CN117320556A - 富含免疫球蛋白的含乳清蛋白的产品 - Google Patents

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Abstract

披露了用于生产富含免疫球蛋白的含乳清蛋白的产品的方法，所述方法包括以下步骤：(i)使用截留分子量(MWCO)为500‑1000kDa、优选500‑800kDa或孔径为50‑100nm、优选50‑80nm的膜对酪蛋白减少的乳进行错流过滤，从而获得UF渗余物和富含乳糖、盐、α‑乳白蛋白和β‑乳球蛋白的渗透物，以及(ii)对所述UF渗余物进行混合模式层析，其中免疫球蛋白粘附到树脂上并随后被洗脱以形成所述富含免疫球蛋白的含乳清蛋白的产品。

Description

富含免疫球蛋白的含乳清蛋白的产品
本发明涉及具有高免疫球蛋白含量的含乳清蛋白的产品、其生产和用途。
在哺乳动物后代能够消化其他来源的食物之前，乳是它们的唯一营养源。所有泌乳动物的初乳和乳都含有免疫球蛋白(Ig)，免疫球蛋白为后代提供针对微生物病原体和毒素的免疫保护，并保护乳腺免受感染。牛乳和人乳中主要类别的免疫球蛋白是IgG、IgA和IgM，这些免疫球蛋白在结构和生物活性上有所不同。IgG可细分为IgG1和IgG2。在人乳中，主要的Ig是IgA。人母乳含有约85wt％-90wt％的IgA、约2wt％-3wt％的IgG、以及约8wt％-10wt％的IgM(J.A.Cakebread等人，J.Agric.Food Chem.[农业食品化学杂志]，63(2015)7311-7316)。人母乳中的总Ig浓度是牛乳中Ig含量的约1.5倍(J.A.van Neerven等人，J.Allergy Clin.Immunol.[变态反应与临床免疫学杂志]，2012年10月，853-858)。
另一方面，在牛乳中，主要的Ig是IgG。成熟牛乳含有约80wt％的IgG(绝大多数是IgG1)、约10wt％的IgM、以及约10％的IgA。牛初乳的Ig含量比成熟牛乳的Ig含量高得多：初乳的总蛋白含量的70％-80％是Ig，而在成熟牛乳中，Ig仅占总蛋白含量的1wt％-2wt％。
通过将至少一种乳清蛋白源、至少一种乳(酪蛋白)蛋白源、至少一种脂质源、至少一种碳水化合物源、以及维生素和矿物质组合来制备婴儿配方乳。牛乳是这些蛋白质、碳水化合物、脂质和维生素的应用来源之一。
人们一直希望生产与人母乳尽可能相似的婴儿配方乳。因此，为实现此目标，人们希望增加婴儿配方乳中的活性免疫球蛋白含量。
通常，通过将乳与至少一种乳清蛋白源、至少一种脂质源、至少一种碳水化合物源、以及维生素和矿物质组合来制备婴儿配方乳。
乳清蛋白源优选地选自乳清蛋白浓缩物(WPC)和血清蛋白浓缩物(SPC)。这两种产品都是将脱脂乳分离成富含酪蛋白和富含乳清蛋白的级分的结果；通过凝乳(即干酪制作)、酸化或微滤。免疫球蛋白主要存在于乳血清/乳清相而非酪蛋白胶束相中，因此被认为是乳清蛋白。
乳清蛋白浓缩物(WPC)常规地通过对酸性乳清或干酪乳清进行超滤和/或反渗透以及任选地去矿化获得。通过超滤，大部分的水、乳糖和灰分从产物中去除，从而将乳清蛋白浓缩。反渗透可用于去除水并进一步浓缩WPC。血清蛋白浓缩物(SPC)也是浓缩的乳清蛋白产物，与WPC的不同之处在于乳清级分的来源。与酸性乳清或干酪乳清相反，SPC中的乳清蛋白来自于脱脂乳的微滤；它们通常被称为天然乳清。所述微滤产生浓缩的酪蛋白渗余物(retentate)级分和含有大部分乳清蛋白作为渗透物(permeate)级分的血清级分。常规地，然后对这种渗透物级分进行超滤和/或反渗透以去除乳糖、灰分和水。
这些常规方法中使用的UF膜的截留分子量(MWCO)在5-10kDa的范围内。因此，水、乳糖和矿物质通过膜，而蛋白质浓缩在渗余物中。
基于总乳清蛋白，常规WPC和SPC的免疫球蛋白含量低于6wt％。这与成熟牛乳中的含量相当，这意味着常规的WPC制备不会导致Ig含量的显著富集。
EP 0 320 152披露了一种使用两种不同工艺生产富含免疫球蛋白的WPC的方法。
在第一种工艺中，使用截留分子量(MWCO)为500kDa的膜对乳清进行超滤。
在第二种工艺中，首先对乳清进行阴离子交换层析。与其他乳清蛋白相反，大多数免疫球蛋白不与阴离子交换树脂结合，因此形成流出物。然后使用MWCO为500kDa的膜对该流出物进行超滤。
