CN117339643A - 用于蛋白样品溶液置换或蛋白分离的装置和方法 - Google Patents

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CN117339643A CN202311065103.1A CN202311065103A CN117339643A CN 117339643 A CN117339643 A CN 117339643A CN 202311065103 A CN202311065103 A CN 202311065103A CN 117339643 A CN117339643 A CN 117339643A
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Abstract

本申请公开了一种用于蛋白样品溶液置换或蛋白分离的装置和方法。本申请装置包括微流控芯片、样品池和电渗流模块；微流控芯片微流道呈两端细长、中间含通孔的腔体结构，微流道两端分别开设目标背景溶液出入口，中间通孔用于容纳样品池和电渗流模块；样品池与中间通孔顶部型腔紧密配合，其与目标背景溶液接触的部位为半透膜结构；电渗流模块与中间通孔中下部型腔紧密配合，置于样品池下方。本申请将电泳、半透膜和电渗流三者结合，在不引入机械力情况下，实现快速、高效溶液置换或蛋白分离，能实现难挥发性盐离子和中性小分子迁移。本申请借助微流控芯片进行溶液置换或蛋白分离，方便自动化控制，且具有良好的在线整合兼容性。

Description

用于蛋白样品溶液置换或蛋白分离的装置和方法
技术领域
本申请涉及蛋白质检测技术领域，特别是涉及一种用于蛋白样品溶液置换或蛋白分离的装置和方法。
背景技术
蛋白质在生命活动中发挥重要的功能作用。蛋白质的生物功能与结构密切相关，明晰蛋白功能有赖于对其多层次结构的分析。蛋白样品的溶液置换是蛋白质分析前处理过程中的常见步骤，对于质谱等分析手段而言更是必要操作。质谱是测量化学物质分子量的工具，由于其超高的灵敏度和分辨率，以及耗样量低等特性被广泛应用于生物大分子表征之中。经表达和纯化后的蛋白通常处于非挥发性盐离子缓冲液中，这些非挥发性盐离子可严重抑制蛋白的离子化及蛋白离子的检测，同时也会污染质谱仪器，因此蛋白质质谱分析的前处理中需将蛋白溶液中的非挥发性盐及其它可能引起信号干扰的小分子物质置换为质谱可兼容的易挥发性盐。除质谱分析外，蛋白样品的溶液置换也常用于其它分析手段中，用于去除起干扰或污染作用的小分子物质，或改变溶液条件。
基于半透膜的超滤操作是近年来对生物大分子进行离子交换的最常使用的方式。在由高速离心产生的机械力下，盐类等小分子物质随原始蛋白溶液经由半透膜离心大量除去，分子量大的蛋白则会被截留在半透膜内；随后向样品中补充含目标组成物的溶液，即可实现目标溶液对原溶液按一定比例的置换；多次重复此过程即可实现大比例置换。这一方法操作较为繁琐、耗时，难以实现自动化，且由高速离心产生的机械力及混入目标溶液时产生的溶液环境突变可能导致蛋白样品因降解、凝集等造成的损失。同样基于半透膜而不施加额外机械力的透析也是广泛应用于溶液置换和纯化浓缩蛋白的常用技术。将原始蛋白溶液置于半透膜透析袋内，目标溶液置于袋外，原始溶液及目标溶液所含物质因在袋内外浓度不同而进行扩散、直至透析袋内外浓度平衡；而蛋白本身则被留在透析袋内。通过持续更新袋外的目标溶液可实现大比例的溶液置换。由于缺少机械力辅助，此方式耗时更长。固相萃取是通过疏水相互作用选择性地保留蛋白质，需借助有机洗脱剂回收蛋白，这会引入变性条件，导致蛋白质的高级结构变化甚至凝集，无法与非变性条件的分析兼容，且会造成样品损失。基于体积排阻色谱(SEC)、凝胶渗透色谱(GPC)或离子交换色谱(IEX)的溶液置换方式同样需要引入机械力辅助，且往往需使用较大量的流动相目标溶液，造成样品溶液的稀释，不利于后续的高灵敏分析。电泳技术可在电场力作用下利用不同分子间的电泳淌度差异实现分离，使蛋白脱离原始溶液体系而进入目标溶液体系。常见的电泳施加方案包括平板凝胶电泳和毛细管电泳。前者难以在非变性条件下高效回收蛋白，后者则因流速过低，既难以通过离线方式有效收集目标溶液中的蛋白，也难以采用通用方案直接对接在线的质谱分析。
并且，无论是从细菌或者细胞中提取的生物样本，还是大量商品化的样品溶液，为保持蛋白的生物活性及生理功能，蛋白质都保存在复杂的背景溶液中。这其中不仅大量含有难挥发性的盐离子，同时还会存在一些不带电的中性小分子，这些都会严重干扰目标样品的质谱信号。尤其是中性小分子难以去除、离子迁移受限等问题。
