分散增强剂作为赋形剂。在一些实例中，合适的分散剂的非限制性实例包括淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、膨润土、纯化木纤维素、羟基乙酸淀粉钠、同晶硅酸盐(isoamorphous silicate)和微晶纤维素作为高HLB乳化剂表面活性剂。
在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物包含崩解剂作为赋形剂。在一些实施方案中，崩解剂是非泡腾崩解剂。合适的非泡腾崩解剂的非限制性实例包括淀粉如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预胶化和改性淀粉、甜味剂、黏土如膨润土、微晶纤维素、藻酸盐、羟基乙酸淀粉钠、树胶如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐胶、果胶和黄蓍胶。在一些实施方案中，崩解剂是泡腾崩解剂。合适的泡腾崩解剂的非限制性实例包括碳酸氢钠与柠檬酸的组合，以及碳酸氢钠与酒石酸的组合。
在一些实施方案中，赋形剂包括调味剂。在一些实例中，掺入外层的调味剂选自合成调味油和调味芳香剂；天然油；植物、叶、花和果实的提取物；及其组合。在一些实施方案中，调味剂可选自肉桂油；冬青油；薄荷油；三叶草油；干草油；茴香油；桉；香草；柑橘油，如柠檬油、橙油、葡萄油和葡萄柚油；以及水果香精，包括苹果、桃、梨、草莓、覆盆子、樱桃、李子、菠萝和杏的香精。
在一些实施方案中，赋形剂包括甜味剂。合适的甜味剂的非限制性实例包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖及其混合物(当不用作载体时)；糖精及其各种盐，如钠盐；二肽甜味剂，如阿斯巴甜；二氢查尔酮化合物、甘草甜素；甜叶菊(Stevia Rebaudiana)(甜菊苷)；蔗糖的氯衍生物如三氯蔗糖；以及糖醇如山梨醇、甘露醇、木糖醇等。
在一些情况下，如本文所述的药物组合物包含着色剂。合适的着色剂的非限制性实例可包括食品、药物和化妆品着色剂(FD&C)，药物和化妆品着色剂(D&C)，以及外用药物和化妆品着色剂(Ext.D&C)。着色剂可用作染料或其相应的色淀。
在一些情况下，如本文所述的药物组合物包含螯合剂。在一些情况下，螯合剂是杀真菌螯合剂。实例包括但不限于：乙二胺-N,N,N’,N’-四乙酸(EDTA)；EDTA的二钠、三钠、四钠、二钾、三钾、二锂和二铵盐；EDTA的钡、钙、钴、铜、镝、铕、铁、铟、镧、镁、锰、镍、钐、锶或锌螯合物；反式-1,2-环己烷-N,N,N’,N’-四乙酸一水合物；N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸；1,3-二氨基-2-羟基丙烷-N,N,N’,N’-四乙酸；1,3-二氨基丙烷-N,N,N’,N’-四乙酸；乙二胺-N,N’-二乙酸；乙二胺-N,N’-二丙酸二盐酸盐；乙二胺-N,N’-双(亚甲基膦酸)半水合物；N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N’,N’-三乙酸；乙二胺-N,N,N’,N’-四(亚甲基膦酸)；O,O’-双(2-氨基乙基)乙二醇-N,N,N’,N’-四乙酸；N,N-双(2-羟基苄基)乙二胺-N,N-二乙酸；1,6-六亚甲基二胺-N,N,N’,N’-四乙酸；N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸；亚氨基二乙酸；1,2-二氨基丙烷-N,N,N’,N’-四乙酸；次氮基三乙酸；次氮基三丙酸；次氮基三(亚甲基磷酸)的三钠盐；7,19,30-三氧杂-1,4,10,13,16,22,27,33-八氮杂双环[11,11,11]三十五烷六氢溴化物；或三乙烯四胺-N,N,N’,N”,N’”,N’”-六乙酸。
还预期了一种组合物，该组合物包含一种或多种其他抗微生物剂或抗真菌剂，例如，多烯如两性霉素B、两性霉素B脂质复合物(ABCD)、脂质体两性霉素B(L-AMB)和脂质体制霉菌素、唑类和三唑类如伏立康唑、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、泊沙康唑等；葡聚糖合酶抑制剂如卡泊芬净、米卡芬净(FK463)和V-棘白菌素(LY303366)；灰黄霉素；烯丙胺类如特比萘芬；氟胞嘧啶或其他抗真菌剂，包括本文所述的那些。另外，预期肽可以与局部抗真菌剂如环吡酮胺、卤普罗近、托萘酯、十一烯酸酯、局部制霉菌素、阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬和其他局部药剂组合。在一些情况下，药物组合物包含额外的药剂。在一些情况下，额外的药剂以治疗有效量存在于药物组合物中。
在普通的储存和使用条件下，如本文所述的药物组合物包含防腐剂以防止微生物的生长。在某些实例中，如本文所述的药物组合物不包含防腐剂。适合注射使用的药物形式包括无菌的水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。药物组合物包含载体，该载体是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和/或植物油，或其任何组合。例如，通过使用包衣，如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需要的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来阻止微生物的作用。在许多情况下，包含等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以引起可注射组合物的延长吸收。
例如，对于在水溶液中的肠胃外施用，如有必要，将液体剂型适当地缓冲，并且用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。液体剂型特别适用于静脉内、肌肉内、皮下、瘤内和腹膜内施用。在这方面，根据本公开内容，可采用的无菌水性介质是本领域技术人员已知的。例如，在某些情况下，将一个剂量溶解于1mL至20mL的等渗NaCl溶液中，并且添加至100mL至1000mL的流体(例如，碳酸氢钠缓冲盐水)中，或在建议的输注部位处注射。
