CN117321192A - Ert2突变体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供了雌激素受体α配体结合结构域(ER‑LBD)的突变体，以及包含此类突变型ER‑LBD的嵌合蛋白。还提供了调控此类嵌合蛋白的转录和调控此类嵌合蛋白的定位的方法。

Description

ERT2突变体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年4月6日提交的美国临时专利申请63/171,227的权益，该临时专利申请据此以引用的方式整体并入用于所有目的。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经由EFS-Web提交并且据此以引用的方式整体并入。所述ASCII副本创建于2022年4月4日，名称为STB-028WO_SL.txt，大小为212,560字节。
背景技术
雌激素受体(ER)是一种配体依赖性转录因子，它结合内源性激素配体(诸如雌激素和雌二醇)。结合至ER的合成配体已经被开发用于治疗ER阳性癌症(诸如ER阳性乳腺癌)。例如，药物他莫昔芬的活性代谢物诱导ER的核易位并且以组织选择性方式拮抗ER。他莫昔芬及其活性代谢物也被用作研究环境中控制核定位的工具。例如，称为ERT2的ER配体结合结构域变体已经被广泛用作具有Cre重组酶的融合蛋白，该Cre重组酶调控动物模型系统中的基于Cre重组酶的基因编辑。使用合成配体来操纵核定位的能力也可用于治疗应用，诸如用于治疗性基因的调控。因此，具有改善的针对合成配体的敏感性和/或选择性的基于ERT2的系统可用于在临床环境中采用基于ERT2的基因调控。
发明内容
在一些实施方案中，本文提供了具有改善的针对非内源性配体(诸如他莫昔芬及其代谢物)的敏感性和/或选择性的经修饰的雌激素受体配体结合结构域(ER-LBD)。在一些实施方案中，本文还提供了包含如本文所述的经修饰的ER-LBD的嵌合蛋白，基因开关，编码如本文所述的经修饰的ER-LBD和嵌合蛋白的多核苷酸分子，编码如本文所述的多核苷酸分子或表达如本文所述的经修饰的ER-LBD和嵌合蛋白的细胞，以及如本文所述的经修饰的ER-LBD、嵌合蛋白、多核苷酸分子、基因开关或细胞的使用方法。
与ERT2相比，本文所述的经修饰的ER-LBD和嵌合蛋白具有更高的针对非内源性配体(例如，4-羟基他莫昔芬，也称为“4-OHT”)的敏感性和/或选择性。ERT2是ER的配体结合结构域，它包含G400V氨基酸取代、M543A氨基酸取代和L544A氨基酸取代(参见SEQ ID NO:2)。除了G400V/M543A/L544A之外，ERT2还可以包含V595A氨基酸取代(参见SEQ ID NO:3)。他莫昔芬的典型临床剂量后的平均峰值血浆浓度在纳摩尔范围内(例如，大约40ng/mL)。然而，野生型ERT2对他莫昔芬代谢物(例如，因多昔芬和4-OHT)的敏感性太低，无法用于在纳摩尔浓度的代谢物处调控基因表达。此外，ERT2可以对内源性配体(诸如雌二醇)具有反应性。因此，具有改善的针对经修饰的ER-LBD和包含经修饰的ER-LBD的嵌合蛋白的非内源性配体的敏感性和/或选择性允许使用基于ER的系统来控制基因调控。
本文提供了经修饰的雌激素受体配体结合结构域(ER-LBD)，所述经修饰的ER-LBD包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸282-595的氨基酸序列，其中所述经修饰的ER-LBD包含G400V氨基酸取代、M543A氨基酸取代和L544A氨基酸取代以及一个或多个另外的氨基酸取代，其中所述一个或多个另外的氨基酸取代在SEQ ID NO:1的区域内，所述区域选自由以下组成的组：位置343-354、位置380-392、位置404-463和位置517-540以及位置547，并且其中与包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的ER-LBD相比，或者由于一个或多个另外的氨基酸取代，与内源性配体相比，经修饰的ER-LBD具有更高的针对非内源性配体的敏感性和/或选择性。在一些方面，经修饰的ER-LBD还包含V595A氨基酸取代。在一些方面，非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物和因多昔芬。
在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的一个或多个位置，所述一个或多个位置选自由以下组成的组：343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、354、380、384、386、387、388、389、391、392、404、407、409、413、414、417、418、420、421、422、424、428、463、517、521、522、524、525、526、527、528、533、534、536、537、538、539、540和547。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置343。在一些方面，SEQID NO:1的位置343处的氨基酸取代选自由以下组成的组：M343F、M343I、M343L和M343V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置344。在一些方面，SEQID NO:1的位置344处的氨基酸取代是G344M。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置345。在一些方面，SEQID NO:1的位置345处的氨基酸取代是L345S。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置346。在一些方面，SEQID NO:1的位置346处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L346I、L346M、L346F和L346V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置347。在一些方面，SEQID NO:1的位置347处的氨基酸取代选自由以下组成的组：T347D、T347E、T347F、T347I、T347K、T347L、T347M、T347N、T347Q、T347R、T347S和T347V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置348。在一些方面，SEQID NO:1的位置348处的氨基酸取代是N348K。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置349。在一些方面，SEQID NO:1的位置349处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L349I、L349M、L349F和L349V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置350。在一些方面，SEQID NO:1的位置350处的氨基酸取代选自由以下组成的组：A350F、A350I、A350L、A350M和A350V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置351。在一些方面，SEQID NO:1的位置351处的氨基酸取代选自由以下组成的组：D351E、D351F、D351I、D351L、D351M、D351N、D351Q和D351V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置352。在一些方面，SEQID NO:1的位置352处的氨基酸取代是R352K。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置354。在一些方面，SEQID NO:1的位置354处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L354I、L354M、L354F和L354V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置380。在一些方面，SEQID NO:1的位置380处的氨基酸取代是E380Q。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置384。在一些方面，SEQID NO:1的位置384处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L384I、L384M、L384F和L384V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置386。在一些方面，SEQID NO:1的位置386处的氨基酸取代是I386V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置387。在一些方面，SEQID NO:1的位置387处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L387I、L387M、L387F和L387V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置388。在一些方面，SEQID NO:1的位置388处的氨基酸取代选自由以下组成的组：M388I、M388L和M388F。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置389。在一些方面，SEQID NO:1的位置389处的氨基酸取代是I389M。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置391。在一些方面，SEQID NO:1的位置391处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L391I、L391M、L391F和L391V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置392。在一些方面，SEQID NO:1的位置392处的氨基酸取代是V392M。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置404。在一些方面，SEQID NO:1的位置404处的氨基酸取代选自由以下组成的组：F404I、F404L、F404M和F404V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置407。在一些方面，SEQID NO:1的位置407处的氨基酸取代是N407D。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置409。在一些方面，SEQID NO:1的位置409处的氨基酸取代是L409V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置413。在一些方面，SEQID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置414。在一些方面，SEQID NO:1的位置414处的氨基酸取代是Q414E。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置417。在一些方面，SEQID NO:1的位置417处的氨基酸取代是C417S。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置418。在一些方面，SEQID NO:1的位置418处的氨基酸取代选自由以下组成的组：V418I、V418L、V418M和V418F。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置420。在一些方面，SEQID NO:1的位置420处的氨基酸取代选自由以下组成的组：G420I、G420M、G420F和G420V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置421。在一些方面，SEQID NO:1的位置421处的氨基酸取代选自由以下组成的组：M421I、M421L、M421F和M421V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置422。在一些方面，SEQID NO:1的位置422处的氨基酸取代是V422I。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置424。在一些方面，SEQID NO:1的位置424处的氨基酸取代选自由以下组成的组：I424L、I424M、I424F和I424V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置428。在一些方面，SEQID NO:1的位置428处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L428I、L428M、L428F和L428V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置463。在一些方面，SEQID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置517。在一些方面，SEQID NO:1的位置517处的氨基酸取代是M517A。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置521。在一些方面，SEQID NO:1的位置521处的氨基酸取代选自由以下组成的组：G521A、G521F、G521I、G521L、G521M和G521V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置522。在一些方面，SEQID NO:1的位置522处的氨基酸取代选自由以下组成的组：M522I、M522L和M522V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置524。在一些方面，SEQID NO:1的位置524处的氨基酸取代选自由以下组成的组：H524A、H524I、H524L、H524F和H524V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置525。在一些方面，SEQID NO:1的位置525处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L525F、L525I、L525M、L525N、L525Q、L525S、L525T和L525V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置526。在一些方面，SEQID NO:1的位置526处的氨基酸取代是Y526L。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置527。在一些方面，SEQID NO:1的位置527处的氨基酸取代是S527N。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置528。在一些方面，SEQID NO:1的位置528处的氨基酸取代选自由以下组成的组：M528F、M528I和M528V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置533。在一些方面，SEQID NO:1的位置533处的氨基酸取代选自由以下组成的组：V533F和V533W。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置534。在一些方面，SEQID NO:1的位置534处的氨基酸取代选自由以下组成的组：V534Q和V534R。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置536。在一些方面，SEQID NO:1的位置536处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L536F和L536M、L536R和L536Y。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置537。在一些方面，SEQID NO:1的位置537处的氨基酸取代选自由以下组成的组：Y537E和Y537S。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置538。在一些方面，SEQID NO:1的位置538处的氨基酸取代选自由以下组成的组：D538G和D538K。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置539。在一些方面，SEQID NO:1的位置539处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L539A和L539R。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置540。在一些方面，SEQID NO:1的位置540处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L540A和L540F。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置547。在一些方面，SEQID NO:1的位置547处的氨基酸取代是H547A。
在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代是两个氨基酸取代。在一些方面，所述两个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：343、345、347、348、351、354、384、387、388、389、391、392、404、418、421、521、524和525。在一些方面，所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置345和348，并且其中SEQ ID NO:1的位置345处的氨基酸取代是L345S，并且其中SEQ ID NO:1的位置348处的氨基酸取代是N348K。在一些方面，所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置384和389，并且其中SEQID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，并且其中SEQ ID NO:1的位置389处的氨基酸取代是I389M。在一些方面，所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置421和392，并且其中SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代是M421I，并且其中SEQ ID NO:1的位置392处的氨基酸取代是V392M。在一些方面，所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354和391，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，并且其中SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391F。在一些方面，所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354和384，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，并且其中SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M。在一些方面，所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354和387，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，并且其中SEQID NO:1的位置387处的氨基酸取代是L387M。在一些方面，所述两个氨基酸取代处于位置387和391，并且其中SEQ ID NO:1的位置387处的氨基酸取代是L387M，并且其中SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391F。在一些方面，所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置384和387，并且其中SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，并且其中SEQID NO:1的位置387处的氨基酸取代是L387M。在一些方面，所述两个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置384和391，并且其中SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，并且其中SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391F。
在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代是三个氨基酸取代。在一些方面，所述三个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：343、347、351、354、388、391、404、414、418、463、521、524和525。在一些方面，所述三个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、384和391，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，并且SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391F。在一些方面，所述三个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置414、463和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置414处的氨基酸取代是Q414E，SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P，并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524L。
在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代是四个氨基酸取代。在一些方面，所述四个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：343、347、351、354、384、388、391、404、413、418、463、521、524和525。在一些方面，所述四个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、384、391和418，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391F，并且SEQ ID NO:1的位置418处的氨基酸取代是V418I。在一些方面，所述四个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置343、388、521和404，并且其中SEQ ID NO:1的位置343处的氨基酸取代是M343I，SEQ ID NO:1的位置388处的氨基酸取代是M388I，SEQ ID NO:1的位置521处的氨基酸取代是G521I，并且SEQ ID NO:1的位置404处的氨基酸取代是F404L。在一些方面，所述四个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置524、347、351和525，并且其中SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524V，SEQ ID NO:1的位置347处的氨基酸取代是T347R，SEQ ID NO:1的位置351处的氨基酸取代是D351Q，并且SEQ ID NO:1的位置525处的氨基酸取代是L525N。在一些方面，所述四个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、384、391和463，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391V，并且SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P。在一些方面，所述四个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置384、391、413和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524F。
在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代是五个氨基酸取代。在一些方面，所述五个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：354、384、391、409、413、414、421、463和524，在一些方面，所述五个氨基酸取代处于SEQID NO:1的位置384、409、413、463和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置409处的氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P，并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524L。在一些方面，所述五个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置391、413、414、463和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391V，SEQ IDNO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置414处的氨基酸取代是Q414E，SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P，并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524F。在一些方面，所述五个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置391、414、421、463和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置414处的氨基酸取代是Q414E，SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P，并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524F。在一些方面，所述五个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、409、413、421和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置409处的氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代是M421L，并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524L。在一些方面，所述五个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、409、421、463和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置409处的氨基酸取代是L409V，SEQ IDNO:1的位置421处的氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P，并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524L。
在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代是六个氨基酸取代。在一些方面，所述六个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：354、384、391、409、413、414、421、463和524。在一些方面，所述六个氨基酸取代处于SEQID NO:1的位置384、391、413、421、463和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P，并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524L。在一些方面，所述六个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置409、413、414、421、463和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置409处的氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置414处的氨基酸取代是Q414E，SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P，并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524L。在一些方面，所述六个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、391、409、413、414和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置409处的氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置414处的氨基酸取代是Q414E，并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524L。
在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代是七个氨基酸取代。在一些方面，所述七个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：354、384、391、409、413、414、421、463、517和524。在一些方面，所述七个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、384、409、413、421、463和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置409处的氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ IDNO:1的位置421处的氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P，并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524F。在一些方面，所述七个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、391、413、421、463、517和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代是M421L，SEQ IDNO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P，SEQ ID NO:1的位置517处的氨基酸取代是M517A，并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524L。在一些方面，所述七个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、391、413、414、421、517和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置414处的氨基酸取代是Q414E，SEQ IDNO:1的位置421处的氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置517处的氨基酸取代是M517A，并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524F。