因此，如何在避免蛋白质降解、变性等损失的情况下，快速、有效的进行蛋白样品溶液置换，有效的去除中性小分子，仍然是本领域的研究重点。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的用于蛋白样品溶液置换或蛋白分离的装置和方法。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种用于蛋白样品溶液置换或蛋白分离的装置，其包括微流控芯片，用于盛放待处理的蛋白样品溶液的样品池，和电渗流模块；微流控芯片的微流道呈两端细长、中间含通孔的腔体结构，微流道的两端分别开设有通孔，作为目标背景溶液入口和目标背景溶液出口，中间通孔用于容纳样品池和电渗流模块；样品池与微流道的中间通孔的顶部型腔紧密配合，样品池与微流道中目标背景溶液接触的部位为半透膜结构；电渗流模块与微流道的中间通孔的中下部型腔紧密配合，使用时电渗流模块放置于样品池下方，直接与微流道中的目标背景溶液接触。其中，两端细长、中间通孔的结构，例如本申请的一种实现方式中具体为纺锤形结构，当然，也可以是其它两端细长中间通孔的形状。本申请中，在进行蛋白样品溶液置换时，微流道中的目标背景溶液，即需要置换的目标溶液；在进行蛋白分离或纯化时，微流道中的目标背景溶液，即待处理蛋白样品的样品原液或与之类似的蛋白质溶解溶液；因此，本申请的目标背景溶液是指，预期置换所得的溶液或蛋白样品溶液中，除蛋白以外的其它溶液成分，如缓冲溶液、不具有缓冲作用的盐溶液、纯溶剂或混合溶剂等。
需要说明的是，本申请的蛋白样品溶液置换或蛋白分离装置，使用时，在样品池内外分别连接正负极，将电泳、半透膜和电渗流三者结合，在不引入机械力的情况下，实现快速、高效的溶液置换；尤其是，利用电渗流实现难挥发性盐离子以及中性小分子的迁移，解决中性小分子难以去除的问题。并且，采用微流控芯片的微流控技术构建微尺度下的置换装置，能够实现自动化控制，具备与其它前处理模块或者后续检测在线整合的兼容性。
还需要说明的是，本申请的装置，除了对蛋白质进行溶液置换以外，利用样品池的半透膜结构，还能够实现对不同尺寸的蛋白进行分离或纯化；因此，本申请的装置也能够作为蛋白分离或纯化的装置使用。
本申请的一种实现方式中，电渗流模块为具有微孔通道的膜或板材，或者，电渗流模块为内径为微米级别或毫米级别的毛细管组成的阵列结构。
需要说明的是，本申请的关键在于，利用电渗流模块产生电渗现象，即在电场中，利用多孔支持物吸附水中的正负离子，使溶液相对带电，在电场作用下，溶液向一定的方向移动。因此，本申请的电渗流模块可以参考现有技术中使用的能够产生电渗现象的多孔支持物，包括但不仅限于具有微孔通道的膜或板材，或者，电渗流模块为内径为微米级别或毫米级别的毛细管组成的阵列结构。其中，毛细管组成的阵列结构，例如由若干个相同高度的毛细管捆成一束作为电渗流模块。
本申请的一种实现方式中，电渗流模块由含二氧化硅成分的材料制备而成。
本申请的一种实现方式中，含二氧化硅成分的材料为硅胶、石英或玻璃。
需要说明的是，本申请的关键在于，将能够产生电渗现象的电渗流模块与电泳和半透膜组合，至于作为电渗流模块的多孔支持材料，包括但不仅限于硅胶、石英和玻璃。
本申请的一种实现方式中，电渗流模块为以下结构中的至少一种，
(1)具有微孔通道的硅胶；例如硅胶膜；
(2)空心玻璃管阵列；例如空心的玻璃管束；
(3)熔融石英毛细管阵列；例如毛细管束；
(4)内部通道插入玻璃丝或石英丝的空心玻璃管阵列；
(5)具有微孔通道阵列的玻璃板；例如微孔玻璃板等。
可以理解，电渗流或称电渗效应，其本质是在多孔介质、微通道或其它流体管道两端施加电压，以此造成流体流动；因此，本申请的电渗流模块只要具有多孔介质、微通道或其它流体管道即可，包括但不仅限于硅胶膜、玻璃管束、玻璃毛细管束或微孔玻璃板。
本申请的一种实现方式中，硅胶或玻璃板的微孔通道的孔径为微米级别或毫米级别。
优选的，硅胶或玻璃板的微孔通道的孔径为0.1mm，例如本申请的一种实现方式中，硅胶膜微孔通道和玻璃板微孔通道的孔径都是0.1mm。
优选的，熔融石英毛细管的内径为小于或等于1mm。
优选的，熔融石英毛细管的内径为0.1mm。
优选的，空心玻璃管的内径为0.6-0.7mm。
优选的，玻璃丝或石英丝的直径为0.1mm。
需要说明的是，以上硅胶膜、玻璃管、玻璃丝、石英丝、玻璃毛细管和玻璃板的具体尺寸只是本申请的一种实现方式中具体采用的尺寸，在相同的发明构思下，还可以在以上尺寸的基础上进行适当调整，例如，微孔通道的孔径或者毛细管的内径为几微米至几毫米范围均可，在此不做具体限定。
