CN117320689A - 用于皮肤和粘膜的新型皮肤可渗透肽、包括其的组合物及它们的用途 - Google Patents

用于皮肤和粘膜的新型皮肤可渗透肽、包括其的组合物及它们的用途 Download PDF

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Abstract

本公开的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段通过组装或融合方法有效地将皮肤生物活性分子递送至皮肤组织深处，从而提供生物活性物质的杰出的皮肤渗透性以及极好的皮肤残留效果，来使生物活性功效最大化。因此，皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段可被广泛地用作靶向包括粘膜的皮肤组织的外用的药物组合物和功能性化妆品组合物的活性成分。

Description

用于皮肤和粘膜的新型皮肤可渗透肽、包括其的组合物及它 们的用途
技术领域
本公开涉及用于生物活性物质的经皮递送的组合物，所述组合物包括皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段；皮肤可渗透组合物；用于经皮递送的载体；皮肤可渗透载体；药物组合物；准药物组合物；化妆品组合物；包括用于经皮递送的组合物的试剂盒；制备用于经皮递送的组合物、化妆品组合物和准药物组合物的方法；生物活性物质的经皮递送方法；以及用于生物活性物质的经皮递送的用途。
背景技术
皮肤占据人体最大的部分，由表皮、真皮和皮下组织组成，并在外部环境中发挥各种功能。特别地，由于构成皮肤屏障的角质层的独特特性，已知皮肤穿透物质的分子量为约500Da或更小。然而，已知低分子量物质也具有低的皮肤渗透效率，并且高分子量物质(如生长因子)具有甚至更低的渗透效率。因此，在化妆品和制药行业，非常需要安全的方法来有效地递送生物活性物质。
物理递送系统(如微针)可能对皮肤造成不可逆的损伤。在现有的皮肤可渗透物质中，经常使用亲脂性物质或聚合物(第10-2274435号韩国专利)，并且它可能在人体内引起各种副作用和未知毒性。因此，有必要使用是人体中存在的蛋白质的片段的肽将生物活性物质安全地递送到真皮。
公开
技术问题
本申请的发明人通过开发皮肤可渗透肽来完成本发明。本公开中所开发的生物膜穿透肽技术是一种最先进的生物技术，它大大提高了原始物质在体内的吸收率并增加了生物利用度，并且是一种下一代新型生物物质平台技术，即使在功能性化妆品或高级药物的原始物质中注入痕量，也能充分体现其功效。因此，该技术旨在应用于皮肤可渗透化妆品和药物的开发等。
技术方案
本公开的目标是提供用于生物活性物质的经皮递送的组合物，所述组合物包括由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段。
本公开的另一目标是提供用于生物活性物质的皮肤渗透的组合物，所述组合物包括皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段。
本公开的另一目标是提供用于生物活性物质的经皮递送的载体，所述载体包括皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段。
本公开的另一目标是提供用于生物活性物质的皮肤可渗透载体，所述载体包括皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段。
本公开的另一目标是提供包括用于经皮递送的组合物的化妆品组合物。
本公开的另一目标是提供包括用于经皮递送的组合物的准药物组合物。
本公开的另一目标是提供用于外用于皮肤或粘膜上的药物组合物，所述药物组合物包括用于经皮递送的组合物。
本公开的另一目标是提供包括用于经皮递送的组合物和生物活性物质的试剂盒。
本公开的另一目标是提供制备用于经皮递送的组合物的方法。
本公开的另一目标是提供使用用于经皮递送的组合物改善皮肤的方法。
本公开的另一目标是提供使用药物组合物预防或治疗皮肤或粘膜疾病的方法。
本公开的另一目标是提供制备化妆品组合物和准药物组合物的方法。
本公开的另一目标是提供使用由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的肽、其衍生物或其片段的生物活性物质的经皮递送方法。
本公开的另一目标是提供由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的肽、其衍生物或其片段用于生物活性物质的经皮递送的用途。
本公开的另一目标是提供由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的肽、其衍生物或其片段用于生物活性物质的皮肤渗透的用途。
有益效果
本公开的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段通过组装或融合方法有效地将皮肤生物活性分子递送至皮肤组织深处，从而提供生物活性物质的杰出的皮肤渗透性以及极好的皮肤残留效果，来使生物活性功效最大化。因此，皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段可被广泛地用作靶向包括粘膜的皮肤组织的外用的药物组合物和功能性化妆品组合物的活性成分。
附图简述
图1显示了用以分析与已知的肽相比，SEQ ID NO:1-8的肽对生物活性物质的皮肤渗透效果的Franz扩散池测定结果的HPLC定量；
图2显示了用以分析本公开的皮肤可渗透肽对生物活性物质的皮肤渗透效果的Franz扩散池测定随时间变化结果的HPLC定量；
图3显示了用以分析本公开的皮肤可渗透肽对具有不同分子量的生物活性物质的皮肤渗透效果的Franz扩散池测定结果的荧光微孔板读取仪定量；
图4显示了用以分析本公开的皮肤可渗透肽对脂质体的皮肤渗透效果的Franz扩散池测定结果的荧光微孔板读取仪定量；并且
图5显示了评估根据本公开的皮肤可渗透肽对生物活性物质的皮肤渗透效果的功效改善的结果。
发明详述
下文中，将按如下所示详细描述本公开。同时，本公开中所公开的每项描述和实施方案也可以应用于其他描述和实施方案。此外，本公开中所公开的各种元素的所有组合均落入本公开的范围内。此外，本公开的范围不受以下描述的具体描述的限制。
本公开的一方面提供了用于生物活性物质的经皮递送的组合物，所述组合物包括由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段。
如本文所用的，术语“皮肤渗透”意指生物膜渗透，并且“皮肤可渗透肽”意指具有生物膜渗透性的肽。皮肤可渗透肽可以具有细胞渗透性和生物膜渗透性，具体地，皮肤和/或粘膜渗透性，但不限于此。
本公开的皮肤可渗透肽可以包括由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段。
本公开可以有效地将生物活性分子引入细胞和皮肤中，由于分子量的大小或皮肤角质层的独特特性，这些生物活性分子难以通过皮肤递送。
与现有的皮肤可渗透肽相比，本公开的皮肤可渗透肽可以通过具有改善的细胞和皮肤渗透性的用于经皮递送的组合物、经皮递送系统以及皮肤可渗透肽组装(assembling)或融合方法将生物活性物质递送至皮肤细胞或皮肤的真皮层中，所述组合物包括皮肤生物活性分子。
本公开的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段通过组装和融合方法有效地将皮肤生物活性分子递送至皮肤组织深处，以展现杰出的皮肤渗透性以及极好的皮肤残留效果，从而使生理活性最大化。因此，本公开可用作靶向包括粘膜的皮肤组织的组合物的组分。
在本公开的示例性实施方案中，SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8及其衍生物被确认具有显著的皮肤渗透性(实施例1-6)。
如本文所用的，术语“衍生物”意指由SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽的衍生物，具体地，它可以是具有通过在SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:8的氨基酸序列中加入一些功能性基团或通过缺失、修饰、取代或加入一些氨基酸序列制备的氨基酸序列的肽，但不限于此。
具体地，在本公开中，衍生物可以是选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中的任一种或多种，但不限于此。