在某些实施方案中，通过将所需量的免疫治疗药剂与以上列举的各种其他成分(如果需要)一起并入合适的溶剂中，然后过滤除菌，来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散体，该无菌媒介物含有基础分散介质和来自上文列举的那些成分中的所需其他成分。在一些情况下，本文公开的组合物被配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括，例如，酸加成盐(通过蛋白质的游离氨基形成)，并且该盐是用无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的。在一些情况下，通过游离羧基形成的盐衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。在一些实施方案中，在配制后，药物组合物以与剂量制剂相容的方式和治疗有效的量施用。
在某些实施方案中，本公开的药物组合物包含药学上可接受的载剂。如本文所用的，“药学上可接受的”包括不干扰活性成分的生物活性的有效性并且/或者对其所施用至的患者无毒的任何载体。合适的药物载体的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液、各种类型的润湿剂和无菌溶液。药学上相容的载体的其他非限制性实例可包括凝胶、生物可吸收的基质材料、含有免疫治疗药剂的植入元件，或其他任何合适的媒介物、递送或分配工具或材料。这样的载体例如通过常规方法配制，并且以有效量施用于对象。
VIII.试剂盒
在一些实施方案中，本公开提供了包含本公开的组合物(例如，药物组合物)(例如，包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段、或含有此类抗体的ADC和免疫治疗药剂的组合物)的试剂盒。试剂盒包括关于允许临床医师(例如医师或护士)向对象施用其中含有的组合物以治疗与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)的说明书。
在某些实施方案中，试剂盒包括含有有效量的本公开的抗体的单剂量药物组合物的包装。任选地，试剂盒中可包括施用药物组合物所必需的仪器或装置。例如，本公开的试剂盒可提供一个或多个含有有效量的本公开的疫苗、载体、稳定化三聚体或优化的病毒多肽的预填充注射器。此外，试剂盒还可包括额外的组成部分，诸如关于患有与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)的对象使用一种或多种含有本公开的TM4SF1结合蛋白或多核苷酸的药物组合物的施用时间表的说明书。
实施例
实施例1：抗TM4SF1抗体的表征
体外结合至细胞系
在不同的鼠细胞系上使用基于细胞的流式细胞术测定来评估示例性的包括含有YTEC突变的人IgG1恒定区的抗TM4SF1抗体1的抗原结合：MS1(鼠胰岛内皮衍生细胞系)、CT26(鼠结肠癌衍生细胞系)和B16F10(鼠黑素瘤衍生细胞系)。
结合的EC50值在图1的图例中示出。示例性抗体1的最大结合表明，TM4SF1在MS1中的表达最大，其次是CT26，然后是B16F10。
体外细胞增殖抑制测定
分别在培养的小鼠(MS1、CT26、B16F10)和人(MiaPaCa2、A549、SKOV3和HUVEC)细胞中评估了包含药物(美登素)和示例性抗体1或示例性抗体2的抗体药物缀合物(药物与抗体比(DAR)为约2)的效果。示例性抗体1和示例性抗体2两者都包含具有YTEC突变的人IgG1恒定区。在第5天评估细胞存活力之前，将细胞用抗体药物缀合物处理温育5天。
表1显示了来自在不同细胞系上，经由接头1(L1)缀合至美登素有效负载的示例性抗体1(示例性抗体1-L1)、经由接头1(L1)或经由其他接头缀合至美登素有效负载的示例性抗体2(示例性抗体2-L1)的细胞增殖抑制活性的代表性EC50值。共同地：经由示例性抗体1-L1的MS1(0.05nM)、B16F10(0.12nM)和CT26(无杀伤)，以及经由示例性抗体2-L1的MiaPaCa2(0.04nM)、A549(0.06nM)、SKOV3(0.81nM)和HUVEC(0.10nM)。尽管TM4SF1在CT26细胞中高度表达，但该细胞对示例性抗体1-L1抗体介导的杀伤具有抗性。
表1：仅来自小鼠来源的示例性抗体1靶细胞。相反，示例性抗体2仅靶向来自人来源的细胞。产生了示例性抗体的变体，以产生不同的抗体，这些抗体是加帽的抗体和裸抗体或者经由七种不同的接头与美登素有效负载缀合。示例性抗体1-L1 ADC随后用于小鼠中所有免疫肿瘤学(IO)相关研究。
表1
符号“-”：无杀伤活性
上述数据代表了来自缀合至美登素有效负载的七种不同接头的EC50。
接头1：PEG4-美登素；BA-PEG4-N-甲基-丙氨酸-美登素
接头2：PEG4Ahx-美登素；BA-PEG4-Ahx-N-甲基-丙氨酸-美登素
接头3：Glc-美登素；BA-葡萄糖醛酸苷-N-甲基-丙氨酸-美登素
接头4：Glu(tb)PEG4-Glc-美登素；BA-Glu-(Ot-丁基)-葡萄糖醛酸苷-N-甲基-甘氨酸-N-甲基-丙氨酸-美登素
接头5：Glu-tb-美登素；BA-PEG4-D-Glu-Ot-丁基-Ahx-N-甲基-丙氨酸-美登素
接头6：GluAhx-美登素；BA-PEG4-D-Glu-Ahx-N-甲基-丙氨酸-美登素
接头7：PEG4Glu-美登素；BA-PEG4-D-Glu-N-甲基-丙氨酸-美登素
实施例2：使用抗TM4SF1 ADC和抗小鼠PD-1抗体的肿瘤消退
对于该研究，使用细胞衍生的同基因小鼠模型来评估包含抗TM4SF1 ADC(示例性抗体1-L1)和抗PD-1抗体组合的治疗的效果。评估的同基因模型是C57BL/6小鼠中的B16F10衍生肿瘤(图2A)和BALB/c小鼠中的CT26衍生肿瘤模型(图2B)。
在图2A中，将B16F10 C57BL/6同基因模型分成多个治疗组，以评估在不同治疗的存在下的肿瘤体积(mm3)：1)媒介物(对照)，2)抗小鼠PD-1抗体(BioXcell，克隆RMP1-14，10mg/kg)，3)示例性抗体1-L1(20mg/kg)，以及4)示例性抗体1-L1(20mg/kg)+抗小鼠PD1(10mg/kg)。示例性抗体1-L1在研究开始时被施用一次。抗小鼠PD1抗体在治疗后第0、5和10天被施用三次。在治疗过程中，在第4、6、9、13和15天测量肿瘤体积。在10天内，与媒介物对照(治疗1)相比，使用单独的抗小鼠PD-1抗体的治疗(治疗2)没有抑制肿瘤生长。含有20mg/kg示例性抗体1-L1的治疗延缓了肿瘤生长(治疗3)，并且在抗小鼠PD-1抗体的存在下显示出协同的肿瘤消退活性(治疗4)。
