CN117305456A - 一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的分子标志物及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的分子标志物及检测方法，所述分子标志物选自Y染色体的DDX3Y、USP9Y、KDM5D、RPS4Y1、UTY基因中的至少一种。DDX3Y、USP9Y、KDM5D、RPS4Y1和UTY中，低表达患者对比高表达患者，生存风险比以及置信区间均大于1，证明它们与ICIs免疫治疗后，患者的生存密切相关。

Description

一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的分子标志物及检测方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的分子标志物及检测方法。
背景技术
近十年，以免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICIs)为代表的免疫治疗极大地改善了肿瘤患者的生存。目前，ICIs免疫疗法已彻底变革多种实体瘤的治疗模式，其中，PD-1/PD-L1抗体在肺癌、食管癌、头颈部鳞癌、肾癌、肝癌、胃癌等多种实体瘤中表现出显著疗效，ICIs免疫治疗在肿瘤临床实践中取得了令人瞩目的成功。
然而，ICIs免疫治疗其疗效在不同患者中差异显著，目前报道的实体瘤ICIs治疗总体有效率仅20％-30％。患者ICIs治疗是否产生应答，受多方面因素影响，包括肿瘤及治疗相关因素、肿瘤非相关的宿主水平因素以及环境因素等，如肿瘤的分子突变谱与代谢重塑、微环境的免疫与血管重塑特征、肠道微生物以及宿主遗传免疫特征等。
临床诊疗中，ICIs免疫治疗需要高效、便捷的生物标志物，从而及时、精准地识别应答人群，从而避免非应答人群不必要的经济负担、发生irAEs的风险以及病情延误等。
目前，三种标志物用于临床，包括肿瘤PD-L1表达、肿瘤突变负荷(Tumormutationburden，TMB)以及微卫星不稳定(Microsatellite instability，MSI)，然而这三种标志物识别ICIs应答患者的准确性和实用性方面仍存在不足，例如部分PD-L1表达极低或阴性的患者ICIs治疗仍然有效，而部分PD-L1表达高于50％患者却对ICIs无应答，且有研究报道诱导非小细胞肺癌PD-L1过表达可能降低PD-1抗体的疗效；而TMB和MSI也无法充分地识别有效患者。
目前，ICIs疗效的精准预测仍是临床亟待解决的重要问题，大量研究正聚焦于免疫治疗精准分子标志物的筛选，文献报道了肿瘤POLE/POLD1等基因突变、微环境免疫和宿主免疫特征、肿瘤与宿主代谢特征、外周血分泌蛋白及其它循环特征等多方面分子标志物，但是目前在研的标志物均未得临床验证。综上所述，临床仍然缺乏精准高效的标志物及时的识别ICIs治疗有效的患者。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的分子标志物，用于解决现有技术中临床上缺乏精准高效的标志物及时的识别ICIs治疗有效的患者的问题，同时，本发明还将提供一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的检测试剂和检测试剂盒；此外，本发明还将提供一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的检测方法。
为实现上述目的及其他相关目的，
本发明的第一方面，提供一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的分子标志物，所述分子标志物选自Y染色体的DDX3Y、USP9Y、KDM5D、RPS4Y1、UTY基因中的至少一种。
于本发明的一实施例中，所述分子标志物选自Y染色体的DDX3Y、USP9Y、KDM5D、RPS4Y1和UTY基因。
于本发明的一实施例中，所述分子标志物选自Y染色体的DDX3Y、USP9Y、KDM5D、RPS4Y1或UTY基因。