具体地，本公开的由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽及其衍生物可以具有如以下化学式1中所示的序列，同时具有皮肤渗透性，但不限于此。
[化学式1]
[X1–X2–Lys–Phe–X3–X4–Ile–Leu–X5–Tyr–Leu–X6]
在化学式1中，X1至X6可以选自碱性氨基酸，并且可以选自精氨酸、赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。优选地，本公开的由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽及其衍生物可以具有化学式1的序列，并且本公开的衍生物可以由SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成，但不限于此。
SEQ ID NO:1：H2N–[Lys–Lys–Leu–Phe–Lys–Lys–Ile–Leu–Lys–Tyr–Leu–Lys]–CO2H，
SEQ ID NO:2：H2N–[Arg–Arg–Leu–Phe–Arg–Arg–Ile–Leu–Arg–Tyr–Leu–Arg]–CO2H，
SEQ ID NO:3：H2N–[Arg–Phe–Leu–Phe–Arg–Leu–Ile–Leu–Arg–Tyr–Leu–Arg]–CO2H，
SEQ ID NO:4：H2N–[Arg–Arg–Leu–Phe–Arg–Leu–Ile–Leu–Arg–Tyr–Leu–Phe]–CO2H，
SEQ ID NO:5：H2N–[Arg–Lys–Leu–Phe–Lys–Arg–Ile–Leu–Arg–Tyr–Leu–Lys]–CO2H，
SEQ ID NO:6：H2N–[Lys–Arg–Leu–Phe–Arg–Lys–Ile–Leu–Lys–Tyr–Leu–Arg]–CO2H，
SEQ ID NO:7：H2N–[Lys–Arg–Leu–Phe–Lys–Arg–Ile–Leu–Arg–Tyr–Leu–Lys]–CO2H，以及
SEQ ID NO:8：H2N–[Arg–Lys–Leu–Phe–Arg–Lys–Ile–Leu–Lys–Tyr–Leu–Arg]–CO2H。
具体地，衍生物可以是其中与选自由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽的N-末端起的第1、2、5、6、9和12位中的任一位置对应的氨基酸被另一碱性氨基酸取代的衍生物。
氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性性质(amphipathic nature)而发生。具体地，在具有带电荷侧链的氨基酸(electricallycharged amino acid)中，带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸(Arginine；R)、赖氨酸(Lysine；K)和组氨酸(Histidine；H)，带负电荷的(酸性)氨基酸包括谷氨酸(Glutamate；E)和天冬氨酸(Aspartate；D)；在具有不带电荷侧链的氨基酸(uncharged amino acid)中，非极性氨基酸(nonpolar amino acid)包括甘氨酸(Glycine；G)、丙氨酸(Alanine；A)、缬氨酸(Valine；V)、亮氨酸(Leucine；L)、异亮氨酸(Isoleucine；I)、甲硫氨酸(Methionine；M)、苯丙氨酸(Phenylalanine；F)、色氨酸(Tryptophan；W)和脯氨酸(Proline；P)，并且极性(polar)或亲水性(hydrophilic)氨基酸包括丝氨酸(Serine；S)、苏氨酸(Threonine；T)、半胱氨酸(Cysteine；C)、酪氨酸(Tyrosine；Y)、天冬酰胺(Asparagine；N)和谷氨酰胺(Glutamine；Q)，并且在非极性氨基酸中，芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
在本公开中，“被另一碱性氨基酸取代”不受限制，只要其被不同于取代之前的氨基酸的碱性氨基酸取代。换言之，取代之前的选自由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽的N-末端起的第1、2、5、6、9和12位中的任一位置处的氨基酸可被另一碱性氨基酸取代，具体地，选自第X1、X2、X3、X4、X5和X6位中的任一位置处的氨基酸可被另一碱性氨基酸取代。具体地，碱性氨基酸可以选自组氨酸、赖氨酸和精氨酸，并且可以是赖氨酸或精氨酸，但不限于此。
关于本公开的目标，由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽的衍生物可以是选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中的任一种或多种，但不限于此。
如本文所用的，“片段”是指具有特定序列的肽的部分序列。本公开的片段可以是由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽或其衍生物的部分序列，其中所述部分序列也可以具有与皮肤可渗透肽或其衍生物相似的皮肤渗透性。
由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段可以衍生自天然产物，但不限于此，并且可以包括任何序列，只要其具有与皮肤可渗透的肽、其衍生物或其片段相同的活性即可。
尽管本公开的皮肤可渗透肽被描述为由SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段，但是并不排除由SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段的氨基酸序列上游或下游的无义序列添加，或者允许保留与皮肤可渗透肽相同功能的沉默突变。对本领域技术人员显而易见的是，只要肽具有与由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段相同或对应的活性，它就属于本公开的皮肤可渗透肽。对于具体的实例，本公开的皮肤可渗透肽可以是由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段，或者具有拥有80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多同源性或同一性的氨基酸序列的肽。
即使在本公开中描述了“包括以特定序列编号列出的氨基酸序列的肽”、“由以特定序列编号列出的氨基酸序列组成的肽”或“具有以特定序列编号列出的氨基酸序列的肽”，只要肽具有与由相应序列编号的氨基酸序列组成的肽相同或等效的活性，则很明显，在本公开中也可以使用具有部分缺失、修饰、取代、保守取代或添加的氨基酸序列的肽，例如，在氨基酸序列的N-末端和/或C-末端处添加不改变肽功能的序列、天然存在的突变、其沉默突变(silent mutation)或保守取代。
“保守性取代(conservative substitution)”意指一种氨基酸被另一种具有相似结构和/或化学性质的氨基酸取代。此类氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性性质(amphipathic nature)的相似性而发生。通常，保守性取代对肽的活性具有很少的影响或没有影响。
本公开的肽可以通过在与固相规则结合的氨基酸主链上连续形成一个或多个氨基酸或适当保护的氨基酸的酰胺键来制备，但不限于此。在不显著破坏稳定性的范围内，在肽中插入、取代或缺失另一氨基酸也是可能的，并且这也落入本公开的范围内。
另外，可以以将促进细胞内迁移的已知细胞可渗透肽另外偶联至C-末端或N-末端的形式来制备本公开的皮肤可渗透肽。例如，已知的细胞可渗透肽(cell permeablepeptide)可以是TAT肽(Arg–Lys–Lys–Arg–Arg–Tyr–Arg–Arg–Arg)和Tat-PTD肽(Gly–Arg–Lys–Lys–Arg–Arg–Gln–Arg–Arg–Arg:Tat PTD)，但本公开不限于此，并且可以使用本领域已知的任何细胞可渗透肽，只要该可渗透肽不抑制本公开的活性即可。