使用阴离子交换树脂的WPC的Ig富集也披露在WO 01/41584中；实例4。
这些程序的缺点是阴离子交换树脂不结合免疫球蛋白，而是结合更丰富的其他乳清蛋白。这导致了层析方法的高容量需求。
H.J.Heidebrecht等人，J.Chromatogr.A[层析杂志A]1562(2018)59-68披露了使用混合模式层析从牛初乳乳清中分离牛IgG。混合模式层析基于疏水相互作用和阳离子交换的组合。
混合模式层析树脂结合免疫球蛋白而不是大多数其他乳清蛋白，这意味着与阴离子交换层析相比需要的层析容量更低。
然而，仍然希望进一步改善层析容量并进一步改善获得的免疫球蛋白的纯度。
本发明的方法满足了该目的，该方法涉及在层析步骤之前使用特定膜进行错流过滤步骤。这样可以进一步增加层析树脂的结合能力，即每个周期中每树脂体积的免疫球蛋白量。先前的过滤步骤减少了可能与免疫球蛋白竞争结合树脂的乳清蛋白的数量，从而提高了免疫球蛋白与树脂的结合能力和传质。
因此，本发明涉及提供具有高于常规含乳清蛋白的产品(例如WPC和SPC)的免疫球蛋白含量的含乳清蛋白的产品，以及涉及导致总Ig含量相对于总蛋白富集至少10倍、优选地至少15倍、最优选地至少20倍的方法。基于总蛋白，根据本发明的含乳清蛋白的产品含有至少40wt％、优选地50wt％-80wt％的IgG。
含乳清蛋白的产品的总蛋白含量通过BCA法测定，如下所述：R.A.Brown等人，Analytical Biochemistry[分析生物化学]，第180卷(1)，1989年7月，136-139。该IgG含量使用基于RP-HPLC的方法测定，如下所述：D.F.Elgar等人，Journal of Chromatogeraphy A[层析杂志A]，第878卷，2000，183-196。
含乳清蛋白的产品通过包括以下步骤的方法制备：
(i)使用截留分子量(MWCO)为500-1000kDa、优选500-800kDa或孔径为50-100nm、优选50-80nm的膜对酪蛋白减少的乳进行错流过滤，从而获得UF渗余物和富含乳糖、盐、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的渗透物，以及
(ii)对所述UF渗余物进行混合模式层析，其中免疫球蛋白粘附到树脂上并随后被洗脱以形成所述富含免疫球蛋白的含乳清蛋白的产品。
术语“酪蛋白减少的乳”是指经受减少酪蛋白的方法的任何乳级分，该方法是例如酪蛋白沉淀(产生酸性乳清)、干酪制作方法(产生干酪乳清)或微滤以分离酪蛋白和血清蛋白(产生天然乳清)。因此，酪蛋白减少的乳优选地涉及酸性乳清、干酪乳清或天然乳清。更优选地，它是指酸性乳清或干酪乳清。
乳优选地为牛乳，更优选地为成熟牛乳。尽管牛初乳含有比成熟牛乳多得多的免疫球蛋白，但使用来自牛初乳的乳清来生产富含免疫球蛋白的含乳清蛋白的产品仍非选择。首先，初乳的组分(例如，其高浓度的乳清蛋白)使得其倾向于沉淀在热交换器和蒸发器的表面上，从而导致它们的清洁和维护方面出现问题。此外，初乳的使用引发了伦理问题，因为它剥夺了新生小牛在其生命最初几天的必要营养。
在本发明的内容中，成熟牛乳是牛乳而非初乳。初乳是产犊后前三天的乳。与成熟牛乳相比，初乳具有更高水平的脂肪、乳清蛋白(包括Ig)、维生素和矿物质，以及更低水平的乳糖和酪蛋白。
酸性乳清是通过使乳(优选地在脱脂和巴氏灭菌之后)经受酪蛋白沉淀方法来生产的。这种酪蛋白沉淀涉及添加酸以诱导酪蛋白凝固，从而产生酸性酪蛋白级分(酪蛋白凝块)和酸性乳清级分。酸优选地选自HCl、H2SO4和柠檬酸。
例如，可以向脱脂乳中添加1M H2SO4，在40℃-45℃下充分搅拌，直至达到4.3-4.6范围内的pH。搅拌酸化的乳直至凝块完全形成。然后通过例如袋式过滤或离心从乳清中除去凝块。
干酪乳清是通过使乳(优选地在脱脂和巴氏灭菌之后)经受干酪制作方法来生产的。该干酪制作方法优选地涉及添加凝固剂和酸化剂，并使其凝固以获得富含酪蛋白的级分(干酪或干酪前体)和乳清级分。