于本发明的一实施例中，所述分子标志物选自Y染色体的DDX3Y和USP9Y。
于本发明的一实施例中，所述USP9Y基因的的上游引物的基因序列如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1序列具有至少90％同一性的同功能序列；所述USP9Y基因的的下游引物的基因序列如SEQ ID NO.2所示，或与SEQ ID NO.2序列具有至少90％同一性的同功能序列；
所述UTY基因的的上游引物的基因序列如SEQ ID NO.3所示，或与SEQ ID NO.3序列具有至少90％同一性的同功能序列；所述UTY基因的的下游引物的基因序列如SEQ IDNO.4所示，或与SEQ ID NO.4序列具有至少90％同一性的同功能序列；
所述KDM5D基因的的上游引物的基因序列如SEQ ID NO.5所示，或与SEQ ID NO.5序列具有至少90％同一性的同功能序列；所述KDM5D基因的的下游引物的基因序列如SEQID NO.6所示，或与SEQ ID NO.6序列具有至少90％同一性的同功能序列；
所述RPS4Y1基因的的上游引物的基因序列如SEQ ID NO.7所示，或与SEQ ID NO.7序列具有至少90％同一性的同功能序列；所述RPS4Y1基因的的下游引物的基因序列如SEQID NO.8所示，或与SEQ ID NO.8序列具有至少90％同一性的同功能序列。
所述DDX3Y基因的的上游引物的基因序列如SEQ ID NO.9所示，或与SEQ ID NO.9序列具有至少90％同一性的同功能序列；所述DDX3Y基因的的下游引物的基因序列如SEQID NO.10所示，或与SEQ ID NO.10序列具有至少90％同一性的同功能序列。
于本发明的一实施例中，所述USP9Y基因的的上游引物的基因序列为与SEQ IDNO.1序列具有至少95％同一性的同功能序列，所述USP9Y基因的的下游引物的基因序列为与SEQ ID NO.2序列具有至少95％同一性的同功能序列；
所述UTY基因的的上游引物的基因序列为与SEQ ID NO.3序列具有至少95％同一性的同功能序列，所述UTY基因的的下游引物的基因序列为与SEQ ID NO.4序列具有至少95％同一性的同功能序列；
所述KDM5D基因的的上游引物的基因序列为与SEQ ID NO.5序列具有至少95％同一性的同功能序列，所述KDM5D基因的的下游引物的基因序列为与SEQ ID NO.6序列具有至少95％同一性的同功能序列；
所述RPS4Y1基因的的上游引物的基因序列为与SEQ ID NO.7序列具有至少95％同一性的同功能序列，所述RPS4Y1基因的的下游引物的基因序列为与SEQ ID NO.8序列具有至少95％同一性的同功能序列；
所述DDX3Y基因的的上游引物的基因序列为与SEQ ID NO.9序列具有至少95％同一性的同功能序列，所述DDX3Y基因的的下游引物的基因序列为与SEQ ID NO.10序列具有至少95％同一性的同功能序列。
本发明的第二方面，提供一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的检测试剂，所述检测试剂包括上述分子标志物。
本发明的第三方面，提供一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述分子标志物，或所述检测试剂盒包括上述检测试剂。
本发明的第四方面，提供一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的检测方法，包括：通过上述分子标志物对样本RNA(患者PBMCs的RNA)进行PCR扩增，检测DDX3Y、USP9Y、KDM5D、RPS4Y1、UTY基因中至少一种的表达量，即可预测肿瘤免疫治疗疗效。
在检测DDX3Y、USP9Y、KDM5D、RPS4Y1、UTY基因的表达量时，使用的方法是RT-PCR,最终得到的是相对表达量。如附图1～3中所示，相对表达量亦可称为相对表达水平，我们的结果直接证明了有疗效的患者这些基因RNA表达水平高(是相对于没有疗效的患者的)，并且生存预后好，反过来说明他是疗效和生存的标志物。RT-PCR相对表达量值大于1为疗效良好。