在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代是八个氨基酸取代。在一些方面，所述八个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置384、391、409、413、421、463、517和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置409处的氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P，SEQ ID NO:1的位置517处的氨基酸取代是M517A，并且SEQID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524F。
本文还提供了包含融合至如本文所述的经修饰的ER-LBD的所关注的多肽的嵌合蛋白。在一些方面，所关注的多肽包含核酸结合结构域。在一些方面，核酸结合结构域包括锌指结构域。在一些方面，核酸结合结构域包括锌指结构域。在一些方面，锌指结构域包含序列MSRPGERPFQCRICMRNFSNMSNLTRHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSDRSVLRRHLRTHTGSQKPFQCRICMRNFSDPSNLARHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSDRSSLRRHLRTHTGSQKPFQCRICMRNFSQSGTLHRHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSQRPNLTRHLRTHLRGS(SEQ ID NO:62)。在一些方面，嵌合蛋白包含嵌合转录因子，并且其中所关注的多肽包含核酸结合结构域和转录调控子结构域。在一些方面，转录模块结构域是转录激活因子。在一些方面，转录激活因子选自由以下组成的组：单纯疱疹病毒蛋白16(VP16)激活结构域；包含VP16的四个串联拷贝的激活结构域；VP64激活结构域；NFκB的p65激活结构域(p65)；爱泼斯坦-巴尔病毒R反式激活因子(Rta)激活结构域；包含VP64、p65和Rta激活结构域(VPR激活结构域)的三元激活因子；包含VP64、p65和HSF1激活结构域(VPH激活结构域)的三元激活因子；和人E1A相关蛋白p300的组蛋白乙酰转移酶核心结构域(p300 HAT核心激活结构域)。在一些方面，转录模块结构域是p65转录激活因子，所述p65转录激活因子包含氨基酸序列DEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS(SEQ ID NO:64)。
本文还提供了分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含编码如本文所述的经修饰的ER-LBD或编码如本文所述的嵌合蛋白的核苷酸序列。
本文还提供了异源性构建体，所述异源性构建体包含可操作地连接至如本文所述的多核苷酸分子的启动子。
本文还提供了包含如本文所述的异源性构建体的质粒。
本文还提供了包含如本文所述的异源性构建体或如本文所述的质粒的细胞。
本文还提供了用于调控所关注的基因的转录的基因开关，所述基因开关包含：(a)如本文所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白结合至嵌合转录因子响应性(CTF响应性)启动子，所述启动子可操作地连接至所关注的基因；和(b)非内源性配体，其中所述非内源性配体与经修饰的ER-LBD的结合诱导嵌合蛋白调控所关注的基因的转录。
在一些方面，非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物和因多昔芬。
在一些方面，所关注的基因编码选自由以下组成的组的多肽：细胞因子、趋化因子、归巢分子、生长因子、细胞死亡调控因子、共活化分子、肿瘤微环境调节物a、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
在一些方面，所关注的基因编码选自由以下组成的组的细胞因子：IL1-β、IL-2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL12p70融合蛋白、IL15、IL17A、IL18、IL21、IL22、I型干扰素、干扰素-γ和TNF-α；和/或
在一些方面，所关注的基因编码IL12p70融合蛋白，所述IL12p70融合蛋白包含氨基酸序列MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGSGGGSGGGSGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS(SEQ ID NO:58)。
本文还提供了一种调控所关注的基因的转录的方法，所述方法包括：用(i)编码如本文所述的嵌合蛋白的异源性构建体和(ii)包含嵌合转录因子响应性(CTF响应性)启动子的靶标表达盒来转化细胞，所述启动子可操作地连接至所关注的基因，以及通过使经转化的细胞与非内源性配体接触来诱导嵌合蛋白调控所关注的基因的转录。在一些方面，所述方法还包括在诱导嵌合蛋白调控转录之前在适合于嵌合蛋白的表达的条件下培养经转化的细胞。在一些方面，调控转录包括活化所关注的基因的转录。在一些方面，靶标表达盒由编码如本文所述的嵌合蛋白的异源性构建体编码，或者靶标表达盒由第二异源性构建体编码。在一些方面，非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物和因多昔芬。
本文还提供了一种调控嵌合蛋白的定位的方法，所述方法包括用编码如本文所述的嵌合蛋白的异源性构建体来转化细胞，以及通过使经转化的细胞与非内源性配体接触来诱导嵌合蛋白的核定位。在一些方面，所述方法还包括在诱导核定位之前在适于嵌合蛋白的表达的条件下培养经转化的细胞。在一些方面，非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物和因多昔芬。
在一些方面，经转化的细胞在人或动物中，并且其中使经转化的细胞与非内源性配体接触包括将药理学剂量的配体施用于人或动物。
在一些方面，非内源性配体以非内源性配体对SEQ ID NO:1的野生型雌激素受体α基本上无活性的浓度施用。
本文提供了经修饰的ER-LBD，所述经修饰的ER-LBD包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸282-595的氨基酸序列和在SEQ ID NO:1的区域内的一个或多个另外的氨基酸取代，所述区域选自由以下组成的组：位置343-354、位置380-392、位置404-463、位置517-540和位置547。在一些方面，如本文所述的经修饰的ER-LBD还包含G400V氨基酸取代、M543A氨基酸取代和L544A氨基酸取代。在一些方面，经修饰的ER-LBD还包含G400V氨基酸取代、M543A氨基酸取代、L544A和V595A氨基酸取代。
在一些方面，经修饰的ER-LBD包含G400V氨基酸取代、M543A氨基酸取代和L544A氨基酸取代以及一个或多个另外的氨基酸取代。在一些方面，与包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的ER-LBD相比，经修饰的ER-LBD具有更高的针对非内源性配体的敏感性。在一些方面，与包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的ER-LBD相比，经修饰的ER-LBD具有更高的针对非内源性配体的选择性。
在一些方面，经修饰的ER-LBD包含G400V氨基酸取代、M543A氨基酸取代、L544A氨基酸取代和V595A氨基酸取代以及一个或多个另外的氨基酸取代。在一些方面，与包含SEQID NO:3的氨基酸序列的ER-LBD相比，经修饰的ER-LBD具有更高的针对非内源性配体的敏感性。在一些方面，与包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的ER-LBD相比，经修饰的ER-LBD具有更高的针对非内源性配体的选择性。
在一些方面，由于一个或多个另外的氨基酸取代，与内源性配体相比，本公开的经修饰的ER-LBD具有更高的针对非内源性配体的敏感性。
在一些方面，与包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的ER-LBD相比，本公开的经修饰的ER-LBD具有更高的针对非内源性配体的敏感性。
在一些方面，与包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的ER-LBD相比，本公开的经修饰的ER-LBD具有更高的针对非内源性配体的选择性。
在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的一个或多个位置，所述一个或多个位置选自由以下组成的组：343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、354、380、384、386、387、388、389、391、392、404、407、409、413、414、417、418、420、421、422、424、428、463、517、521、522、524、525、526、527、528、533、534、536、537、538、539、540和547。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置343。在一些方面，位置343处的氨基酸取代选自由以下组成的组：M343F、M343I、M343L和M343V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置344。在一些方面，位置344处的氨基酸取代是G344M。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置345。在一些方面，位置345处的氨基酸取代是L345S。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置346。在一些方面，位置346处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L346I、L346M、L346F和L346V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置347。在一些方面，位置347处的氨基酸取代选自由以下组成的组：T347D、T347E、T347F、T347I、T347K、T347L、T347M、T347N、T347Q、T347R、T347S和T347V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置348。在一些方面，位置348处的氨基酸取代是N348K。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置349。在一些方面，位置349处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L349I、L349M、L349F和L349V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置350。在一些方面，位置350处的氨基酸取代选自由以下组成的组：A350F、A350I、A350L、A350M和A350V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置351。在一些方面，位置351处的氨基酸取代选自由以下组成的组：D351E、D351F、D351I、D351L、D351M、D351N、D351Q和D351V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置352。在一些方面，位置352处的氨基酸取代是R352K。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置354。在一些方面，位置354处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L354I、L354M、L354F和L354V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置380。在一些方面，位置380处的氨基酸取代是E380Q。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置384。在一些方面，位置384处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L384I、L384M、L384F和L384V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置386。在一些方面，位置386处的氨基酸取代是I386V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置387。在一些方面，位置387处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L387I、L387M、L387F和L387V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置388。在一些方面，位置388处的氨基酸取代选自由以下组成的组：M388I、M388L和M388F。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置389。在一些方面，位置389处的氨基酸取代是I389M。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置391。在一些方面，位置391处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L391I、L391M、L391F和L391V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置392。在一些方面，位置392处的氨基酸取代是V392M。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置404。在一些方面，位置404处的氨基酸取代选自由以下组成的组：F404I、F404L、F404M和F404V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置407。在一些方面，位置407处的氨基酸取代是N407D。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置409。在一些方面，位置409处的氨基酸取代是L409V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置413。在一些方面，位置413处的氨基酸取代是N413D。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置414。在一些方面，位置414处的氨基酸取代是Q414E。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置417。在一些方面，位置417处的氨基酸取代是C417S。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置418。在一些方面，位置418处的氨基酸取代选自由以下组成的组：V418I、V418L、V418M和V418F。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置420。在一些方面，位置420处的氨基酸取代选自由以下组成的组：G420I、G420M、G420F和G420V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置421。在一些方面，位置421处的氨基酸取代选自由以下组成的组：M421I、M421L、M421F和M421V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置422。在一些方面，位置422处的氨基酸取代是V422I。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置424。在一些方面，位置424处的氨基酸取代选自由以下组成的组：I424L、I424M、I424F和I424V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置428。在一些方面，位置428处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L428I、L428M、L428F和L428V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置463。在一些方面，位置463处的氨基酸取代是S463P。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置517。在一些方面，位置517处的氨基酸取代是M517A。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置521。在一些方面，位置521处的氨基酸取代选自由以下组成的组：G521A、G521F、G521I、G521L、G521M和G521V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置522。在一些方面，位置522处的氨基酸取代选自由以下组成的组：M522I、M522L和M522V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置524。在一些方面，位置524处的氨基酸取代选自由以下组成的组：H524A、H524I、H524L、H524F和H524V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置525。在一些方面，位置525处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L525F、L525I、L525M、L525N、L525Q、L525S、L525T和L525V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置526。在一些方面，位置526处的氨基酸取代是Y526L。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置527。在一些方面，位置527处的氨基酸取代是S527N。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置528。在一些方面，位置528处的氨基酸取代选自由以下组成的组：M528F、M528I和M528V。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置533。在一些方面，位置533处的氨基酸取代选自由以下组成的组：V533F和V533W。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置534。在一些方面，位置534处的氨基酸取代选自由以下组成的组：V534Q和V534R。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置536。在一些方面，位置536处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L536F和L536M、L536R和L536Y。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置537。在一些方面，位置537处的氨基酸取代选自由以下组成的组：Y537E和Y537S。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置538。在一些方面，位置538处的氨基酸取代选自由以下组成的组：D538G和D538K。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置539。在一些方面，位置539处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L539A和L539R。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置540。在一些方面，位置540处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L540A和L540F。
在一些方面，所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置547。在一些方面，位置547处的氨基酸取代是H547A。
在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代包括两个氨基酸取代。在一些方面，所述两个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：343、345、347、348、351、354、384、387、388、389、391、392、404、418、421、521、524和525。
在一些方面，所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置345和348。在一些方面，在SEQ ID NO:1的位置345处的氨基酸取代是L345S并且在SEQ ID NO:1的位置348处的氨基酸取代是N348K。
在一些方面，所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置384和389。在一些方面，在SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M并且在SEQ ID NO:1的位置389处的氨基酸取代是I389M。
在一些方面，所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置421和392。在一些方面，在SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代是M421I并且在SEQ ID NO:1的位置392处的氨基酸取代是V392M。
在一些方面，所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354和391。在一些方面，在SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I并且在SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391F。
在一些方面，所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354和384。在一些方面，在SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I并且在SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M。
在一些方面，所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354和387。在一些方面，在SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I并且在SEQ ID NO:1的位置387处的氨基酸取代是L387M。
在一些方面，所述两个氨基酸取代处于位置387和391。在一些方面，在SEQ ID NO:1的位置387处的氨基酸取代是L387M并且在SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391F。
在一些方面，所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置384和387。在一些方面，在SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M并且在SEQ ID NO:1的位置387处的氨基酸取代是L387M。
在一些方面，所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置384和391。在一些方面，在SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M并且在SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391F。
在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代包括三个氨基酸取代。在一些方面，所述三个氨基酸取代各自处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：343、347、351、354、388、391、404、418、521、524和525。
在一些方面，所述三个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、384和391。在一些方面，在SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，在SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，并且在SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391F。
在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代包括四个氨基酸取代。
在一些方面，所述四个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、384、391和418。在一些方面，在SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，在SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，在SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391F，并且在SEQ IDNO:1的位置418处的氨基酸取代是V418I。
在一些方面，所述四个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置343、388、521和404。在一些方面，在SEQ ID NO:1的位置343处的氨基酸取代是M343I，在SEQ ID NO:1的位置388处的氨基酸取代是M388I，在SEQ ID NO:1的位置521处的氨基酸取代是G521I，并且在SEQ IDNO:1的位置404处的氨基酸取代是F404L。
在一些方面，所述四个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置524、347、351和525。在一些方面，在SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524V，在SEQ ID NO:1的位置347处的氨基酸取代是T347R，在SEQ ID NO:1的位置351处的氨基酸取代是D351Q，并且在SEQ IDNO:1的位置525处的氨基酸取代是L525N
在一些方面，非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬(4-OHT)、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物和因多昔芬。
还提供了包含融合至如本文所述的经修饰的ER-LBD的所关注的多肽的嵌合蛋白。在一些方面，所关注的多肽包含核酸结合结构域。在一些方面，核酸结合结构域包括锌指(ZF)结构域。在一些方面，嵌合蛋白是转录因子，并且所关注的多肽包含转录调控子结构域。
还提供了编码如本文所述的经修饰的ER-LBD或如本文所述的嵌合蛋白的分离的多核苷酸分子。
还提供了包含可操作地连接至编码如本文所述的经修饰的ER-LBD或如本文所述的嵌合蛋白的多核苷酸分子的启动子的异源性构建体。
还提供了包含如本文所述的异源性构建体的质粒。
还提供了包含如本文所述的异源性构建体或如本文所述的质粒的细胞(诸如，分离的细胞或细胞群)。
还提供了用于调控所关注的基因的转录的基因开关。在一些方面，基因开关包括包含如本文所述的经修饰的ER-LBD和转录调控子的嵌合蛋白，以及非内源性配体，其中非内源性配体与经修饰的ER-LBD的结合诱导嵌合蛋白调控所关注的基因的转录。在一些方面，基因开关的非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬(4-OHT)、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物和因多昔芬。
本文还提供了一种调控所关注的基因的转录的方法。在一些方面，所述方法包括(a)用(i)编码包含经修饰的ER-LBD和转录调控子结构域的嵌合蛋白的异源性构建体和(ii)包含所关注的基因的靶标表达盒来转化细胞；(b)在适于嵌合蛋白的表达的条件下培养经转化的细胞；以及
(c)通过使经转化的细胞与非内源性配体接触来诱导嵌合蛋白调控所关注的基因的转录。
在一些方面，调控转录的方法是活化转录的方法。
在一些方面，调控转录的方法是抑制转录的方法。
在一些方面，靶标表达盒由编码嵌合体的异源性构建体编码。
在一些方面，靶标表达盒由与编码嵌合体的异源性构建体不同的异源性构建体编码。
还提供了一种调控所关注的多肽的定位的方法。在一些方面，所述方法包括(a)用编码嵌合蛋白的异源性构建体来转化细胞，所述嵌合蛋白包含融合至如本文所述的经修饰的ER-LBD的所关注的多肽；(b)在适于嵌合蛋白的表达的条件下培养经转化的细胞；以及(c)通过使经转化的细胞与非内源性配体接触来诱导嵌合蛋白的核定位。
在一些方面，本文所述的方法中的任一种的经转化的细胞在人或动物中。在一些方面，使经转化的细胞与非内源性配体接触包括将药理学剂量的配体施用于人或动物。
在一些方面，前述方法的步骤(c)的非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物和因多昔芬。
在一些实施方案中，非内源性配体以非内源性配体对野生型雌激素受体α基本上无活性的浓度施用。
附图说明
关于以下描述和附图，将更好地理解本公开的这些和其他特征、方面和优点。
图1A和图1B提供了通过计算机模拟分析的第一组突变的结合能计算。图1A提供了与雌二醇结合的结合能计算，图1B提供了与4-OHT结合的结合能计算。
图2提供了通过计算机模拟分析的针对第二组突变的4-OHT结合的结合能计算。
图3提供了通过计算机模拟分析的针对第三组突变的4-OHT结合的结合能计算。
图4提供了通过计算机模拟分析的针对第四组突变的4-OHT结合的结合能计算。
图5提供了通过计算机模拟分析的针对第五组突变的4-OHT结合的结合能计算。
图6显示了在螺旋12的取向和对接位点上雌二醇结合的和非内源性配体结合的构象之间的结构差异。
图7提供了通过计算机模拟分析的针对第六组突变的激动剂结合的与拮抗剂结合的构象的结合能计算。
图8A、图8B和图8C显示了在第一次转染筛选中测定的在不同浓度的4-OHT下各种经修饰的ER-LBD对报告基因表达的影响。
图9A、图9B和图9C显示了在第二次转染筛选中测定的在不同浓度的4-OHT下各种经修饰的ER-LBD对报告基因表达的影响。
图10A、图10B和图10C显示了在第三次转染筛选中测定的在不同浓度的4-OHT下各种经修饰的ER-LBD对报告基因表达的影响。
图11A和图11B显示了在第一次转导筛选中测定的在不同浓度的4-OHT下各种经修饰的ER-LBD对报告基因表达的影响。
图12显示了在第二次转导筛选中测定的在不同浓度的4-OHT下各种经修饰的ER-LBD对报告基因表达的影响。
图13显示了在第二次转导筛选中测定的在不同浓度的4-OHT下各种经修饰的ER-LBD对报告基因表达的影响。
图14A和图14B显示了ERT2(SB04401)和OFF mCherry报告基因构建体(SB01066)的高通量蛋白质工程化的骨架。
图15A和图15B显示了在组合文库筛选中测定的在不同浓度的因多昔芬和4-OHT下各种经修饰的ER-LBD对报告基因表达的影响。