本申请的一种实现方式中，本申请用于蛋白样品溶液置换或蛋白分离的装置还包括电路组件，电路组件包括导电电极和电源；使用时，电源正极的导电电极固定在样品池内，与待处理的蛋白样品溶液接触，电源负极的导电电极固定在微流控芯片的目标背景溶液入口或目标背景溶液出口。
本申请的一种实现方式中，本申请用于蛋白样品溶液置换或蛋白分离的装置还包括目标背景溶液组件，目标背景溶液组件包括用于调控微流控芯片的微流道中目标背景溶液流速的液体推进装置；使用时，液体推进装置与微流控芯片的目标背景溶液入口连通。其中，液体推进装置包括但不仅限于注射泵。
本申请的一种实现方式中，目标背景溶液组件还包括废液池；使用时，废液池与微流控芯片的目标背景溶液出口连通。
需要说明的是，本申请的电路组件，例如导电电极、电源都可以采用实验室常规使用的电泳设备；同样的，目标背景溶液组件，例如注射泵、废液池等也都可以采用实验室常规使用的注射液设备。可以理解，本申请的关键在于微流控芯片、样品池和电渗流模块，至于其他组件都可以根据需求选择性的组合到本申请用于蛋白样品溶液置换或蛋白分离的装置中。
本申请的一种实现方式中，微流控芯片由聚二甲基硅氧烷制备，并承载于玻璃载玻片上。
需要说明的是，二甲基硅氧烷只是本申请的一种实现方式中具体采用的微流控芯片制备材料，不排除还可以采用其他常规的微流控芯片制备材料。
本申请的一种实现方式中，样品池由聚氨酯树脂制备，样品池的底部塑封有半透膜。
需要说明的是，聚氨酯树脂只是本申请的一种实现方式中具体采用的样品池制备材料，不排除还可以采用其他材料制备样品池。
本申请的一种实现方式中，样品池的底部为再生纤维透析袋。
本申请的另一面还公开了一种蛋白样品溶液置换或蛋白分离的方法，包括采用本申请用于蛋白样品溶液置换或蛋白分离的装置对待处理的蛋白样品溶液进行原始溶液的置换或蛋白分离。
本申请的一种实现方式中，本申请的蛋白样品溶液置换或蛋白分离方法，具体包括如下步骤：
将电渗流模块和样品池置于微流控芯片的中间通孔中，并将样品池置于电渗流模块的上方，向微流控芯片的目标背景溶液入口以设定流速通入目标背景溶液，目标背景溶液经过微流道的中间通孔，最后由目标背景溶液出口排出；其中，在进行蛋白样品溶液置换时，通入微流道中的目标背景溶液，即需要置换的目标溶液；在进行蛋白分离或纯化时，通入微流道中的目标背景溶液，即待处理蛋白样品的样品原液或与之类似的蛋白质溶解溶液；
将样品池清理干净，将待处理的蛋白样品溶液放入样品池中，使目标背景溶液与样品池内的待处理的蛋白样品溶液接触；
将电源正极的导电电极固定在样品池内，与待处理的蛋白样品溶液接触，电源负极的导电电极固定在微流控芯片的目标背景溶液入口或目标背景溶液出口，形成闭环回路；
通过电源施加电压，驱动待处理的蛋白样品溶液中粒径小于半透膜孔径的离子穿过半透膜，与此同时，在电渗流模块的作用下，利用电渗流效果使粒径小于半透膜孔径的中性小分子也穿过半透膜和电渗流模块，实现待处理的蛋白样品溶液的原始溶液置换；或者使尺寸小于半透膜孔径的蛋白穿过半透膜，实现待处理的蛋白样品溶液的蛋白分离。
本申请的一种实现方式中，微流道中通入的目标背景溶液为需要置换的目标溶液或蛋白质溶解溶液。
优选的，微流道中通入的目标背景溶液为醋酸铵溶液、碳酸氢铵溶液或者醋酸铵或碳酸铵添加pH调节剂的溶液。
需要说明的是，为保留蛋白质的天然构象，基本上使电泳前后待处理的蛋白样品溶液的pH处于差别不大的pH范围内；同时，质谱检测要求样品溶液中不含有非挥发性盐，以防造成信号干扰并污染质谱。因此，本申请优选采用醋酸铵溶液作为目标背景溶液。可以理解，采用醋酸铵溶液作为目标背景溶液主要是考虑质谱检测的使用需求；在其他使用情况下，也可以直接采用需要置换的溶液作为目标背景溶液。
本申请的一种实现方式中，本申请的方法还包括在向样品池中放入待处理的蛋白样品溶液之前，检查是否漏液，如果有漏液则需要重新更换微流控芯片和/或样品池；检查是否漏液包括，观察微流控芯片以及微流控芯片与样品池之间的缝隙是否有渗液。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的蛋白样品溶液置换或蛋白分离装置和方法，将电泳、半透膜和电渗流三者结合，在不引入机械力的情况下，实现快速、高效的溶液置换或蛋白分离；通过电渗流实现难挥发性盐离子和中性小分子的迁移，解决了中性小分子难以去除的问题。并且，借助微流控芯片进行溶液置换或蛋白分离，不仅能够实现自动化控制，而且能够与前处理模块或者后续检测都具有良好的在线整合兼容性。