本公开的肽和化合物可以以金属复合化合物的形式制备，其中金属可以选自：铜、镁、钙、铁、锌、镍、银、锗和镓，但不限于此。优选地，可以使用铜，但不限于此。
同时，本公开的肽可以以盐的形式存在。可用于本公开的盐的形式可以在化合物的最终分离和纯化期间制备，或者通过使氨基与合适的酸反应来制备。例如，酸加成盐可以包括：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘化物、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、均三甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一酸盐，但不限于此。另外，可用于形成酸加成盐的酸的实例可包括无机酸(如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸)以及有机酸(如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸)，但不限于此。优选地，本公开的肽可以以三氟乙酸盐或乙酸盐的形式制备。
用于制备包括在本公开的组合物中的肽的氨基酸的氨基或羧基可以由合适的保护基保护。受保护的氨基酸可以附接到固体载体上，或者通过在适合形成酰胺键合的条件下加入下一个氨基酸来在溶液中反应。可选地，在加入用合适的保护基保护的氨基酸之前，可以完全除去保护基团。在所有氨基酸都根据需要连接后，可以通过顺序或同时从游离的残余保护基团和游离的固体支持物中分离来得到最终的靶肽。
作为制备本公开的肽化合物的最优选的合成方法，可以利用使用固相聚合物载体的固相肽合成方法，并且通过上述方法制备的肽的α-氨基可以被酸性或碱性敏感性官能团保护。此时，氨基酸的保护基团必须在肽缩合反应条件下具有稳定的性质，并且必须具有在不破坏生长的肽链或不使其中包含的任何手性中心外消旋的情况下易于去除的性质。因此，合适的保护基团可以包括9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、苄氧基羰基(Cbz)、联苯异丙氧基羰基、叔戊氧基羰基、异冰片氧基羰基、(α,α)-二甲基-3,5-二甲氧基苄氧基羰基、O-硝基苯基亚磺酰基、2-氰基-叔丁氧羰基等。在本公开的范围内也可以使用本领域中已知的用于该目的的其他合适的保护基团。
9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护基可以用作本公开的肽合成中使用的氨基酸的最优选的保护基团。
特别地，作为在本公开的肽合成中使用的氨基酸残基的保护基团，用于N-甲基谷氨酸的叔丁基(t-Bu)；用于赖氨酸的叔丁氧羰基(Boc)；用于丝氨酸的7t丁基(t-Bu)；用于苏氨酸和别苏氨酸的叔丁基(t-Bu)；以及用于半胱氨酸的三苯甲基(Trt)是优选的，但本公开不限于此。
在固相肽合成方法中，C-末端氨基酸可以附接至合适的固体支撑物或树脂上。用于上述合成的合适的固体支撑物是那些对逐步缩合-去保护反应的试剂和反应条件是惰性的，以及不溶于所用介质中的物质，例如2-氯三苯甲基氯树脂(2-chlorotrityl chlorideresin)、rink amid或rink amid 4-甲基苄基氢胺(4-methylbenzylhydrylamine)树脂(rink amid MBHA树脂)。
特别地，C-末端肽的优选固体支撑物可以是可从Novabichem公司获得的2-氯三苯甲基氯化物、rink amid或rink amid 4-甲基苄基氢胺树脂(rink amid MBHA树脂)。
可以在10℃至50℃的温度条件下，优选地，在30℃的温度条件下，在诸如二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或DMF的溶剂中，在存在或不存在4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、N-甲基吗啉(NMM)、苯并三唑-1-基氧-三(二甲基氨基)鏻-六氟磷酸盐(BOP)或双(2-氧-3-恶唑烷基)氯化膦(BOPCl)的情况下，通过N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)、[O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐](HATU)或O-苯并三唑-1-基-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)活化羧酸约1小时至约24小时，通过缩合反应来将C-末端酰胺(amide)与树脂或固相支撑物缩合(结合、偶联)。
当固体支撑物是rink amid 4-甲基苄基氢胺树脂时，在与C-末端氨基酸偶联之前，用仲胺，优选地，过量的20％哌啶DMF溶液切割作为优选保护基团的Fmoc官能团。用于将靶氨基酸偶联至去保护的4-(2′,4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基乙酰胺基乙基树脂的优选试剂是于用于适当保护的氨基酸的DMF溶剂中的偶联试剂，诸如N-甲基吗啉(NMM)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、[O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐](HATU)、O-苯并三唑-1-基-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)或N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)。
本公开中所进行的连续氨基酸的偶联可以使用相关领域中广泛已知的自动多肽合成仪进行，或者可以直接手动进行。作为合成反应的优选条件，通过利用仲胺溶液(优选哌啶)处理，然后用足够过量的溶剂洗涤，然后以约3至7倍摩尔过量引入每个待偶联的保护氨基酸，并且该反应可以优选地在DMF溶剂中进行，来对用Fmoc基团保护的α-氨基酸进行去保护。
在使用本公开的固相树脂合成肽的最后一步中，可以通过连续或一次进行操纵来从树脂中去除待获得的肽，并且可以对保护氨基酸残基的保护基团进行去保护。作为从树脂中去除肽并对残基中存在的保护基进行去保护的条件，通常可以使用切割树脂肽键的切割试剂混合物，例如，含有三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)、茴香硫醚、水或乙二硫醇(EDT)等的二氯甲烷混合的混合物溶液。由此获得的混合溶液可以通过用过量的冷藏二乙醚溶剂处理而形成沉淀物。通过离心使由此获得的沉淀物完全沉淀，并且主要去除过量的三氟乙酸、三异丙基硅烷、茴香硫醚、水和乙二硫醇，并且重复上述程序两次或更多次以获得固化的沉淀物。此时，可以使用由水和乙腈溶剂组成的混合溶剂和反相高效液相色谱法(HPLC)来分离和纯化完全去保护的肽盐。可以通过使用冷冻干燥将分离和纯化的肽溶液完全浓缩和干燥而获得固体肽。
本公开提供了用于生物活性物质的经皮递送的组合物。
如本文所用的，“生物活性物质”是一个概念，其共同指在体内具有生理作用的物质。生物活性物质可以是亲水性、疏水性或难溶性的，并且包括但不限于任何一种，只要其可以具有生理作用，诸如天然产物、化合物(chemical compound)、蛋白质、肽、氨基酸、核酸、脂质、脂质体、聚合物等。另外，本公开的生物活性物质可单独使用，并且可包括但不限于与其他生物活性物质的组合、与载体的组合以及与已知皮肤可渗透肽的组合。
在一实施方案中，本公开的生物活性物质可以是用于皮肤、皮肤经皮和/或粘膜的药物、准药物和/或化妆品的主要组分。
本公开的生物活性物质可以具有一种或多种生理作用，并且可以具有诸如皮肤改善、健康促进、疾病预防、改善等的生理作用，但是可以包括但不限于任一种，只要其可以与本公开的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段一起使用即可。
在一实施方案中，生物活性物质可以是选自利多卡因、咖啡因、胶原蛋白、透明质酸和脂质体中的任一种或多种，但不限于此。
由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段可以直接或间接与生物活性物质连接，但不限于此。