图16A、图16B、图16C和图16D显示了在验证筛选中测定的在不同浓度的因多昔芬、4-OHT和雌二醇下各种经修饰的ER-LBD对报告基因表达的影响。SB03422是野生型ER-LBD，被纳入作为表现基准。
图17A和图17B显示了在NK细胞中测定的在不同浓度的因多昔芬和4-OHT下各种经修饰的ER-LBD对报告基因表达的影响。箭头表示在人体中的药理学相关的4-OHT或因多昔芬的估算浓度。
图18A和图18B显示了在NK细胞中测定的在不同浓度的因多昔芬下各种经修饰的ER-LBD对IL-12表达的影响。
具体实施方式
除非另有说明，否则权利要求和说明书中使用的术语定义如下。
术语“体内”是指发生在活生物体内的过程。
如本文使用的术语“哺乳动物”包括人和非人，包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物和猪科动物。
术语百分比“同一性”，在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，是指两个或更多个序列或子序列，当比较和比对最大对应性时，具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，如使用下述序列比较算法之一(例如，BLASTP和BLASTN或技术人员可用的其他算法)或通过目视检查测量的。根据应用，百分比“同一性”可以存在于进行比较的序列的一个区域中，例如，存在于功能结构域中，或者可替代地，存在于要比较的两个序列的全长中。
对于序列比较而言，通常一个序列用作参考序列，将测试序列与其做比较。在使用序列比较算法时，把测试序列和参考序列输入计算机，如有必要，则指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后该序列比较算法基于指定程序参数，计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
可以进行用于比较的序列的最佳比对，例如，通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)，或通过目视检查(通常参见Ausubel等人，见下文)。
适于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，该算法在Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中有描述。可通过国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得用于进行BLAST分析的软件。
术语“足量”意指足以产生所需效果的量，例如足以调节细胞中的蛋白质聚集的量。
术语“治疗有效量”是有效改善疾病症状的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以被认为是治疗。
必须指出的是，如本说明书和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一种(个)”和“所述(该)”包括复数指示物。
经修饰的雌激素受体配体结合结构域(ER-LBD)
本公开提供了一种经修饰的雌激素受体配体结合结构域(ER-LBD)，所述经修饰的ER-LBD包含对应于SEQ ID NO:1(人雌激素受体，UniProt ID No：P03372)的氨基酸282-595的氨基酸序列，包含氨基酸取代G400V、M543A和L544A或氨基酸取代G400V、M543A、L544A和V595A，并且包含在SEQ ID NO:1的区域内的配体结合残基的一个或多个另外的氨基酸取代，所述区域选自位置343-354、位置380-392、位置404-463和位置517-540以及位置547。在一些方面，一个或多个氨基酸取代产生：(a)与内源性配体相比，更高的针对非内源性配体的敏感性，(b)与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的ER-LBD相比，更高的针对非内源性配体的敏感性，和/或(c)与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的ER-LBD相比，更高的针对非内源性配体的选择性。
一个或多个另外的氨基酸取代可以产生：(a)与内源性配体相比，更高的针对非内源性配体的敏感性，(b)与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的ER-LBD相比，更高的针对非内源性配体的敏感性和/或(c)与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的ER-LBD相比，更高的针对非内源性配体的选择性。在一些实施方案中，一个或多个另外的氨基酸取代产生与SEQ ID NO:2的ER-LBD相比更高的针对非内源性配体的敏感性。在一些实施方案中，一个或多个另外的氨基酸取代产生与SEQ ID NO:2的ER-LBD相比更高的针对非内源性配体的敏感性。在一些实施方案中，一个或多个另外的氨基酸取代产生与SEQ ID NO:2的ER-LBD相比更高的针对非内源性配体的选择性。在一些实施方案中，一个或多个另外的氨基酸取代产生与SEQ IDNO:3的ER-LBD相比更高的针对非内源性配体的选择性。
“配体结合残基”是指定位于雌激素受体(ER)的配体结合口袋或ER-配体结合结构域的残基，并且包括用于与内源性配体(例如，雌二醇)结合的口袋和用于与非内源性配体(诸如4-OHT)结合的口袋。对应于SEQ ID NO:1的位置343-354、位置380-392和位置404-463内的残基涉及与内源性和非内源性配体的结合。对应于SEQ ID NO:1的位置517-547内的残基(例如，残基517-40和残基547)定位于称为螺旋12的螺旋内并且涉及内源性配体结合。
与对非内源性配体的敏感性相比，对非内源性配体的敏感性更高意味着，经修饰的ER-LBD结合至非内源性配体(例如，因多昔芬)的亲和力比它结合至内源性配体(例如，雌二醇)的亲和力更高。
与对不包含一个或多个氨基酸取代的ER-LBD(例如，包含SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的氨基酸序列的ER-LBD)的敏感性相比，对非内源性配体的敏感性更高意味着，经修饰的ER-LBD结合至非内源性配体(例如，因多昔芬)的亲和力比不包含一个或多个另外的氨基酸取代的ER-LBD与非内源性配体结合的亲和力更高。在一些实施方案中，与不包含一个或多个另外的氨基酸取代的ER-LBD的结合相比，更高的灵敏度是与非内源性配体的结合亲和力改善至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。在一些实施方案中，更高的灵敏度通过以下方式来展示：即与包含缺乏一个或多个另外的氨基酸取代的ER-LBD的嵌合转录因子相比，包含经修饰的ER-LBD的嵌合转录因子的转录调控更高(例如，转录活化更高或转录阻遏更高)。在一些实施方案中，在转导的转染测定法中，在嵌合转录因子响应性启动子的控制下，响应于非内源性配体(例如，4-OHT)，包含经修饰的ER-LBD的嵌合转录因子，与在相同条件下但是使用缺乏一个或多个另外的氨基酸取代的ER-LBD的报告基因的表达相比，能够诱导报告基因的表达增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少35％(如通过报告基因阳性细胞百分比所测量，或如通过几何平均荧光强度所测量)。
对非内源性配体的选择性更高是指与内源性配体(例如，雌二醇)相比，优先结合至非内源性配体(例如，4-OHT或因多昔芬)。选择性可以使用选择性系数来度量，该系数是在与底物(例如，经修饰的ER-LBD)的复合物中一个配体(例如，非内源性配体)被另一个配体(例如，内源性配体)取代的反应的平衡常数。选择性系数越大，竞争性配体(例如，内源性配体)从与底物(例如，经修饰的ER-LBD)形成的复合物取代初始配体(例如，非内源性配体)的程度就越大。在一些实施方案中，更高的选择性通过以下方式来展示：即与在存在内源性配体的情况下的转录调控相比，在存在非内源性配体的情况下，嵌合转录因子的转录调控得以改善。在一些实施方案中，在转导的转染测定法中，在嵌合转录因子响应性启动子的控制下，响应于非内源性配体(例如，4-OHT)，包含经修饰的ER-LBD的嵌合转录因子，与在相同条件下但是响应于内源性配体(例如，雌二醇)的报告基因的表达相比，能够诱导报告基因的表达增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少35％(如通过报告基因阳性细胞百分比所测量，或如通过几何平均荧光强度所测量)。
在一些方面，配体结合残基的一个或多个氨基酸取代包括螺旋12内的一个或多个氨基酸取代。ER-LBD的螺旋12包括SEQ ID NO:1的残基位置533-547。在一些实施方案中，螺旋12内的一个或多个氨基酸取代在选自538、536、539、540、547、534、533和537的一个或多个位置处。
“非内源性配体”可以指例如不由表达雌激素受体的生物体天然表达的合成雌激素受体结合配体。非内源性雌激素受体结合配体包括但不限于他莫昔芬及其代谢物，诸如4-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物和因多昔芬。
一个或多个另外的氨基酸取代可以在SEQ ID NO:1的一个或多个位置处，所述位置选自：343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、354、380、384、386、387、388、389、391、392、404、407、409、413、414、417、418、420、421、422、424、428、463、517、521、522、524、525、526、527、528、533、534、536、537、538、539、540和547。在一些实施方案中，一个或多个另外的氨基酸取代包括在上文列出的位置中的一个、上文列出的位置中的两个、上文列出的位置中的三个、上文列出的位置中的四个或上文列出的位置中的五个处的取代。
在一些方面，一个或多个另外的氨基酸取代选自表1中列出的取代中的一个或多个。
表1
在一些方面，一个或多个另外的突变包括至少两个突变、至少三个突变、至少四个突变、至少五个突变、至少六个突变、至少七个突变或至少八个突变。在一些方面，一个或多个另外的突变包括二至十个突变、二至九个突变、二至八个突变、二至七个突变、二至六个突变、二至五个突变、二至四个突变、二至三个突变、三至十个突变、三至九个突变、三至八个突变、三至七个突变、三至六个突变、三至五个突变、三至四个突变、四至十个突变、四至九个突变、四至八个突变、四至七个突变、四至六个突变、四至五个突变、五至十个突变、五至九个突变、五至八个突变、五至七个突变、五至六个突变、六至十个突变、六至九个突变、六至八个突变、六至七个突变、七至十个突变、七至九个突变、七至八个突变、八至十个突变、八至九个突变或九至十个突变。
在一些方面，一个或多个另外的突变包括选自表2中列出的突变中的至少两个突变。
表2
在一些实施方案中，本文提供了一种经修饰的ER-LBD变体，该变体具有的氨基酸序列与如本文所述的经修饰的ER-LBD具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性，条件是该变体包含G400V/MS43A/L544A三氨基酸取代或G400V/M543A/L544A/V595A四氨基酸取代，并且包含赋予更高的针对非内源性配体的灵敏度和/或选择性的一个或多个另外的氨基酸取代(例如，表1和表2中所示的氨基酸取代中的一个或多个)。
嵌合蛋白
在一些方面，本公开提供了包含融合至经修饰的ER-LBD的所关注的多肽的嵌合蛋白。经修饰的ER-LBD能够在结合至非内源性配体时进行核定位。因此，经修饰的ER-LBD与所关注的多肽的融合可以允许控制所关注的多肽的细胞定位。
在一些实施方案中，所关注的多肽包含接头。一个或多个接头可以在嵌合蛋白的各个结构域之间使用，诸如在ER-LBD和所关注的多肽之间使用。例如，多肽接头可以包含诸如以下一者或多者的氨基酸序列：GGGGSGGGGSGGGGSVDGF(SEQ ID NO:4)和ASGGGGSAS(SEQID NO:5)。
在一些实施方案中，所关注的多肽包含至少一个核酸结合结构域。在一些实施方案中，核酸结合结构域是锌指结构域。在一些实施方案中，嵌合蛋白包含转录调控子，诸如转录激活因子或转录阻遏因子。包含核酸结合结构域可以允许通过由非内源性配体(例如，4-OHT或因多昔芬)诱导的嵌合蛋白进行靶向核酸结合。
在一些方面，核酸结合结构域包含DNA结合锌指蛋白结构域(ZF蛋白结构域)。在一些方面，ZF蛋白结构域在设计上是模块化的，并且由锌指阵列(ZFA)构成。在一些方面，所述转录效应子结构域选自：单纯疱疹病毒蛋白16(VP16)激活结构域；包含VP16的四个串联拷贝的激活结构域、VP64激活结构域；NFκB的p65激活结构域；爱泼斯坦-巴尔病毒R反式激活因子(Rta)激活结构域；包含VP64、p65和Rta激活结构域(VPR激活结构域)的三元激活因子；包含VP64、p65和HSF1激活结构域(VPH激活结构域)的三元激活因子；人E1A相关蛋白p300的组蛋白乙酰转移酶(HAT)核心结构域(p300 HAT核心激活结构域)；Krüppel相关盒(KRAB)阻遏结构域；阻遏因子元件沉默转录因子(REST)阻遏结构域；毛发相关的基本螺旋-环-螺旋阻遏蛋白的WRPW基序(SEQ ID NO:82)，所述基序称为WRPW((SEQ ID NO:82))阻遏结构域；DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶3B(DNMT3B)阻遏结构域；和HP1α染色体阴影阻遏结构域。
在一些实施方案中，ZF蛋白结构域在设计上是模块化的，并且由锌指阵列(ZFA)构成。锌指阵列包含多个连接在一起的锌指蛋白基序。每个锌指基序与不同的核酸基序结合。这导致ZFA对任何所需的核酸序列具有特异性。ZF基序可以彼此直接相邻，或由灵活的接头序列隔开。在一些实施方案中，ZFA是串联排列的ZF基序的阵列、串或链。ZFA可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个锌指基序。ZFA可以具有1-10、1-15、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10或5-15个锌指基序。
ZF蛋白结构域可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个ZFA。ZF结构域可以具有1-10、1-15、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10或5-15个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含一至十个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含至少一个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含至少两个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含至少三个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含至少四个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含至少五个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含至少十个ZFA。
示例性的ZF蛋白结构域在序列SRPGERPFQCRICMRNFSRRHGLDRHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSDHSSLKRHLRTHTGSQKPFQCRICMRNFSVRHNLTRHLRTHTGEKPFQCRICMRNFSDHSNLSRHLKTHTGSQKPFQCRICMRNFSQRSSLVRHLRTHTGEKPFQCRICMRNFSESGHLKRHLRTHLRGS(SEQ ID NO:6)中示出。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域是ZF5-7 DNA结合结构域。示例性ZF5-7DNA结合结构域在序列MSRPGERPFQCRICMRNFSNMSNLTRHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSDRSVLRRHLRTHTGSQKPFQCRICMRNFSDPSNLARHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSDRSSLRRHLRTHTGSQKPFQCRICMRNFSQSGTLHRHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSQRPNLTRHLRTHLRGS(SEQ ID NO:62)中示出。
在一些实施方案中，嵌合蛋白是嵌合转录因子，并且除了经修饰的ER-LBD之外还包含核酸结合结构域和转录调控子结构域。在一些方面，核酸结合结构域和转录调控子结构域是相同的天然存在的蛋白质的一部分。在一些方面，核酸结合结构域和转录调控子结构域是异源性的并且天然不存在于相同的蛋白质内。
如本文所用，“转录调控子结构域”是指当靶向基因的启动子区域(例如，通过特异性结合至所关注的启动子的核酸结合结构域)时，能够调控基因的转录的多肽结构域。在一些方面，转录调控子结构域包括转录阻遏因子。在一些方面，转录阻遏因子包含转录阻遏因子结构域，所述转录阻遏因子结构域选自：Krüppel相关盒(KRAB)阻遏结构域；阻遏因子元件沉默转录因子(REST)阻遏结构域；毛发相关的基本螺旋-环-螺旋阻遏蛋白的WRPW基序(SEQ ID NO:82)，所述基序称为WRPW(SEQ ID NO:82)阻遏结构域；DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶3B(DNMT3B)阻遏结构域；和HP1α染色体阴影阻遏结构域。
在一些方面，转录调控子结构域包括转录激活因子。在一些方面，转录激活因子包含转录激活因子结构域，所述转录激活因子结构域选自：单纯疱疹病毒蛋白16(VP16)激活结构域；包含VP16的四个串联拷贝的激活结构域；VP64激活结构域；NFκB的p65激活结构域(即，p65)；爱泼斯坦-巴尔病毒R反式激活因子(Rta)激活结构域；包含VP64、p65和Rta激活结构域(VPR激活结构域)的三元激活因子；包含VP64、p65和HSF1激活结构域(VPH激活结构域)的三元激活因子；和人E1A相关蛋白p300的组蛋白乙酰转移酶(HAT)核心结构域(p300HAT核心激活结构域)。在一些方面，转录调控子结构域包含p65转录激活因子。在一些方面，p65转录激活因子包含氨基酸序列DEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS(SEQ IDNO:64)。
基因开关
本文还提供了用于调控转录的基因开关。基因开关可以包含(a)嵌合转录因子，它包含经修饰的ER-LBD并且能够结合至嵌合转录因子响应性启动子(CTF响应性启动子)，所述嵌合转录因子响应性启动子可操作地连接至所关注的基因，和(b)非内源性配体，它结合至嵌合蛋白的经修饰的ER-LBD。在非内源性配体与经修饰的ER-LBD结合时，嵌合蛋白可以调控所关注的基因的转录。
在一些实施方案中，所关注的基因编码选自由以下组成的组的多肽：细胞因子、趋化因子、归巢分子、生长因子、细胞死亡调控因子、共活化分子、肿瘤微环境调节物a、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。在一些实施方案中，所关注的基因编码细胞因子。在一些实施方案中，所关注的基因编码选自由以下组成的组的细胞因子：IL1-β、IL-2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL-12p70融合蛋白、IL15、IL17A、IL18、IL21、IL22、I型干扰素、干扰素-γ和TNF-α。在一些实施方案中，所关注的基因编码IL12p70融合蛋白，所述IL12p70融合蛋白包含氨基酸序列MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGSGGGSGGGSGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS(SEQ ID NO:58)。
在一些实施方案中，非内源性配体选自4-羟基他莫昔芬(4-OHT)、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物和因多昔芬。
在特定实施方案中，非内源性配体是4-羟基他莫昔芬(4-OHT，也称为阿非昔芬)。
在特定实施方案中，非内源性配体是因多昔芬。
分离的多核苷酸分子和异源性构建体
本文还提供了编码如本文所述的经修饰的ER-LBD或嵌合蛋白的分离的多核苷酸分子和异源性构建体。在一些方面，本公开提供了一种分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含编码如本文所述的经修饰的ER-LBD或嵌合蛋白的核苷酸序列。在一些方面，本公开提供了一种异源性构建体，所述异源性构建体包含可操作地连接至多核苷酸分子的启动子，所述多核苷酸分子编码经修饰的ER-LBD或嵌合蛋白。
在一些方面，本公开还提供了包含靶基因表达盒的分离的多核苷酸和/或异源性构建体。
“分离的”核酸分子或多核苷酸是指已经从天然环境移除的核酸分子，诸如DNA或RNA。例如，编码异源性构建体中含有的经修饰的ER-LBD或嵌合蛋白的多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的其他实例包括维持在异源性宿主细胞中的重组多核苷酸或溶于溶液的纯化的(部分或基本上)多核苷酸。分离的多核苷酸还包括通常含有多核苷酸分子的细胞中所含的多核苷酸分子，但是所述多核苷酸分子存在于染色体外或不同于天然染色体位置的染色体位置处。
分离的多核苷酸分子包括但不限于cDNA多核苷酸、RNA多核苷酸、RNAi寡核苷酸(例如，siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、shRNA等)、mRNA多核苷酸、环状质粒、线性DNA片段、载体、微环、ssDNA、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)以及寡核苷酸。
在一些实施方案中，分离的多核苷酸分子选自：DNA、cDNA、RNA、mRNA和裸质粒(线性或环状)。
所谓与本发明的参考核苷酸序列具有至少例如95％“同一性”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，意指所述多核苷酸的核苷酸序列与参考序列具有同一性，但是多核苷酸序列可以包含每100个核苷酸的参考核苷酸序列最多五个点突变。换句话说，为了获得与参考核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中最多5％的核苷酸可以缺失或被另一个核苷酸取代，或者参考序列中最多5％的总核苷酸的核苷酸数量可以插入到参考序列中。参考序列的这些改变可以发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或这些末端位置之间的任何位置处，单独散布在参考序列中的残基中或散布在参考序列内的一个或多个连续组中。实际上，任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，可以常规地使用已知的计算机程序来确定。
在一些方面，由多核苷酸分子编码的嵌合蛋白是嵌合转录因子，并且多核苷酸分子还包含靶标表达盒，所述靶标表达盒包含可操作地连接至嵌合转录因子响应性(CTF响应性)启动子的所关注的基因。在一些实施方案中，靶标表达盒存在于与嵌合蛋白相同的异源性构建体中。在一些实施方案中，嵌合蛋白和靶标表达盒存在于单独的异源性构建体中。
术语“表达盒”是指重组或合成产生的多核苷酸，具有允许特定多核苷酸在靶细胞中转录的一系列核酸元件。表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子等序列。在一些方面，本公开提供了一种表达盒，所述表达盒包含编码经修饰的ER-LBD或包含经修饰的ER-LBD的嵌合蛋白的多核苷酸。
如本文所述的包含经修饰的ER-LBD的分离的多核苷酸分子和异源性构建体是工程化多核苷酸分子。“工程化多核苷酸”是自然界中不存在的多核苷酸。然而，应当理解，虽然工程化多核苷酸作为一个整体不是天然存在的，但它可以包含自然界中存在的核苷酸序列。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含来自不同生物体(例如，来自不同物种)的核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含鼠核苷酸序列、细菌核苷酸序列、人核苷酸序列和/或病毒核苷酸序列。术语“工程化多核苷酸”包括重组核酸和合成核酸。“重组多核苷酸”是指通过连接核苷酸分子来构建的分子，并且在一些实施方案中，可以在活细胞中复制。“合成多核苷酸”是指扩增的或化学合成的或通过其他方式合成的分子。合成多核苷酸包括经过化学修饰或其他修饰但是可以与天然存在的核苷酸分子发生碱基配对的那些。修饰包括但不限于一个或多个修饰的核苷酸间键和非天然核酸。修饰更详细描述于美国专利第6,673,611号和美国申请公开2004/0019001中，这些文献中的每一个通过引用以其整体并入。经修饰的核苷酸间键可以是二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯键。非天然核酸可以是锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、二醇核酸(GNA)、磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(PMO或“吗啉代”)和苏糖核酸(TNA)。非天然核酸进一步详细描述于国际申请WO 1998/039352、美国申请公开号2013/0156849和美国专利号6,670,461、5,539,082、5,185,444中有更详细的描述，这些文献中的每一篇均全文以引用方式并入本文。重组多核苷酸和合成多核苷酸还包括由前述中的任一者的复制产生的那些分子。本公开的工程化多核苷酸可以由单个分子(例如，包括在同一质粒或其他载体中)或由多个不同的分子(例如，多个不同的独立复制分子)编码。
可以使用标准分子生物学方法产生本公开的工程化多核苷酸(参见例如Green和Sambrook,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2012,Cold Spring HarborPress)。在一些实施方案中，使用GIBSON克隆产生工程化核酸构建体(参见例如Gibson,D.G.等人Nature Methods,343-345,2009；以及Gibson,D.G.等人NatureMethods,901-903,2010，这些文献中的每一篇均以引用方式并入本文)。GIBSON通常在单管反应中使用三种酶促活性：5'核酸外切酶、DNA聚合酶的′Y延伸活性和DNA连接酶促活性。5'核酸外切酶促活性回切5'端序列并暴露互补序列以用于退火。然后聚合酶促活性填补退火区域上的空位。随后DNA连接酶封闭切口并将DNA片段共价连接在一起。邻接片段的重叠序列比Golden Gate Assembly中使用的序列长得多，因此获得更高百分比的正确组装。在一些实施方案中，使用IN-/>克隆(Clontech)产生经工程化的核酸构建体。
在一些实施方案中，如本文所述的多核苷酸分子包含在异源性构建体中。术语“载体”或“表达载体”与“异源性构建体”同义，并且是指用于在靶细胞中引入一个或多个基因并且引导所述基因的表达的多核苷酸分子，所述基因与构建体可操作地缔合。该术语包括作为自我复制核酸结构的构建体以及掺入所引入的宿主细胞的基因组中的载体。如本文所述的异源性构建体包括表达盒。在一些方面，本文提供了一种异源性构建体，所述异源性构建体包含表达盒，所述表达盒包含可操作地连接至多核苷酸分子的启动子，所述多核苷酸分子编码经修饰的ER-LBD或包含经修饰的ER-LBD的嵌合蛋白。
如本文所用，“启动子”是指核酸序列的控制区域，在该区域控制核酸序列的剩余部分的起始和转录速率。启动子也可以包含调节蛋白和分子(诸如RNA聚合酶和其他转录因子)可结合的亚区域。启动子可以是组成型的、诱导型的、阻遏型的、组织特异性的或它们的任何组合。启动子驱动其调节的核酸序列的表达或转录。在本文中，当启动子相对于其调节以控制(“驱动”)该序列的转录起始和/或表达的核酸序列处于正确的功能位置和取向时，该启动子被认为是“可操作地连接的”。
启动子可以是与基因或序列天然缔合的启动子，如可以通过分离位于给定基因或序列的编码片段上游的5'非编码序列来获得。这种启动子可以称为“内源性的”。在一些实施方案中，编码核酸序列可以位于重组或异源启动子的控制下，所述启动子是指在其天然环境中通常不与编码序列缔合的启动子。此类启动子可以包括其他基因的启动子；从任何其他细胞分离的启动子；以及非“天然存在”的合成启动子或增强子，例如通过本领域已知的遗传工程方法来包含改变表达的不同转录调节区的不同元件和/或突变的启动子或增强子。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术产生序列，包括聚合酶链式反应(PCR)(参见例如美国专利号4,683,202和美国专利号5,928,906)。
如本文所用，“诱导型启动子”是指特征在于当存在信号、受信号影响或与信号接触的情况下，调控(例如，启动或活化)转录活性的启动子。信号可以是内源性的或正常的外源性条件(例如，光)、化合物(例如，化学或非化学化合物)或蛋白质(例如，如本文所述的嵌合转录因子)，其以一定方式与诱导型启动子接触，由此在调节诱导型启动子的转录活性方面有活性。转录的激活可牵涉直接作用于启动子以驱动转录或通过使阻止启动子驱动转录的阻遏因子灭活来间接作用于启动子。相反，转录失活可能涉及直接作用于启动子以阻止转录或通过激活阻遏因子(该阻遏因子随后作用于启动子)来间接作用于启动子。
如本文所用，如果在存在局部肿瘤状态(例如，炎症或缺氧)或信号的情况下，启动子的转录被激活、失活、增加或减少，则启动子“对该状态或信号作出应答”或“受该状态或信号调节”。在一些实施方案中，启动子包含应答元件。“应答元件”是启动子区内的DNA短序列，其结合调节(调控)由启动子进行的基因表达的特定分子(例如，转录因子)。可以根据本公开使用的应答元件包括但不限于根皮素可调控制元件(PEACE)、锌指DNA结合结构域(DBD)、干扰素-γ激活序列(GAS)(Decker,T.等人J Interferon Cytokine Res.1997年3月；17(3):121-34，该文献以引用方式并入本文)、干扰素刺激应答元件(ISRE)(Han,K.J.等人J Biol Chem.2004年4月9日；279(15):15652-61，该文献以引用方式并入本文)、NF-κB应答元件(Wang,V.等人Cell Reports.2012；2(4):824-839，该文献以引用方式并入本文)和STAT3应答元件(Zhang,D.等人J of Biol Chem.1996；271:9503-9509，该文献以引用方式并入本文)。本文涵盖其他应答元件。应答元件还可以含有串联重复序列(例如，编码应答元件的相同核苷酸序列的连续重复序列)以通常增加应答元件对其同源结合分子的敏感性。串联重复序列可以标记为2X、3X、4X、5X等以指示存在的重复序列数目。
表3中列出了反应性启动子(也称为“诱导型启动子”)(例如，TGF-β反应性启动子)的非限制性实例，该表示出了启动子和转录因子的设计，以及诱导分子对转录因子(TF)的影响并且示出了转基因转录(T)(B，结合；D，解离；n.d.，未确定)(A，激活；DA，失活；DR，去阻遏)(参见Horner,M.和Weber,W.FEBS Letters 586(2012)20784--2096m，以及其中引用的参考文献)。诱导型启动子的组分的非限制性实例包括表4中所示的那些。
表3
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表4
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启动子的其他非限制性实例包括巨细胞病毒(CMV)启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、延伸因子(EFS)启动子、MND启动子(一种合成启动子，含有带有骨髓增生性肉瘤病毒增强子的改良MoMuLV LTR的U3区)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子和泛素C(UbC)启动子。
在一些方面，本公开提供了一种异源性构建体，所述异源性构建体包含可操作地连接至多核苷酸分子的启动子，所述多核苷酸分子编码如本文所述的经修饰的ER-LBD或嵌合蛋白。
在一些实施方案中，可操作地连接至编码经修饰的ER-LBD或嵌合蛋白的多核苷酸分子的启动子是组成型启动子、诱导型启动子或合成启动子。