附图说明
图1是本申请实施例中微流控芯片的结构示意图；
图2是本申请实施例中样品池的结构示意图；
图3是本申请实施例中蛋白样品溶液置换装置及其整体流程的示意图；
图4是本申请实施例中有机染料柠檬黄进行溶液置换的测试结果；
图5是本申请实施例中处于0.25mM KCl溶液的cyt c进行溶液置换前后的测试结果；
图6是本申请实施例中处于不同浓度的PBS溶液的cyt c的质谱检测结果；
图7是本申请实施例中处于1×PBS溶液的Ub进行溶液置换前后的测试结果；
图8是本申请实施例中处于1×PBS溶液的avidin电泳置换不同时间后在质谱条件为SF 20eV下的质谱图，用于展示完整四聚体信号；
图9是本申请实施例中处于1×PBS溶液的avidin电泳置换不同时间后在质谱条件为SF 60eV下的质谱图，用于展示气相解离所得单体信号；
图10是本申请实施例中不同电荷蛋白混合后进行溶液置换和蛋白分离的测试结果；
图11是本申请实施例中另一种微流控芯片的结构示意图；
图12是本申请实施例中电渗流模块的结构示意图；
图13是本申请实施例中另一种蛋白样品溶液置换装置及其整体流程的示意图；
图14是本申请实施例中添加电渗流模块和不添加电渗流模块对罗丹明B进行电泳后的吸光度检测结果。
具体实施方式
本申请针对蛋白质分析的前处理需求，引入电泳原理，结合半透膜原理，不引入机械力而实现快速、高效的溶液置换。进一步的，为了提升溶液的置换性能，在已开发的置换装置中引入电渗流模块，利用电渗流效应来驱动离子和中性小分子迁移。
电渗流是由施加的电势在多孔材料、毛细管、膜、微通道或者其他流体导管上所引起的液体运动。电渗流是化学分离技术中的重要技术，比如毛细管电泳。毛细管使用的石英材料会在毛细管内壁上留有大量裸露的硅羟基，这些硅羟基会在pH 3以上的溶液条件下，发生解离，形成带负电的基团。溶液中的阳离子会聚集在这些负电荷附近，形成双电层以及扩散层。在毛细管两端施加用于电泳的电压时，扩散层中的大量正电荷会向负极发生移动，由于这些正电荷的载体是溶剂化的阳离子，它们可拖动大量溶液随之共同移动。毛细管内径较小，内部溶液可以在这样的作用下发生整体移动，宏观上就体现为电渗流。电渗流是毛细管内溶液的整体效果，电渗流自身的速度可以为管内所有物质提供一个共同的淌度分量。这个淌度的方向与阳离子的电泳方向相同，与阴离子的电泳方向相反，且往往数值大于电泳淌度，因此综合作用的结果是使阳离子的移动更快，并且使中性物质和阴离子也能以相对较小的淌度和阳离子同向运动，这一结果的正面意义是一次操作即可同向分离带电情况不同的物质。改变毛细管内壁的表面性质、改变溶液的离子强度都可以改变双电层的Zeta电势ζ，改变溶液温度可以改变溶液黏度，因此这些参数都可以用于调节电渗流的强弱。
电泳是带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的方向移动，而电渗是由于多孔材料等吸附水中的正负离子，使溶液相对带电，在电场作用下，溶液向一个方向移动，也就是溶液中的所有离子都可以向同一个方向移动。本申请创造性的提出，如果把能产生电渗流的器件应用到本申请的溶液置换装置中，这样就会缩短溶液中难挥发性盐离子以及中性小分子迁移的时间，提升性能。
本申请的蛋白样品溶液置换或蛋白分离的装置将电泳原理、半透膜的分离作用和电渗流原理三者结合，解决了中性小分子难以去除的问题；并采用微流控技术构建微尺度下的置换或蛋白分离装置，可自动化控制，并具备与其它前处理模块在线整合的兼容性。
本申请的蛋白样品溶液置换或蛋白分离的装置和方法与现有技术相比具有以下优点：
1.利用电泳原理驱动原始溶液中的小分子离子穿过半透膜，截留蛋白，实现蛋白与原始溶液环境的分离或者不同尺寸蛋白的分离纯化。
2.利用电泳原理驱动目标溶液中的小分子离子穿过半透膜，与蛋白汇合，实现将蛋白置于新的溶液环境中；或者使小尺寸蛋白穿过半透膜使蛋白分离或纯化。
3.利用电渗流模块实现难挥发性盐离子以及中性小分子的迁移，解决了中性小分子难以去除的问题。
4.连续灌注目标溶液，提高置换效率，利于自动化控制。
5.以微流控芯片形式构建装置，减小样品耗用，并且利于自动化控制和与其它功能模块的在线联用。
6.利用电场电泳效应进行溶液置换只涉及离子的置换，不向样品中引入溶剂，不会引起稀释。例如，电泳过程伴随电渗流，则溶剂可在电渗流的作用下进入或离开半透膜。