在一实施方案中，由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段和生物活性物质彼此直接连接或经由连接子连接，或者可以另外包括其他蛋白质部分(moiety)，但不限于此。作为本公开的连接方法，可以不受限制地使用本领域中进行的任何方法，只要该方法不改变由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段和待连接的生物活性物质的结构或活性即可。连接子可以是由1个氨基酸至20个氨基酸组成的肽连接子，或者非肽连接子，但不限于此。
在一实施方案中，本公开的由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段可以经由非共价键(例如，离子键、氢键、范德瓦尔斯力键等)与生物活性物质连接，但不限于此。
在一实施方案中，本公开的由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段可以与生物活性物质连接(例如，经由共价键)，但不限于此。皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段和生物活性物质可以彼此直接连接，或者可以经由连接子连接，或者可以包括其他蛋白质部分(moiety)，但不限于此。
在一实施方案中，皮肤可渗透肽可以利用生物活性物质进行自组装(self-assembling)或自融合(self-fusion)。
在一实施方案中，皮肤可渗透肽的一个或多个分子可以围绕生物活性物质或与生物活性物质融合，但不限于此。
如本文所用的，“经皮递送”意指通过生物膜递送生物活性物质。本公开的用于经皮递送的组合物可用于将生物活性物质递送至细胞和生物膜，具体地，用于通过皮肤和/或粘膜递送，但不限于此。
本公开的用于经皮递送的组合物可以增加生物活性物质对选自皮肤和粘膜中的任一种或多种的渗透性，但不限于此。
本公开的用于经皮递送的组合物可以根据需要，通过进一步包括载体、赋形剂、稀释剂、抗氧化剂和/或缓冲剂等来使用，但不限于此。
在一实施方案中，载体可以是脂质体(lyposome)，但不限于此。
如本文所用的，“脂质体”是指由磷脂双层在水溶液中形成的中空结构。脂质体可以包括中空结构内的生物活性物质，但不限于此。
在一实施方案中，脂质体可以通过本公开的由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段，增加生物活性物质的皮肤渗透性和/或经皮递送，但不限于此。
在本公开的一实施方案中，本公开证实了可以增加3kDa、30kDa和300kDa的利多卡因、咖啡因、胶原蛋白以及800kDa的透明质酸(HA)的生物活性物质的皮肤渗透性和经皮递送，而与它们的性质、大小和类型无关。此外，在本公开的一实施方案中，还证实了本公开的皮肤可渗透肽增加了脂质体的皮肤渗透性和经皮递送活性(实施例1-6)。这表明本公开的皮肤可渗透肽增加了含有生物活性物质的脂质体的皮肤渗透性和经皮递送活性。
本公开的另一方面提供了用于生物活性物质的皮肤渗透的组合物，所述组合物包括由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段。
SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列、皮肤可渗透肽、衍生物或片段、生物活性物质和皮肤渗透如上文所述。
在一实施方案中，本公开的用于皮肤渗透的组合物可以增加生物活性物质对选自皮肤和粘膜中的任一种或多种的渗透性，但不限于此。
可以根据需要，通过进一步包括载体、赋形剂、稀释剂、抗氧化剂和/或缓冲剂等来使用本公开的用于皮肤渗透的组合物，但不限于此。
本公开的另一方面提供了用于生物活性物质的经皮递送的载体，所述载体包括由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段。
本公开的另一方面提供了用于生物活性物质的皮肤可渗透载体，所述载体包括由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段。
SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列、皮肤可渗透肽、衍生物、片段、生物活性物质、经皮递送和皮肤渗透如上文所述。
如本文所用的，以组合物为例，“载体”意指那些能够支撑任何物质或组分的载体，并且可以与支撑物、浸渍剂或介质等互换使用。另外，作为载体实例的组合物可以通过诸如手、抽吸、倾倒或刷等应用方式应用和递送至皮肤。
用于经皮递送的组合物、用于皮肤渗透的组合物、用于经皮递送的载体和皮肤可渗透载体可包括在药物组合物、准药物组合物或化妆品组合物等中，但不限于此。
关于本公开的目标，用于生物活性物质的经皮递送的载体和皮肤可渗透载体可以包括由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段。
在一实施方案中，本公开的用于经皮递送的组合物、用于皮肤渗透的组合物、用于经皮递送的载体和皮肤可渗透载体可以是外用的皮肤制剂。
如本文所用的，“外用的皮肤制剂”意指应用于皮肤或粘膜的制剂。在本公开中，外用的制剂不限于形状等，只要其应用于皮肤或粘膜即可，并且外用的制剂可以进一步分类为软膏、乳膏、乳液、凝胶等，但不限于此。
具体地，软膏可以是外用的半固体制剂，其中应用于皮肤或粘膜的主要成分溶解或分散在基质中。基质根据其成分可分为亲脂性软膏和水溶性软膏。使用亲脂性基质的软膏可以软化皮肤或粘膜，具有极好的密封性，并且适合应用于伤口，但具有不容易去除的缺点。软膏可以是对局部渗透成分有利的制剂，这些成分由于其类似于皮肤或粘膜的亲脂性性质和皮肤软化作用而难以渗经皮肤。
由于软膏主要由油性相(如油)组成，因此它们具有极好的保湿性质，并且有利于亲脂性组分的渗透，但具有粘性的缺点。乳膏可以是在油包水型中乳化的半固体外用剂，并且可以是通过混合油相和水相来提高粘性的制剂。作为乳化过程，表面活性剂或特殊过程可用于混合油相和水相。另外，乳膏可以是比软膏更容易应用和去除的制剂，并且乳液是具有比乳膏更类似于水的性质的制剂，并且是外用制剂，其中主要成分溶解、乳化或细分散在水性液体制剂中。使用主要成分、添加剂和纯化水等，并且其均被均质化以制备溶液、悬浮液或乳液。凝胶可以是由液体渗透的具有高分子量的有机分子组成的外用半固体制剂。凝胶可以是胶凝剂在水中的分散，并且可以使用胶凝剂(如卡波姆)或合成聚合物。取决于活性成分、使用目的和使用方法等，可以使用各种类型的外用制剂，并且根据本公开的外用制剂不限于此。
本公开的另一方面提供了包括本公开的用于经皮递送的组合物的化妆品组合物。
用于经皮递送的组合物等如上文所述。
化妆品组合物可根据生物活性物质的生理功能用于皮肤改善或用于疾病预防或改善，但不限于此。
在一实施方案中，化妆品组合物可用于皮肤改善，但不限于此。
在一实施方案中，化妆品组合物可以用于皮肤再生、伤口愈合、抗衰老、皱纹改善、美白、炎症缓解、抗菌作用、保湿、增湿和抗氧化作用，但不限于此。
在一实施方案中，化妆品组合物可用于预防或改善皮肤病，但不限于此。
皮肤病是指其中在皮肤上出现由遗传因素、生理因素和环境因素引起的异常症状(如炎症、红斑、增厚、纤维化和死皮细胞)的疾病。例如，皮肤病可以是特应性皮炎、过敏、牛皮癣、脂溢性皮炎、接触性皮炎、红斑狼疮、痤疮、疣、病毒感染、丘疹性荨麻疹等，但不限于此。
如本文所用的，“预防”是指借以抑制或延缓疾病(例如，皮肤病)的发作或其进展的任何行动。
如本文所用的，“改善”是指借以至少减少与病况的缓解或治疗相关的参数(例如症状的严重程度)的任何行动。在本公开中，化妆品组合物可在选自以下的制剂中制备：溶液、外用软膏、乳膏、泡沫、滋养乳液、软化乳液、香水、面膜、软化乳液、乳剂、化妆基质、香精、肥皂、液体清洁剂、沐浴制剂、防晒霜、太阳油、悬浮剂、乳剂、糊状物、凝胶、乳液、粉末、肥皂、含有表面活性剂的清洁剂、油、粉状粉底、乳液粉底、蜡粉底、贴剂和喷雾剂，但不限于此。
本公开的化妆品组合物还可以包括一种或多种化妆品可接受的载体，其被混合在一般皮肤化妆品中，并且可以适当地与作为常见成分的例如油、水、表面活性剂、保湿剂、低级醇、增稠剂、螯合剂、着色剂、防腐剂、香料等混合，但不限于此。
包括在本公开的化妆品组合物中的化妆品可接受的载体根据化妆品组合物的制剂而变化。
当本公开的制剂是软膏、糊状物、乳膏或凝胶时，动物脂肪、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌等可以用作载体组分，但不限于此。这些物质可以单独使用，也可以在其两种或更多种的混合物中使用。