在一些实施方案中，可操作地连接至编码经修饰的ER-LBD或嵌合蛋白的多核苷酸分子的启动子是组成型启动子。组成型启动子的实例显示于表5中。在一些实施方案中，组成型启动子选自：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。
表5
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表达系统还包含靶标表达盒
在一些方面，嵌合蛋白是嵌合转录因子，并且本公开还提供了一种靶标表达盒，所述靶标表达盒包含嵌合转录因子响应性(CTF响应性)启动子。
“靶标表达盒”是指包含具有嵌合转录因子可控性表达的基因的表达盒。基于非内源性配体(例如，4-OHT或因多昔芬)的存在，表达由嵌合转录因子控制。
在一些方面，本公开提供了编码所关注的基因的多核苷酸分子，所述基因可操作地连接至嵌合转录因子响应性启动子(CTF响应性启动子)。CTF响应性启动子是合成的诱导型启动子，它们对包含经修饰的ER-LBD的嵌合转录因子具有反应性，并且可响应于非内源性配体(诸如4-OHT)而被诱导。
在一些实施方案中，CTF响应性启动子包含核心启动子序列和结合结构域，所述结合结构域结合至如本文所述的嵌合转录因子。
结合结构域可以包含一个或多个锌指结合位点。结合结构域可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个锌指结合位点。在一些实施方案中，结合结构域包含一个锌指结合位点。在一些实施方案中，结合结构域包含两个锌指结合位点。在一些实施方案中，结合结构域包含三个锌指结合位点。在一些实施方案中，结合结构域包含四个锌指结合位点。包含锌指结合位点的示例性结合结构域在以下序列中示出：cgggtttcgtaacaatcgcatgaggattcgcaacgccttcGGCGTAGCCGATGTCGCGctcccgtctcagtaaaggtcGGCGTAGCCGATGTCGCGcaatcggactgccttcgtacGGCGTAGCCGATGTCGCGcgtatcagtcgcctcggaacGGCGTAGCCGATGTCGCGcattcgtaagaggctcactctcccttacacggagtggataACTAGTTCTAGAGGGTATATAATGGGGGCCA(SEQ ID NO:37)。
核心启动子序列可以包括最小启动子。最小启动子的实例包括minP、minCMV、YB_TATA和minTK
在一些方面，包括经修饰的ER-LBD的嵌合蛋白是嵌合转录因子，并且异源性构建体还包含靶标表达盒，所述靶标表达盒包含嵌合转录因子响应性启动子。在一些方面，本文提供了第一异源性构建体和第二异源性构建体，所述第一异源性构建体包含表达盒，所述表达盒包含编码嵌合转录因子(包括经修饰的ER-LBD)的多核苷酸分子，所述第二异源性构建体包含靶标表达盒，所述靶标表达盒包含嵌合转录因子响应性(CTF响应性)启动子。
在一些实施方案中，本公开的工程化多核苷酸或构建体被构造为产生多种多肽。例如，多核苷酸可以被构造为产生2种不同的多肽。多核苷酸分子可以被构造为产生包含如本文所述的嵌合蛋白的多肽和所关注的多肽，这些多肽在响应于嵌合蛋白的启动子的控制下表达。
在一些实施方案中，可以由ER-LBD或嵌合蛋白转录调控的如本文所述的ER-LBD或嵌合蛋白和所关注的基因可以由相同的多核苷酸分子或异源性构建体编码。
在一些实施方案中，工程化核酸可以是多顺反子的，即，可以从单个转录物产生多于一种单独的多肽(例如，多个外源多核苷酸)。通过使用各种接头，工程化核酸可以成为多顺反子的，例如编码第一外源性多核苷酸的多核苷酸序列可以连接到编码第二外源性多核苷酸的核苷酸序列，诸如呈第一基因:接头:第二基因5’至3’取向。接头多核苷酸序列可以编码一个或多个2A核糖体跳跃元件，诸如T2A。其他2A核糖体跳跃元件包括但不限于E2A、P2A和F2A。2A核糖体跳跃元件允许在翻译期间产生由第一基因和第二基因编码的单独多肽。接头可以编码可切割接头多肽序列，如弗林蛋白酶切割位点或TEV切割位点，其中在表达后可切割接头多肽被切割，从而产生由第一基因和第二基因编码的单独多肽。可切割的接头可以包含进一步促进切割的多肽序列，如这种柔性接头(例如，Gly-Ser-Gly序列)。
接头可以编码内部核糖体进入位点(IRES)，使得在翻译期间产生由第一基因和第二基因编码的单独多肽。接头可以编码剪接受体，如病毒剪接受体。
接头可以是接头的组合，诸如弗林蛋白酶-2A接头，其可以通过2A核糖体跳跃，然后进一步切割弗林蛋白酶位点以允许完全去除2A残基来产生单独的多肽。在一些实施方案中，接头的组合可以包含弗林蛋白酶序列、柔性接头和2A接头。因此，在一些实施方案中，接头是弗林蛋白酶-Gly-Ser-Gly-2A融合多肽。在一些实施方案中，接头是弗林蛋白酶-Gly-Ser-Gly-T2A融合多肽。
一般而言，多顺反子系统可以使用任意数目的接头或接头的组合，以表达任意数目的基因或其部分(例如，工程化核酸可以编码第一多肽分子、第二多肽分子和第三多肽分子，各自由接头隔开，使得产生由第一多肽、第二多肽和第三多肽编码的单独多肽)。
如本文所用，“接头”可以指连接第一多肽序列和第二多肽序列的多肽或上述多顺反子接头。
转录后调控元件
在一些实施方案中，本公开的工程化核酸包含转录后调控元件(PRE)。PRE可以通过实现三级RNA结构稳定性和3'末端形成来增强基因表达。PRE的非限制性实例包括乙型肝炎病毒PRE(HPRE)和土拨鼠肝炎病毒PRE(WPRE)。在一些实施方案中，转录后调控元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。在一些实施方案中，WPRE包含WPRE元件的α、β和γ组分。在一些实施方案中，WPRE包括WPRE元件的α组分。WPRE序列的实例包括SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39。
工程化细胞
本文还提供了包含本公开的一种或多种多核苷酸分子或构建体的细胞以及产生细胞的方法。这些细胞在本文中称为“工程化细胞”。这些通常含有一种或多种工程化核酸的细胞在自然界中不存在。在一些实施方案中，细胞是重组表达所述一种或多种工程化多核苷酸的分离的细胞。在一些实施方案中，工程化多核苷酸由一种或多种载体或来自细胞基因组的选定基因座表达。在一些实施方案中，细胞经工程化以包含多核苷酸，该多核苷酸包含可操作地连接至核苷酸序列的启动子。
本公开的工程化细胞可包含整合到细胞基因组中的工程化多核苷酸。工程细胞可以包含能够在不整合到细胞基因组中的情况下表达的工程化多核苷酸，例如，用瞬时表达系统(诸如质粒或mRNA)工程化的多核苷酸。
工程化细胞类型
本公开的工程化细胞可以是人细胞。工程化细胞可以是人原代细胞。工程化原代细胞可以是任何体细胞。工程化原代细胞可以是任何干细胞。在一些实施方案中，工程化细胞源自受试者。在一些实施方案中，工程化细胞相对于受试者是同种异体的。
本公开的工程化细胞可以分离自受试者，诸如已知或怀疑患有癌症的受试者。细胞分离方法是本领域技术人员已知的并且包括但不限于基于细胞表面标志物表达的分选技术，诸如FACS分选、阳性分离技术和阴性分离、磁性分离及它们的组合。对于接受治疗的受试者而言，经工程化的细胞可以是同种异体的。同种异体修饰的细胞可以与接受治疗的受试者HLA匹配。经工程化的细胞可以是培养的细胞，如离体培养的细胞。经工程化的细胞可以是离体培养的细胞，如从受试者分离的原代细胞。培养的细胞可以与一种或多种细胞因子一起培养。
在一些实施方案中，本公开的工程化细胞选自：T细胞(例如，CD8+T细胞、CD4+T细胞或γ-δT细胞)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调控性T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、先天性淋巴样细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、巨噬细胞(例如，M1巨噬细胞或M2巨噬细胞)、单核细胞、树突细胞、红细胞、血小板细胞、神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞、基板来源的细胞，雪旺细胞(Schwann cell)、心肌细胞、内皮细胞、结节细胞、小胶质细胞、肝细胞、胆管细胞、β细胞、人胚胎干细胞(ESC)、ESC来源的细胞、多能干细胞、间充质基质细胞(MSC)、诱导多能干细胞(iPSC)和iPSC来源的细胞。
在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是T细胞(例如，CD8+T细胞、CD4+T细胞或γ-δT细胞)。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是调控性T细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是自然杀伤T(NKT)细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是B细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是先天性淋巴样细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是肥大细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是嗜酸性粒细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是嗜碱性粒细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是骨髓细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是巨噬细胞，例如M1巨噬细胞或M2巨噬细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是单核细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞或分离的细胞是树突细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是红细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是血小板细胞。在一些实施方案中，本公开的细胞是神经元。在一些实施方案中，本公开的细胞是少突胶质细胞。在一些实施方案中，本公开的细胞是星形胶质细胞。在一些实施方案中，本公开的细胞是基板来源的细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是雪旺细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是心肌细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是内皮细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是结节细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是小胶质细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是肝细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是胆管细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是β细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是人胚胎干细胞(ESC)。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是ESC来源的细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是多能干细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是间充质基质细胞(MSC)。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是iPSC来源的细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是自体的。在一些实施方案中，工程化细胞是同种异体的。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是CD34+细胞、CD3+细胞、CD8+细胞、CD16+细胞和/或CD4+细胞。
在一些实施方案中，本公开的细胞是选自以下的肿瘤细胞：腺癌细胞、膀胱肿瘤细胞、脑肿瘤细胞、乳腺肿瘤细胞、宫颈肿瘤细胞、结直肠肿瘤细胞、食道肿瘤细胞、神经胶质瘤细胞、肾肿瘤细胞、肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、黑色素瘤细胞、间皮瘤细胞、卵巢肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、前列腺肿瘤细胞、皮肤肿瘤细胞、甲状腺肿瘤细胞和子宫肿瘤细胞。
本文还提供了包括培养本公开的工程化细胞的方法。培养本文所述的经工程化的细胞的方法是已知的。本领域技术人员将认识到培养条件将取决于特定的目标经工程化的细胞。本领域技术人员将认识到，培养条件将取决于经工程化的细胞的特定下游用途，例如，用于后续将经工程化的细胞施用于受试者的特定培养条件。
对细胞进行工程改造的方法
本文还提供了用如本文所述的任何多核苷酸分子或构建体对细胞进行工程改造的组合物和方法。
一般而言，通过引入(即递送)本公开的一种或多种多核苷酸对细胞进行工程改造。递送方法包括但不限于病毒介导的递送、脂质介导的转染、纳米颗粒递送、电穿孔、超声处理和通过物理手段的细胞膜变形。本领域技术人员将理解，递送方法的选择可以取决于待工程化的特定细胞类型。
病毒介导的递送
基于病毒载体的递送平台可用于对细胞进行工程改造。一般而言，基于病毒载体的递送平台通过引入(即，递送)至宿主细胞中对细胞进行工程改造。例如，基于病毒载体的递送平台可以通过引入本文所述的任何工程化核酸来对细胞进行工程改造。基于病毒载体的递送平台可以是核酸，因此工程化核酸也可以涵盖工程化的病毒衍生核酸。此类工程化的病毒衍生核酸也可以称为重组病毒或工程化病毒。
基于病毒载体的递送平台可以在同一核酸内编码超过一种工程化核酸、基因或转基因。例如，工程化的病毒衍生核酸，例如重组病毒或工程化病毒，可以编码一种或多种转基因，包括但不限于本文所述的任何工程化核酸。一种或多种转基因可以被构造为表达本文所述的多肽(例如，经修饰的ER-LBD)。除了编码编码经修饰的ER-LBD的转基因以外，基于病毒载体的递送平台还可以编码一种或多种基因，诸如病毒感染性和/或病毒产生所需的病毒基因(例如，衣壳蛋白、包膜蛋白、病毒聚合酶、病毒转录酶等)，称为顺式作用元件或基因。
基于病毒载体的递送平台可包含多于一种病毒载体，诸如编码本文所述的工程化核酸、基因或转基因并且称为反式作用元件或基因的单独病毒载体。例如，除了编码经修饰的ER-LBD的载体以外，基于辅助依赖性病毒载体的递送平台可以在一个或多个另外的单独载体上提供病毒感染性和/或病毒产生所需的另外的基因。一种病毒载体可以递送多于一种工程化多核苷酸，诸如一种载体递送被构造为产生经修饰的ER-LBD的工程化多核苷酸，并且一种工程化多核苷酸被构造为产生所关注的基因。多于一种病毒载体可以递送多于一种工程化核酸，诸如第一载体递送被构造为产生经修饰的ER-LBD的工程化多核苷酸，并且第二载体递送另一种工程化多核苷酸。所用病毒载体的数量可以取决于上述基于病毒载体的疫苗平台的包装容量，并且本领域技术人员可以选择适当数量的病毒载体。
一般而言，任何基于病毒载体的系统都可用于分子的体外产生，或用于体内和离体基因治疗程序，例如，用于体内递送。选择适当的基于病毒载体的系统将取决于多种因素，诸如货物/有效载荷大小、病毒系统的免疫原性、目标靶细胞、基因表达强度和时间，以及本领域技术人员了解的其他因素。
基于病毒载体的递送平台可以是基于RNA的病毒或基于DNA的病毒。示例性基于病毒载体的递送平台包括但不限于单纯疱疹病毒、腺病毒、麻疹病毒(measles virus)、流感病毒、印第安纳水泡病毒、新城疫病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、粘液瘤病毒、呼肠孤病毒、腮腺炎病毒、马拉巴病毒、狂犬病毒、轮状病毒、肝炎病毒、风疹病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、呼吸道合胞病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、麻疹病毒(morbillivirus)、慢病毒、复制型逆转录病毒、弹状病毒、塞尼卡谷病毒、辛德毕斯病毒以及它们的任何变体或衍生物。其他示例性的基于病毒载体的递送平台在本领域中有描述，诸如牛痘、鸡痘、自我复制甲病毒、马拉巴病毒、腺病毒(参见，例如，Tatsis等人，Adenoviruses,MolecularTherapy(2004)10,616—629)，或慢病毒，包括但不限于第二代慢病毒、第三代慢病毒或混合的第二代/第三代慢病毒和设计为靶向特定细胞类型或受体的任何一代重组慢病毒(参见，例如，Hu等人，Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer andInfectious Diseases,Immunol Rev.(2011)239(1):45-61,Sakuma等人，Lentiviralvectors:basic to translational,Biochem J.(2012)443(3):603-18,Cooper等人，Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviralvectors containing the human ubiquitin C promoter,Nucl.Acids Res.(2015)43(1):682-690,Zufferey等人，Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe andEfficient In vivo Gene Delivery,J.Virol.(1998)72(12):9873-9880)。
这些序列前面可以有一个或多个靶向亚细胞区室的序列。在引入(即，递送)到宿主细胞中后，受感染的细胞(即，工程细胞)可以表达并且在一些情况下分泌经修饰的ER-LBD(或包含经修饰的ER-LBD的嵌合多肽)。可用于免疫方案的牛痘载体和方法描述于例如美国专利号4,722,848中。另一种载体是BCG(卡介苗)。BCG载体在Stover等人(Nature351:456-460(1991))中。根据本文的描述，可用于引入(即，递送)工程化核酸的多种其他载体(例如，伤寒沙门菌(Salmonella typhi)载体等)对于本领域技术人员将是显而易见的。
基于病毒载体的递送平台可以是靶向肿瘤细胞的病毒，本文称为溶瘤病毒。溶瘤病毒的实例包括但不限于溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤流感病毒、溶瘤印第安纳水泡病毒、溶瘤新城疫病毒、溶瘤痘苗病毒、溶瘤脊髓灰质炎病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤腮腺炎病毒、溶瘤马拉巴病毒、溶瘤狂犬病病毒、溶瘤轮状病毒、溶瘤肝炎病毒、溶瘤风疹病毒、溶瘤登革热病毒、溶瘤基孔肯雅病毒、溶瘤呼吸道合胞病毒、溶瘤淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤慢病毒、溶瘤复制逆转录病毒、溶瘤棒状病毒、溶瘤塞内卡谷病毒、溶瘤辛德毕斯病毒及它们的任何变体或衍生物。本文所述的任何溶瘤病毒可以是包含一种以上转基因(例如，本文所述的工程化核酸)的重组溶瘤病毒。转基因可以被构造为表达经修饰的ER-LBD(或包含经修饰的ER-LBD的嵌合多肽)和任选地所关注的基因。
在一些实施方案中，病毒选自：慢病毒、逆转录病毒、溶瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)和病毒样颗粒(VLP)。
基于病毒载体的递送平台可以是基于逆转录病毒的。一般而言，逆转录病毒载体由顺式作用的长末端重复序列组成，其包装能力高达6-10kb的外来序列。最小顺式作用LTR足以复制和包装载体，然后载体用于将该一种或多种工程化核酸(例如，编码经修饰的ER-LBD的转基因)整合到靶细胞中以提供永久性转基因表达。基于逆转录病毒的递送系统包括但不限于基于以下的那些：鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及它们的组合(参见，例如，Buchscher等人，J.Virol.66:2731-2739(1992)；Johann等人，J.Virol.66:1635-1640(1992)；Sommnerfelt等人，Virol.176:58-59(1990)；Wilson等人，J.Virol.63:2374-2378(1989)；Miller等人，J,Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)。其他逆转录病毒系统包括Phoenix逆转录病毒系统。
基于病毒载体的递送平台可以是基于慢病毒的。一般来讲，慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并且通常产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。基于慢病毒的递送平台可以是基于HIV的，诸如ViraPower系统(ThermoFisher)或pLenti系统(Cell Biolabs)。基于慢病毒的递送平台可以是基于SIV或FIV的。其他示例性基于慢病毒的递送平台在美国专利号7,311,907、7,262,049、7,250,299、7,226,780、7,220,578、7,211,247、7,160,721、7,078,031、7,070,993、7,056,699、6,955,919中有更详细的描述，这些专利中的每一篇均以引用方式并入本文以用于所有目的。
基于病毒载体的递送平台可以是基于腺病毒的。一般而言，基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有非常高的转导效率，不需要细胞分裂，实现高的滴度和表达水平，并且可以在相对简单的系统中大量生产。一般而言，腺病毒可用于在受感染的细胞内瞬时表达转基因，因为腺病毒通常不会整合到宿主的基因组中。基于腺病毒的递送平台在Li等人，Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994；Borras等人，Gene Ther 6:515 524,1999；Li和Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等人，H Gene Ther 5:10881097,1999；WO 94/12649、WO 93/03769、WO 93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984和WO 95/00655中有更详细的描述，各自通过引用并入本文用于所有目的。其他示例性的基于腺病毒的递送平台在美国专利第5585362、6,083,716、7,371,570、7,348,178、7,323,177、7,319,033、7,318,919和7,306,793号以及国际专利申请WO96/13597中有更详细的描述，每个专利通过引用并入本文用于所有目的。
基于病毒载体的递送平台可以是基于腺相关病毒(AAV)的。腺相关病毒(“AAV”)载体可以用于用工程化核酸(例如，本文所述的任何工程化核酸)转导细胞。AAV系统可以用于体外产生经修饰的ER-LBD(或包含经修饰的ER-LBD的嵌合多肽)，或用于体内和离体基因治疗程序中，例如，用于体内递送经修饰的ER-LBD(参见，例如，West等人，Virology160:38-47(1987)；美国专利第4,797,368、5,436,146、6,632,670、6,642,051、7,078,387、7,314,912、6,498,244、7,906,111号；美国专利公布US2003-0138772、US2007/0036760和US2009/0197338；Gao等人，J.Virol,78(12):6381-6388(2004年6月)；Gao等人，Proc Natl AcadSci USA,100(10):6081-6086(2003年5月13日)；以及国际专利申请WO 2010/138263和WO93/24641；Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801(1994)；Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)，各自通过引用并入本文用于所有目的)。用于构建重组AAV载体的示例性方法在美国专利第5,173,414号；Tratschin et ah,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin等人，Mol.细胞生物学》4:2072-2081(1984)；Hermonat&amp；Muzyczka,PNAS 81:64666470(1984)；以及Samuiski等人,J.Virol.63:03822-3828(1989)，所述文献各自出于所有目的通过引用在此并入。一般而言，基于AAV的载体包含具有对应于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.Rh10、AAV11及它们的变体中的任一种的氨基酸序列的衣壳蛋白。
基于病毒载体的递送平台可以是病毒样颗粒(VLP)平台。一般而言，VLP是通过产生病毒结构蛋白并纯化所得病毒颗粒而构造的。然后，纯化后，将货物/有效载荷(例如，本文所述的任何工程化核酸)离体包封在纯化的颗粒内。因此，VLP的产生保持编码病毒结构蛋白的核酸与编码货物/有效载荷的核酸分开。用于产生VLP的病毒结构蛋白可以在多种表达系统中产生，包括哺乳动物、酵母、昆虫、细菌或体内翻译表达系统。可以使用本领域技术人员已知的方法在所需货物的存在下使纯化的病毒颗粒变性和重新形成以产生VLP。VLP的产生在Seow等人(Mol Ther.2009年5月；17(5):767–777)中有更详细的描述，通过引用并入本文用于所有目的。
基于病毒载体的递送平台可以工程改造为靶向(即，感染)一系列细胞，靶向一小部分细胞或靶向特定细胞。一般而言，针对基于病毒载体的递送平台选择的包膜蛋白将决定病毒嗜性。基于病毒载体的递送平台中使用的病毒可以假型化以靶向特定的目标细胞。基于病毒载体的递送平台可以是泛嗜性的并且感染一系列细胞。例如，基于泛嗜性病毒载体的递送平台可以包括VSV-G包膜。基于病毒载体的递送平台可以是兼嗜性的并且感染哺乳动物细胞。因此，本领域技术人员可以选择适当的嗜性、假型和/或包膜蛋白以靶向期望的细胞类型。
脂质结构递送系统
本公开的工程化核酸(例如，编码本文所述的经修饰的ER-LBD或嵌合蛋白的核酸)可以使用脂质介导的递送系统来引入细胞中。一般来讲，脂质介导的递送系统使用由包围内部区室的外部脂质膜构成的结构。基于脂质的结构的实例包括但不限于基于脂质的纳米颗粒、脂质体、胶束、外泌体、囊泡、胞外囊泡、细胞或组织。脂质结构递送系统可以体外、体内或离体递送货物/有效载荷(例如，本文所述的任何经工程化的核酸)。
基于脂质的纳米颗粒可包含但不限于单层脂质体、多层脂质体和脂质制剂。如本文所用，“脂质体”是一个通用术语，其涵盖通过将期望的货物(例如工程化核酸，诸如本文所述的任何工程化核酸)包封在脂质壳或脂质聚集体内而形成的脂质媒介物的体外制剂。脂质体的特征可以是具有带双层膜的囊泡结构，通常包括磷脂，以及通常包括水性组合物的内部介质。脂质体包含但不限于乳剂、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、片状层等。脂质体可以是单层脂质体。脂质体可以是多层脂质体。脂质体可以是多泡脂质体。脂质体可以带正电荷、带负电荷或不带电荷。在某些实施方案中，脂质体电荷是中性的。脂质体可以由标准的囊泡形成脂质形成，这些脂质通常包含中性和带负电荷的磷脂和固醇，如胆固醇。通常通过考虑期望的目的(例如，体内递送的标准，诸如脂质体大小、酸不稳定性和脂质体在血流中的稳定性)来指导脂质的选择。多种方法可用于制备脂质体，如在例如Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.)》9；467(1980)、美国专利第4,235,871号、第4,501,728号、第4,501,728号、第4,837,028号和第5,019,369号中所述，所述文献各自出于所有目的通过引用并入本文。
当包括磷脂的脂质悬浮在过量的水溶液中使得多个脂质层被水性介质隔开时，自发生成多层脂质体。在脂质组分经历自我重排后，水和溶解的溶质被截留在脂质双层之间的封闭结构中。期望的货物(例如，多肽、核酸、小分子药物、工程化核酸，诸如本文所述的任何工程化核酸、病毒载体、基于病毒的递送系统等)可以被包封在脂质体的水性内部，通过与脂质体和多肽/核酸都相连的连接分子连接到脂质体，散布在脂质体的脂质双层内，被截留在脂质体中，与脂质体复合，或者以其他方式与脂质体相连，使得可以将其递送到靶实体。亲脂性分子或具有亲脂性区域的分子也可以溶解在脂质双层中或与脂质双层缔合。
根据本实施方案使用的脂质体可以通过不同的方法制备，如本领域的普通技术人员所知。脂质体的制备在WO 2016/201323、国际申请PCT/US85/01161和PCT/US89/05040以及美国专利4,728,578、4,728,575、4,737,323、4,533,254、4,162,282、4,310,505和4,921,706中有更详细的描述；各自通过引用并入本文用于所有目的。
脂质体可以是阳离子脂质体。阳离子脂质体的实例在美国专利号5,962,016、5,030,453、6,680,068、美国申请2004/0208921以及国际专利申请WO03/015757A1、WO04029213A2和WO02/100435A1中有更详细的描述，这些文献中的每一篇据此全文以引用方式并入。
脂质介导的基因递送方法例如在WO 96/18372；WO 93/24640；Mannino&Gould-Fogerite,BioTechniques 6(7):682-691(1988)；美国专利第5,279,833号；Rose美国专利第5,279,833号；WO91/06309；及Felgner等人，Proc.国家科学院院刊》USA 84:7413-7414(1987)中有描述，所述文献各自出于所有目的通过引用并入本文。
外来体是内吞来源的小膜囊泡，在多泡体与质膜融合后释放到细胞外环境中。外泌体的大小在30nm与100nm直径之间的范围内。它们的表面由来自供体细胞的细胞膜的脂质双层组成，并且它们包含来自产生外泌体的细胞的细胞质，并在表面上展示来自亲代细胞的膜蛋白。用于递送核酸的外泌体是本领域技术人员已知的，例如，美国专利第9,889,210号中更详细描述的外泌体，该专利以引用方式并入本文以用于所有目的。
如本文所用，术语“细胞外囊泡”或“EV”是指包括包裹内部空间的膜的细胞来源的囊泡。一般而言，细胞外囊泡包括所有膜结合囊泡，这些囊泡的直径小于它们所来源的细胞。通常细胞外囊泡的直径范围为20nm至1000nm，并且可以包括处于内部空间内，展示在细胞外囊泡的外表面上，和/或跨越膜的各种大分子货物。货物可以包括核酸(例如，本文所述的任何经工程化的核酸)、蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或其组合。作为实例而非限制，胞外囊泡包含凋亡小体、细胞碎片、通过直接或间接操纵(例如，通过连续挤压或用碱性溶液处理)而衍生自细胞的囊泡、囊泡化细胞器和由活细胞(例如，通过直接细胞质膜出芽或晚期内体与细胞质膜的融合)产生的囊泡。细胞外囊泡可源自于活的或死的生物体、外植组织或器官和/或培养的细胞。
如本文所用，术语“外来体”是指细胞来源的小(直径在20-300nm之间，更优选直径在40-200nm之间)囊泡，该囊泡包括包裹内部空间的膜，并且该囊泡通过直接质膜出芽或通过晚期内体与质膜融合从细胞生成。外泌体包括脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包括有效载荷(例如，治疗剂)、受体(例如，靶向部分)、多核苷酸(例如，核酸、RNA或DNA，如本文所述的任何经工程化的核酸)、糖(例如，单糖、多糖或聚糖)或其他分子。外来体可源自于生产细胞，并基于其大小、密度、生物化学参数或其组合从生产细胞分离。外来体是一种细胞外囊泡。通常，外来体的产生/生物发生不会导致生产细胞的破坏。外来体和外来体的制备在WO 2016/201323中有更详细的描述，其特此通过引用整体并入。