在图2B中，将CT26 BALB/c同基因模型分成多个治疗组，以评估在不同治疗的存在下的肿瘤体积(mm3)：1)媒介物(对照)，2)抗小鼠PD-1抗体(BioXcell，克隆RMP1-14，10mg/kg)，3)示例性抗体1-L1(20mg/kg)，以及4)示例性抗体示例性抗体1-L1(20mg/kg)+抗小鼠PD-1抗体(10mg/kg)。类似于图2A，抗TM4SF1抗体治疗在治疗开始时被施用一次，而抗小鼠PD-1抗体注射在第0、7和14天被施用3次。仅用抗小鼠PD-1抗体治疗导致肿瘤进展类似于媒介物对照，并且到第14天处死动物。与媒介物对照相比，使用20mg/kg的示例性抗体1-L1治疗小鼠提高了肿瘤消退潜力，然而在治疗开始后28天，添加施用抗小鼠PD-1抗体进一步增加了对肿瘤生长的抑制。
图2A和2B显示，测试的ADC(示例性抗体1-L1)分别在B16F10(C57BL/6小鼠)和CT26(BALB/c小鼠)同基因肿瘤模型中具有与抗小鼠PD-1抗体的协同肿瘤消退效应。这种协同的肿瘤生长抑制结果表明，经由示例性抗体1-L1的肿瘤血管靶向可能通过促进白细胞经由肿瘤血管伤口浸润到肿瘤中而激活肿瘤中的免疫应答。这种肿瘤血管靶向与免疫检查点阻断方法的组合方法被预期提供巨大的机会，以将许多不同类型的实体瘤从免疫无活性状态转变为活性状态。
可能由于纺锤体检查点突变，一些肿瘤细胞系如CT26对美登素有效负载具有抗性。因此，在CT26同基因肿瘤中用示例性抗体1-L1抗体的肿瘤消退结果(图2B)仅经由靶向肿瘤血管。在抗小鼠PD-1免疫阻断抗体的存在下，此类肿瘤消退被进一步改善。
实施例4：抗TM4SF1抗体的表征
体外结合至细胞系
在不同的鼠细胞系上使用基于细胞的流式细胞术测定，来评估包括含有YTEC突变的人IgG1恒定区的示例性抗TM4SF1抗体药物缀合物(美登素)的抗原结合：MS1(鼠胰岛内皮衍生细胞系)、CT26(鼠结肠癌衍生细胞系)、B16F10(鼠黑色素瘤衍生细胞系)和LLC(鼠肺癌)。RENCA细胞系用作阴性对照，因为不存在TM4SF1的表达。
结合的EC50值在图3的图例中示出。示例性抗体1的最大结合表明TM4SF1在MS1中的表达最大，其次是CT26，接着是B16F10，然后是LLC。Renca不表达TM4SF1。通常，在基于细胞的测定中，示例性抗体1组中抗体的结合亲和力为3-7nM EC50。
体外细胞增殖抑制测定
分别在培养的小鼠(MS1、CT26、B16F10)和人(MiaPaCa2、A549、SKOV3和HUVEC)细胞中评估了包含药物(美登素)和示例性抗体1或示例性抗体2的抗体药物缀合物(药物与抗体比(DAR)为约2)的效果。示例性抗体1和示例性抗体2两者都包含具有YTEC突变的人IgG1恒定区。在第5天评估细胞存活力之前，将细胞用抗体药物缀合物处理温育4天。
表3显示了来自在不同细胞系上，经由接头1(L1)缀合至美登素有效负载的示例性抗体1(示例性抗体1-L1)、经由接头1(L1)或经由其他接头缀合至美登素有效负载的示例性抗体2(示例性抗体2-L1)的细胞增殖抑制活性的代表性EC50值。共同地：经由示例性抗体1-L1的MS1(0.05nM)、B16F10(0.12nM)、RENCA(无杀伤)和CT26(无杀伤)，以及经由示例性抗体2-L1的MiaPaCa2(0.04nM)、A549(0.06nM)、SKOV3(0.81nM)和HUVEC(0.10nM)。尽管TM4SF1在CT26细胞中高度表达，但该细胞对示例性抗体1-L1抗体介导的杀伤具有抗性。
表3：
符号“-”：无杀伤活性
上述数据代表了来自缀合至美登素有效负载的七种不同接头的EC50。
接头1：PEG4-美登素；BA-PEG4-N-甲基-丙氨酸-美登素
接头2：PEG4Ahx-美登素；BA-PEG4-Ahx-N-甲基-丙氨酸-美登素接头3：Glc-美登素；BA-葡萄糖醛酸苷-N-甲基-丙氨酸-美登素
接头4：Glu(tb)PEG4-Glc-美登素；BA-Glu-(Ot-丁基)-葡萄糖醛酸苷-N-甲基-甘氨酸-N-甲基-丙氨酸-美登素
接头5：Glu-tb-美登素；BA-PEG4-D-Glu-Ot-丁基-Ahx-N-甲基-丙氨酸-美登素
接头6：GluAhx-美登素；BA-PEG4-D-Glu-Ahx-N-甲基-丙氨酸-美登素
接头7：PEG4Glu-美登素；BA-PEG4-D-Glu-N-甲基-丙氨酸-美登素
实施例5：在CT26同基因模型中使用抗TM4SF1 ADC和抗小鼠CTLA-4抗体的肿瘤消退
对于该研究，使用细胞衍生的同基因CT26小鼠模型来评估包含抗TM4SF1 ADC(示例性抗体1-L1)和/或抗小鼠CTLA-4抗体(克隆9H10；BioXCell)组合的治疗的效果。
BALB/c小鼠中的CT26小鼠结肠癌衍生肿瘤模型(图4A-4H)。在图4A-4D中，施用0mpk的抗TM4SF1 ADC(示例性抗体1-L1)，并且分别施用0、2.5、5和10mpk的抗小鼠CTLA-4抗体。图4E-4H示出了施用20mpk的抗TM4SF1 ADC(示例性抗体1-L1)的同基因模型，并且分别施用0、2.5、5和10mpk的抗小鼠CTLA-4抗体。所有剂量在研究的第0天施用一次。
在图4A中，将CT26 BALB/c同基因模型(n＝40)分成2个治疗组，以评估在不同治疗的存在下的肿瘤体积(mm3)：1)媒介物(对照)和2)同种型匹配对照(IS-Ctl)，它们在研究的第0天被施用一次。在治疗过程中，每周测量肿瘤体积2-3次，如图4A中的点所示。两种治疗都没有导致任何肿瘤消退。在图4B中，第三个CT26 BALB/c治疗组(n＝5)，其中抗小鼠CTLA-4抗体在研究的第0天以2.5mpk施用一次。仅用抗小鼠CTLA-4抗体治疗导致一定水平的肿瘤生长抑制，其中1只动物到第14天经历了无肿瘤(TF)(20％TF)，并且持续至少直到第50天之后。在图4C中，CT26 BALB/c治疗组(n＝15)，其中抗小鼠CTLA-4抗体在研究的第0天以5mpk被施用一次。用5mpk的抗小鼠CTLA-4抗体治疗比单独的2.5mpk导致明显更好的肿瘤生长抑制，其中2只小鼠到第21天经历了无肿瘤(13.3％TF)，并且持续至少直到第50天之后。在图4D中，CT26 BALB/c治疗组(n＝19)，其中抗小鼠CTLA-4抗体在研究的第0天以10mpk被施用一次。与2.5或5mpk组相比，用10mpk的抗小鼠CTLA-4抗体治疗导致了最好的肿瘤生长抑制，其中4只小鼠经历了无肿瘤。到第21天，4只动物经历了无肿瘤(21％TF)，并且持续至少直到第55天之后。