当本公开的制剂是粉末或喷雾时，乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉末等可以用作载体组分。特别地，当制剂是喷雾时，可以另外包括推进剂(如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚)，但不限于此。这些物质可以单独使用，也可以在其两种或更多种的混合物中使用。
当本公开的制剂是溶液或乳液时，溶剂、增溶剂或乳化剂可以用作载体组分。例如，可以使用水、甘油、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油等。特别地，可以使用棉籽油、花生油、玉米籽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油、甘油脂族酯、聚乙二醇或山梨糖醇脂肪酸酯，但不限于此。这些物质可以单独使用，也可以在其两种或更多种的混合物中使用。
当本公开的制剂是悬浮剂时，液相稀释剂(如水、甘油、乙醇或丙二醇)、悬浮剂(如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯、聚氧乙烯山梨醇酸酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄芪胶等)可用作载体组分，但不限于此。这些物质可以单独使用，也可以在其两种或更多种的混合物中使用。
当本公开的制剂是肥皂时，脂肪酸碱金属盐、脂肪酸半酯盐、脂肪酸蛋白质水解物、羟乙基磺酸盐、羊毛脂衍生物、脂族醇、植物油、甘油、糖等可以用作载体组分，但不限于此。这些物质可以单独使用，也可以在其两种或更多种的混合物中使用。
本公开的另一方面提供了包括本公开的用于经皮递送的组合物的准药物组合物。
准药物组合物可根据生物活性物质的生理功能用于皮肤改善，或者用于预防或改善皮肤病，但不限于此。
用于经皮递送的组合物、生物活性物质、皮肤改善、皮肤病、预防和改善等如上文所述。
如本文所用的，“准药物”是指在用于诊断、治疗、改善、缓解、处理或预防人类或动物疾病的物品中，具有比药物更温和作用的物品。例如，根据药事法，准药物是指对人体有轻微作用或没有直接影响的那些物品，其不包括用作药物的物品，包括用于治疗或预防人类或动物疾病目的的物品。
本公开的准药物组合物可以在选自身体清洁剂、泡沫、肥皂、面膜、软膏、乳膏、乳液、精华和喷雾的制剂中制备，但不限于此。
在本公开的化妆品组合物或准药物组合物中，由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段可以基于组合物的总量，以按重量计0.01％至按重量计100.0％、按重量计0.1％至按重量计10％的量被包括。
本公开的另一方面提供了外用于皮肤上的药物组合物，所述药物组合物包括本公开的用于经皮递送的组合物。
根据生物活性物质的生理功能，药物组合物可以用于预防或治疗皮肤病，但不限于此。用于经皮递送的组合物、外用于皮肤上的制剂、生物活性物质、皮肤病和预防等如上文所述。
如本文所用的，“治疗”是指疾病(例如，皮肤病)的症状借以好转或得到有利改善的任何行动。在本公开中，治疗可以包括防止疾病复发、缓解症状、降低进展速率、缓解疾病状态、暂时或持续缓解疾病状态、实现减轻或改善预后的所有行动。
除了由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段之外，本公开的药物组合物还可以包括生物活性物质和药学上可接受的载体。
如本文所用的，“药学上可接受的”意指它在施用期间，在不刺激生物体的情况下，不干扰所施用的可以在药学领域中一般性使用的化合物的生物活性和性质。本公开的药物组合物可以与载体一起配制，以用作食品、药物、饲料添加剂、饮用水添加剂等。
载体的类型没有特别限制，并且可以使用本领域中常用的任何载体。载体的非限制性实例可包括盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、麦芽糖糊精、甘油、乙醇等。这些可单独使用或在其两种或更多种的混合物中使用，但不限于此。
另外，本公开的药物组合物可通过添加其他药学上可接受的添加剂(如赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、缓冲剂或抑菌剂)，并根据需要另外添加填充剂、补充剂、润湿剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂或润滑剂等来使用，但不限于此。
本公开的药物组合物可以在配制成适合外用于皮肤上的各种制剂后使用。
外用于皮肤上的制剂的非限制性实例可包括气雾剂、喷雾剂、清洁剂、软膏、包衣粉末、油、乳膏等，但不限于此，只要它们可作为外用于皮肤上的制剂起作用即可。
为了配制本公开的外用于皮肤上的药物组合物，可以使用无菌水性溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳液、冻干制剂、外用制剂等。作为非水溶剂和悬浮剂，可以使用丙二醇和聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、酯(如油酸乙酯)等，但不限于此。
此外，更具体地，当配制本公开的药物组合物时，将本公开的药物组合物与稳定剂或缓冲液在水中混合以制备溶液或悬浮液，然后可以将其配制成诸如安瓿(ampoule)的单位。另外，当本公开的药物组合物被配制成气雾剂时，推进剂等可以与添加剂混合，使得水分散的浓缩物或湿粉末被分散，但不限于此。
另外，当本公开的药物组合物被配制成软膏、乳膏等时，动物脂肪、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌等可以用作载体组分，但不限于此。
当本公开的药物组合物被配制外用于皮肤上时，其可以更优选地具有选自凝胶、贴剂、喷雾、软膏、硬膏、洗剂、搽剂、糊剂和巴布剂的制剂，但不限于此。
本公开的药物组合物的药学有效量和外用有效剂量可以取决于药物组合物的配制方法、施用方法、施用时间和/或施用途径等而变化，并且可以取决于各种因素而变化，包括通过施用药物组合物所要实现的反应的类型和程度、对象的类型、年龄、体重、一般健康状况、疾病症状或严重程度、性别、饮食、排泄、在对象中同时或单独使用的药物以及组合物的其他组分，以及医学领域中熟知的类似因素，并且本领域技术人员可以容易地确定和开出用于所需治疗的有效剂量。本公开的药物组合物的给药可以每天进行一次或分成几次。因此，剂量不旨在在任何方面限制本公开的范围。
另外，本公开中的施用可以是外用的施用，并且本公开的药物组合物的优选剂量可以是每天1mg/kg至1000mg/kg。
本公开的药物组合物的施用途径和施用模式可以是独立的，并且不特别限制于该模式，并且药物组合物可以遵循任何施用途径或施用模式，只要其可以到达靶位点即可。药物组合物可以以皮肤外部制剂的方式施用。具体地，可以使用将组合物涂敷或喷洒到疾病部位的方法，但不限于此。
本公开的药物组合物可以优选地通过涂敷或喷雾来施用，并且具体地，其通过局部涂敷到需要改善皮肤状况或预防、改善或治疗皮肤病的区域来施用。
本公开的另一方面提供了试剂盒，其包括本公开的用于经皮递送的组合物；以及生物活性物质。
试剂盒可以用于经皮递送、皮肤渗透、皮肤改善、预防或治疗皮肤病，但不限于此。可以提供试剂盒，使得用于经皮递送的组合物和生物活性物质可以存储在单独的容器中，并在使用时混合，但不限于此。
另外，本公开的试剂盒可以包括由一种或多种其他组分组成的组合物、溶液或用于经皮递送、皮肤渗透、皮肤改善、预防或治疗皮肤病的装置，但不限于此。作为其它组分的实例，可以包括合适的载体、增溶剂、缓冲剂、稳定剂等，但不限于此。载体可以包括可溶性载体或不溶性载体，并且可溶性载体的实例可以包括本领域已知的生理上可接受的缓冲剂(例如PBS)，并且不溶性载体的实例可以包括聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯和聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、交联葡聚糖、多糖、聚合物(如在乳胶、其他纸、玻璃、金属、琼脂糖上镀有金属的磁性微粒)，以及以上的组合，但不限于此。
另外，本公开的试剂盒还可以包括描述用于进行最佳反应的条件的用户指南。该指南是一份打印件，其解释了如何使用试剂盒，例如反应条件等。该指南包括小册子或传单形式的手册、贴在试剂盒上的标签以及包含试剂盒的包装表面上的说明。另外，该指南包括通过电子媒介(如互联网)公开或提供的信息。
本公开的另一方面提供了制备本公开的用于经皮递送的组合物的方法。