如上所述，本发明的一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的分子标志物及检测方法，具有以下有益效果：
固有免疫和适应性免疫的性别差异广为人知。相应地，在ICIs免疫治疗临床诊疗中，已经观察到男性比女性疗效更好，而潜在原因知之甚少。我们发现了Y染色体是一个全新的标志物，并提出了一个全新的概念，即Y染色体的缺失可能是女性患者疗效较差的原因，男性患者Y染色体的缺失(LOY)或Y染色体低表达(EDY)是PD-1/PD-L1阻断免疫反应的有用生物标志物和潜在调控者。
此外，我们首次揭示了Y染色体基因表达，包括DDX3Y、USP9Y、KDM5D、RPS4Y1和UTY。DDX3Y低表达患者对比高表达患者，发现集中，log rankp＝0.0304,HR(95％CI):2.137(1.109-6.305)，验证集中，log rankp＝0.0151,HR(95％CI):2.055(1.148-3.205)。USP9Y低表达患者对比高表达患者，发现集中，log rankp＝0.0299,HR(95％CI):2.084(1.084-4.109)，验证集中，log rankp＝0.0083,HR(95％CI):2.045(1.202-3.218)。KDM5D低表达患者对比高表达患者，发现集中，log rankp＝0.0064,HR(95％CI):2.677(1.572-10.250)，验证集中，log rank p＝0.0067,HR(95％CI):1.928(1.222-3.289)。RPS4Y1低表达患者对比高表达患者，发现集中，log rankp＝0.0062,HR(95％CI):2.495(1.430-7.706)，验证集中，log rankp＝0.0135,HR(95％CI):2.061(1.148-3.158)。UTY低表达患者对比高表达患者，发现集中，log rankp＝0.0010,HR(95％CI):3.257(1.619-6.238)。由此可知，DDX3Y、USP9Y、KDM5D、RPS4Y1和UTY中，低表达患者对比高表达患者，生存风险比和置信区间均大于1，证明它们与ICIs免疫治疗后，患者的生存密切相关。
附图说明
图1为发现集中DDX3Y和USP9Y在ICIs免疫治疗的患者中表达水平，蓝色为ICIs免疫治疗中疗效差的患者的表达水平柱状图，红色为ICIs免疫治疗中疗效良好的患者的表达水平柱状图。
图2为验证集中DDX3Y和USP9Y在ICIs免疫治疗的患者中表达水平，蓝色为ICIs免疫治疗中疗效差的患者的表达水平柱状图，红色为ICIs免疫治疗中疗效良好的患者的表达水平柱状图。
图3为DDX3Y和USP9Y在男性患者中的亚组分析，蓝色为ICIs免疫治疗中疗效差的患者的表达水平柱状图，红色为ICIs免疫治疗中疗效良好的患者的表达水平柱状图。
图4为DDX3Y在男性患者中的生存分析图。
图5为USP9Y在男性患者中的生存分析图。
图6为发现集中DDX3Y高表达患者和DDX3Y低表达患者的无进展生存期可能性趋势图。
图7为验证集中DDX3Y高表达患者和DDX3Y低表达患者的无进展生存期可能性趋势图。
图8为发现集中USP9Y高表达患者和USP9Y低表达患者的无进展生存期可能性趋势图。
图9为验证集中USP9Y高表达患者和USP9Y低表达患者的无进展生存期可能性趋势图。
图10为发现集中KDM5D高表达患者和KDM5D低表达患者的无进展生存期可能性趋势图。
图11为验证集中KDM5D高表达患者和KDM5D低表达患者的无进展生存期可能性趋势图。
图12为发现集中RPS4Y1高表达患者和RPS4Y1低表达患者的无进展生存期可能性趋势图。
图13为验证集中RPS4Y1高表达患者和RPS4Y1低表达患者的无进展生存期可能性趋势图。
图14为发现集中UTY高表达患者和UTY低表达患者的无进展生存期可能性趋势图。