7.采用新颖的半透膜封装形式制备样品池。
下面通过具体实施方式结合附图对本申请作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他装置、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
实施例一
一、微流控芯片设计和制备
本例的微流控芯片，其微流道整体呈两端细长、中间通孔的结构，本例具体采用纺锤形设计，如图1所示，纺锤形的设计可以减少流体流动过程中的流阻和产生的死体积；微流道的高度为240μm，宽为300μm。在流道的两端分别有0.7mm的孔径的通孔，分别为Buffer入口和Buffer出口，即目标背景溶液入口11和目标背景溶液出口12，中间的通孔的直径为5mm，即中间通孔13，可嵌入样品池；纺锤形腔体的最大直径大于样品池直径，使样品池底部的透析膜完全可以和芯片流道内不断更换的目标背景溶液充分接触。
设计具有纺锤结构的微流芯片结构，并制作菲林，之后通过光刻技术制作微流控芯片模板。在硅片上均匀涂布SU-8光刻胶后烘烤干燥，经曝光实现微流控图案从掩膜版到硅片上的转移。将聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)的A液和B液按质量比10:1混匀后倒入光刻膜板中，置于80℃静置60min，脱模得到对应的PDMS芯片流道。分别在入口和出口打0.7mm直径的单侧通孔，在纺锤形区域中央位置的打5mm直径的单侧通孔。
二、样品池制作
本例的样品池，如图2所示，呈圆形的碗型结构21，其底部塑封有半透膜结构22。
制作样品池模具，把再生纤维透析袋放入模具的底部并固定。聚氨酯树脂(C3H8N2O，PU树脂)A液和B液按照质量1:1混合均匀后，迅速灌入模具中，自由静置20min后取出样品池。待处理的蛋白样品溶液置于样品池中；微流道中连续灌注目标溶液。
半透膜是分离不同尺寸粒子的有力工具，在生物样品的前处理过程中被广泛使用，如透析法、超滤法等。电泳就是带电的离子在电场力的驱动下向着与其所带电荷相反方向迁移的过程。施加电场使样品原液中的蛋白质与共存的非挥发性盐离子向半透膜方向迁移，由于半透膜的拦截作用，小尺寸的阴离子或阳离子通过半透膜，而尺寸较大的蛋白就被截留下来，留在样品池中。为了保证稳定电路，并且为样品原液补充离子，需要在半透膜的另一侧也就使芯片流道层提供稳定的溶液，与样品原液有良好接触。电泳过程中，半透膜两侧的溶液进行离子交换。为保留蛋白质的天然构象，基本上使电泳前后样品原液的pH处于差别不大的pH范围内；同时，质谱检测要求样品溶液中不含有非挥发性盐，以防造成信号干扰并污染质谱；因此选择具有质谱兼容能力的醋酸铵溶液作为本例的目标背景溶液。
本例的样品池底部塑封了半透膜，底部快速流动的目标背景溶液与样品池内样品接触良好，因此可以在保持电通路的同时带走被交换的离子。
三、电路组件和目标背景溶液组件
本例选择高纯铂丝作为导电电极，固定在电泳池内与待处理的蛋白样品溶液接触，电极的另一端固定在目标背景溶液入口和目标背景溶液出口位置。在整个电路中串联一个可以切换电源正负极的供电装置，本例具体采用的是可切换正负极的单片机，定时切换电源方向以驱动样品原液中的阴阳离子均能有机会穿过半透膜。电极方向改变，蛋白质的迁移方向也随之改变。值得注意的是，最后一次切换电极，应该保证电极方向使蛋白向远离半透膜方向迁移，以减少半透膜对蛋白的吸附。
本例的蛋白样品溶液置换流程包括：
为制作完成的芯片连接溶液管路以及用于灌注目标溶液的注射器；将含有离子交换膜的样品池底部卡在芯片腔体内径最大处；验漏后连接电路。
其中，管道连接如图3所示：首先第一根溶液软管31一端连接第一钢针32，另一端连接注射器33的针头；第二根溶液软管34一端连接第二钢针35；把第一根溶液软管31上的第一钢针32插入目标背景溶液入口中，另一端连接注射器33；第二根溶液软管34上的第二钢针35插入目标背景溶液出口中，另一端置于废液池36；注射器33、第一根溶液软管31、第一钢针32、微流道、第二钢针35、第二根溶液软管34和废液池36构成液体通路；准备电源37、切换电源正负极的供电装置38、导线39、99.99％高纯铂丝310；供电装置38两端分别连接置于样品池内的高纯铂丝310及目标背景溶液出口的第二钢针35形成闭合回路，如图3所示。
注射器吸取目标背景溶液，即150mM醋酸铵溶液，调节液体推进装置，本例具体为200μL/min，将目标背景溶液以稳定流速注入微流道内将体积约20μL样品加入样品池中；设置供电装置的工作时间及电源电极切换时间后通电。