在图4E中，CT26 BALB/c治疗组(n＝35)，其中示例性抗体1-L1抗体在研究的第0天以20mpk被施用。仅用抗TM4SF1抗体治疗导致肿瘤比图4A的对照组延迟发展约一周。仅用抗TM4SF1抗体治疗导致没有动物表现出无肿瘤结果，并且由于肿瘤负荷而需要从研究中移除。在图4F-4H中，添加了第二个治疗组，其由用抗TM4SF1抗体(20mpk)和抗小鼠CTLA-4抗体(分别为2.5、5和10mpk)治疗的小鼠组成。在图4F中，来自示例性抗TM4SF1 ADC/抗小鼠CTLA-4组合治疗组(2.5mpk，n＝5)的一只小鼠表现出无肿瘤(20％TF)，而其他小鼠表现出肿瘤生长，并且由于肿瘤负荷而需要从研究中移除。在图4G中，来自示例性抗TM4SF1 ADC/抗小鼠CTLA-4组合治疗组(5mpk，n＝21)的15只小鼠表现出无肿瘤(71.4％TF)，而6只其他小鼠表现出随时间推移的肿瘤生长，并且由于肿瘤负荷而需要从研究中移除。在图4H中，来自示例性抗TM4SF1 ADC/抗小鼠CTLA-4组合治疗组(10mpk，n＝15)的7只小鼠表现出无肿瘤(46.7％TF)，而其他8只小鼠表现出随时间推移的肿瘤生长，并且由于肿瘤负荷而需要从研究中移除。总之，我们的研究表明，用血管靶向细胞毒性抗TM4SF1 ADC组合抗CTLA-4抗体的阻断治疗小鼠同基因肿瘤模型产生了有效的抗肿瘤免疫激活。在大多数具有CT26肿瘤的小鼠中，抗TM4SF1 ADC与抗CTLA-4抗体的单一组合治疗消除了肿瘤；相反，在仅用抗CTLA-4抗体治疗的对照小鼠中，大多数小鼠经历了肿瘤生长，并且由于肿瘤负荷而需要被处死。具体而言，在分别用2.5mpk、5mpk和10mpk的抗CTLA-4抗体治疗下，20％、13.3％和21％的具有CT26肿瘤的BALB/C小鼠在60-70天的评估时间内变成无肿瘤；而在相同剂量的抗CTLA-4抗体与20mpk抗TM4SF1 ADC组合的情况下，相应的组中分别有20％、71.4％和46.7％的小鼠在60-70天的评估期内达到无肿瘤状态。这种抗肿瘤免疫的显著增强可能是通过破坏肿瘤内皮，将免疫学上冷的“肿瘤伤口”转变为免疫学上温暖且密切监控的“慢性伤口”，在5mpk抗CTLA-4抗体下将无肿瘤级分从13.3％增加到71.4％的原因。
CT26再激发
为了确定经由免疫检查点抑制剂抗CTLA-4抗体的治疗获得的无肿瘤(TF)小鼠是否为长期效果，对图4A-4H中在初始给药后近60至70天不再显示CT26肿瘤的小鼠再次注射CT26肿瘤细胞。例如，图5A中使用的CTLA-4小鼠取自在相应的处理条件下显示TF的小鼠(图4B)。在每个再激发条件下，使用2组对照小鼠：1)8周龄的BALB/c和2)退役的BALB/c繁殖者(约7-8月龄)。在第0天，对照和无肿瘤小鼠中的每一个在它们的上腹部左侧皮下接受一百万个CT26肿瘤细胞，该上腹部左侧与图4B中注射原始肿瘤细胞的一侧相反。结果显示，除了图5C中的一个异常值之外，所有无肿瘤小鼠持续表现为无肿瘤。相比之下，在两个对照组小鼠中，肿瘤生长迅速，并且在引入肿瘤细胞后20天内，由于肿瘤负荷，需要将其处死。具体而言，在再激发后表现出TF的小鼠是图5A(100％，2/2)、图5B(100％，4/4)、图5C(93.3％，1/15)和图5D(100％，7/7)。因此，这项目前正在进行的研究表明，当将CT26肿瘤细胞重新引入已经形成T细胞记忆以消除CT26肿瘤细胞的相同小鼠中时，CT26肿瘤细胞不能生长成肿瘤。
该目前正在进行的研究的结果(图5C)显示，无肿瘤组中15只小鼠中仅有一只显示肿瘤再生长。这表明，一旦T细胞记忆在免疫检查点抗小鼠CTLA-4抗体的帮助下在小鼠中正确形成并且变得无肿瘤，小鼠可以在肿瘤细胞稍后被再激发时根除肿瘤细胞。我们的抗TM4SF1抗体1-L1与5mpk免疫检查点抗小鼠CTLA-4抗体的联合疗法增强了小鼠形成记忆性T细胞并且成为无肿瘤的能力。
实施例6：在Renca同基因模型中使用抗TM4SF1 ADC和抗小鼠CTLA-4抗体的肿瘤消退
对于该研究，使用细胞衍生的同基因Renca小鼠模型来评估包含抗TM4SF1 ADC(示例性抗体1-L1)和/或抗小鼠CTLA-4抗体(克隆9H10；BioXCell)组合的治疗的效果。
评估的同基因模型是BALB/c小鼠中的Renca衍生的肿瘤模型(图6A-6F)。在图6A-6C中，施用0mpk的抗TM4SF1 ADC(示例性抗体1-L1)，并且分别以0、5和10mpk施用抗小鼠CTLA-4抗体。图6D-6F示出了施用20mpk的抗TM4SF1 ADC(示例性抗体1-L1)以及分别以0、2.5、5和10mpk施用的抗小鼠CTLA-4抗体的组合的同基因模型。所有剂量均在研究的第0天被施用。
在图6A中，将Renca BALB/c同基因模型(n＝5)分成2个治疗组，以评估在不同治疗的存在下的肿瘤体积(mm3)：1)媒介物(对照)和2)同种型匹配对照(IS-Ctl)，它们在研究开始时施用一次。在治疗过程中，定期测量肿瘤体积，如点所指示的。两种治疗都没有引起任何肿瘤消退。
在图6B中，第三个Renca BALB/c治疗组(n＝5)，其中以5mpk施用抗小鼠CTLA-4抗体。在治疗开始时施用一次抗小鼠CTLA-4抗体治疗。仅用抗小鼠CTLA-4抗体治疗导致肿瘤进展类似于无治疗对照，其中1只动物到第14天显示无肿瘤(20％TF)，并且持续至少直到第70天之后。在图6C中，Renca BALB/c治疗组(n＝5)，其中以10mpk施用抗小鼠CTLA-4抗体。在治疗开始时施用一次抗小鼠CTLA-4抗体治疗。仅用抗小鼠CTLA-4抗体治疗导致肿瘤比未治疗对照组进展更慢，其中1只小鼠到第14天经历了无肿瘤(20％TF)，并且持续至少直到第70天之后。在图6D中，Renca BALB/c治疗组(n＝5)，其中在研究开始时以20mpk施用抗TM4SF1ADC。在图6E中，Renca BALB/c治疗组(n＝5)，其中在研究的第0天以20mpk施用示例性抗体1-L1抗体组合抗小鼠CTLA-4抗体(5mpk)。组合治疗导致肿瘤生长更慢，其中80％的小鼠显示无肿瘤，一些小鼠在至少70天后保留TF。在图6F中，Renca BALB/c治疗组(n＝5)，其中在研究的第0天以20mpk施用示例性抗体1-L1抗体组合抗小鼠CTLA-4抗体(10mpk)。组合治疗导致肿瘤生长更慢，其中在至少70天的观察期的整个过程期间，20％的小鼠显示无肿瘤。与CT26肿瘤模型的研究结果相似，Renca肿瘤模型的研究表明，用血管靶向的细胞毒性抗TM4SF1 ADC组合5mpk的CTLA-4的抗体阻断治疗小鼠同基因肿瘤模型产生了有效的抗肿瘤免疫激活。相反，对于仅用抗CTLA-4抗体治疗的对照小鼠，大多数小鼠经历了肿瘤生长，并且由于肿瘤负荷而需要被处死。此外，如在CT26肿瘤模型中观察到的，抗TM4SF1 ADC与5mpkCTLA-4抗体的联合疗法显示出比10mpk CTLA-4抗体治疗更好的肿瘤消退结果。过量(>5mpk)剂量的抗CTLA-4抗体阻碍抗肿瘤免疫的常见观察结果可能通过免疫细胞向正常组织转向来解释，因为CTLA-4通常用来抑制自身免疫。在临床上，CTLA-4抗体受到自身免疫副作用的剂量限制。例如，在伊匹单抗的情况下，首先标签列出的警告和注意事项是免疫介导的肝炎、免疫介导的内分泌疾病、免疫介导的肺炎、免疫介导的肾炎和免疫介导的脑炎。如果通过血管靶向的细胞毒性抗TM4SF1 ADC的抗肿瘤免疫的激活使得CTLA-4抗体在较低剂量下有效，低于产生这些自身免疫毒性的剂量阈值，那么CTLA-4抗体的治疗范围可以显著提高，并且达到疗效的患者数量可以大大增加。