如本文所用，术语“纳米囊泡”(也称为“微囊泡”)是指细胞来源的小(直径在20-250nm之间，更优选直径在30-150nm之间)囊泡，该囊泡包括包裹内部空间的膜，并且该囊泡通过直接或间接操纵从细胞产生，使得在没有所述操纵的情况下所述生产细胞不会产生所述纳米囊泡。一般而言，纳米囊泡是细胞外囊泡的亚种。对生产细胞的适当操纵包含但不限于连续挤压、用碱性溶液处理、超声处理或其组合。在一些情况下，纳米囊泡的产生可导致所述生产细胞的破坏。优选地，纳米囊泡群基本上不含通过从质膜直接出芽或晚期核内体与质膜融合而从生产细胞得到的囊泡。纳米囊泡包括脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包括有效载荷(例如，治疗剂)、受体(例如，靶向部分)、多核苷酸(例如，核酸、RNA或DNA，如本文所述的任何经工程化的核酸)、糖(例如，单糖、多糖或聚糖)或其他分子。纳米囊泡一旦根据所述操纵从生产细胞中得到，就可以基于其大小、密度、生物化学参数或其组合从生产细胞分离。
一般而言，脂质纳米颗粒(LNP)是合成脂质结构，依赖于脂质的两亲性形成膜和囊泡样结构(Riley 2017)。一般而言，这些囊泡通过吸收到靶细胞的膜中并将货物释放到胞质溶胶中来递送货物/有效载荷，如本文所述的任何经工程化的核酸或病毒系统。LNP形成中使用的脂质可以是阳离子、阴离子或中性的。脂质可以是合成的或天然来源的，并且在一些情况下是可生物降解的。脂质可以包含脂肪、胆固醇、磷脂、脂质缀合物，包含但不限于聚乙二醇(PEG)缀合物(PEG化脂质)、蜡、油、甘油酯和脂溶性维生素。脂质组合物通常包含限定的材料混合物，如阳离子脂质、中性脂质、阴离子脂质和两亲性脂质。在一些情况下，包含特定脂质以防止LNP聚集、防止脂质氧化或提供促进附加部分附接的功能性化学基团。脂质组合物可影响整体LNP大小和稳定性。在一个实例中，脂质组合物包括二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(MC3)或MC3样分子。可以将MC3和MC3样脂质组合物配制成包含一种或多种其他脂质，如PEG或PEG缀合脂质、固醇或中性脂质。另外，LNP可进一步设计或功能化，以促进特定细胞类型的靶向。LNP设计中的另一个考虑因素是靶向效率和细胞毒性之间的平衡。
一般来说，胶束是使用单链脂质形成的球形合成脂质结构，其中单链脂质的亲水头部形成外层或膜，并且单链脂质的疏水尾部形成胶束中心。胶束通常是指仅含脂质单层的脂质结构。胶束在Quader等人(Mol Ther.2017年7月5日；25(7):1501-1513)中，所述文献出于所有目的通过引用并入本文。
直接暴露于血清的核酸载体，如表达载体，可能有几种不良后果，包括血清核酸酶对核酸的降解或游离核酸对免疫系统的脱靶刺激。类似地，直接暴露于血清的病毒递送系统可以触发不期望的免疫反应和/或病毒递送系统的中和。因此，经工程化的核酸和/或病毒递送系统的封装可用于避免降解，同时也避免潜在的脱靶影响。在某些实例中，经工程化的核酸和/或病毒递送系统被完全封装在递送媒剂内，如在LNP的水性内部。可以通过本领域技术人员熟知的技术，如在微流体液滴生成装置上进行的微流体混合和液滴生成，将经工程化的核酸和/或病毒递送系统封装在LNP内。此类装置包含但不限于标准T形接头装置或流量聚焦装置。在一个实例中，将所需的脂质制剂，如含有MC3或MC3样组合物，与经工程化的核酸或病毒递送系统和任何其他所需的试剂并行地提供给液滴生成装置，使得递送载体和所需的试剂完全封装在基于MC3或MC3样的LNP内部。在一个实例中，液滴生成装置可以控制所产生的LNP的大小范围和大小分布。例如，LNP的大小可以在直径为1至1000纳米的范围内，例如1、10、50、100、500或1000纳米。液滴产生后，可以进一步对包封货物/有效载荷(例如，经工程化的核酸和/或病毒递送系统)的递送媒剂进行处理或工程化，以使其作好施用的准备。
纳米颗粒递送
纳米材料可以用于递送工程化核酸(例如，编码本文所述的经修饰的ER-LBD或嵌合蛋白的核酸)。重要的是，纳米材料媒介物可以由非免疫原性材料制成，并且通常避免引发对递送载体本身的免疫。这些材料可包含但不限于脂质(如前所述)、无机纳米材料和其他聚合材料。纳米材料颗粒在Riley等人(Recent Advances in Nanomaterials for GeneDelivery—AReview.Nanomaterials 2017,7(5),94)中有更详细的描述，该文献以引用方式并入本文以用于所有目的。
基因组编辑系统
基因组编辑系统可用于对宿主基因组进行工程改造以编码工程化核酸，诸如编码本公开的经修饰的ER-LBD的核酸。一般来讲，“基因组编辑系统”是指将外源基因整合到宿主细胞基因组中的任何系统。基因组编辑系统包括但不限于转座子系统、核酸酶基因组编辑系统和基于病毒载体的递送平台。
转座子系统可用于将工程化核酸，诸如本公开的工程化核酸，整合到宿主基因组中。转座子通常包含位于货物/有效载荷核酸和转座酶两侧的末端反向重复序列(TIR)。转座子系统可以为TIR侧翼货物提供顺式或反式转座子。转座子系统可以是逆转录转座子系统或DNA转座子系统。一般来讲，转座子系统将货物/有效载荷(例如，经工程化的核酸)随机整合到宿主基因组中。转座子系统的实例包括使用Tc1/mariner转座子超家族的转座子的系统，诸如Sleeping Beauty转座子系统，这些系统在Hudecek等人(Crit Rev Biochem MolBiol.2017年8月；52(4):355-380)和美国专利第6,489,458号、第6,613,752号和第7,985,739号中，所述文献各自出于所有目的通过引用并入本文。转座子系统的另一个实例包括PiggyBac转座子系统，其在美国专利第6,218,185和6,962,810号中有更详细的描述，各自通过引用并入本文用于所有目的。
核酸酶基因组编辑系统可用于对宿主基因组进行工程化改造以编码本公开的工程化核酸，诸如分离的多核苷酸或异源性构建体。不希望受理论束缚，一般来讲，用于引入外源基因的核酸酶介导的基因编辑系统利用了细胞的天然DNA修复机制，特别是同源重组(HR)修复途径。简言之，在对基因组DNA产生损伤(通常是双链断裂)之后，细胞可以通过在DNA合成期间使用在其5'末端和3’末端具有相同或基本上相同的序列的另一DNA来源作为模板来修复损害而解决损伤。在自然情况下，HDR可以使用细胞中存在的其他染色体作为模板。在基因编辑系统中，将外源多核苷酸引入细胞中，用作同源重组模板(HRT或HR模板)。一般来讲，在模板化HDR期间，可以将在HRT内5’和3’互补末端之间包含有损伤的染色体中最初未发现的任何额外外源序列(例如，基因或基因的一部分)掺入(即，“整合”)到给定的基因组座位中。因此，给定的基因组基因座的典型HR模板具有与内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列，与内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列，以及编码货物/有效载荷核酸(例如，本文所述的任何工程化核酸，诸如任何本文所述的工程化核酸)的核苷酸序列。
在一些实例中，HR模板可以是线性的。线性HR模板的实例包含但不限于线性化质粒载体、ssDNA、合成DNA和PCR扩增DNA。在特定实例中，HR模板可以是环状的，如质粒。环状模板可以包含超螺旋模板。
相对于要引入的外源序列，在HR模板的5'和3'末端发现的相同或基本上相同的序列通常称为臂(HR臂)。HR臂可以与内源基因组靶基因座的区域相同(即，100％相同)。一些实例中的HR臂可以与内源基因组靶基因座的区域基本上相同。虽然可以使用基本上相同的HR臂，但HR臂相同可能是有利的，因为HDR通路的效率可能受到具有小于100％同一性的HR臂的影响。
每条HR臂，即5'和3'HR臂，可以是相同大小或不同大小。每条HR臂的长度可以各自大于或等于50、100、200、300、400或500个碱基。尽管HR臂通常可以是任意长度，但是也可以考虑实际因素，如HR臂长度和整体模板大小对整体编辑效率的影响。HR臂可以与紧邻切割位点的内源基因组靶基因座的区域相同或基本上相同。每条HR臂可以与紧邻切割位点的内源基因组靶基因座的区域相同或基本上相同。每条HR臂可以与切割位点一定距离内的内源基因组靶基因座的区域相同或基本上相同，该距离如彼此相距1个碱基对、小于或等于10个碱基对、小于或等于50个碱基对，或小于或等于100个碱基对。
核酸酶基因组编辑系统可以使用多种核酸酶切割靶基因组基因座，包括但不限于成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)家族核酸酶或其衍生物、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)或其衍生物、锌指核酸酶(ZFN)或其衍生物，以及归巢核酸内切酶(HE)或其衍生物。
CRISPR介导的基因编辑系统可用于对宿主基因组进行工程改造以编码工程化核酸，诸如本文所述的工程化核酸。CRISPR系统在M.Adli(“The CRISPR tool kit forgenome editing and beyond”Nature Communications；volume 9(2018),Articlenumber:1911)中有更详细的描述，其教导的所有内容通过引用并入本文。一般来讲，CRISPR介导的基因编辑系统包含CRISPR相关(Cas)核酸酶和将切割引向特定靶序列的RNA。示例性的CRISPR介导的基因编辑系统是由Cas9核酸酶和RNA构成的CRISPR/Cas9系统，该RNA具有CRISPR RNA(crRNA)结构域和反式激活CRISPR(tracrRNA)结构域。crRNA通常具有两个RNA结构域：通过与靶序列(“确定的核苷酸序列”，例如基因组序列)的碱基对杂交来指导特异性的向导RNA序列(gRNA)；和与tracrRNA杂交的RNA结构域。tracrRNA可以与核酸酶(例如，Cas9)相互作用，从而促进核酸酶向基因组座位的募集。crRNA和tracrRNA多核苷酸可以是单独的多核苷酸。crRNA和tracrRNA多核苷酸可以是单个多核苷酸，也称为单向导RNA(sgRNA)。虽然此处说明了Cas9系统，但也可以使用其他CRISPR系统，如Cpf1系统。核酸酶可以包含其衍生物，如Cas9功能突变体，例如Cas9“切口酶”突变体，其通常仅介导确定的核苷酸序列的单链的切割，而不是通常由Cas9酶产生的完全双链断裂。
一般而言，CRISPR系统的组分彼此相互作用形成核糖核蛋白(RNP)复合物以介导序列特异性切割。在一些CRISPR系统中，每个组分都可以单独产生并用于形成RNP复合物。在一些CRISPR系统中，每个组分都可以在体外单独产生，并在体外彼此接触(即“复合”)以形成RNP复合物。然后可以将体外产生的RNP引入(即，“递送”)到细胞的细胞质和/或细胞核(例如，T细胞的细胞质和/或细胞核)中。体外产生的RNP复合物可以通过多种方式递送到细胞，这些方式包括但不限于电穿孔、脂质介导的转染、通过物理方式的细胞膜变形、脂质纳米颗粒(LNP)、病毒样颗粒(VLP)和超声处理。在一个特定的实例中，可以使用基于Nucleofactor/电穿孔的递送系统/>将体外产生的RNP复合物递送到细胞中。其他电穿孔系统包含但不限于MaxCyte电穿孔系统、Miltenyi CliniMACS电穿孔系统、Neon电穿孔系统和BTX电穿孔系统。可以使用本领域技术人员已知的多种蛋白质生产技术在体外产生(即，合成和纯化)CRISPR核酸酶(例如，Cas9)。可以使用本领域技术人员已知的多种RNA生产技术(诸如体外转录或化学合成)在体外产生(即，合成和纯化)CRISPR系统RNA(例如，sgRNA)。
体外产生的RNP复合物可以以不同的核酸酶与gRNA比率复合。体外产生的RNP复合物也可以在CRISPR介导的编辑系统中以不同的量使用。例如，根据需要编辑的细胞数目，可以调整添加的RNP总量，如在反应中编辑大量细胞时减少添加的RNP复合物的量。
在一些CRISPR系统中，每种组分(例如，Cas9和sgRNA)可以由多核苷酸单独编码，其中每种多核苷酸一起或单独引入细胞中。在一些CRISPR系统中，每个组分都可以由单个多核苷酸编码(即，多启动子或多顺反子载体，见下文示例性多顺反子系统的描述)并引入细胞中。在每种多核苷酸编码的CRISPR组分在细胞内表达(例如，核酸酶的翻译和CRISPRRNA的转录)后，RNP复合物可以在细胞内形成，然后可以指导位点特异性切割。
一些RNP可以工程改造成具有促进RNP递送到细胞核中的部分。例如，Cas9核酸酶可以具有核定位信号(NLS)结构域，使得如果Cas9 RNP复合物被递送到细胞的细胞质中，或者在Cas9翻译和随后RNP形成之后，NLS可以促进Cas9 RNP进一步运输到细胞核中。
本文所述的细胞可以使用非病毒方法进行工程化，例如，本文所述的核酸酶和/或CRISPR介导的基因编辑系统可以使用非病毒方法递送至细胞。本文所述的细胞可以使用病毒方法进行工程化，例如，本文所述的核酸酶和/或CRISPR介导的基因编辑系统可以使用病毒方法诸如腺病毒、逆转录病毒、慢病毒或本文所述的任何其他基于病毒的递送方法递送至细胞。
在一些CRISPR系统中，可以提供超过一种CRISPR组合物，使得每种组合物单独地靶向不止靶核苷酸序列处的相同基因或一般基因组座位。例如，可以提供两种单独的CRISPR组合物以指导在彼此一定距离内的两个不同靶核苷酸序列处切割。在一些CRISPR系统中，可以提供一种以上CRISPR组合物，使得每个组合物单独靶向相同基因或一般基因组基因座的相反链。例如，可以提供两种单独的CRISPR“切口酶”组合物以指导在相同基因或一般基因组基因座的相反链处切割。
一般来讲，本文所述的CRISPR介导的编辑系统的特征可以应用于其他基于核酸酶的基因组编辑系统。TALEN是经工程化的位点特异性核酸酶，其由TALE(转录激活因子样效应物)的DNA结合结构域和限制性内切核酸酶Fokl的催化结构域构成。通过改变DNA结合结构域的单体的高度可变残基区中存在的氨基酸，可以形成不同的人工TALEN来靶向各种核苷酸序列。DNA结合结构域随后将核酸酶指导至靶序列并产生双链断裂。基于TALEN的系统更详细描述于美国序列号12/965,590；美国专利第8,450,471号；美国专利第8,440,431号；美国专利第8,440,432号；美国专利第10,172,880号；以及美国序列号13/738,381中，所有这些都通过引用以其整体并入本文。基于ZFN的编辑系统更详细描述于美国专利第6,453,242号、第6,534,261号、第6,599,692号、第6,503,717号、第6,689,558号、第7,030,215号、第6,794,136号、第7,067,317号、第7,262,054号、第7,070,934号、第7,361,635号、第7,253,273号；和美国专利公布第2005/0064474号、第2007/0218528号、第2005/0267061号中；所述文献全部出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
其他工程改造递送系统
将工程化核酸(例如，编码本文所述的经修饰的ER-LBD或嵌合蛋白的分离的多核苷酸)引入细胞或其他靶受体实体(诸如本文所述的任何脂质结构)中的各种额外方式。
电穿孔可用于将多核苷酸递送至受体实体。电穿孔是一种通过施加电场以使靶细胞或实体的外膜或外壳瞬时透化，将货物/有效载荷内化到靶细胞或实体的内部区室的方法。一般来讲，该方法包括将细胞或靶实体置于含有所关注货物(例如，本文所述的任何经工程化的核酸)的溶液中的两个电极之间。然后通过施加允许货物进入实体内部(诸如细胞的细胞质)的瞬态设定电压来破坏细胞的脂质膜，即透化。在细胞的实例中，即使不是大多数，也至少有一些细胞保持活力。细胞和其他实体可以在体外、体内或离体进行电穿孔。电穿孔条件(例如，细胞数量、货物浓度、恢复条件、电压、时间、电容、脉冲类型、脉冲长度、体积、电转杯长度、电穿孔溶液组成等)根据若干因素而变化，这些因素包括但不限于细胞或其他受体实体的类型、待递送的货物、期望的内化效率和期望的活力。此类标准的优化在本领域技术人员的范围内。多种装置和方案可用于电穿孔。实例包括但不限于转染系统、/>Flow ElectroporationTM、/>NucleofectorTM系统和Bio-/>电穿孔系统。
用于将工程化核酸(例如，本文所述的编码经修饰的ER-LBD或嵌合蛋白的分离的多核苷酸)引入细胞或其他靶受体实体中的其他方式包括但不限于超声处理、基因枪、流体动力学注射和通过物理方式的细胞膜变形。
用于在体内递送工程化mRNA(例如裸质粒或mRNA)的组合物和方法在Kowalski等人(Mol Ther.2019年4月10日；27(4):710–728)和Kaczmarek等人(Genome Med.2017；9:60.)中有详细描述，各自通过引用并入本文用于所有目的。
使用方法
使用如本文所述的经修饰的ER-LBD、嵌合蛋白或细胞的方法也涵盖在本公开中。
在一些方面，所述方法包括调控所关注的基因的转录。调控转录的方法可以包括：用(i)编码包含经修饰的ER-LBD的嵌合转录因子的异源性构建体，和(ii)包含嵌合转录因子响应性(CTF响应性)启动子的靶标表达盒来转化细胞，所述启动子可操作地连接至所关注的基因；在适于嵌合蛋白的表达的条件下培养经转化的细胞；以及通过使经转化的细胞与非内源性配体接触来诱导嵌合蛋白调控所关注的基因的转录。
在一些实施方案中，调控转录的方法是活化转录的方法。活化转录可以使用嵌合蛋白来实现
在一些实施方案中，所述方法包括活化转录。活化转录可以例如使用包含经修饰的ER-LBD、DNA结合结构域和转录活化结构域的嵌合蛋白来实现。
在一些实施方案中，所述方法包括阻遏转录。阻遏转录可以例如使用包含经修饰的ER-LBD、DNA结合结构域和转录阻遏因子结构域的嵌合蛋白来实现。
在一些方面，所述方法包括调控嵌合蛋白的定位。调控定位的方法可以包括用编码嵌合蛋白的异源性构建体来转化细胞，所述嵌合蛋白包含经修饰的ER-LBD结构域和所关注的多肽；在适于嵌合蛋白的表达的条件下培养经转化的细胞；以及通过使经转化的细胞与非内源性配体接触来诱导嵌合蛋白的核定位。在一些实施方案中，调控定位包括诱导核定位。
在一些实施方案中，非内源性配体以非内源性配体对野生型雌激素受体α基本上无活性的浓度施用。
体内方法
本文提供的方法还包括修饰定位或调控体内转录，例如，通过将非内源性配体递送至体内表达经修饰的ER-LBD或嵌合蛋白的细胞。
在一些实施方案中，经转化的细胞在人或动物中，并且使经转化的细胞与非内源性配体接触包括将药理学剂量的配体施用于人或动物。在一些实施方案中，施用于受试者的非内源性配体包括他莫昔芬。在他莫昔芬的口服施用后，药物在肝脏中被转化为活性他莫昔芬代谢物。在一些实施方案中，活性他莫昔芬代谢物选自4-羟基他莫昔芬(“4-OHT”)、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物和因多昔芬。在一些实施方案中，非内源性配体以约1mg/天至约100mg/天之间的浓度施用于受试者。在特定实施方案中，非内源性配体以约40mg/天的浓度施用于受试者。
在一些方面，本文提供的方法还包括调控所关注的基因的体内转录，例如，通过将(i)用如本文所述的嵌合转录因子转化的细胞和(ii)非内源性配体递送于受试者。在一些实施方案中，经转化的细胞包含靶基因表达盒，所述靶基因表达盒包含与所关注的基因可操作地连接的嵌合转录因子响应性启动子。
在一些实施方案中，受试者是人或动物，并且使经转化的细胞与非内源性配体接触包括将药理学剂量的非内源性配体施用于人或动物。
在一些方面，本文提供的方法还包括在体内递送组合物，该组合物能够产生本文所述的工程化细胞，例如能够将本文所述的多核苷酸分子体内递送至细胞。此类组合物包含任何病毒介导的递送平台、任何脂质结构递送系统、任何纳米颗粒递送系统、任何基因组编辑系统或本文所述的能够在体内对细胞进行工程化的任何其他工程化递送系统。
本文提供的方法还包括在体内递送组合物，该组合物能够产生如本文所述的任何经修饰的ER-LBD、嵌合蛋白或嵌合转录因子(并且在一些实施方案中，由嵌合转录因子调控的基因)。能够在体内产生经修饰的ER-LBD、嵌合蛋白或嵌合转录因子(并且在一些实施方案中，由嵌合转录因子调控的基因)的组合物包括但不限于本文所述的任何工程化核酸。能够在体内产生诱导型转录因子(并且在一些实施方案中，由诱导型转录因子调控的基因)的组合物可以是裸mRNA或裸质粒。
药物组合物
本公开的经修饰的ER-LBD、嵌合蛋白和细胞可以配制于药物组合物中。除了一种或多种工程化核酸或工程化细胞外，这些组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。此类材料应无毒并且不应干扰活性成分的功效。载剂或其他材料的确切性质可取决于施用途径，例如口服、静脉内、皮肤或皮下、鼻、肌肉内、腹膜内途径。
无论是给予个体的细胞、多肽、核酸、小分子还是根据本公开的其他药学上有用的化合物，优选以“治疗有效量”或“预防有效量”施用(如这种情况可以，尽管可以认为预防是治疗)，这也足以显示对个体有益。实际施用的量及施用速率和时程将取决于所治疗的疾病的性质和严重程度。治疗处方(例如对剂量的决定等)在一般从业者和其他医师的职责内，并且通常考虑了待治疗的病症、个别患者的病状、递送部位、施用方法和从业者已知的其他因素。上面提到的技术和方案的实例可以在Remington’sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.(编辑)，1980中找到。
组合物可单独施用或与其他治疗组合，同时施用或顺序施用，这取决于待治疗的病状。
附加实施方案
以下段落提供了另外列举的实施方案。
1.一种经修饰的雌激素受体配体结合结构域(ER-LBD)，所述经修饰的ER-LBD包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸282-595的氨基酸序列，其中所述经修饰的ER-LBD包含G400V氨基酸取代、M543A氨基酸取代和L544A氨基酸取代以及一个或多个另外的氨基酸取代，其中所述一个或多个另外的氨基酸取代在SEQ ID NO:1的区域内，所述区域选自由以下组成的组：位置343-354、位置380-392、位置404-463和位置517-540以及位置547，并且其中与包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的ER-LBD相比，所述经修饰的ER-LBD具有更高的针对非内源性配体的敏感性。
2.一种经修饰的雌激素受体配体结合结构域(ER-LBD)，所述经修饰的ER-LBD包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸282-595的氨基酸序列，其中所述经修饰的ER-LBD包含G400V氨基酸取代、M543A氨基酸取代和L544A氨基酸取代以及一个或多个另外的氨基酸取代，其中所述一个或多个另外的氨基酸取代在SEQ ID NO:1的区域内，所述区域选自由以下组成的组：位置343-354、位置380-392、位置404-463和位置517-540以及位置547，并且其中由于所述一个或多个另外的氨基酸取代，与内源性配体相比，所述经修饰的ER-LBD具有更高的针对非内源性配体的敏感性。
3.一种经修饰的雌激素受体配体结合结构域(ER-LBD)，所述经修饰的ER-LBD包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸282-595的氨基酸序列，其中所述经修饰的ER-LBD包含G400V氨基酸取代、M543A氨基酸取代和L544A氨基酸取代以及一个或多个另外的氨基酸取代，其中所述一个或多个另外的氨基酸取代在SEQ ID NO:1的区域内，所述区域选自由以下组成的组：位置343-354、位置380-392、位置404-463和位置517-540以及位置547，并且其中与包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的ER-LBD相比，所述经修饰的ER-LBD具有更高的针对非内源性配体的选择性。
4.如段落1至3中任一项所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个另外的氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的一个或多个位置，所述一个或多个位置选自由以下组成的组：343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、354、380、384、386、387、388、389、391、392、404、407、409、413、414、417、418、420、421、422、424、428、463、517、521、522、524、525、526、527、528、533、534、536、537、538、539、540和547。
5.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置343。
6.如段落5所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置343处的氨基酸取代选自由以下组成的组：M343F、M343I、M343L和M343V。
7.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置344。
8.如段落7所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置344处的氨基酸取代是G344M。
9.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置345。
10.如段落9所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置345处的氨基酸取代是L345S。
11.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置346。
12.如段落11所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置346处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L346I、L346M、L346F和L346V。
13.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置347。
14.如段落13所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置347处的氨基酸取代选自由以下组成的组：T347D、T347E、T347F、T347I、T347K、T347L、T347M、T347N、T347Q、T347R、T347S和T347V。
15.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置348。
16.如段落15所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置348处的氨基酸取代是N348K。
17.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置349。
18.如段落17所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置349处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L349I、L349M、L349F和L349V。
19.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置350。
20.如段落19所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置350处的氨基酸取代选自由以下组成的组：A350F、A350I、A350L、A350M和A350V。
21.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置351。
22.如段落21所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置351处的氨基酸取代选自由以下组成的组：D351E、D351F、D351I、D351L、D351M、D351N、D351Q和D351V。
23.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置352。
24.如段落23所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置352处的氨基酸取代是R352K。
25.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置354。
26.如段落25所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L354I、L354M、L354F和L354V。
27.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置380。
28.如段落27所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置380处的氨基酸取代是E380Q。
29.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置384。
30.如段落29所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L384I、L384M、L384F和L384V。
31.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置386。
32.如段落31所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置386处的氨基酸取代是I386V。
33.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置387。
34.如段落33所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置387处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L387I、L387M、L387F和L387V。
35.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置388。
36.如段落35所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置388处的氨基酸取代选自由以下组成的组：M388I、M388L和M388F。
37.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置389。
38.如段落37所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置389处的氨基酸取代是I389M。
39.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置391。
40.如段落39所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L391I、L391M、L391F和L391V。
41.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置392。
42.如段落41所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置392处的氨基酸取代是V392M。
43.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置404。
44.如段落43所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置404处的氨基酸取代选自由以下组成的组：F404I、F404L、F404M和F404V。
45.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置407。
46.如段落45所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置407处的氨基酸取代是N407D。
47.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置409。
48.如段落47所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置409处的氨基酸取代是L409V。
49.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置413。
50.如段落49所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D。
51.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置414。
52.如段落51所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置414处的氨基酸取代是Q414E。
53.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置417。
54.如段落53所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置417处的氨基酸取代是C417S。
55.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置418。