酸化的目标pH优选地在4.8至5.7、更优选地在4.9至5.5的范围内。合适的酸化剂包括将乳糖转化为乳酸的发酵剂(细菌酸化剂)、酸、酸味剂(例如葡萄糖酸δ内酯或GDL)以及这些中的两种或更多种的组合。最常见的发酵剂包括嗜热型发酵剂，典型地来自CSK公司、科汉森公司(Chr.Hansen)或杜邦公司(DuPont)的发酵剂。科汉森公司的嗜热型发酵剂包括冷冻培养物STI-02、STI-03、STI-04和STI-06，以及冻干培养物STI-12、STI-13和STI-14。也可以使用嗜温型发酵剂。
合适的凝固剂在本领域是已知的，并且包括例如小牛皱胃酶、发酵产生的皱胃酶和微生物皱胃酶。小牛皱胃酶的实例包括CSK公司生产的Kalase和科汉森公司生产的Naturen。发酵产生的皱胃酶的实例包括DSM公司的Fromase和CSK公司的Milase。微生物皱胃酶的实例为科汉森公司的Chy-Max和DSM公司的Maxiren。其他凝固剂包括胃蛋白酶和植物来源的各种蛋白水解酶。
基于总蛋白，酪蛋白减少的乳的总IgG含量通常在2.5wt％-10wt％、优选地2.5wt％-5.0wt％的范围内。通过测定总蛋白含量并减去该总蛋白含量中的非蛋白氮(NPN)和酪蛋白含量来测定酪蛋白减少的乳的总蛋白含量；全部通过熟知的凯氏定氮法(Kjeldahl method)(换算系数6.38)来测定。酪蛋白减少的乳的IgG含量可以使用ELISA定量装置进行测定，如下所述：R.L.Valk-Weeber，T.Eshuis-de Ruiter，L.Dijkhuizen，和S.S.van Leeuwen，International Dairy Journal[国际乳品杂志]，第110卷，2020年11月，104814。
使用截留分子量(MWCO)为500-1000kDa、优选500-800kDa或孔径为50-100nm、优选50-80nm的膜对酪蛋白减少的乳进行错流过滤，从而获得富含乳糖、盐、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的渗透物，以及富含免疫球蛋白(相对于总蛋白)的渗余物。
该过滤步骤用于增加流的免疫球蛋白浓度和纯度，以改善层析树脂的结合能力和下一步骤产物的纯度。
合适的错流过滤膜类型包括螺旋卷式膜、陶瓷膜和中空纤维膜。考虑到价格和在大规模方法中的适用性，优选螺旋卷式膜。
该膜可以由各种类型的聚合物构建，例如聚砜(PS)、(改性)聚醚砜、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯腈(PAN)、乙酸纤维素(CA)和聚丙烯(PP)。
穿过膜的跨膜压力(TMP)优选地在0.25-1.5巴、更优选地0.25-1.0巴、最优选地0.25-0.5巴的范围内。
错流过滤步骤在10℃-15℃或50℃-55℃、优选地50℃-55℃的温度范围内进行。
对于螺旋卷式膜，错流流速优选地在0.1-0.3m/s、更优选地0.2-0.3m/s、最优选地0.25-0.3m/s的范围内；对于陶瓷膜，错流流速为5-7m/s，最优选地6-7m/s；对于中空纤维膜，错流流速为1-3m/s，更优选地2-3m/s，最优选地2.5-3m/s。
为了进一步提高免疫球蛋白的纯度，需要进行渗滤。
可以以固定的VCF对酪蛋白减少的乳进行浓缩或渗滤。
渗余物优选具有约中性pH。也就是说，pH优选地在6.0至8.0、更优选地在6.5至7.5的范围内。如果pH尚未在此范围内，可以通过添加酸或碱来调节pH。
然后对渗余物进行特殊类型的层析，我们在本文中将其称为混合模式层析或多元模式层析。这种类型的层析涉及疏水相互作用和阳离子相互作用的组合，也称为疏水性电荷诱导层析(HCIC)。在中性pH下，蛋白质与树脂的结合是通过疏水相互作用进行的；在低pH下，洗脱机制基于静电排斥。
优选的混合模式树脂是MEP HyperCelTM，其由与4-巯基-乙基-吡啶(4-MEP)配体连接的多孔纤维素基质组成。在pKa为4.8的情况下，4-MEP配体在中性pH下不带电荷，因此免疫球蛋白的吸附主要通过疏水相互作用实现。
其他合适的混合模式树脂为HEA HypercelTM，其含有己胺配体；HCX层析树脂，其含有强离子性磺基基团、弱离子性羧基基团、疏水相互作用的苯基基团以及氢结合的羟基和胺基基团；Nuvia cPrime，一种疏水性阳离子交换树脂；和CaptoTM MMC，一种多峰弱阳离子交换树脂。