图15为分离外周血PBMCs时分层图片。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
临床诊疗中，血液循环标志物优势较明显，血液标本获取简单无创、可实现纵向疗效监测，不依赖组织活检、不受肿瘤异质性影响等，同时外周血不仅客观反映了宿主系统性的免疫状态，而且作为肿瘤免疫周期中重要的一环，与肿瘤免疫密切相关。因此，我们首先建立了两个免疫治疗的临床队列，分别为发现集(N＝55)和验证集(N＝98)，在ICIs治疗前收集外周血标本，分离外周血单个和免疫细胞(PBMCs)，提取总RNA，进行了转录组测序，用于标志物的初步筛选，然后在使用实时荧光定量PCR(RT-PCR)的方法在两个队列中进行标志物的验证，最终筛选出候选标志物，进行生存分析。具体步骤如下：
1.临床研究队列的建立
(1)患者初筛
本研究已在华西医院申请并获得伦理委员会批准[伦理审批号：2019年审(1045)号]。研究纳入2020年5月1日至2021年5月1日期间就诊于四川大学华西医院肿瘤科，且初次使用ICIs免疫治疗的实体瘤患者。
纳入标准：患者纳入需符合以下标准：
①临床诊断明确的实体肿瘤患者；
②既往未使用过任何类型的ICIs单药或联合治疗；
③已进行医患沟通，预计近期将进行初次ICIs免疫治疗；
排除标准：
剔除黑色素瘤、生殖系统肿瘤、结直肠癌患者。
(2)患者随访
第一，1个月随访，即样本收集后1个月内进行治疗方案的随访，剔除由于各种原因最终拒绝ICIs免疫治疗的患者及样本。
第二，周期性随访6个月，记录患者每周期疗效评价结果(RECIST 1.1)，收集患者电子病历信息，并按照如下剔除标准筛选患者。
剔除标准：
①剔除在研究随访期内未遵医嘱规律接受ICIs治疗或失访的患者；
②剔除临床结局不明确、疗效和不良反应分组不确切的患者；
③剔除疗效评价为超进展的患者；
④剔除病历记录不完整的患者。
研究终点：参考既往研究，在疗效标志物研究中，本研究将6个月内疾病进展的患者定义为ICIs治疗非应答组，疾病稳定/部分缓解/全部缓解6个月以上的患者定义为ICIs治疗应答组。
2.样本收集
收集患者接受ICIs治疗前1周内的外周血样本共4-5mL。
3.分离外周血PBMCs
(1)取15mL离心管，淋巴细胞分离液体积：血液体积＝1：1，先后加入离心管，使外周血悬浮于Ficoll表面，500g，升速2，降速2，常温离心30min；
(2)如图15分层，主要分为4层，包括血浆层、白膜层(PBMCs)、Ficoll层、红细胞和多核细胞层(粒细胞细胞层)。
(3)缓慢仔细地将第二层白色膜状PBMCs移入一个新的15mL离心管中，加入10mLPBS溶液洗涤，3000rpm，常温离心5min，去上清，用1mLTrizol重悬于2mL EP管内，保存于-80℃，即得PBMCs Trizol样本。
4.RNA提取：酚-氯仿法
(1)取出冻存于-80℃的PBMCs Trizol样本，常温溶解5-10min；
(2)加200μL氯仿/1mLTrizol，上下颠倒，共10-15次，常温静置2-3分钟，离心机4℃预冷，12000g，离心15min，观察到各相的分层。从上至下包括无色水相、中间层和酚-氯仿相，RNA溶解于无色水相、约600μL-700μL，DNA溶解于中间层，酚-氯仿相主要为有机溶剂；
(3)将无色水相移入一个新的2mL EP管内，加入500μL异丙醇/1mLTrizol，常温下静置10min，12000g，4℃离心10min，去除上清液，沉淀即为RNA；
(4)75％乙醇2次洗涤RNA沉淀，晾干；
(5)用去除RNA酶的水溶解RNA沉淀，55-60℃溶解5-10min，混匀，Nanodrop检测浓度并记录，于-80℃保存。
5.RNA质控
(1)NanoDrop 2000检测RNA浓度、OD260/280比值以及OD260/230比值，反映RNA的含量及提取的纯度。浓度≥70ng/μL，总量≥2μg的RNA样品满足实验需求，单次建库用量1μg；OD260/280值在1.8-2.0范围内，OD260/230值在2.0-2.5范围内，视为RNA样品的纯度高，无蛋白质和碳水化合物的污染。