Renca再激发
为了确定完全肿瘤消退在肿瘤再激发期间是否可以持续，用Renca再激发在图6A-6F中初始给药后近60至70天表现出无肿瘤(TF)的小鼠。例如，图7A中使用的CTLA4小鼠取自在相应的治疗条件下显示TF的小鼠(图6B)。为了使小鼠年龄与无肿瘤小鼠相匹配，使用7-8个月大的退役的BALB/c繁殖者作为对照小鼠。在第0天，将一百万个Renca肿瘤细胞皮下注射到每只小鼠的上腹部，并且随时间追踪肿瘤生长。如在CT26肿瘤再激发中所看到的，所有无肿瘤小鼠在Renca肿瘤模型中持续表现为无肿瘤。相反，在对照组小鼠中，肿瘤生长迅速，并且在引入肿瘤细胞之后20天内，由于肿瘤负荷需要将小鼠处死。具体地，在Renca肿瘤细胞再激发之后表现出TF的小鼠是图7A(100％，1/1)、图7B(100％，1/1)、图7C(100％，4/4)和图7D(100％，1/1)。因此，我们的研究表明，在BALB/c小鼠的CT26和Renca肿瘤模型中，在抗TM4SF1 ADC与抗CTLA-4抗体的单一组合治疗后，许多BALB/c小鼠不仅通过消除初始肿瘤而且还通过建立长期T细胞记忆变得无肿瘤，并且有效地消除了重新引入的肿瘤细胞，而无需再次治疗。
实施例7：在B16F10同基因模型中使用抗TM4SF1 ADC和抗小鼠CTLA-4抗体的肿瘤消退
对于该研究，使用细胞衍生的同基因B16F10小鼠模型来评估包含抗TM4SF1 ADC(示例性抗体1-L1)和/或抗小鼠CTLA-4抗体(9H10)组合的治疗的效果。
C57BL/6小鼠中的B16F10小鼠黑色素瘤细胞衍生的肿瘤模型(图8A-8H)。在图8A-8D中，施用0mpk的抗TM4SF1 ADC(示例性抗体1-L1)，并且分别以0、2.5、5和10mpk施用抗小鼠CTLA-4抗体。图8E-8H示出了施用20mpk的抗TM4SF1 ADC(示例性抗体1-L1)的同基因模型，并且分别以0、2.5、5和10mpk施用抗小鼠CTLA-4抗体。所有剂量均在研究的第0天施用。
在图8A中，将B16F10 C57BL/6同基因模型(n＝5)分成2个治疗组，以评估在不同治疗的存在下的肿瘤体积(mm3)：1)媒介物(对照)和2)同种型匹配对照(IS-Ctl)，它们在研究开始时被施用一次。在治疗过程中，定期测量肿瘤体积，如图4A中的点所指示的。两种治疗中的肿瘤生长被称为对照肿瘤生长。在图8B中，第三个B16F10 C57BL/6治疗组(n＝5)，其中抗小鼠CTLA-4抗体以2.5mpk施用，并且在治疗开始时被施用一次。仅用抗小鼠CTLA-4抗体治疗导致肿瘤进展类似于未治疗对照，其中没有小鼠表现出无肿瘤。在图8C中，B16F10C57BL/6治疗组(n＝5)，其中抗小鼠CTLA-4抗体以5mpk施用，并且在治疗开始时被施用一次。仅用抗小鼠CTLA-4抗体治疗导致肿瘤进展类似于未治疗对照，其中没有小鼠表现出无肿瘤。在图8D中，B16F10 C57BL/6治疗组(n＝5)，其中抗小鼠CTLA-4抗体以10mpk施用，并且在治疗开始时被施用一次。仅用抗小鼠CTLA-4抗体治疗导致肿瘤进展类似于未治疗对照，其中没有小鼠表现出无肿瘤。这一结果与BALB/c小鼠不同，单独的抗CTLA-4抗体不影响C57BL/6小鼠中的B16F10肿瘤生长。
在图8E中，B16F10 C57BL/6治疗组(n＝5)，其中在研究的第0天以20mpk施用示例性抗体1-L1抗体。与对照小鼠相比，仅用抗TM4SF1 ADC治疗显示出肿瘤生长的有希望的延迟。在图8F-8H中，添加了第二个治疗组，其由用抗TM4SF1 ADC(20mpk)和抗小鼠CTLA-4抗体(分别为2.5、5和10mpk)治疗的小鼠组成。在图8F中，来自示例性抗TM4SF1 ADC与抗小鼠CTLA-4抗体组合治疗组(2.5mpk，n＝5)的小鼠没有表现出无肿瘤(0％TF)，其中所有小鼠都表现出与单独的示例性抗TM4SF1 ADC治疗相似的肿瘤生长。在图8G中，来自示例性抗TM4SF1 ADC与抗小鼠CTLA-4抗体组合治疗组(5mpk，n＝5)的小鼠没有表现出无肿瘤(0％TF)，其中所有小鼠都表现出与单独的示例性抗TM4SF1 ADC治疗相似的肿瘤生长。在图8H中，来自示例性抗TM4SF1 ADC与抗小鼠CTLA-4抗体组合治疗组(10mpk，n＝5)的小鼠没有表现出无肿瘤(0％TF)，其中所有小鼠都表现出与单独的示例性抗TM4SF1 ADC治疗相似的肿瘤生长。总之，该实施例证明了在对检查点抑制剂无应答的肿瘤模型(例如对CTLA-4抗体治疗无应答的C57BL/6小鼠中的B16F10模型)中，与抗TM4SF1 ADC的联合疗法不会使肿瘤模型有应答。
实施例8：在LLC同基因模型中使用抗TM4SF1 ADC和抗CTLA抗体的肿瘤消退
对于该研究，使用C57BL/6小鼠品系中的细胞衍生的同基因LLC肿瘤模型来评估包含抗TM4SF1 ADC(示例性抗体1-L1)和/或抗CTLA4抗体(9H10)组合的治疗的效果。
C57BL/6小鼠中LLC衍生的肿瘤模型(图9A-9H)。在图9A-9D中，施用0mpk的抗TM4SF1 ADC(示例性抗体1-L1)，并且分别以0、2.5、5和10mpk施用抗CTLA抗体。图9E-9H示出了施用20mpk的抗TM4SF1 ADC(示例性抗体1-L1)并且分别以0、2.5、5和10mpk施用抗CTLA抗体的同基因模型。所有剂量均在研究的第0天施用。
在图9A中，将LLC C57BL/6同基因模型(n＝5)分成2个治疗组，以评估在不同治疗的存在下的肿瘤体积(mm3)：1)媒介物(对照)和2)同种型匹配对照(IS-Ctl)，它们在研究开始时被施用一次。在治疗过程中，定期测量肿瘤体积，如图9A中的点所指示的。两种治疗都没有引起任何肿瘤消退。在图9B中，第三个B16F10 C57BL/6治疗组(n＝5)，其中以2.5mpk施用抗小鼠CTLA-4抗体。在治疗开始时施用一次抗小鼠CTLA-4抗体治疗。仅用抗小鼠CTLA-4抗体治疗导致肿瘤进展类似于未治疗对照，其中没有小鼠表现出完全肿瘤消退。在图9C中，B16F10 C57BL/6治疗组(n＝5)，其中以5mpk施用抗小鼠CTLA-4抗体。在治疗开始时施用一次抗小鼠CTLA-4抗体治疗。仅用抗小鼠CTLA-4抗体治疗导致肿瘤进展类似于未治疗对照，其中没有小鼠表现出完全肿瘤消退。在图9D中，LLC C57BL/6治疗组(n＝5)，其中以10mpk施用抗小鼠CTLA-4抗体。在治疗开始时施用一次抗小鼠CTLA-4抗体治疗。仅用抗小鼠CTLA-4抗体治疗导致肿瘤进展类似于无治疗媒介物和IS-Ctl对照，其中没有小鼠表现出无肿瘤。因此，LLC肿瘤消退结果非常类似于B16F10肿瘤，并且抗小鼠CTLA-4抗体不能影响肿瘤生长。