56.如段落55所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置418处的氨基酸取代选自由以下组成的组：V418I、V418L、V418M和V418F。
57.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置420。
58.如段落57所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置420处的氨基酸取代选自由以下组成的组：G420I、G420M、G420F和G420V。
59.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置421。
60.如段落59所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代选自由以下组成的组：M421I、M421L、M421F和M421V。
61.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置422。
62.如段落61所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置422处的氨基酸取代是V422I。
63.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置424。
64.如段落63所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置424处的氨基酸取代选自由以下组成的组：I424L、I424M、I424F和I424V。
65.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置428。
66.如段落65所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置428处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L428I、L428M、L428F和L428V。
67.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置463。
68.如段落67所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P。
69.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置517。
70.如段落69所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置517处的氨基酸取代是M517A。
71.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置521。
72.如段落71所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置521处的氨基酸取代选自由以下组成的组：G521A、G521F、G521I、G521L、G521M和G521V。
73.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置522。
74.如段落73所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置522处的氨基酸取代选自由以下组成的组：M522I、M522L和M522V。
75.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置524。
76.如段落75所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代选自由以下组成的组：H524A、H524I、H524L、H524F和H524V。
77.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置525。
78.如段落77所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置525处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L525F、L525I、L525M、L525N、L525Q、L525S、L525T和L525V。
79.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置526。
80.如段落79所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置526处的氨基酸取代是Y526L。
81.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置527。
82.如段落81所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置527处的氨基酸取代是S527N。
83.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置528。
84.如段落83所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置528处的氨基酸取代选自由以下组成的组：M528F、M528I和M528V。
85.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置533。
86.如段落85所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置533处的氨基酸取代选自由以下组成的组：V533F和V533W。
87.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置534。
88.如段落87所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置534处的氨基酸取代选自由以下组成的组：V534Q和V534R。
89.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置536。
90.如段落89所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置536处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L536F和L536M、L536R和L536Y。
91.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置537。
92.如段落91所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置537处的氨基酸取代选自由以下组成的组：Y537E和Y537S。
93.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置538。
94.如段落93所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置538处的氨基酸取代选自由以下组成的组：D538G和D538K。
95.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置539。
96.如段落95所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置539处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L539A和L539R。
97.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置540。
98.如段落97所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置540处的氨基酸取代选自由以下组成的组：L540A和L540F。
99.如段落4所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置547。
100.如段落99所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置547处的氨基酸取代是H547A。
101.如段落1至100中任一项所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个另外的氨基酸取代是两个氨基酸取代。
102.如段落101所述的经修饰的ER-LBD，其中所述两个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：343、345、347、348、351、354、384、387、388、389、391、392、404、418、421、521、524和525。
103.如段落102所述的经修饰的ER-LBD，其中所述两个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置345和348。
104.如段落103所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置345处的氨基酸取代是L345S并且SEQ ID NO:1的位置348处的氨基酸取代是N348K。
105.如段落102所述的经修饰的ER-LBD，其中所述两个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置384和389。
106.如段落105所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M并且SEQ ID NO:1的位置389处的氨基酸取代是I389M。
107.如段落102所述的经修饰的ER-LBD，其中所述两个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置421和392。
108.如段落107所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代是M421I并且SEQ ID NO:1的位置392处的氨基酸取代是V392M。
109.如段落102所述的经修饰的ER-LBD，其中所述两个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置354和391。
110.如段落109所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I并且SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391F。
111.如段落102所述的经修饰的ER-LBD，其中所述两个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置354和384。
112.如段落111所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I并且SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M。
113.如段落102所述的经修饰的ER-LBD，其中所述两个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置354和387。
114.如段落113所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I并且SEQ ID NO:1的位置387处的氨基酸取代是L387M。
115.如段落102所述的经修饰的ER-LBD，其中所述两个氨基酸取代处于位置387和391。
116.如段落115所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置387处的氨基酸取代是L387M并且SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391F。
117.如段落102所述的经修饰的ER-LBD，其中所述两个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置384和387。
118.如段落117所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M并且SEQ ID NO:1的位置387处的氨基酸取代是L387M。
119.如段落102所述的经修饰的ER-LBD，其中所述两个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置384和391。
120.如段落117所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M并且SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391F。
121.如段落1至120中任一项所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个另外的氨基酸取代是三个氨基酸取代。
122.如段落121所述的经修饰的ER-LBD，其中所述三个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：343、347、351、354、388、391、404、414、418、463、521、524和525。
123.如段落122所述的经修饰的ER-LBD，其中所述三个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置354、384和391。
124.如段落123所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M,并且SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391F。
125.如段落122所述的经修饰的ER-LBD，其中所述三个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置414、463和524。
126.如段落125所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置414处的氨基酸取代是Q414E，SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P,并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524L。
127.如段落1至126中任一项所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个另外的氨基酸取代是四个氨基酸取代。
128.如段落127所述的经修饰的ER-LBD，其中所述四个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：343、347、351、354、384、388、391、404、413、418、463、521、524和525。
129.如段落128所述的经修饰的ER-LBD，其中所述四个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置354、384、391和418。
130.如段落129所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391F,并且SEQ ID NO:1的位置418处的氨基酸取代是V418I。
131.如段落128所述的经修饰的ER-LBD，其中所述四个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置343、388、521和404。
132.如段落131所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置343处的氨基酸取代是M343I，SEQ ID NO:1的位置388处的氨基酸取代是M388I，SEQ ID NO:1的位置521处的氨基酸取代是G521I,并且SEQ ID NO:1的位置404处的氨基酸取代是F404L。
133.如段落128所述的经修饰的ER-LBD，其中所述四个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置524、347、351和525。
134.如段落133所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524V，SEQ ID NO:1的位置347处的氨基酸取代是T347R，SEQ ID NO:1的位置351处的氨基酸取代是D351Q,并且SEQ ID NO:1的位置525处的氨基酸取代是L525N。
135.如段落128所述的经修饰的ER-LBD，其中所述四个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置354、384、391和463。
136.如段落135所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391V,并且SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P。
137.如段落128所述的经修饰的ER-LBD，其中所述四个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置384、391、413和524。
138.如段落137所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D,并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524F。
139.如段落1至138中任一项所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个另外的氨基酸取代是五个氨基酸取代。
140.如段落139所述的经修饰的ER-LBD，其中所述五个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：354、384、391、409、413、414、421、463和524。
141.如段落140所述的经修饰的ER-LBD，其中所述五个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置384、409、413、463和524。
142.如段落141所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置409处的氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ IDNO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P,并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524L。
143.如段落140所述的经修饰的ER-LBD，其中所述五个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置391、413、414、463和524。
144.如段落143所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置414处的氨基酸取代是Q414E，SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P,并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524F。
145.如段落140所述的经修饰的ER-LBD，其中所述五个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置391、414、421、463和524。
146.如段落145所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置414处的氨基酸取代是Q414E，SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P,并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524F。
147.如段落140所述的经修饰的ER-LBD，其中所述五个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置354、409、413、421和524。
148.如段落147所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置409处的氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代是M421L,并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524L。
149.如段落140所述的经修饰的ER-LBD，其中所述五个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置354、409、421、463和524。
150.如段落149所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置409处的氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P,并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524L。
151.如段落1至150中任一项所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个另外的氨基酸取代是六个氨基酸取代。
152.如段落151所述的经修饰的ER-LBD，其中所述六个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：354、384、391、409、413、414、421、463和524。
153.如段落152所述的经修饰的ER-LBD，其中所述六个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置384、391、413、421、463和524。
154.如段落153所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P,并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524L。
155.如段落152所述的经修饰的ER-LBD，其中所述六个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置409、413、414、421、463和524。
156.如段落155所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置409处的氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置414处的氨基酸取代是Q414E，SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P,并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524L。
157.如段落152所述的经修饰的ER-LBD，其中所述六个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置354、391、409、413、414和524。
158.如段落157所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置409处的氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置414处的氨基酸取代是Q414E,并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524L。
159.如段落1至158中任一项所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个另外的氨基酸取代是七个氨基酸取代。
160.如段落159所述的经修饰的ER-LBD，其中所述七个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：354、384、391、409、413、414、421、463、517和524。
161.如段落160所述的经修饰的ER-LBD，其中所述七个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置354、384、409、413、421、463和524。
162.如段落161所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置409处的氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P,并且SEQID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524F。
163.如段落160所述的经修饰的ER-LBD，其中所述七个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置354、391、413、421、463、517和524。
164.如段落163所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P，SEQ ID NO:1的位置517处的氨基酸取代是M517A,并且SEQID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524L。
165.如段落160所述的经修饰的ER-LBD，其中所述七个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置354、391、413、414、421、517和524。
166.如段落165所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置354处的氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置414处的氨基酸取代是Q414E，SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置517处的氨基酸取代是M517A,并且SEQID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524F。
167.如段落1至166中任一项所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个另外的氨基酸取代是八个氨基酸取代。
168.如段落167所述的经修饰的ER-LBD，其中所述八个氨基酸取代处于SEQ IDNO:1的位置384、391、409、413、421、463、517和524。
169.如段落168所述的经修饰的ER-LBD，其中SEQ ID NO:1的位置384处的氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置391处的氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置409处的氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置413处的氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置421处的氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置463处的氨基酸取代是S463P，SEQ IDNO:1的位置517处的氨基酸取代是M517A,并且SEQ ID NO:1的位置524处的氨基酸取代是H524F。
170.如段落1至169中任一项所述的经修饰的ER-LBD，其中所述经修饰的ER-LBD还包含V595A氨基酸取代。
171.如段落1至170中任一项所述的经修饰的ER-LBD，其中所述非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物和因多昔芬。
172.一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含融合至如段落1至171中任一项所述的经修饰的ER-LBD的所关注的多肽。
173.如段落172所述的嵌合蛋白，其中所述所关注的多肽包含核酸结合结构域。
174.如段落173所述的嵌合蛋白，其中所述核酸结合结构域包含锌指结构域。
175.如段落174所述的嵌合蛋白，其中所述锌指结构域包含序列MSRPGERPFQCRICMRNFSNMSNLTRHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSDRSVLRRHLRTHTGSQKPFQCRICMRNFSDPSNLARHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSDRSSLRRHLRTHTGSQKPFQCRICMRNFSQSGTLHRHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSQRPNLTRHLRTHLRGS(SEQ ID NO:62)。
176.如段落172至175中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含嵌合转录因子，并且其中所关注的多肽包含核酸结合结构域和转录调控子结构域。
177.如段落176所述的嵌合蛋白，其中所述转录模块结构域是转录激活因子。
178.如实施方案177所述的嵌合蛋白，其中所述转录激活因子选自由以下组成的组：单纯疱疹病毒蛋白16(VP16)激活结构域；包含VP16的四个串联拷贝的激活结构域；VP64激活结构域；NFκB的p65激活结构域(p65)；爱泼斯坦-巴尔病毒R反式激活因子(Rta)激活结构域；包含VP64、p65和Rta激活结构域(VPR激活结构域)的三元激活因子；包含VP64、p65和HSF1激活结构域(VPH激活结构域)的三元激活因子；和人E1A相关蛋白p300的组蛋白乙酰转移酶核心结构域(p300 HAT核心激活结构域)。
179.如段落178所述的嵌合蛋白，其中所述转录激活因子是p65转录激活因子，所述p65转录激活因子包含氨基酸序列DEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS(SEQ IDNO:64)。
180.一种分离的多核苷酸分子，所述分离的多核苷酸分子包含编码如段落1至171中任一项所述的经修饰的ER-LBD的核苷酸序列。
181.一种分离的多核苷酸分子，所述分离的多核苷酸分子包含编码如段落172至179中任一项所述的嵌合蛋白的核苷酸序列。
182.一种异源性构建体，所述异源性构建体包含可操作地连接至如段落180所述的多核苷酸分子的启动子。
183.一种异源性构建体，所述异源性构建体包含可操作地连接至如段落181所述的多核苷酸分子的启动子。
184.一种质粒，所述质粒包含如段落182所述的异源性构建体。
185.一种质粒，所述质粒包含如段落183所述的异源性构建体。
186.一种细胞，所述细胞包含如段落182所述的异源性构建体或如段落184所述的质粒。
187.一种细胞，所述细胞包含如段落183所述的异源性构建体或如段落185所述的质粒。
188.一种用于调控所关注的基因的转录的基因开关，所述基因开关包含：
(a)如段落176所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白结合至嵌合转录因子响应性(CTF响应性)启动子，所述启动子可操作地连接至所述所关注的基因；和
(b)非内源性配体，其中所述非内源性配体与所述经修饰的ER-LBD的结合诱导所述嵌合蛋白调控所述所关注的基因的转录。
189.如段落188所述的基因开关，其中所述非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物和因多昔芬。
190.如段落188或段落189所述的基因开关，其中所述所关注的基因编码选自由以下组成的组的多肽：细胞因子、趋化因子、归巢分子、生长因子、细胞死亡调控因子、共活化分子、肿瘤微环境调节物a、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