本公开的另一目标提供了生理活性物质的经皮递送方法，所述方法包括向皮肤或粘膜应用本公开的用于经皮递送的组合物；以及生物活性物质。
本公开的另一目标提供了改善皮肤的方法，所述方法包括向皮肤或粘膜应用本公开的用于经皮递送的组合物；以及生物活性物质。
本公开的另一目标提供了预防或治疗皮肤或粘膜疾病的方法，所述方法包括向不包括人类的对象的皮肤或粘膜应用本公开的药物组合物。
本公开的另一目标提供了预防或改善皮肤或粘膜疾病的方法，所述方法包括向皮肤应用本公开的化妆品组合物或准药物组合物。
本公开的另一目标提供了制备化妆品组合物、准药物组合物或药物组合物的方法，所述方法包括将本公开的用于经皮递送的组合物与生物活性物质混合。
本公开的另一目标提供了本公开的由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的肽、其衍生物或其片段用于生物活性物质的皮肤渗透的用途。
本公开的另一目标提供了本公开的由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的肽、其衍生物或其片段用于生物活性物质的经皮递送的用途。
本公开的另一目标提供了本公开的由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的肽、其衍生物或其片段和生物活性物质；包括其的化妆品组合物；或者准药物组合物用于皮肤改善或预防或改善皮肤病的用途。
本公开的另一目标提供了包括本公开的由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的肽、其衍生物或其片段和生物活性物质的药物组合物用于预防或治疗皮肤病的用途。用于经皮递送的组合物、生物活性物质、皮肤改善、药物组合物、化妆品组合物、准药物组合物、皮肤病、预防、改善和治疗如上文所述。
如本文所用的，术语“对象”是指任何动物，其包括小鼠、牲畜和哺乳动物(包括人类)等，但不限于此。
如本文所用的，术语“应用”意指通过任何合适的方法使本公开的用于经皮递送的组合物和生物活性物质与对象的皮肤接触，并且包括旨在将本公开的用于经皮递送的组合物和生物活性物质吸收到皮肤中的所有行动，但不限于此。
用于实施本发明的形式
在下文中，将参考实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例和实验实施例仅用于说明本公开，并且本公开的范围不旨在受到这些实施例和实验实施例的限制。
制备实施例1：皮肤可渗透肽的制备
为了检查皮肤可渗透肽的功能，制备了SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8的肽及其衍生物肽。
1-1：SEQIDNO:1的肽的合成
称取71.4mg(0.10mmol)购自Novabiochem公司的2-氯三苯甲基氯化物树脂(1.4mmol/g负载树脂)，将树脂与7.5mL甲基氯化物溶剂化并反应5分钟，然后除去甲基氯化物(methylchloride)。
此后，将Fmoc–Lys(Boc)–OH(281.1mg，0.60mmol)完全溶解在7.5mL MC溶剂中，加入0.21mL的1.2mmol的N,N′-二异丙基乙胺(DIPEA)，并将溶液加入树脂中。在室温下对反应溶液进行振荡(shaking)12小时，然后用10mL DMF溶剂洗涤4次。
然后，加入7.5mL 20％(w/v)哌啶(piperidine)DMF溶液，然后振荡(shaking)15分钟，并且保护基团从已经加入上述树脂中的物质中完全去除9-芴基甲氧基羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl；Fmoc)，并且使用10mL的DMF溶剂洗涤该物质四次(每次10mL，洗涤四次)。在这个阶段，Fmoc保护基团的去保护反应通过Kaiser测试(E.Kaiser等人，Anal.Biochem.,1970,34(2),595–598)得到证实。
同时，将Fmoc–Leu–OH(212.0mg，0.60mmol)和六氟磷酸苯并三唑四甲基脲(hexafluorophosphate benzotriazole tetramethyluronium；HBTU)(227.6mg，0.60mmol)和羟基苯并三氮唑(hydroxybenzotriazole；HOBt)(81.0mg，0.6mmol)完全溶解在7.5mL的DMF溶剂中，然后向其中加入DIPEA(0.21mL，1.2mmol)，并将混合物加入上述树脂中。在室温下振荡(shaking)3小时后，将反应溶液用每次10mL的DMF溶剂洗涤四次。在该阶段，进行Kaiser测试以确认反应完成。
接下来，根据与下面相同的合成循环，将肽连续缩合(偶联)。
(1)用DMF溶剂(10mL)洗涤4次；
(2)使用20％(w/v)哌啶DMF溶液(7.5mL)进行去保护15分钟；
(3)用DMF溶剂(10mL)洗涤4次；
(4)加入Fmoc-氨基酸、HBTU、HOBt、DIPEA；
(5)通过加入HBTU、HOBt和DIPEA缩合试剂活化氨基酸，并缩合3小时；
(6)用DMF溶剂(10mL)洗涤4次。
重复以上(1)-(6)，并在此时，将Fmoc–Leu–OH之后的Fmoc保护的氨基酸(0.60mmol)按下述顺序加入树脂反应容器中并缩合。
(i)Fmoc–Tyr(tBu)–OH；
(ii)Fmoc–Lys(Boc)–OH；
(iii)Fmoc–Leu–OH；
(iv)Fmoc–Ile–OH；
(v)Fmoc–Lys(Boc)–OH；
(vi)Fmoc–Lys(Boc)–OH；
(vii)Fmoc–Phe–OH；
(viii)Fmoc–Leu–OH；
(ix)Fmoc–Lys(Boc)–OH；
(x)Fmoc–Lys(Boc)–OH。
在(6)Fmoc–Lys(Boc)–OH缩合后，最终处理20％哌啶DMF溶液(7.5mL)，然后用每次10mL的DMF溶剂洗涤三次，MC溶剂洗涤三次，并且乙醚溶剂洗涤三次。
合成完成后，立即使用三氟乙酸/三异丙基硅烷/水(95:2.5:2.5)(10mL)的混合物，将肽从肽偶联树脂上切割3小时。将由此获得的混合溶液用储存在冰箱中的100mL二乙醚溶剂处理以产生沉淀物。通过离心使所获得的沉淀物完全沉淀，并主要除去三氟乙酸，并重复上述程序(通过加入100mL二乙醚溶剂洗涤沉淀物并离心的步骤；除去三氟乙酸的程序，尝试其主要的去除)两次，以获得固化的沉淀物。
使用C-18柱，使用含有0.001％三氟乙酸的5％-100％乙腈/水梯度溶剂系统，在50分钟内通过HPLC纯化沉淀物(肽)。将纯化的部分冷冻干燥，以获得155mg的SEQ ID NO:1的皮肤可渗透肽，其为白色粉末状三氟乙酸盐。
SEQ ID NO:1：H2N–[Lys–Lys–Leu–Phe–Lys–Lys–Ile–Leu–Lys–Tyr–Leu–Lys]–CO2H
MS(ESI)m/e，[M+H]+＝1550.17；(155mg)。
1-2：SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:8的肽的合成
以下SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:8的肽在与制备实施例1-1中相同的制备过程中制备，不同之处在于Fmoc保护的氨基酸的顺序发生了改变。
SEQ ID NO:2：H2N–[Arg–Arg–Leu–Phe–Arg–Arg–Ile–Leu–Arg–Tyr–Leu–Arg]–CO2H
MS(ESI)m/e，[M+H]+＝1718.23；(171mg)
SEQ ID NO:3：H2N–[Arg–Phe–Leu–Phe–Arg–Leu–Ile–Leu–Arg–Tyr–Leu–Arg]–CO2H
MS(ESI)m/e，[M+H]+＝1666.18；(166mg)
SEQ ID NO:4：H2N–[Arg–Arg–Leu–Phe–Arg–Leu–Ile–Leu–Arg–Tyr–Leu–Phe]–CO2H
MS(ESI)m/e，[M+H]+＝1666.18；(166mg)
SEQ ID NO:5：H2N–[Arg–Lys–Leu–Phe–Lys–Arg–Ile–Leu–Arg–Tyr–Leu–Lys]–CO2H
MS(ESI)m/e，[M+H]+＝1634.2；(153mg)
SEQ ID NO:6：H2N–[Lys–Arg–Leu–Phe–Arg–Lys–Ile–Leu–Lys–Tyr–Leu–Arg]–CO2H
MS(ESI)m/e，[M+H]+＝1634.2；(143mg)