四、蛋白样品溶液置换试验
1.可行性验证
使用有机染料柠檬黄测试本例蛋白样品溶液置换装置的有效性。由于该染料在负离子形式下正常显色，故将电源负极接入样品池，电源正极接入目标溶液流道出口。目标背景溶液为150mM NH4Ac溶液。本例测试了电泳0min、15min、30min、40min和50min后样品溶液的吸光度值，每个时间点进行三次平行测定，结果如图4所示。其中，电泳的电压为60V，电泳0min是指未进行电泳。
如图4所示，初始状态下含有约0.02微克染料的样品溶液颜色随电泳时间延长而减淡，且在40min后近乎消失。50min后，溶液吸光度降低了约500倍。本实验证明了利用本装置利用单一电场方向置换原始溶液中单一离子的有效性。
在此基础上，本例测试了对含0.25mM KCl的cyt c溶液的置换效果。其中，电泳在流控电源提供的300μA恒定电流下进行；每20s切换一次电极方向。
图5所示为电泳前后cyt c样品的质谱图，其中A图为全局信号谱图，B图为+6价cytc离子信号的放大谱图。以本装置进行溶液置换后，高价态(+8～+10价)离子信号消失，表明因KCl存在而造成的蛋白变性得以消除；蛋白与K离子形成的加合物如[cyt c+5H+1K]6+和[cyt c+4H+2K]6+等得以大幅减少，蛋白离子主要以[cyt c+6H]6+形式存在，数据质量大幅提升。
2.不同浓度PBS下cyt c溶液的置换效果
磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲溶液，其主要成分为Na2HPO4-7H2O，KH2PO4和NaCl，可为生物大分子提供适宜的pH缓冲作用和盐平衡作用，本例分别对处于0.2×、0.5×及1×PBS缓冲液中的cyt c进行溶液置换。如图6所示，左、右侧分别为溶液置换前后cyt c蛋白样品的质谱图，主图为全局谱图，上方为cyt c+7价离子的放大谱图。
结果显示，蛋白溶液中存在的PBS成分显著干扰蛋白信号，在较低PBS浓度下形成大量碱金属阳离子加合物分散并压制蛋白信号，在高PBS浓度下信号压制成为主导因素，可导致蛋白信号完全消失。本例采用150mM醋酸铵溶液进行置换，为使原PBS溶液中的阴阳离子均得以置换，每20s切换一次电场方向，电泳过程持续1h；以流控电源将电流恒定控制为300μA。置换操作完成后各样品在质谱检测中呈现的碱金属阳离子加合物均大幅减少，以质子化的分子离子为蛋白离子的主要呈现形式，谱图质量大幅提升，且原始PBS浓度对置换结果的影响不大，证明本装置对实际蛋白样品可高效实现溶液置换。
3.PBS环境下其他种类蛋白溶液的置换效果
(1)泛素的溶液置换
泛素(ubiquitin，Ub)是一种存在于真核生物中的小蛋白，分子量约为8.6kDa。本例将置于1×PBS的Ub样品进行溶液置换，以流控电源提供300μA恒流电场，电极方向每20s切换一次；质谱检测结果如图7所示，为溶液置换前后样品的质谱图，下方主图为全局谱图，上方插图为+6及+5价蛋白离子信号放大谱图。碱金属阳离子加合物引起的信号分散作用和对蛋白的信号压制作用在溶液置换后大幅改善。
(2)重组亲和素的溶液置换
重组亲和素(avidin)是由鸡蛋清中提取的糖蛋白，由四个相同亚基通过非共价相互作用组成复合物，分子量约60kDa。在非变性条件下对纯蛋白的质谱检测中，在较低的源内裂解(source fragmentation，SF)条件下(如20eV)，可检测到完整四聚体信号。如图8所示，处于1×PBS条件下的avidin样品由于非挥发性离子的信号压制作用，无法直接获得质谱信号。采用本装置以300μA恒电流进行10min、30min和60min的溶液置换后，可获取高质量的完整蛋白复合物信号，分子量符合理论值，证明溶液置换效果达到预期。
在较高的SF条件下(如60eV)，avidin的四聚体复合物可经气相解离反应解离出单体。图9所示为溶液置换前后气相解离所得单体的质谱图，电泳条件同上。随电泳时间延长，碱金属阳离子加合物显著减少，蛋白单体的糖型分布更加清晰，谱图质量显著提高。
4.多蛋白共存样品中的蛋白分离效果
本装置中使用的半透膜可起到利用膜孔尺寸分离不同蛋白的作用。本例中Ub及β-乳球蛋白(β-Lg)尺寸均小于半透膜孔径，而免疫球蛋白G(IgG)大于半透膜孔径。本例将Ub与IgG以摩尔比1:3混合的样品进行蛋白分离试验，结果如图10的A图所示；将β-Lg与IgG以摩尔比1:3混合的样品进行蛋白分离试验，结果如图10的B图所示。蛋白分离试验利用本装置以300μA恒电流进行溶液置换，每20s切换一次电极方向。