191.如段落190所述的基因开关，其中所关注的基因编码选自由以下组成的组的细胞因子：IL1-β、IL-2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL-12p70融合蛋白、IL15、IL17A、IL18、IL21、IL22、I型干扰素、干扰素-γ和TNF-α。
192.如段落191所述的基因开关，其中所述所关注的基因编码IL12p70融合蛋白，所述IL12p70融合蛋白包含氨基酸序列MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGSGGGSGGGSGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS(SEQ ID NO:58)。
193.一种调控所关注的基因的转录的方法，所述方法包括：用(i)编码如段落176所述的嵌合蛋白的异源性构建体和(ii)包含嵌合转录因子响应性(CTF响应性)启动子的靶标表达盒来转化细胞，所述启动子可操作地连接至所述所关注的基因，以及通过使经转化的细胞与非内源性配体接触来诱导所述嵌合蛋白调控所述所关注的基因的转录。
194.如段落193所述的方法，其中所述方法还包括在诱导所述嵌合蛋白调控转录之前在适合于所述嵌合蛋白的表达的条件下培养所述经转化的细胞。
195.如段落193或194所述的方法，其中调控转录包括活化所述所关注的基因的转录。
196.如段落193或194所述的方法，其中调控转录包括阻遏所述所关注的基因的转录。
197.如段落193至196中任一项所述的方法，其中所述靶标表达盒由编码如段落174所述的嵌合蛋白的所述异源性构建体编码。
198.如段落193至196中任一项所述的方法，其中所述靶标表达盒由第二异源性构建体编码。
199.一种调控嵌合蛋白的定位的方法，所述方法包括用编码如段落172至179中任一项所述的嵌合蛋白的异源性构建体来转化细胞，以及通过使经转化的细胞与非内源性配体接触来诱导所述嵌合蛋白的核定位。
200.如段落199所述的方法，所述方法还包括在诱导所述核定位之前在适于所述嵌合蛋白的表达的条件下培养所述经转化的细胞。
201.如段落193或195至200中任一项所述的方法，其中所述经转化的细胞在人或动物中，并且其中使所述经转化的细胞与所述非内源性配体接触包括将药理学剂量的所述配体施用于所述人或动物。
202.如段落193至201中任一项所述的方法，其中所述非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物和因多昔芬。
203.如段落201或段落202所述的方法，其中所述非内源性配体以所述非内源性配体对SEQ ID NO:1的野生型雌激素受体α基本上无活性的浓度施用。
实施例
下面是用于实施本公开的具体实施方案的实施例。提供实施例仅仅是为了说明的目的，并非旨在以任何方式限制本公开的范围。已经努力确保所用的数字的准确性(例如，数量，温度等)，但是当然应允许一些实验误差和偏差。
除非另有说明，否则本公开的实践将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。此类技术在文献中有全面解释。参见，例如,T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.，当前新增)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编辑,Academic Press,Inc.)；Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)A卷和B卷(1992)。
实施例1：被预测为调控配体结合的ERT2突变
对4-OHT、因多昔芬和雌二醇与称为ERT2的雌激素受体α的突变体形式的结合进行计算机模拟建模，以鉴定与SEQ ID NO:2的ERT2相比，被预测为具有增加的针对4-OHT的敏感性的突变。
材料和方法
将雌二醇和ERα之间的复合物(PDB：1QKU，分辨率)以及4-OHT和ERα之间的复合物(PDB：3ERT，分辨率/>)的可用的晶体结构用于生成雌二醇和ERT2、4-OHT和ERT2以及因多昔芬和ERT2之间的复合物模型。ERT2序列与ERα有三个残基的不同(G400V/M543A/L544A)。结构模型中仅使用从306至551的残基，因为可用的结构都是仅使用该区域解析的。
使用标准方案(Kannan等人，ACS Omega.2017年11月30日；2(11):7881–7891)对apoERT2、ERT2–雌二醇、ERT2–4-OHT和ERT2–因多昔芬复合物进行MD模拟(每个模拟进行100ns，每个一式三份)。ERT2和结合的配体/药物二者均在模拟过程中保持稳定(使用标准指标)。将模拟后半段(50ns)生成的构象(模拟被认为是已平衡的)用于后续分析。
结果
对第一组突变进行4-OHT结合改善的计算机模拟分析。根据其他雌激素受体蛋白的同源位置处存在的氨基酸来选择配体结合口袋中的残基的十八个突变。在18个选定的突变中，有17个突变体的结合紧密度比野生型ERT2大至少1.8kcal/mol；只有M517A突变似乎会破坏4-OHT结合的稳定性(图1A)。然后，进行结合能计算以观察突变对雌二醇的结合的影响。与4-OHT(其中除M517A之外的所有突变都有利于结合，如负ΔΔG值所示)相比，大多数突变(图1B)对雌二醇的结合的影响可忽略不计(所有突变的ΔΔG值均在2kcal/mol内，而对于大多数突变，4-OHT的ΔΔG值>2kcal/mol)。仅突变L409V、M517A和N407D表现出与雌二醇的结合增加大于1kcal/mol，但是L409V和N407D二者与4-OHT的结合紧密度分别大3kcal/mol和4kcal/mol。第一组突变如下表6中所示。
表6
对第二组突变进行4-OHT结合改善的计算机模拟分析。对于配体结合口袋处的另外五个位点的十九个不同突变(除了表6所示的之外)，对4-OHT和雌二醇与ERT2的结合进行分子对接模拟，以鉴定与野生型ERT2相比对4-OHT的敏感性增加的其他突变体。结合能计算的进行与对第一组突变进行的计算一致。全部十九个突变均表现出与4-OHT的结合得以改善，范围为1.8kcal/mol至7kcal/mol(参见图2)。第二组突变如表7所示。
表7
对第三组突变进行4-OHT结合改善的计算机模拟分析。选择配体结合袋中的另外六个残基位置(残基428、346、349、418、421和424)处的总共23个突变进行分子对接模拟。结合能计算的进行与对第一组突变进行的计算一致。六个突变(L346F、L349M、V418I、V418M、I424M和M421L)表现出与4-OHT的结合改善至少约1.5kcal/mol(图3)。这23个突变如表8所示。
表8
对第四组突变进行4-OHT结合改善的计算机模拟分析。选择配体结合袋中的另外六个残基位置(残基528、343、388、522、414和521)处的总共23个突变进行分子对接模拟。结合能计算的进行与对第一组突变进行的计算一致。23个突变中的18个表现出与4-OHT的结合改善至少约1.0kcal/mol(图4)。第四组突变如表9所示。
表9
对第五组突变进行4-OHT结合改善的计算机模拟分析。选择另外五个残基位置(残基524、525、347、350和351)处的总共38个突变进行分子对接模拟。结合能计算的进行与对第一组突变进行的计算一致。38个突变中的28个表现出与4-OHT的结合改善至少约1.0kcal/mol至多达约4.5kcal/mol(图5)。第五组突变如表10所示。
表10
通过分子对接模拟对第1-5组的所有突变进行与因多昔芬和雌二醇结合的进一步分析，以确定与因多昔芬和雌二醇的结合能量(以ΔΔG计算，单位为kcal/mol)。另外，与雌二醇结合相比，因多昔芬结合的结合能之间的差值以ΔΔΔG值计算。4-OHT、因多昔芬和雌二醇中的每者的结合能，以及4-OHT和因多昔芬的结合能与雌二醇结合相比差异的汇总如表11所示。
表11
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对第六组突变进行计算机模拟分析，以鉴定破坏激动剂结合确认(即，雌二醇结合构象)和/或稳定拮抗剂结合确认(即，4-OHT或因多昔芬结合构象)的突变体。激动剂结合和拮抗剂结合构象之间的主要结构差异在于螺旋12的取向和对接位点(H12，参见图6)。选择螺旋12中的八个残基位置(残基538、536、539、540、547、534、533和537)处的总共14个突变进行分析。拮抗剂结合构象中的突变型ERT2和野生型ERT2的自由能差值，以及激动剂结合构象中的突变型ERT2和野生型ERT2的自由能差值以ΔG值计算。然后，计算ΔΔG值，负值表示ERT2突变体的拮抗剂结合构象优于突变体的激动剂结合构象，正值表示激动剂构象优于拮抗剂结合构象。十四个突变中的七个(D538K、L536F、L536Y、L536M、L539R、H547A和V534R)稳定拮抗剂确认(参见图7)。第六组突变如表12所示。
表12
实施例2：通过转染筛选鉴定药物敏感性增加的ERT2突变体
通过转染测定法来分析ERT2突变体响应于4-OHT诱导报告基因表达的能力。在第一次转染筛选中，编码具有实施例1中所述的突变的ERT2的构建体是在如SEQ ID NO:3所示的“野生型”ERT2(包含G400V/M543A/L544A/V595A四氨基酸取代)的背景下产生的。每个ERT2构建体均包含用于DNA结合的ZF10-1结构域、p65转录活化结构域和ERT2突变体。测试每个构建体对4-OHT的敏感性。将每个突变体克隆到表达构建体中，用于转染HEK293T+YBTATA_mCherry报告细胞系。在第二次转染筛选中，产生如实施例1所述的编码其他ERT2突变体的构建体并测试该构建体对4-OHT的敏感性。对于筛选，将细胞用三种不同浓度的4-OHT(0.025、0.1和0.25μM)处理，然后通过荧光活化细胞分选(FACS)来测定mCherry表达(图8A-8C、图9A-9C和图10A-10C)。
材料和方法
将HEK293T细胞用编码合成启动子的慢病毒转导，该启动子由连接至YBTATA最小启动子的4个ZF10-1结合位点组成。该合成启动子驱动mCherry的表达。来自该细胞系的细胞被称为“报告细胞”。
第1天，将报告细胞以1.5e5个细胞/孔涂铺在24孔板中。第2天，用ERT突变体转染细胞。为每个孔制备0.6μgDNA、1.8μL Fugene和30μLOptimem的混合物，其中DNA编码与p65和ERT2突变体融合的ZF10-1。在一些筛选中，包括编码GFP的质粒作为对照，以通过流式细胞术来选择经转染的细胞。第3天，将细胞以1:20的比率分离并接种到96孔板中。用0、0.025、0.1或0.25μM 4-OHT来处理细胞。第5天，除去培养基，将细胞用胰蛋白酶消化，然后重悬于添加有Sytox Red(APC通道中的荧光)活力染料的FACS缓冲液中。使细胞在流式细胞仪上运行，并通过FSC/SSC(针对细胞)、FSC/Sytox Red(针对活细胞)、FSC/FSC-Width(针对单细胞)以及可能的GFP+(针对经转染的细胞)(如果包括转染对照)进行门控。绘制每个药物浓度处mCherry阳性细胞的百分比，并且与野生型ERT2进行比较，并鉴定出对4-OHT更敏感的突变体。
结果
如图8A-8C、图9A-9C和图10A-10C所示，转染筛选鉴定出与ERT2(SEQ ID NO:3)相比具有改善的mCherry表达诱导的突变体。在第一次转染筛选中，观察到十七个突变体的表达诱导得以改善：L354I(SB03498)、L391V(SB03505)、Q414E(SB03383)、L409V(SB03375)、S463P(SB03393)、L384M(SB03377)、L354I+L384M(SB03511)、N413D(SB03381)、M517A(SB03379),G344M(SB03372))、I386V(SB03373)、N407D(SB03380)、C417S(SB03371)、R352K(SB03384)、Y537S(SB03389)、M388F(SB03579)和G521A(SB03587)，以下七个突变体诱导的表达改善最大：L354I(SB03498)、L391V(SB03505)、Q414E(SB03383)、L409V(SB03375)和S463P(SB03393)(图8A-8C)。在第二次转染筛选中，观察到十个突变体的表达诱导得以改善：I424L(SB03558)、M421L(SB03566)、M421F(SB03567)、T347E(SB03801)、L536M(SB03828)、Y537E(SB03839)、T347I(SB03802)和T347M(SB03805)、V418I(SB03550)和V533W(SB03838)，以下六个突变体诱导的表达得以显著改善：I424L(SB03558)、M421L(SB03566)、M421F(SB03567)、T347E(SB03801)、L536M(SB03828)和Y537E(SB03839)(图9A-9C)。在第三次转染筛选中(图10A-10C)，观察到如表13中所示的突变体的表达诱导改善。
表13.
表13
实施例3：通过转导筛选鉴定药物敏感性增加的突变体
通过三次转导筛选来分析ERT2突变体响应于4-OHT诱导报告基因表达的能力。突变体L354I+L384M(在第一次转染筛选中鉴定)被包括在全部三次转导筛选中。克隆编码ERT2突变体的慢病毒载体，该突变体在实施例2的转染筛选中展示处对4-OHT的反应有所改善。如实施例2所述的报告细胞系用编码ERT2突变体的慢病毒进行转导，并评估突变体响应于各种4-OHT浓度诱导mCherry表达的能力。
材料和方法
对于转导筛选，第1天，将报告细胞以2e5个细胞/孔涂铺在12孔板中。第2天，用编码来自转染筛选的先导ERT突变体的慢病毒来转导细胞。第3天和第4天，对细胞进行传代以维持平板上<90％的汇合度。第5天，将细胞接种到96孔板中并用0、0.001、0.0025、0.004、0.025、0.05、0.1或0.25μM 4-OHT处理。第8天，除去培养基，将细胞用胰蛋白酶消化，然后重悬于添加有Sytox Red(APC通道中的荧光)活力染料的FACS缓冲液中。使细胞在流式细胞仪上运行，并通过FSC/SSC(对于细胞)、FSC/Sytox Red(对于活细胞)进行门控，绘制每个药物浓度处的mCherry阳性细胞的百分比，并与野生型ERT2进行比较，以找到更敏感的突变体(图11A)。柱状图中还显示了两个药物浓度(0.004和0.025μM 4-OHT)处的mCherry阳性细胞的百分比(图11B)。
结果
如图11A和11B所示，第一次转导筛选展示了几种突变体的4-OHT反应有所改善，这些突变体在实施例2的转染筛选中被鉴定为具有改善的4-OHT结合。具体而言，与野生型ERT2(构建体3422，SEQ ID NO:3)相比，突变体L354I、L391V、Q414E、L409V、S463P、L384M和L354I+L384M均展示出改善的4-OHT反应。在第一次转导筛选中展示出改善的4-OHT结合的ERT2突变体如表14所示。
表14
如图12所示，第二次转导筛选展示了在实施例2的转染筛选中鉴定的突变体的4-OHT反应得以改善。具体而言，与野生型ERT2(构建体3422)相比，突变体M517A和N413D和L354I+L384M展示出改善的4-OHT反应。值得注意的是，L354I+L384M突变体的4-OHT反应的改善在第一次和第二次转导筛选中均得到证实。在第二次转导筛选中展示出改善的4-OHT结合的ERT2突变体如表15所示。
表15
构建体 描述
SB03379 M517A
SB03381 N413D
SB03511 L354I+L384M
如图13所示，第三次转导筛选展示了在实施例2的转染筛选中鉴定的突变体的4-OHT反应得以改善。具体而言，与野生型ERT2(构建体3422)相比，突变体I524L、M421L和L354I+L384M展示出改善的4-OHT反应。在第三次转导筛选中展示出改善的4-OHT结合的ERT2突变体如表16所示。
表16
构建体 描述
SB03558 I524L
SB03566 M421L
SB03511 L354I+L384M
实施例4：用于开发因多昔芬ON开关的ERT2突变体文库筛选
材料和方法
ERT2突变体组合文库筛选
将HEK293T细胞用SB04401(组合ERT2突变体文库)(图14A)转导，该文库由约800个独特的ER-LBD变体组成，每个变体都是表18中给出的突变体以及它们纳入原则的独特组合。为了生成每个细胞具有独特的ER-LBD变体的同质细胞系，通过拷贝数测定法对经转导的HEK293T细胞的病毒整合进行定量。鉴定出每个细胞的平均病毒整合度<1个拷贝的ERT2突变体文库的细胞系，并对该细胞系进行嘌呤霉素选择。然后用SB01066 mCherry报告基因来转导选定的细胞系(图14B)。然后通过mCherry报告基因来测试转导细胞对因多昔芬和4-OHT的敏感性，如果ER-LBD变体对低至约0.1nM至约1μM的测试浓度敏感，则该报告基因将表达。分选表达mCherry并因此响应于因多昔芬处理的细胞，然后从所述分选的细胞中分离基因组DNA。通过以下方式从分离的基因组DNA中鉴定出变体：；通过PCR扩增ERT2编码序列，然后将PCR产物插入到pcr4 TOPO载体(Life Technologies)中。然后提交获得的菌落进行桑格测序。将所鉴定的突变体被克隆到构建体中，例如，SB06136-SB06153(ZF10-1_p65_ERT2突变体)。
表18
使用mCherry报告基因在U87MG中进行ERT2突变体验证
在转导前约16小时，将100k U87MG:1066细胞接种到12孔板形式的16个孔中。在转导过程中，每个孔中的细胞均用100k pg的ERT2变体构建体的病毒进行转导。在转导后，在24孔板中将细胞分成每孔50k个细胞，并用无药物培养基或一系列因多昔芬或4-OHT药物条件进行处理。在用因多昔芬或4-OHT处理细胞后约两天，收集细胞并通过流式细胞术来定量mCherry报告基因表达。
结果
ERT2突变体文库的筛选鉴定出对1nM因多昔芬敏感的ERT2变体的子集。在该子集中，有15个变体(表19)活化mCherry报告基因的能力在U87MG细胞中得以验证(SB01066；图14B)，浓度在0pM、10pM、50pM、100pM的范围内，并且因多昔芬(图15A)和4-OHT(图15B)为1nM。在用因多昔芬或4-OHT处理后约24小时对mCherry的表达进行定量。如结果所展示，全部15个变体对浓度约为1nM或更低的因多昔芬和4-OHT敏感，而阴性对照U87MG和U87MG:1066阴性对照则未显示出敏感性。
表19
构建体 描述
SB06136 ZF10-1_p65_ERT2_突变体81
SB06138 ZF10-1_p65_ERT2_突变体93
SB06139 ZF10-1_p65_ERT2_突变体86
SB06140 ZF10-1_p65_ERT2_突变体95
SB06141 ZF10-1_p65_ERT2_突变体88
SB06142 ZF10-1_p65_ERT2_突变体77
SB06143 ZF10-1_p65_ERT2_突变体49
SB06144 ZF10-1_p65_ERT2_突变体58
SB06145 ZF10-1_p65_ERT2_突变体62
SB06146 ZF10-1_p65_ERT2_突变体63
SB06147 ZF10-1_p65_ERT2_突变体55
SB06149 ZF10-1_p65_ERT2_突变体41
SB06150 ZF10-1_p65_ERT2_突变体43
SB06151 ZF10-1_p65_ERT2_突变体46
SB06152 ZF10-1_p65_ERT2_突变体40
选择来自此前筛选的ERT2变体(表20)进行针对因多昔芬和4-OHT敏感性的进一步测试，对照为野生型ERT2。测试表明，野生型ERT2在约25nM因多昔芬和约25nM 4-OHT处开始活化，而三个测试的ERT2变体在1nM和0.1nM因多昔芬以及1nM和0.1nM 4-OHT处活化mCherry表达(图16A-16D)。示例性热图显示了在不同浓度(包括2.2pM雌二醇)处测试的构建体的mCherry表达的倍数活化(图16B)。ERT2是ER-α突变，对雌二醇不敏感，先导ERT2变体被证实继续对生物学观察的雌二醇浓度不敏感。倍数活化通过将每个测试条件的gMFImCherry水平除以用报告基因(SB01066)转导的U87MG细胞的gMFI mCherry水平来计算。
表20
构建体 描述
SB06141 ZF10-1_p65_ERT2_突变体88
SB06146 ZF10-1_p65_ERT2_突变体63
SB06149 ZF10-1_p65_ERT2_突变体41
SB03422 ZF10-1_p65_ERT2野生型
SB01066 pMinYBTATA:mCherry报告基因
实施例5：NK细胞中的ERT2突变体的验证
材料和方法
使用mCherry报告基因在NK细胞中验证ERT2突变体
在饲养细胞活化10天后，用ERT2突变体病毒和报告基因SB01066病毒来共转导NK细胞(实验设置1)。在转导后第2天，用浓度范围为0nM、0.01nM、0.1nM、1nM和10nM的因多昔芬或4-OHT来处理经转导的NK细胞。第4天，通过流式细胞术来检查细胞的mCherry表达。
实验设置1
使用IL12报告基因在NK细胞中验证ERT2突变体
在饲养细胞活化10天后，用ERT2/IL12载体来转导NK细胞(表22；实验设置2)。在转导后第2天，用浓度范围为0nM、0.1nM、1nM、10nM、100nM和1000nM的因多昔芬来处理经转导的NK细胞。第4天，通过Luminex来检查细胞的IL-12表达。
实验设置2
结果
选择来自此前筛选的ERT2变体(表21；图17A-17B)在原代NK细胞中进行针对因多昔芬和4-OHT敏感性的进一步测试。在所测试的变体中，SB06142(突变体77；L354I/L391V/N413D/M421L/S463P/M517A/H524L)、SB06136(突变体81；L384M/L391V/N413D/M421L/S463P/H524L)和SB06145(突变体62；L409V/N413D/Q414E/M421L/S463P/H524L)对浓度为0.1nM的因多昔芬和4-OHT敏感(图17A-17B)。
表21
构建体 描述
SB06136 ZF10-1_p65_ERT2_突变体81
SB06138 ZF10-1_p65_ERT2_突变体93
SB06139 ZF10-1_p65_ERT2_突变体86
SB06140 ZF10-1_p65_ERT2_突变体95
SB06141 ZF10-1_p65_ERT2_突变体88
SB06142 ZF10-1_p65_ERT2_突变体77
SB06143 ZF10-1_p65_ERT2_突变体49
SB06144 ZF10-1_p65_ERT2_突变体58
SB06145 ZF10-1_p65_ERT2_突变体62
SB06146 ZF10-1_p65_ERT2_突变体63
SB06147 ZF10-1_p65_ERT2_突变体55
SB06149 ZF10-1_p65_ERT2_突变体41
SB06150 ZF10-1_p65_ERT2_突变体43
SB06151 ZF10-1_p65_ERT2_突变体46
SB06152 ZF10-1_p65_ERT2_突变体40
为了展示治疗性多肽的递送，如下表22所示构建ERT2/IL-12载体，并测试原代NK细胞对因多昔芬的敏感性。在NK细胞中进行的ERT2/IL-12载体测试表明，TL10009以及来自SB06142的ERT2-L354I/L391V/N413D/S463P/H524L和crIL12 CD16 CS在IL-12中显示出最佳诱导和倍数变化(图18A-18B)。
表22
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表17序列
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虽然本公开已经参考优选实施方案和各种替代实施方案具体地示出和描述，但是相关领域的技术人员将理解，在不脱离本公开和所附权利要求的精神和范围的情况下可以在其中做出形式和细节上的各种变化。
本说明书正文中引用的所有参考文献、颁发的专利和专利申请均通过引用整体并入本文用于所有目的。

Claims (15)

1.一种经修饰的雌激素受体配体结合结构域(ER-LBD)，所述经修饰的ER-LBD包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸282-595的氨基酸序列，其中所述经修饰的ER-LBD包含G400V氨基酸取代、M543A氨基酸取代和L544A氨基酸取代以及一个或多个另外的氨基酸取代，其中所述一个或多个另外的氨基酸取代在SEQ ID NO:1的区域内，所述区域选自由以下组成的组：位置343-354、位置380-392、位置404-463和位置517-540以及位置547，并且其中与包含SEQID NO:2的氨基酸序列的ER-LBD相比，或者由于所述一个或多个另外的氨基酸取代，与内源性配体相比，所述经修饰的ER-LBD具有更高的针对非内源性配体的敏感性和/或选择性，
任选地其中所述经修饰的ER-LBD还包含V595A氨基酸取代，和/或
任选地其中所述非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物和因多昔芬。
2.如权利要求1所述的经修饰的ER-LBD，其中所述一个或多个另外的氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的一个或多个位置，所述一个或多个位置选自由以下组成的组：343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、354、380、384、386、387、388、389、391、392、404、407、409、413、414、417、418、420、421、422、424、428、463、517、521、522、524、525、526、527、528、533、534、536、537、538、539、540和547。
3.如权利要求2所述的经修饰的ER-LBD，其中：
a.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置343，任选地其中SEQ ID NO:1的位置343处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：M343F、M343I、M343L和M343V；
b.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置344，任选地其中SEQ ID NO:1的位置344处的所述氨基酸取代是G344M；
c.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置345，任选地其中SEQ ID NO:1的位置345处的所述氨基酸取代是L345S；
d.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置346，任选地其中SEQ ID NO:1的位置346处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：L346I、L346M、L346F和L346V；
e.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置347，任选地其中SEQ ID NO:1的位置347处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：T347D、T347E、T347F、T347I、T347K、T347L、T347M、T347N、T347Q、T347R、T347S和T347V；
f.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置348，任选地其中SEQ ID NO:1的位置348处的所述氨基酸取代是N348K；
g.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置349，任选地其中SEQ ID NO:1的位置349处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：L349I、L349M、L349F和L349V；
h.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置350，任选地其中SEQ ID NO:1的位置350处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：A350F、A350I、A350L、A350M和A350V；
i.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置351，任选地其中SEQ ID NO:1的位置351处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：D351E、D351F、D351I、D351L、D351M、D351N、D351Q和D351V；
j.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置352，任选地其中SEQ ID NO:1的位置352处的所述氨基酸取代是R352K；
k.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置354，任选地其中SEQ ID NO:1的位置354处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：L354I、L354M、L354F和L354V；
l.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置380，任选地其中SEQ ID NO:1的位置380处的所述氨基酸取代是E380Q；
m.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置384，任选地其中SEQ ID NO:1的位置384处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：L384I、L384M、L384F和L384V；
n.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置386，任选地其中SEQ ID NO:1的位置386处的所述氨基酸取代是I386V；
o.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置387，任选地其中SEQ ID NO:1的位置387处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：L387I、L387M、L387F和L387V；
p.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置388，任选地其中SEQ ID NO:1的位置388处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：M388I、M388L和M388F；
q.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置389，任选地其中SEQ ID NO:1的位置389处的所述氨基酸取代是I389M；
r.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置391，任选地其中SEQ ID NO:1的位置391处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：L391I、L391M、L391F和L391V；
s.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置392，任选地其中SEQ ID NO:1的位置392处的所述氨基酸取代是V392M；
t.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置404，任选地其中SEQ ID NO:1的位置404处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：F404I、F404L、F404M和F404V；
u.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置407，任选地其中SEQ ID NO:1的位置407处的所述氨基酸取代是N407D；
v.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置409，任选地其中SEQ ID NO:1的位置409处的所述氨基酸取代是L409V；
w.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置413，任选地其中SEQ ID NO:1的位置413处的所述氨基酸取代是N413D；
x.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置414，任选地其中SEQ ID NO:1的位置414处的所述氨基酸取代是Q414E；