(2)RNA质量分析：利用Agilent 2100生物分析仪的电泳胶图和电泳谱图，进行RNA完整性分析。采用RIN值≥8且28S/18S≥1.5，表示RNA无明显降解。
6.RNA链特异性文库构建与转录组测序(RNAsequencing，RNA-seq)
(1)mRNA纯化：细胞总RNA中大部分为rRNA，少部分为RNA-seq所测定的mRNA，因此首先利用mRNA具有多腺苷酸尾部(ployA)的修饰特性将其纯化分离，应用携带ploy T探针的磁珠与样品杂交，吸附mRNA，然后将磁珠清洗去除，获得总mRNA；
(2)mRNA片段化：用Illumina建库试剂盒(RS-122-2101)中的Fragment,Prime,Finish Mix试剂将mRNA打成短序列；
(3)双链cDNA的合成：分步骤进行逆转录，第一步用一链cDNA反应混合物和逆转录酶，第二步加入二链cDNA反应混合物；
(4)末端修复、加Adaptor：双链cDNA 3’端加A，5’端修复，加“Y”字形的Adaptor，结构上包括测序引物结合序列、桥式PCR结合序列以及6-8个碱基组成的barcode序列；
(5)DNA片段大小的选择：在上述多步骤反应中，由于多种原因可能会导致过长片段和短小片段的产生。小片段RNA偏短，测序时会被测通，产出的冗余数据较多，严重影响有效数据的占比；而大片段RNA过长，测序时无法测通，影响测序数据的产出和质量；因此，要用AMPure XP beads进行DNA片段大小的选择；cDNA片段扩增、纯化及文库质检，本研究分析文库的长度及质量是否满足测序要求。
(7)RNA-seq：Ilumina NovaSeq 6000边扩增边测序，目标数据6G。
7.RNA-seq原始数据的初步生物信息学分析，形成标准化表达矩阵
Ilumina NovaSeq 6000测序获得的原始数据，称为RawData或者RawReads，以FastQ文件存储输出，使用服务器打开，文件包括每条reads的基本描述、碱基序列和测序质量。由于测序仪稳定性、测序试剂、样本因素等多方面的原因，RawData中包含部分错误信息，为排除其影响，进行如下处理：
(1)数据质控与数据过滤：使用Trimmomatic软件，去除非基因组序列如reads上的接头序列(Adaptor)，去除低质量碱基含量过多(＞50％)以及未知碱基含量过多(＞10％)的reads，去除重复序列，去除插入片段过长的序列，将raw data变为clean data，并统计每个样本数据过滤前后的reads数和碱基量、有效数据量、GC含量、碱基质量比例(Q30：错误率小于0.1％、准确率高于99.9％的碱基比例)等；
(2)reads比对、基因注释：将clean reads与human reference序列比对(HISAT2)，得到每条reads的基因组位置，形成bam文件，统计比对信息，包括：比对上的reads数(mapped reads)，比对率、多个位置reads数与比例、唯一位置reads比例，正负链reads比例等；然后bam文件的位置信息对应到某个基因，获得基因位置的注释信息，以GTF文件输出，包含信息：序列名称、注释来源、染色体编号、起始位点和结束位点、正负链、注释得分、序列属性、注释信息等；
(3)基因表达量计算分析：利用HTseq-count软件，进行基因表达量的初步计算，即利用前已获得的基因注释信息(GTF文件)，计算相应reads数，统计为counts值；根据FPKM校正算法标准化公式计算表达量：
FPKM(A基因)＝比对到A基因的reads数/(比对到所有基因的reads总数×A基因的长度)×109
使用cufflinks软件计算基因表达量FPKM值，reads总数为比对后统计的mappedreads，基因长度利用GenomicFeatures包来获得，得到基因表达tab文件，合并多个样本tab文件，得到标准化的表达矩阵。
8.RNA-seq数据分析与差异标志物的筛选
(1)数据结果质控分析：利用R软件进行发现集全样本未分组的PCA分析，绘制二维和三维PCA图，所有基因FPKM箱线图及密度分布曲线图，观察图形分布，进行后续分析。