图10的结果显示，40min即可去除溶液中的小蛋白成分，仅保留大尺寸的IgG蛋白，有效实现蛋白分离。
实施例二
一、新型微流控芯片设计和制备
本例在实施例一的基础上进行改进，实施例一的微流控芯片只含有一层PDMS，本例在此基础上多加一层PDMS，如图11所示，第一层PDMS与实施例一相同，唯一的区别在于中间通孔的直径为7mm；第二层PDMS，不需要流道，只需要中间含有5mm的通孔用来放置样品池即可。需要注意的是，第二层PDMS的5mm中间通孔与第一层PDMS的7mm中间通孔完全重合，以保证在电泳的时候样品池的半透膜可以和底部的溶液充分的接触。使用时，如图13所示，电渗流模块131和样品池132都置于微流控芯片133的中间通孔中，并将样品池132置于电渗流模块131的上方。
二、电渗流模块
其中，电渗流模块131为具有微孔通道的膜或板材，或者，内径为微米级别或毫米级别的毛细管组成的阵列结构。本例的电渗流模块由含二氧化硅成分的材料制备而成，例如硅胶、石英或玻璃。微孔通道的孔径或者毛细管的内径为微米级别或毫米级别，可以是几微米至几毫米，只要能够起到电渗效应即可。
本例分别设计了五种不同结构的电渗流模块进行试验，如图12所示，具体为以下结构：
方式1：在第一层PDMS的7mm中间通孔放置一块直径7mm，厚度2mm，且具有微孔通道的硅胶膜，其微孔通道的孔径为0.1mm，即具有微孔通道的硅胶。
方式2：把内径0.68mm，外径1.20mm的玻璃管截成高度约2mm的玻璃管，然后各玻璃管紧密接触阵列排布，形成空心玻璃管阵列，放置在第一层PDMS的7mm中间通孔中。
方式3：把内径0.10mm，外径0.30mm的玻璃毛细管截成高度约2mm的小管，然后各毛细管紧密接触阵列排布，形成毛细管阵列，放置在第一层PDMS的7mm中间通孔中。
方式4：把内径0.68mm，外径1.20mm的空心玻璃管截成高度约2mm的玻璃管，各空心玻璃管紧密接触阵列排布，形成空心玻璃管阵列，并在玻璃管中插满直径0.10mm的光纤以增加流道，放置在第一层PDMS的7mm中间通孔中。
方式5：制作直径为7mm，高度为2mm的微通道玻璃孔板，其微通道孔径为0.10mm。
三、电渗流效果试验
本例利用罗丹明B作为指示剂，以溶液对552nm可见光的吸光度作为评价指标，通过设置电渗流模块前后的结果对比，分别测试了以上五种电渗流模块的溶液置换效果。
电泳过程中，溶液中的阳离子向负极迁移，阴离子向正极迁移；而电渗流的方向始终由负极流向正极。罗丹明B在阳离子形式下正常显色，如将电源正极接入样品池，电源负极接入目标背景溶液流道出口，如图13所示，则该指示剂无论在电泳作用下还是电渗流作用下均可由样品池穿越半透膜向目标背景溶液流道出口移动。
本例测试了在电极恒定条件下，设置5种电渗流模块前后电泳0min、10min、20min、30min和40min后的结果，各时间点进行三次平行测定，结果如图14和表1所示。电泳电压为60V，电泳0min指未进行电泳。图14中，最上面一条曲线为正常电泳，即不添加电渗流模块直接进行相同条件的电泳，下面五条曲线由上而下依序为采用方式3电渗流模块的曲线、采用方式2电渗流模块的曲线、采用方式5电渗流模块的曲线、采用方式1电渗流模块的曲线、采用方式4电渗流模块的曲线。
表1采用电渗流模块前后对罗丹明B样品溶液进行溶液置换所得溶液的552nm吸光度对比
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表1统计了平行实验三次的结果，例如“方式1”是指采用方式1作为电渗流模块，“0min”是指没有进行电泳测量的吸光度值，“9.25/9.25/9.25”是指三次平行实验的测试结果。又例如，“方式1”、“10min”对应的数据“3.86/2.61/4.27”是指采用方式1作为电渗流模块电泳10min后，三次平行实验测量的吸光度分别为3.86、2.61、4.27。
图14和表1的结果显示，设置电渗流模块后在电泳作用下指示剂浓度显著降低，溶液置换效果显著增强。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

1.一种用于蛋白样品溶液置换或蛋白分离的装置，其特征在于：包括微流控芯片，用于盛放待处理的蛋白样品溶液的样品池，和电渗流模块；