在图9E中，LLC C57BL/6治疗组(n＝5)，其中在研究的第0天以20mpk施用示例性抗体1-L1抗体。与对照小鼠相比，仅用抗TM4SF1 ADC治疗导致肿瘤生长有希望的延迟。在图9F-9H中，添加了第二个治疗组，其由用抗TM4SF1抗体(20mpk)和抗小鼠CTLA-4抗体(分别为2.5、5和10mpk)治疗的小鼠组成。在图9F中，来自示例性抗TM4SF1 ADC与抗小鼠CTLA-4抗体组合治疗组(2.5mpk，n＝5)的小鼠没有表现出无肿瘤(0％CTR)，其中所有小鼠都表现出与单独的示例性抗TM4SF1 ADC治疗相似的肿瘤生长。在图9G中，来自示例性抗TM4SF1 ADC抗小鼠CTLA-4抗体组合治疗组(5mpk，n＝5)的小鼠没有表现出无肿瘤(0％CTR)，而抗小鼠CTLA-4抗体组合治疗没有表现出无肿瘤(0％CTR)，其中所有小鼠都表现出类似于单独的示例性抗TM4SF1 ADC治疗的肿瘤生长。在图9H中，来自示例性抗TM4SF1 ADC与抗小鼠CTLA-4抗体组合治疗的小鼠没有表现出无肿瘤(0％CTR)，其中所有小鼠都表现出与单独的示例性抗TM4SF1 ADC治疗相似的肿瘤生长。总之，我们的研究表明，在对检查点抑制剂无应答的肿瘤模型(例如对CTLA-4抗体治疗无应答的C57BL/6小鼠中的B16F10和LLC肿瘤模型)中，与抗TM4SF1 ADC的联合疗法不会使肿瘤模型更有应答。然而，当肿瘤模型具有低应答率时，如在BALB/c小鼠的CT26和Renca模型中，与抗TM4SF1 ADC的联合疗法显著增加了应答率。
对本领域技术人员而言将显而易见的是，在不脱离本公开的精神或范围的情况下，可以对本公开的组合物、方法和试剂盒进行各种修改和变化。因此，本公开旨在覆盖本公开的修改和变化，只要它们落入所附权利要求及其等同物的范围内。
表2.序列描述

Claims (56)

1.一种组合，其包含：
a.抗TM4SF1结合蛋白；以及
b.免疫治疗药剂。
2.根据权利要求1所述的组合，其中所述免疫治疗药剂是细胞因子、佐剂或免疫检查点抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的组合，其中所述免疫治疗药剂是抗体或抗原结合片段。
4.根据权利要求3所述的组合，其中所述免疫治疗药剂是针对存在于髓系细胞、肿瘤细胞、淋巴系细胞中的靶标或存在于肿瘤微环境中的蛋白质的抗体或其抗原结合片段。
5.根据权利要求3所述的组合，其中所述免疫治疗药剂是针对PD-1、CD40、CTLA-4、CSF1/CSF1R、SIRPα、CLEC-1中的至少一种的抗体或其抗原结合片段。
6.根据权利要求3所述的组合，其中所述免疫治疗药剂是针对以下中的至少一种的抗体或其抗原结合片段：CCR4、CTLA-4、A1R、A2AR、A3R、TIM-3、BTLA、VISTA、TIGIT、LAG-3、ILRa/CD25、ITGB1/CD29、Ly 24/CD44、CD48、CEACAM1/CD66a、Nt5e/CD73、CD94/NKG2A、FAS/CD95、SLAF1/CD150、NRP1/CD304、GITR/CD357、ICOS、Tnfrs4/OX40、Folr4/JUNO、P2X7、ANXA2、IDO、B7-H6、KIR、GARP(LRRC32)、TNFR2。
7.根据权利要求3所述的组合，其中所述免疫治疗药剂是针对PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CD47、TDO、DcR3中的至少一种的抗体或其抗原结合片段。
8.根据权利要求3所述的组合，其中所述免疫治疗药剂是针对外泌体、细胞因子、白介素或趋化因子中的至少一种的抗体或其抗原结合片段。
9.根据权利要求3所述的组合，其中所述免疫治疗药剂是针对PS、PD-L1、STING中的至少一种的抗体或其抗原结合片段。
10.一种组合，其包含：
a.抗TM4SF1结合蛋白；以及
b.选自以下的免疫治疗药剂：伊匹单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗、阿替利珠单抗、度伐利尤单抗、曲美木单抗、斯巴达珠单抗、阿维鲁单抗、信迪利单抗、特瑞普利单抗、MGA012、MGD013、MGD019、依诺妥珠单抗、MGD009、MGC018、MEDI0680、PDR001、FAZ053、TSR022、MBG453、瑞拉利单抗(BMS986016)、LAG525、IMP321、REGN2810(西米普利单抗)、REGN3767、培西达替尼、LY3022855、FPA008、BLZ945、GDC0919、艾卡哚司他、吲哚莫德、BMS986205、CPI-444、MEDI9447、PBF509、利瑞鲁单抗、IMC-001、莫那利珠单抗及其组合。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的组合，其中所述抗TM4SF1结合蛋白包含：
重链可变结构域，所述重链可变结构域包含CDR3结构域，所述CDR3结构域包含与SEQID NO:8、20、32、44、56、68、80、96、118、119、120、121或162具有至少75％同一性的氨基酸序列；CDR2结构域，所述CDR2结构域包含与SEQ ID NO:7、19、31、43、55、67、79、95、116、117或161具有至少75％同一性的氨基酸序列；和CDR1结构域，所述CDR1结构域包含与SEQ ID NO:6、18、30、42、54、66、78、94、115或160具有至少75％同一性的氨基酸序列；以及
轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含CDR3结构域，所述CDR3结构域包含与SEQID NO:14、26、38、50、62、74、86、110、129或159具有至少75％同一性的氨基酸序列；CDR2结构域，所述CDR2结构域包含与SEQ ID NO:13、25、37、49、61、73、85或109、128或158具有至少75％同一性的氨基酸序列；和CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72、84、107、108、124、125、126、127或157具有至少75％同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合，其中所述抗TM4SF1结合蛋白包含IgG Fc区，并且其中所述IgG Fc区在以下位置中的至少一个处包含突变：E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250Q、T256E、D265、N297、K322、P331、M428和N434；如通过如Kabat中所述的EU索引编号的。
13.根据权利要求12所述的组合，其中所述IgG Fc区包含以下突变中的至少一个：E233P、L234A、L235A、G237A、M252Y、S254T、T250Q、T256E、D265A、N297C、K322A、P331G、M428L、N434A和N434S；如通过如Kabat中所述的EU索引编号的。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的组合疗法，其中所述抗TM4SF1结合蛋白与治疗性分子缀合，形成抗体-药物缀合物。
15.根据权利要求14所述的组合，其中所述治疗性分子选自蛋白酶体抑制剂、卡奇霉素、吡咯并苯并二氮杂澳瑞他汀、倍癌霉素、美登醇及其任何组合。
16.根据权利要求15所述的组合，其中所述治疗性分子包含蛋白酶体抑制剂，并且其中所述蛋白酶体抑制剂选自：硼替佐米(Velcade、PS-341)、PR-171(卡非佐米)、伊沙佐米德兰佐米、马里佐米、奥泼佐米、VR23、PI-1840、(苄氧基羰基)-Leu-Leu-苯丙氨醛、2,3,5a,6-四氢-6-羟基-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3a,10a-联二硫桥-吡嗪并[1,2α]吲哚-1,4-二酮、4-羟基-3-硝基苯基乙酰基-Leu-Leu-Leu-乙烯基砜、sapojargon、Ac-hFLFL-环氧化物、阿克拉霉素A、阿柔比星、ACM、AdaK(Bio)Ahx3L3VS、AdaLys(Bio)Ahx3L3VS、金刚烷-乙酰基-(6-氨基己酰基)-3-(亮氨酰基)-3-乙烯基-(甲基)-砜、ALLM、ALLN、钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、苄氧羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨醛、苄氧羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-正缬氨醛、胶霉毒素、异戊酰-L-酪氨酰-L-缬氨酰-DL-酪氨醛、裂体-乳胞素-β-内酯、Z-LL-Nva-CHO、泛素醛、YU101、MP-LLL-VS、LDN-57444、Z-GPFL-CHO、Z-LLL-CHO、洛伐他汀、α-甲基-裂体-乳胞素-β-内酯、美维诺林、MK-803、NIP-L3VS、NP-LLL-VS、NPI-0052(salinosporamide A)、MLN519(PS-519)、NLVS(三亮氨酸乙烯基砜)、利托那韦、Ro106-9920、Z-LLF-CHO、Z-LL-B(OH)2、RRRPRPPYLPR、Tyropeptin A、ZL3VS、PR-11、PR-39、0106-9920、蛋白酶体抑制剂I、蛋白酶体抑制剂II、蛋白酶体抑制剂III、蛋白酶体抑制剂IV、AdaAhx3L3VS、肽抑制素、MG-132、MG-262、MG-115、α-甲基omuralide、MG-101、艾泼米辛、omuralide、乳胞素和NEOSH101。
17.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-16中任一项所述的组合以及用于向对象施用所述抗TM4SF1结合蛋白和所述免疫治疗药剂的说明书。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述抗TM4SF1结合蛋白和所述免疫治疗药剂在单一组合物中。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述抗TM4SF1结合蛋白和所述免疫治疗药剂在单独的组合物中。
20.一种试剂盒，其包含根据权利要求17-19中任一项所述的组合以及用于向对象施用所述抗TM4SF1结合蛋白和药剂所述免疫治疗药剂的说明书。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述抗TM4SF1结合蛋白和所述免疫治疗药剂在单一组合物中。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述抗TM4SF1结合蛋白和所述免疫治疗药剂在单独的组合物中。
23.一种试剂盒，其包含以下中的任一者：
a.包含治疗有效量的抗TM4SF1结合蛋白的组合物；和
b.包含治疗有效量的药剂免疫治疗药剂的组合物，
以及用于向对象顺序或同时施用a.和b.的说明书。
24.一种试剂盒，其包含以下中的任一者：
a.包含治疗有效量的抗TM4SF1结合蛋白的组合物；和
b.包含治疗有效量的免疫治疗药剂的组合物，所述免疫治疗药剂选自：伊匹单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗、阿替利珠单抗、度伐利尤单抗、曲美木单抗、斯巴达珠单抗、阿维鲁单抗、信迪利单抗、特瑞普利单抗、MGA012、MGD013、MGD019、依诺妥珠单抗、MGD009、MGC018、MEDI0680、PDR001、FAZ053、TSR022、MBG453、瑞拉利单抗(BMS986016)、LAG525、IMP321、REGN2810(西米普利单抗)、REGN3767、培西达替尼、LY3022855、FPA008、BLZ945、GDC0919、艾卡哚司他、吲哚莫德、BMS986205、CPI-444、MEDI9447、PBF509、利瑞鲁单抗、IMC-001、莫那利珠单抗及其组合；
以及用于向对象顺序或同时施用a.和b.的说明书。
25.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-16中任一项所述的组合或根据权利要求17-24中任一项所述的试剂盒，以及以下中的至少一种：药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或其任何组合。