SEQ ID NO:7：H2N–[Lys–Arg–Leu–Phe–Lys–Arg–Ile–Leu–Arg–Tyr–Leu–Lys]–CO2H
MS(ESI)m/e，[M+H]+＝1634.2；(132mg)
SEQ ID NO:8：H2N–[Arg–Lys–Leu–Phe–Arg–Lys–Ile–Leu–Lys–Tyr–Leu–Arg]–CO2H
MS(ESI)m/e，[M+H]+＝1634.2；(172mg)。
实施例1：SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8及其衍生物对生物活性物质的皮肤渗透性 的评估
为了确认作为皮肤可渗透肽的功能，与已知肽进行比较评估了利多卡因(Lidocaine)的皮肤渗透性。处理了由选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽及其SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4的衍生物的混合物，或者已知的肽和利多卡因，或者单独的利多卡因，以评估皮肤渗透性。
详细地，为了评估皮肤渗透性，使用真实的人类皮肤，并通过Franz扩散池测定测量皮肤渗透性；并通过HPLC测量利多卡因的渗透量，然后进行比较。已知的肽序列如下。
-已知的肽序列(TAT)：GRKKRRQRRRPQ
Franz扩散池测定
本实验中使用的人类皮肤购自韩国UMC Science有限公司，并且PBS(磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline),Gibco,USA)购自西格玛奥德里奇。
为了测量皮肤可渗透肽的皮肤渗透性，根据进行皮肤吸收研究的OECD(2004，巴黎)指导文件和食品和药物安全部(2009)关于化妆品的动物测试的替代方法(体外皮肤吸收测试方法)的指南，进行Franz扩散池测定。
首先，将皮肤面积设置为3cm2，并且将皮肤的角质层面朝上放置在接受室上。此后，将供给室放置在角质层上并夹住。将磁条插入Franz扩散池底部的接受器中，并通过取样臂填充缓冲剂。当测试物质是水溶性的时，缓冲剂是pH 7.4的PBS，或者当测试物质是油溶性时，乙醇:水＝1:1。
接受器流体(receptor fluid)的温度于32℃±1℃下保持恒定，并且湿度保持在30％–70％，然后稳定30分钟。此后，将搅拌器设定为600rpm。用1mL浓度为2mM的样品处理各组的皮肤。此后，通过将插入接受器中的磁力搅拌棒的速度保持在600rpm，将水性溶液充分混合。6小时后，通过接受器的取样臂进行取样，并且为了定量，通过HPLC分析STD(100μM标准样品)和样品，并且渗透性表示为与STD相比的百分比(％)。
结果，证实了当使用SEQ ID NOS:5-8及其衍生物时，利多卡因的皮肤渗透量显著优于使用已知肽的情况和不使用肽的情况(图1)。
实施例2：皮肤可渗透肽对生物活性物质的皮肤渗透性的评估
在上述SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8的肽中，测量了对咖啡因(Caffeine)具有最高效应的SEQ ID NO:8的皮肤可渗透肽的皮肤渗透性随时间的变化。对SEQ ID NO:8的皮肤可渗透肽和咖啡因的混合物或单独的咖啡因进行处理，以评估其皮肤渗透性。
详细地，按实施例1中那样使用真实的人类皮肤进行Franz扩散池测定，并且通过HPLC测量咖啡因的渗透量，然后进行比较(图2)。
结果，证实了当使用SEQ ID NO:8时，咖啡因的皮肤渗透量显著优于使用已知肽的情况和不使用肽的情况。
实施例3：皮肤可渗透肽对具有不同分子量的生物活性物质的皮肤渗透性的评估
为了评估即使对于具有不同分子量的生物活性物质，皮肤可渗透肽是否具有皮肤渗透性，在与SEQ ID NO:8的肽混合后处理3kDa、30kDa和300kDa FITC缀合(conjugation)的胶原蛋白(COLA)和800kDa透明质酸(HA)，或者单独处理，并且通过Franz扩散池测定获得的水性溶液，然后使用荧光微孔板读取仪(SpectraMax i3,Molecular Devices,USA)分析FITC荧光值。
根据制造商的说明，通过从Abcam(Cambridge,MA,USA)购买FITC缀合试剂盒((ab188285))，来进行FITC缀合方法。
结果，证实当使用具有SEQ ID NO:8的肽的混合物时，观察到具有不同分子量(3kDa、30kDa和300kDa)的胶原蛋白和透明质酸的强皮肤渗透效应(图3)。
实施例4：皮肤可渗透肽对脂质体的皮肤渗透性的评估
为了仔细检查皮肤可渗透肽对作为一种生理活性物质生物活性物质的脂质体(Liposome)的皮肤渗透效应的影响，用SEQ ID NO:8的肽和脂质体的混合物或单独的脂质体处理人类皮肤3小时。然后通过Franz扩散池测定获得的水性溶液，并使用荧光微孔板读取仪(SpectraMax i3,Molecular Devices,USA)分析FITC荧光值。
使用购自西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich,MO,USA)的脂质体试剂盒对荧光素进行脂质体化，并将脂质体化荧光素用作脂质体，以用于皮肤渗透性测试。通过SEM测量脂质体的尺寸为180nm。
结果，证实了当处理SEQ ID NO:8的肽和脂质体的混合物时，脂质体的皮肤渗透效应显著增加(图4)。
实施例5：由于皮肤可渗透肽对生物活性物质的皮肤渗透效应引起的生物活性物 质功效改善的评估
为了检查由于通过SEQ ID NO:8的肽的活性成分的皮肤渗透效应引起的生物活性物质的功效改善，用作为生物活性物质的KTTKS肽和SEQ ID NO:8的肽的混合物处理，或者用单独的KTTKS肽处理HDF细胞，并使用ELISA测定法分析胶原蛋白产生量。
本实验中使用的HDF细胞购自Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA,USA)。将HDF细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Gipco,LifeTechnologies,Grand Island,NY,USA)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中进行培养，并在37℃下，于5％CO2孵育器中培养。
将密度为2×105个细胞/mL的HDF细胞以250μL的体积分配在48孔中，并允许稳定24小时。以不同浓度处理样品，并在CO2孵育器中培养48小时，然后获得每种培养物。根据制造商的说明(胶原蛋白I型ELISA试剂盒,R&D Biosystems)，将抗体在包被缓冲液中稀释，包被在微孔上，并在4℃下孵育过夜。用洗涤缓冲液洗涤每个孔三次后，分配100μL培养物。将孔在室温下保持1小时，用洗涤缓冲液洗涤三次，用100μL抗生物素蛋白–HRP缀合的抗体处理，在室温下保持1小时，然后再次洗涤三次。将100μL TMB底物分配到其中，在黑暗中保持30分钟，并用50μL终止液处理，然后用显微分光光度计(Molecular Device,Sunnyvale,CA,USA)在450nm处测量吸光度。
结果，证实了当处理SEQ ID NO:8的肽和KTTKS的混合物时，胶原蛋白的产生量根据KTTKS肽的皮肤渗透效应的增加而显著增加(图5)。
实施例6：由于皮肤可渗透肽对生物活性物质的皮肤渗透效应引起的功效改善的 人类应用测试的评估
为了通过人体应用测试证实由于通过SEQ ID NO:8的肽的活性成分的皮肤渗透效应引起的功效改善，通过SKNMED临床试验中心对20名对象进行了人类应用测试。给测试组开出SEQ ID NO:8的肽和1％超低分子量透明质酸的混合物的处方，并且给对照组开出不含SEQ ID NO:8的肽的1％超低分子量透明质酸的处方。
对于测试对象，产品应用区域为前臂，每次产品应用量约为0.5g±0.1g，并且产品应用周期和方法为每天两次(其他生活模式与往常相同)。该测试是在对象在没有空气流动和阳光直射的情况下，在恒定温度和湿度条件下(20–25℃的室温，40％–60％的湿度)休息皮肤至少30分钟后进行的。为了准确地确定本公开的效应，在测试期间防止应用区域接触水或出汗，从而可以尽可能多地保存产品应用区域。另外，为了最大限度地减少测量误差，通过同一测试仪重复每一测量三次，并评估平均值。