y.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置417，任选地其中SEQ ID NO:1的位置417处的所述氨基酸取代是C417S；
z.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置418，任选地其中SEQ ID NO:1的位置418处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：V418I、V418L、V418M和V418F；
aa.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置420，任选地其中SEQ ID NO:1的位置420处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：G420I、G420M、G420F和G420V；
bb.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置421，任选地其中SEQ ID NO:1的位置421处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：M421I、M421L、M421F和M421V；
cc.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置422，任选地其中SEQ ID NO:1的位置422处的所述氨基酸取代是V422I；
dd.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置424，任选地其中SEQ ID NO:1的位置424处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：I424L、I424M、I424F和I424V；
ee.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置428，任选地其中SEQ ID NO:1的位置428处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：L428I、L428M、L428F和L428V；
ff.其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置463，任选地其中SEQ ID NO:1的位置463处的所述氨基酸取代是S463P；
gg.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置517，任选地其中SEQ ID NO:1的位置517处的所述氨基酸取代是M517A；
hh.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置521，任选地其中SEQ ID NO:1的位置521处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：G521A、G521F、G521I、G521L、G521M和G521V；
ii.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置522，任选地其中SEQ ID NO:1的位置522处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：M522I、M522L和M522V；
jj.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置524，任选地其中SEQ ID NO:1的位置524处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：H524A、H524I、H524L、H524F和H524V；
kk.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置525，任选地其中SEQ ID NO:1的位置525处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：L525F、L525I、L525M、L525N、L525Q、L525S、L525T和L525V；
ll.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置526，任选地其中SEQ ID NO:1的位置526处的所述氨基酸取代是Y526L；
mm.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置527，任选地其中SEQ ID NO:1的位置527处的所述氨基酸取代是S527N；
nn.其中所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置528，任选地其中SEQ ID NO:1的位置528处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：M528F、M528I和M528V；
oo.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置533，任选地其中SEQ ID NO:1的位置533处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：V533F和V533W；
pp.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置534，任选地其中SEQ ID NO:1的位置534处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：V534Q和V534R；
qq.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置536，任选地其中SEQ ID NO:1的位置536处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：L536F和L536M、L536R和L536Y；
rr.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置537，任选地其中SEQ ID NO:1的位置537处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：Y537E和Y537S；
ss.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置538，任选地其中SEQ ID NO:1的位置538处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：D538G和D538K；
tt.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置539，任选地其中SEQ ID NO:1的位置539处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：L539A和L539R；
uu.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置540，任选地其中SEQ ID NO:1的位置540处的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：L540A和L540F；或
vv.所述一个或多个位置包括SEQ ID NO:1的位置547，任选地其中SEQ ID NO:1的位置547处的所述氨基酸取代是H547A。
4.如权利要求1至3中任一项所述的经修饰的ER-LBD，其中：
a.所述一个或多个另外的氨基酸取代是两个氨基酸取代，任选地其中所述两个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：343、345、347、348、351、354、384、387、388、389、391、392、404、418、421、521、524和525，
任选地其中所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置345和348，并且其中SEQ IDNO:1的位置345处的所述氨基酸取代是L345S，并且其中SEQ ID NO:1的位置348处的所述氨基酸取代是N348K，
任选地其中所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置384和389，并且其中SEQ IDNO:1的位置384处的所述氨基酸取代是L384M，并且其中SEQ ID NO:1的位置389处的所述氨基酸取代是I389M，
任选地其中所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置421和392，并且其中SEQ IDNO:1的位置421处的所述氨基酸取代是M421I，并且其中SEQ ID NO:1的位置392处的所述氨基酸取代是V392M，
任选地其中所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354和391，并且其中SEQ IDNO:1的位置354处的所述氨基酸取代是L354I，并且其中SEQ ID NO:1的位置391处的所述氨基酸取代是L391F，
任选地所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354和384，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的所述氨基酸取代是L354I，并且其中SEQ ID NO:1的位置384处的所述氨基酸取代是L384M，
任选地其中所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354和387，并且其中SEQ IDNO:1的位置354处的所述氨基酸取代是L354I，并且其中SEQ ID NO:1的位置387处的所述氨基酸取代是L387M，
任选地其中所述两个氨基酸取代处于位置387和391，并且其中SEQ ID NO:1的位置387处的所述氨基酸取代是L387M，并且其中SEQ ID NO:1的位置391处的所述氨基酸取代是L391F，
任选地其中所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置384和387，并且其中SEQ IDNO:1的位置384处的所述氨基酸取代是L384M，并且其中SEQ ID NO:1的位置387处的所述氨基酸取代是L387M，
任选地其中所述两个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置384和391，并且其中SEQ IDNO:1的位置384处的所述氨基酸取代是L384M，并且其中SEQ ID NO:1的位置391处的所述氨基酸取代是L391F；和/或
b.所述一个或多个另外的氨基酸取代是三个氨基酸取代，任选地其中所述三个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：343、347、351、354、388、391、404、414、418、463、521、524和525，
任选地其中所述三个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、384和391，并且其中SEQID NO:1的位置354处的所述氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置384处的所述氨基酸取代是L384M，并且其中SEQ ID NO:1的位置391处的所述氨基酸取代是L391F，
任选地其中所述三个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置414、463和524，并且其中SEQID NO:1的位置414处的所述氨基酸取代是Q414E，SEQ ID NO:1的位置463处的所述氨基酸取代是S463P，并且其中SEQ ID NO:1的位置524处的所述氨基酸取代是H524L；和/或
c.所述一个或多个另外的氨基酸取代是四个氨基酸取代，任选地其中所述四个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：343、347、351、354、384、388、391、404、413、418、463、521、524和525，
任选地其中所述四个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、384、391和418，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的所述氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置384处的所述氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置391处的所述氨基酸取代是L391F，并且其中SEQID NO:1的位置418处的所述氨基酸取代是V418I，
任选地其中所述四个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置343、388、521和404，并且其中SEQ ID NO:1的位置343处的所述氨基酸取代是M343I，SEQ ID NO:1的位置388处的所述氨基酸取代是M388I，SEQ ID NO:1的位置521处的所述氨基酸取代是G521I，并且其中SEQID NO:1的位置404处的所述氨基酸取代是F404L，
任选地其中所述四个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置524、347、351和525，并且其中SEQ ID NO:1的位置524处的所述氨基酸取代是H524V，SEQ ID NO:1的位置347处的所述氨基酸取代是T347R，SEQ ID NO:1的位置351处的所述氨基酸取代是D351Q，并且其中SEQID NO:1的位置525处的所述氨基酸取代是L525N，
任选地其中所述四个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、384、391和463，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的所述氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置384处的所述氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置391处的所述氨基酸取代是L391V，并且其中SEQID NO:1的位置463处的所述氨基酸取代是S463P，
任选地其中所述四个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置384、391、413和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置384处的所述氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置391处的所述氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置413处的所述氨基酸取代是N413D，并且其中SEQID NO:1的位置524处的所述氨基酸取代是H524F；和/或
d.所述一个或多个另外的氨基酸取代是五个氨基酸取代，任选地其中所述五个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：354、384、391、409、413、414、421、463和524，
任选地其中所述五个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置384、409、413、463和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置384处的所述氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置409处的所述氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置413处的所述氨基酸取代是N413D，SEQ IDNO:1的位置463处的所述氨基酸取代是S463P，并且其中SEQ ID NO:1的位置524处的所述氨基酸取代是H524L，
任选地其中所述五个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置391、413、414、463和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置391处的所述氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置413处的所述氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置414处的所述氨基酸取代是Q414E，SEQ IDNO:1的位置463处的所述氨基酸取代是S463P，并且其中SEQ ID NO:1的位置524处的所述氨基酸取代是H524F，
任选地其中所述五个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置391、414、421、463和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置391处的所述氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置414处的所述氨基酸取代是Q414E，SEQ ID NO:1的位置421处的所述氨基酸取代是M421L，SEQ IDNO:1的位置463处的所述氨基酸取代是S463P，并且其中SEQ ID NO:1的位置524处的所述氨基酸取代是H524F，
任选地其中所述五个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、409、413、421和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的所述氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置409处的所述氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置413处的所述氨基酸取代是N413D，SEQ IDNO:1的位置421处的所述氨基酸取代是M421L，并且其中SEQ ID NO:1的位置524处的所述氨基酸取代是H524L，
任选地其中所述五个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、409、421、463和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的所述氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置409处的所述氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置421处的所述氨基酸取代是M421L，SEQ IDNO:1的位置463处的所述氨基酸取代是S463P，并且其中SEQ ID NO:1的位置524处的所述氨基酸取代是H524L；和/或
e.所述一个或多个另外的氨基酸取代是六个氨基酸取代，任选地其中所述六个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：354、384、391、409、413、414、421、463和524，
任选地其中所述六个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置384、391、413、421、463和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置384处的所述氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置391处的所述氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置413处的所述氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置421处的所述氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置463处的所述氨基酸取代是S463P，并且其中SEQ ID NO:1的位置524处的所述氨基酸取代是H524L，
任选地其中所述六个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置409、413、414、421、463和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置409处的所述氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置413处的所述氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置414处的所述氨基酸取代是Q414E，SEQ ID NO:1的位置421处的所述氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置463处的所述氨基酸取代是S463P，并且其中SEQ ID NO:1的位置524处的所述氨基酸取代是H524L，
任选地其中所述六个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、391、409、413、414和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的所述氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置391处的所述氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置409处的所述氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置413处的所述氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置414处的所述氨基酸取代是Q414E，并且其中SEQ ID NO:1的位置524处的所述氨基酸取代是H524L；和/或
f.所述一个或多个另外的氨基酸取代是七个氨基酸取代，任选地其中所述七个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的选自由以下组成的组的位置：354、384、391、409、413、414、421、463、517和524，
任选地其中所述七个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、384、409、413、421、463和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的所述氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置384处的所述氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置409处的所述氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置413处的所述氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置421处的所述氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置463处的所述氨基酸取代是S463P，并且其中SEQ IDNO:1的位置524处的所述氨基酸取代是H524F，
任选地其中所述七个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、391、413、421、463、517和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的所述氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置391处的所述氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置413处的所述氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置421处的所述氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置463处的所述氨基酸取代是S463P，SEQ ID NO:1的位置517处的所述氨基酸取代是M517A，并且其中SEQ IDNO:1的位置524处的所述氨基酸取代是H524L，
任选地其中所述七个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置354、391、413、414、421、517和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置354处的所述氨基酸取代是L354I，SEQ ID NO:1的位置391处的所述氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置413处的所述氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置414处的所述氨基酸取代是Q414E，SEQ ID NO:1的位置421处的所述氨基酸取代是M421L，SEQ ID NO:1的位置517处的所述氨基酸取代是M517A，并且其中SEQ IDNO:1的位置524处的所述氨基酸取代是H524F；和/或
g.所述一个或多个另外的氨基酸取代是八个氨基酸取代，任选地其中所述八个氨基酸取代处于SEQ ID NO:1的位置384、391、409、413、421、463、517和524，并且其中SEQ ID NO:1的位置384处的所述氨基酸取代是L384M，SEQ ID NO:1的位置391处的所述氨基酸取代是L391V，SEQ ID NO:1的位置409处的所述氨基酸取代是L409V，SEQ ID NO:1的位置413处的所述氨基酸取代是N413D，SEQ ID NO:1的位置421处的所述氨基酸取代是M421L，SEQ IDNO:1的位置463处的所述氨基酸取代是S463P，SEQ ID NO:1的位置517处的所述氨基酸取代是M517A，并且其中SEQ ID NO:1的位置524处的所述氨基酸取代是H524F。
5.一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含融合至如权利要求1至4中任一项所述的经修饰的ER-LBD的所关注的多肽，
任选地，其中所述所关注的多肽包含核酸结合结构域，任选地其中所述核酸结合结构域包括锌指结构域，任选地其中所述核酸结合结构域包括锌指结构域，任选地其中所述锌指结构域包含序列MSRPGERPFQCRICMRNFSNMSNLTRHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSDRSVLRRHLRTHTGSQKPFQCRICMRNFSDPSNLARHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSDRSSLRRHLRTHTGSQKPFQCRICMRNFSQSGTLHRHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSQRPNLTRHLRTHLRGS(SEQ ID NO:62)，
任选地其中所述嵌合蛋白包含嵌合转录因子，并且其中所述所关注的多肽包含核酸结合结构域和转录调控子结构域，任选地其中所述转录模块结构域是转录激活因子，任选地其中所述转录激活因子选自由以下组成的组：单纯疱疹病毒蛋白16(VP16)激活结构域；包含VP16的四个串联拷贝的激活结构域；VP64激活结构域；NFκB的p65激活结构域(p65)；爱泼斯坦-巴尔病毒R反式激活因子(Rta)激活结构域；包含VP64、p65和Rta激活结构域(VPR激活结构域)的三元激活因子；包含VP64、p65和HSF1激活结构域(VPH激活结构域)的三元激活因子；和人E1A相关蛋白p300的组蛋白乙酰转移酶核心结构域(p300 HAT核心激活结构域)，或者
任选地其中所述转录模块结构域是p65转录激活因子，所述p65转录激活因子包含氨基酸序列DEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS(SEQ ID NO:64)。
6.一种分离的多核苷酸分子，所述分离的多核苷酸分子包含编码如权利要求1至4中任一项所述的经修饰的ER-LBD或编码如权利要求5所述的嵌合蛋白的核苷酸序列。
7.一种异源性构建体，所述异源性构建体包含可操作地连接至如权利要求6所述的多核苷酸分子的启动子。
8.一种质粒，所述质粒包含如权利要求7所述的异源性构建体。
9.一种细胞，所述细胞包含如权利要求7所述的异源性构建体或如权利要求8所述的质粒。
10.一种用于调控所关注的基因的转录的基因开关，所述基因开关包含：
(a)如权利要求5所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白结合至嵌合转录因子响应性(CTF响应性)启动子，所述启动子可操作地连接至所述所关注的基因；和
(b)非内源性配体，其中所述非内源性配体与所述经修饰的ER-LBD的结合诱导所述嵌合蛋白调控所述所关注的基因的转录。
11.如权利要求10所述的基因开关，其中：
a.所述非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物和因多昔芬；和/或
b.所述所关注的基因编码选自由以下组成的组的多肽：细胞因子、趋化因子、归巢分子、生长因子、细胞死亡调控因子、共活化分子、肿瘤微环境调节物a、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶；和/或
c.所述所关注的基因编码选自由以下组成的组的细胞因子：IL1-β、IL-2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL12p70融合蛋白、IL15、IL17A、IL18、IL21、IL22、I型干扰素、干扰素-γ和TNF-α；和/或
d.所述所关注的基因编码IL12p70融合蛋白，所述IL12p70融合蛋白包含氨基酸序列MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGSGGGSGGGSGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS(SEQ ID NO:58)。
12.一种调控所关注的基因的转录的方法，所述方法包括：用(i)编码如权利要求5所述的嵌合蛋白的异源性构建体和(ii)包含嵌合转录因子响应性(CTF响应性)启动子的靶标表达盒来转化细胞，所述启动子可操作地连接至所述所关注的基因，以及通过使经转化的细胞与非内源性配体接触来诱导所述嵌合蛋白调控所述所关注的基因的转录，
任选地其中所述方法还包括在诱导所述嵌合蛋白调控转录之前在适合于所述嵌合蛋白的表达的条件下培养所述经转化的细胞，
任选地其中调控转录包括活化所述所关注的基因的转录，
任选地其中所述靶标表达盒由编码如权利要求5所述的嵌合蛋白的所述异源性构建体编码，或者所述靶标表达盒由第二异源性构建体编码，并且
任选地其中所述非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物和因多昔芬。
13.一种调控嵌合蛋白的定位的方法，所述方法包括用编码如权利要求5所述的嵌合蛋白的异源性构建体来转化细胞，以及通过使经转化的细胞与非内源性配体接触来诱导所述嵌合蛋白的核定位，
任选地其中所述方法还包括在诱导所述核定位之前在适于所述嵌合蛋白的表达的条件下培养所述经转化的细胞，并且
任选地其中所述非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物和因多昔芬。
14.如权利要求12或权利要求13所述的方法，其中所述经转化的细胞在人或动物中，并且其中使所述经转化的细胞与所述非内源性配体接触包括将药理学剂量的所述配体施用于所述人或动物。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述非内源性配体以所述非内源性配体对SEQ IDNO:1的野生型雌激素受体α基本上无活性的浓度施用。
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