26.一种治疗对象的方法，所述方法包括施用一种组合，所述组合包含：
a.抗TM4SF1结合蛋白；以及
b.免疫检查点抑制剂。
27.根据权利要求26所述的方法，其中将所述抗TM4SF1结合蛋白和所述免疫治疗药剂同时施用于所述对象。
28.根据权利要求26所述的方法，其中将所述抗TM4SF1结合蛋白和所述免疫治疗药剂顺序施用于所述对象。
29.根据权利要求28所述的方法，其中首先施用所述抗TM4SF1结合蛋白，其次施用所述免疫治疗药剂。
30.根据权利要求28所述的方法，其中首先施用所述免疫治疗药剂，其次施用所述抗TM4SF1结合蛋白。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述首先施用和其次施用间隔1、2、3、6、12、24、48小时或更多小时。
32.根据权利要求26-31中任一项所述的方法，其中所述施用导致改善的T细胞功能。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述改善的T细胞功能包括肿瘤微环境(TME)中的增加的T细胞浸润。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中所述改善的T细胞功能包括肿瘤血管中ICAM-1和VCAM-1的增加的表达。
35.一种治疗对象的方法，所述方法包括施用一种组合，所述组合包含：
a.抗TM4SF1结合蛋白；以及
b.选自以下的免疫治疗药剂：伊匹单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗、阿替利珠单抗、度伐利尤单抗、曲美木单抗、斯巴达珠单抗、阿维鲁单抗、信迪利单抗、特瑞普利单抗、MGA012、MGD013、MGD019、依诺妥珠单抗、MGD009、MGC018、MEDI0680、PDR001、FAZ053、TSR022、MBG453、瑞拉利单抗(BMS986016)、LAG525、IMP321、REGN2810(西米普利单抗)、REGN3767、培西达替尼、LY3022855、FPA008、BLZ945、GDC0919、艾卡哚司他、吲哚莫德、BMS986205、CPI-444、MEDI9447、PBF509、利瑞鲁单抗、IMC-001、莫那利珠单抗及其组合。
36.根据权利要求35所述的方法，其中将所述抗TM4SF1结合蛋白和所述免疫治疗药剂同时施用于所述对象。
37.根据权利要求35所述的方法，其中将所述抗TM4SF1结合蛋白和所述免疫治疗药剂顺序施用于所述对象。
38.根据权利要求37所述的方法，其中首先施用所述抗TM4SF1结合蛋白，其次施用所述免疫治疗药剂。
39.根据权利要求37所述的方法，其中首先施用所述免疫治疗药剂，其次施用所述抗TM4SF1结合蛋白。
40.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述首先施用和其次施用间隔1、2、3、6、12、24、48小时或更多小时。
41.根据权利要求35-40中任一项所述的方法，其中所述施用导致改善的T细胞功能。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述改善的T细胞功能包括肿瘤微环境(TME)中的增加的T细胞浸润。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述改善的T细胞功能包括肿瘤血管中ICAM-1和VCAM-1的增加的表达。
44.一种在对象中改善T细胞应答的方法，其包括施用根据权利要求1-16中任一项所述的组合，其中改善的应答与改善的T细胞功能相关。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述改善的T细胞功能包括肿瘤微环境(TME)中的增加的T细胞浸润。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述改善的T细胞功能包括肿瘤血管中ICAM-1和VCAM-1的增加的表达。
47.根据权利要求44-46中任一项所述的方法，其中施用所述组合疗法包括第一治疗和第二治疗。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述第一治疗包含所述抗TM4SF1结合蛋白，并且其中所述第二治疗包含所述免疫检查点抑制剂药剂。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述第一治疗包含所述抗TM4SF1结合蛋白，并且其中所述第二治疗包含所述治疗药剂。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的方法，其中所述第一治疗和所述第二治疗在1、2、3、4、5或7天内进行。
51.根据权利要求26-50中任一项所述的方法，其中每周、每两周、每月或每两年施用所述组合。
52.根据权利要求26-51中任一项所述的方法，其中所述对象正经历可能诱导转移的治疗。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述治疗包括手术、放射治疗和化学治疗。
54.根据权利要求26-53中任一项所述的方法，其中所述对象患有癌症。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌、肝癌、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰腺癌、胃部(胃)癌、宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、尿路上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌(鳞状细胞癌和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌、淋巴瘤(NHL或HL)、急性髓细胞白血病(AML)、T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、食道癌、梅克尔细胞癌、MSI-高癌症、KRAS突变肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤和骨髓增生异常综合征(MDS)。
56.根据权利要求26-55中任一项所述的方法，其中所述对象是人类。
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