随后使用水溶液(优选pH为2.0-7.0、更优选2.0-6.0、甚至更优选3.0-5.0、并且最优选4.0-5.0)从树脂中洗脱免疫球蛋白。优选地，使用缓冲溶液来达到该pH。可以使用任何类型的缓冲液。
如果需要，可以使所得含免疫球蛋白的流出物经受进一步的处理步骤。此类处理步骤的实例是：去矿化，例如通过超滤和/或渗滤；浓缩，例如通过蒸发或冷冻浓缩；和干燥，例如喷雾干燥或冷冻干燥。
基于总蛋白，根据本发明并通过根据权利要求1所述的方法生产的含乳清蛋白的产品优选地包含至少40wt％、优选地50wt％-80wt％的IgG。如上所述，该产品的总蛋白含量通过BCA法测定，如下所述：R.A.Brown等人，Analytical Biochemistry[分析生物化学]，第180卷(1)，1989年7月，136-139；IgG含量使用基于RP-HPLC的方法测定，如下所述：D.F.Elgar等人，Journal of Chromatogeraphy A[层析杂志A]，第878卷，2000，183-196。
可以进一步浓缩、去矿化、和/或(喷雾)干燥由本发明的方法得到的含乳清蛋白的产品以制备粉末状产品。
根据本发明的含乳清蛋白的产品特别适合用作生产营养组合物、特别是配方乳的成分。配方乳选自下组：婴儿配方乳、较大婴儿配方乳和成长型配方乳。因此，本发明进一步涉及营养组合物、典型地用于儿童的营养组合物，例如配方乳、特别是婴儿配方乳、较大婴儿配方乳或成长型配方乳。
营养组合物、特别是配方乳，可通过将WPC与至少一种脂质源、碳水化合物源、维生素和矿物质以及任选的其他乳品和蛋白质源组合来制备。
脂质源可以是适合在配方乳中使用的任何脂质或脂肪。优选的脂肪源包括乳脂肪、红花籽油、蛋黄脂质、菜籽油、橄榄油、椰子油、棕榈仁油、大豆油、鱼油、棕榈油酸、高油酸葵花籽油和高油酸红花籽油、以及含有长链多不饱和脂肪酸的微生物发酵油。在一个实施例中，使用无水乳脂肪。脂质源也可以是源自这些油例如棕榈油精、中链甘油三酯，和脂肪酸例如花生四烯酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、二十二碳六烯酸、亚麻酸、油酸、月桂酸、癸酸、辛酸、己酸等的酯的级分形式。也可以添加少量的含有大量预先形成的花生四烯酸和二十二碳六烯酸的油，如鱼油或微生物油。脂肪源优选地具有约5∶1至约15∶1，例如约8∶1至约10∶1的n-6与n-3脂肪酸比率。在特定方面，婴儿配方乳包含油混合物，该油混合物包含被酯化为三酰甘油的棕榈酸，例如其中在三酰甘油的sn-2位置被酯化的棕榈酸的量为按重量计20％至60％的总棕榈酸，并且在三酰甘油的sn-1/sn-3位置被酯化的棕榈酸的量为按重量计40％至80％的总棕榈酸。
优选地存在于配方乳中的维生素和矿物质的实例为维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素E、维生素K、维生素C、维生素D、叶酸、肌醇、烟酸、生物素、泛酸、胆碱、钙、磷、碘、铁、镁、铜、锌、锰、氯化物、钾、钠、硒、铬、钼、牛磺酸和L-肉碱。矿物质通常以盐的形式添加。
优选地存在于配方乳中的碳水化合物的实例为乳糖、不可消化的寡糖(例如半乳寡糖(GOS)和/或果寡糖(FOS))和人乳寡糖(HMO)。
如有必要，营养组合物可含有乳化剂和稳定剂，如大豆卵磷脂、单甘油酯和二甘油酯的柠檬酸酯等。营养组合物也可含有可能具有有益效果的其他物质，例如乳铁蛋白、核苷酸、核苷等。
图
图1展示了实例1-3的层析步骤期间IgG的穿透。它示出了流过柱而非与树脂结合的IgG的百分比。流过柱的IgG的水平越低，即穿透越低，结合能力越高。
实例
对比实例1
将具有10wt％干物质的干酪乳清用作起始材料。将pH调整到7.0。将已知量(2.51)的所述干酪乳清上样至混合模式层析柱(MEP-Hypercel，50ml树脂)，流速为4个批体积/小时(BV/hr)，等于3.3ml/min。在上样和随后的冲洗后，用(1)pH 6的0.050mol/l MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲液、(2)pH 4.5的0.05mol/l乙酸钠缓冲液和(3)pH 2.7的0.1mol/l甘氨酸-HCl缓冲液逐步洗脱吸附的蛋白质。当树脂暴露在乙酸盐缓冲液(50mM，pH＝4，5)中、使用4BV/hr流速时，绝大多数吸附的蛋白质从柱中释放出来。