为了检查皮肤纹理是否得到改善，使用Visioscan将光均匀分布到反射器上，并利用视频传感器芯片和物镜拍摄图像。导出了由255个灰度级(Gray level)表示的皮肤表面的非光面图像(尺寸约为10mm×8mm)，并且在导出的测量值中反映了表示皮肤粗糙度的SEr(粗糙度(Roughness))值。测量预定区域，并且与使用产品之前的面积相比，在使用产品24小时后再次测量相同区域，从而检查皮肤粗糙度。随着SEr的增加，皮肤粗糙度降低，表明皮肤纹理得到改善。
使用Cutometer双MPA 580测量皮肤弹性是否得到改善。Cutometer的测量原理是基于吸力法，其中负压使皮肤机械变形。在装置中产生压力，并在定义的时间后将皮肤吸入探针的孔中。在探针内部，经由非接触式光学测量系统确定穿透深度。该光学测量系统由一个光源和一个光接受器以及两个彼此面对的棱镜组成，这两个棱镜将光从发射器投射到接受器。光强度由于皮肤的穿透深度而变化。在测量过程中，皮肤对负压的抵抗力(硬度)及其返回其原始位置的能力(弹性)实时显示为曲线(以mm/时间表示)。从这些曲线中，作为测量参数，R2值被计算为与皮肤表面的弹性和粘弹性特性以及皮肤老化一致。该值越接近1(100％)，其弹性就越大。在该人体应用测试中，在使用产品24小时后，测量了代表测试区域皮肤弹性的R2值(R2＝Ua/Uf；最大振幅的比例)。
前臂区域的光泽度使用SkinGlossMeter(SGM,Delfin)测量。当来自635nm红色二极管激光器的光从皮肤表面反射时，检测反射量。将通过装置内部衍射微观结构的光用于计算光泽度值，作为SGU(皮肤光泽度单位(Skin Gloss Unit))参数。皮肤的光泽度越高，测量值就越高。在该人类应用测试中，在使用产品之前和使用产品之后24小时测量代表测试区域的皮肤光泽度的SGU值。
另外，通过以下公式计算改善率。
-改善率(％)公式＝{(使用前-使用后)/使用前}×100
结果发现，在24小时后，与对照组相比，测试组的皮肤纹理、皮肤弹性和光泽度的平均改善率分别表现出约40倍、4倍和5倍的增加(表1)。
[表1]
以上结果证实了本公开的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段具有极好的皮肤渗透性，并因此，其具有作为皮肤可渗透肽的显著效应。
基于以上描述，本领域技术人员将理解，在不改变其技术精神或基本特征的情况下，本公开可以以不同的具体形式实施。在这一点上，应该理解，上述实施方案不是限制性的，而是在所有方面都是说明性的。本公开的范围由所附的权利要求而不是由其之前的描述来限定，并因此，落入权利要求的边界和界限内的所有变化和修改，或者这些边界和界限的等价物，都因此旨在被权利要求所包含。
序列表
<110> 愢丽科恩株式会社(Cellicon Lab Inc.)
<120> 用于皮肤和粘膜的新型皮肤可渗透肽、包括其的组合物及它们的用途
<130> OPA22040
<160> 8
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 皮肤穿透肽1
<400> 1
Lys Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Tyr Leu Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 皮肤穿透肽2
<400> 2
Arg Arg Leu Phe Arg Arg Ile Leu Arg Tyr Leu Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 皮肤穿透肽3
<400> 3
Arg Phe Leu Phe Arg Leu Ile Leu Arg Tyr Leu Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 皮肤穿透肽4
<400> 4
Arg Arg Leu Phe Arg Leu Ile Leu Arg Tyr Leu Phe
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 皮肤穿透肽5
<400> 5
Arg Lys Leu Phe Lys Arg Ile Leu Arg Tyr Leu Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 皮肤穿透肽6
<400> 6
Lys Arg Leu Phe Arg Lys Ile Leu Lys Tyr Leu Arg
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 皮肤穿透肽7
<400> 7
Lys Arg Leu Phe Lys Arg Ile Leu Arg Tyr Leu Lys
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 皮肤穿透肽8
<400> 8
Arg Lys Leu Phe Arg Lys Ile Leu Lys Tyr Leu Arg
1 5 10

Claims (21)

1.用于生物活性物质的经皮递送的组合物，所述组合物包含由SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段。
2.如权利要求1所述的用于生物活性物质的经皮递送的组合物，其中所述衍生物的与选自由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽的N-末端起的第1、2、5、6、9和12位中的任一位置对应的氨基酸被另一碱性氨基酸取代。
3.如权利要求2所述的用于生物活性物质的经皮递送的组合物，其中所述碱性氨基酸是赖氨酸(Lysine)或精氨酸(Arginine)。
4.如权利要求1所述的用于生物活性物质的经皮递送的组合物，其中所述衍生物是选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中的任一种或多种。
5.如权利要求1所述的用于生物活性物质的经皮递送的组合物，其中所述用于经皮递送的组合物增加生物活性物质对选自皮肤和粘膜中的任一种或多种的渗透性。
6.如权利要求1所述的用于生物活性物质的经皮递送的组合物，其还包含载体。
7.如权利要求6所述的用于生物活性物质的经皮递送的组合物，其中所述载体是脂质体(lyposome)。
8.如权利要求1所述的用于生物活性物质的经皮递送的组合物，其中所述生物活性物质是在体内具有生理作用的物质。
9.用于生物活性物质的皮肤渗透的组合物，所述组合物包含由SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段。
10.用于生物活性物质的经皮递送的载体，所述载体包含由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段。
11.用于生物活性物质的皮肤可渗透载体，所述载体包含由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的皮肤可渗透肽、其衍生物或其片段。
12.化妆品组合物，其包含权利要求1所述的用于经皮递送的组合物。
13.准药物组合物，其包含权利要求1所述的用于经皮递送的组合物。
14.用于外用于皮肤或粘膜上的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1所述的用于经皮递送的组合物。
15.试剂盒，其包含权利要求1所述的用于经皮递送的组合物；以及生物活性物质。
16.制备权利要求1所述的用于经皮递送的组合物的方法。
17.制备化妆品组合物、准药物组合物或药物组合物的方法，所述方法包括将权利要求1所述的用于经皮递送的组合物与生物活性物质混合。
18.生物活性物质的经皮递送方法，其包括向皮肤或粘膜应用权利要求1所述的用于经皮递送的组合物和生物活性物质。
19.改善皮肤的方法，其包括向皮肤或粘膜施用权利要求1所述的用于经皮递送的组合物和生物活性物质。
20.由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的肽、其衍生物或其片段用于生物活性物质的皮肤渗透的用途。
21.由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中的任一氨基酸序列组成的肽、其衍生物或其片段用于生物活性物质的经皮递送的用途。
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