所述微流控芯片的微流道呈两端细长、中间含通孔的腔体结构，微流道的两端分别开设有通孔，作为目标背景溶液入口和标背景溶液出口，中间通孔用于容纳样品池和电渗流模块；
所述样品池与微流道的中间通孔的顶部型腔紧密配合，样品池与微流道中的目标背景溶液接触的部位为半透膜结构；
所述电渗流模块与微流道的中间通孔的中下部型腔紧密配合，使用时电渗流模块放置于样品池下方，直接与微流道中的目标背景溶液接触。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述电渗流模块为具有微孔通道的膜或板材，或者，所述电渗流模块为内径为微米级别或毫米级别的毛细管组成的阵列结构；
优选的，所述电渗流模块由含二氧化硅成分的材料制备而成；
优选的，所述含二氧化硅成分的材料为硅胶、石英或玻璃；
优选的，所述电渗流模块为以下结构中的至少一种，
(1)具有微孔通道的硅胶；
(2)空心玻璃管阵列；
(3)熔融石英毛细管阵列；
(4)内部通道插入玻璃丝或石英丝的空心玻璃管阵列；
(5)具有微孔通道阵列的玻璃板。
3.根据权利要求2所述的装置，其特征在于：所述硅胶或玻璃板的微孔通道的孔径为微米级别或毫米级别；
优选的，所述硅胶或玻璃板的微孔通道的孔径为0.1mm；
优选的，所述熔融石英毛细管的内径为小于或等于1mm；
优选的，所述熔融石英毛细管的内径为0.1mm；
优选的，所述空心玻璃管的内径为0.6-0.7mm；
优选的，所述玻璃丝或石英丝的直径为0.1mm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的装置，其特征在于：还包括电路组件，所述电路组件包括导电电极和电源；
使用时，电源正极的导电电极固定在所述样品池内，与待处理的蛋白样品溶液接触，电源负极的导电电极固定在微流控芯片的目标背景溶液入口或目标背景溶液出口。
5.根据权利要求1-3任一项所述的装置，其特征在于：还包括目标背景溶液组件，所述目标背景溶液组件包括用于调控微流控芯片的微流道中目标背景溶液流速的液体推进装置；使用时，液体推进装置与微流控芯片的目标背景溶液入口连通；
优选的，所述目标背景溶液组件还包括废液池；使用时，废液池与微流控芯片的目标背景溶液出口连通。
6.根据权利要求1-3任一项所述的装置，其特征在于：所述微流控芯片由聚二甲基硅氧烷制备，并承载于玻璃载玻片上；
优选的，所述样品池由聚氨酯树脂制备，样品池的底部塑封有半透膜；
优选的，所述样品池的底部为再生纤维透析袋。
7.一种蛋白样品溶液置换或蛋白分离的方法，其特征在于：包括采用权利要求1-6任一项所述的装置对待处理的蛋白样品溶液进行原始溶液的置换或者蛋白分离。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：包括将电渗流模块和样品池置于所述微流控芯片的中间通孔中，并将样品池置于电渗流模块的上方，向所述微流控芯片的目标背景溶液入口以设定流速通入目标背景溶液，目标背景溶液经过微流道的中间通孔，最后由目标背景溶液出口排出；
将样品池清理干净，将待处理的蛋白样品溶液放入所述样品池中，使目标背景溶液与样品池内的待处理的蛋白样品溶液接触；
将电源正极的导电电极固定在所述样品池内，与待处理的蛋白样品溶液接触，电源负极的导电电极固定在微流控芯片的目标背景溶液入口或目标背景溶液出口，形成闭环回路；
通过电源施加电压，驱动待处理的蛋白样品溶液中粒径小于半透膜孔径的离子穿过半透膜，与此同时，在电渗流模块的作用下，利用电渗流效果使粒径小于半透膜孔径的中性小分子也穿过半透膜和电渗流模块，实现待处理的蛋白样品溶液的原始溶液置换；或者使尺寸小于半透膜孔径的蛋白穿过半透膜，实现待处理的蛋白样品溶液的蛋白分离。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述微流道中通入的目标背景溶液为需要置换的目标溶液或蛋白质溶解溶液；
优选的，所述微流道中通入的目标背景溶液为醋酸铵溶液、碳酸氢铵溶液或者醋酸铵或碳酸铵添加pH调节剂的溶液。
10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于：还包括在向样品池中放入待处理的蛋白样品溶液之前，检查是否漏液，如果有漏液则需要重新更换微流控芯片和/或样品池；
所述检查是否漏液包括，观察微流控芯片以及微流控芯片与样品池之间的缝隙是否有渗液。
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