使用BCA和RP-HPLC对获得的级分(起始材料、穿透物和吸附物)进行蛋白质和IgG含量分析。获得的结果示于表1中。
图1示出了穿透曲线，该曲线展示了流过而非与树脂结合的Ig浓度。
对比实例2
重复对比实例1，不同之处在于进行层析前，首先将干酪乳清稀释至干物质含量为6wt％，然后使用TAMI 8kDa陶瓷膜进行错流过滤方法。应用的错流流速为151/min；跨膜压力为1.5巴。这导致渗余物的浓缩系数为4。
将所述渗余物的pH调节至7.0，然后根据实例1进行层析。
获得的结果示于表1中；穿透曲线示于图1中。
实例3
重复对比实例2，不同之处在于用500kD螺旋卷式膜进行错流过滤。总共有400kg的乳清在浓缩物侧循环。以80l/min的错流流速和0.5巴的TMP开始过滤。将产物浓缩至最终体积约为331，并且将获得的浓缩物进行1x33 1份的渗滤。
将所述渗余物的pH调节至7.0，然后根据实例1进行层析。
获得的结果示于表1中；穿透曲线示于图1中。显示了与实例1和2的方法相比，实例3的方法导致显著降低的IgG穿透(即损失)、更高的IgG纯度和更高的产率。因此，对比不过滤的用8kDa膜进行超滤，在层析步骤之前进行根据本发明的错流过滤改善了结合能力、IgG纯度和产率。
表1

Claims (12)

1.一种用于生产富含免疫球蛋白的含乳清蛋白的产品的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)使用截留分子量(MWCO)为500-1000kDa、优选500-800kDa或孔径为50-100nm、优选50-80nm的膜对酪蛋白减少的乳进行错流过滤，从而获得UF渗余物和富含乳糖、盐、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的渗透物，以及
(ii)对所述UF渗余物进行混合模式层析，其中免疫球蛋白粘附到树脂上并随后被洗脱以形成所述富含免疫球蛋白的含乳清蛋白的产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该酪蛋白减少的乳选自酸性乳清、干酪乳清和天然乳清，优选地选自酸性乳清和干酪乳清。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中对步骤(ii)中形成的该含乳清蛋白的产品进行浓缩和/或干燥步骤。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中基于总乳清蛋白，该含乳清蛋白的产品包含至少40wt％、优选地50wt％-80wt％的IgG。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中进行混合模式层析的该渗余物的pH在6.0-8.0的范围内，优选地在6.5-7.5的范围内。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中进行错流过滤前，基于总蛋白，该酪蛋白减少的乳的IgG含量在2.5wt％-10wt％、优选地2.5wt％-5.0wt％的范围内。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(i)中使用的该膜是螺旋卷式膜。
8.一种可以根据前述权利要求中任一项所述获得的含乳清蛋白的产品。
9.根据权利要求8所述的含乳清蛋白的产品，其包含基于总乳清蛋白，至少40wt％、优选地50wt％-80wt％的IgG。
10.一种营养组合物，其包含根据权利要求8或9所述的含乳清蛋白的产品。
11.根据权利要求10所述的营养组合物，其中该营养组合物选自婴儿配方乳、较大婴儿配方乳和成长型乳。
12.一种用于生产根据权利要求10或11所述的营养组合物的方法，该方法通过将根据权利要求8或9所述的含乳清蛋白的产品与至少一种脂肪源、碳水化合物源、维生素和矿物质以及任选地另外的乳品和/或蛋白质源组合来进行。
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