(2)基因差异表达分析：分别利用R语言DESeq R包、EdgeR包以及limma_voom包的算法进行差异分析，首先删除在一半以上样本中counts数为0的基因，再进行后续的差异分析。在DESeq R包中，用estimateSizeFactors函数对每个样本基因的counts数目进行归一化处理，消除不同样本数据量不同造成的影响，计算每个样本的sizefactor(该值与每个样本的测序数据量线性相关)，用counts/sizefactor值表示某基因在该样本中归一化后的表达量，通过BaseMean值(即counts/sizefactor在组内的均值)，利用nbinomTest函数，计算基因在不同比较组间的FC值，对归一化后counts进行差异显著性负二项分布检验，计算P值。在EdgeR包中，用calcNormFactors函数计算标准化因子，用counts/标准化因子表示某基因在该样本中标准化后的表达量。Limma包也是通过calcNormFactors函数计算标准化因子，然后再经过voom转换，随后计算FC值及P值。三种算法均根据FC值＞1.3及P值＜0.05的原则初步筛选差异基因，分别以log2(FC)为X轴，-log10(Pvalue)为Y轴，绘制火山图，以及不同样本差异基因表达聚类热图，统计不同比较组上调和下调的差异基因数量，对三种算法筛选出的差异基因取交集，绘制韦恩图，形成差异基因集，并绘制交集差异基因聚类热图。
(3)候选差异基因筛选：基于交集差异基因，进一步选择至少有一组FPKM平均值大于3的基因，进行RNA-seq与qPCR检测的一致性验证。经过筛选即得Y染色体的基因可以预测ICIs免疫治疗患者的应答效应以及生存预后，具体包括DDX3Y,USP9Y,KDM5D,RPS4Y1,UTY。
9.反转录PCR
(1)去除基因组DNA(gDNA)反应：
去除gDNA反应体系
反应条件：常温，5min
(2)逆转录反应：
逆转录反应体系
反应条件：37℃，15min
85℃，5sec
4℃，∞
cDNA产物储存于-20℃冰箱备用。
10.实时荧光定量PCR(RT-PCR)
使用购于成都微克公司的TBPremix Ex TaqTMII试剂盒(Takara，日本)，利用QuantStudio5仪器进行RT-PCR反应。
RT-PCR反应体系
反应条件：Hold Stage：95℃，30sec
PCR Stage：95℃，5sec；60℃，34sec；(40×)
Melt Curve Stage：95℃，15sec；60℃，1min；95℃，1sec。
扩增结果显示溶解曲线PCR产物单峰，导出数据进行Ct值计算分析，采用2(-ΔΔCt)方法计算RNA相对表达量，△Ct＝Ct(目的基因)－Ct(参考基因)，2(-ΔΔCt)＝2(-ΔCt)/Average[2(-ΔCt)(对照组所有样本)]。
本研究中所有的RT-PCR引物用防降解液溶解，工作浓度为10uM。引物序列如下：
其中，ACTB不是靶基因，是内部参考基因。DDX3Y、USP9Y、KDM5D、RPS4Y1、UTY是靶基因。
11.统计分析
连续型变量在统计上用均数±标准差(SD)来描述，采用Student’s t检验计算组间差异；分类变量用频率和百分比来描述，卡方检验计算组间差异。使用survival和survminer R软件包进行生存分析。采用log-rank检验评价显著性，采用风险比(HR)评价PFS的风险。所有分析均在R(4.2.1版本)和GraphPad Prism(6.01版本)中进行。
Y染色体的基因可以预测ICIs免疫治疗患者的应答效应以及生存预后，从图1到11可以看出Y染色体的基因中DDX3Y、USP9Y、KDM5D、RPS4Y1、UTY可以预测ICIs免疫治疗患者的应答效应以及生存预后，DDX3Y、USP9Y、KDM5D、RPS4Y1、UTY与患者免疫治疗后的生存预后密切相关，可用于预测ICIs治疗效果。
图1为发现集中DDX3Y和USP9Y在ICIs免疫治疗的患者中表达水平，蓝色为ICIs免疫治疗中疗效差的患者的表达水平柱状图，红色为ICIs免疫治疗中疗效良好的患者的表达水平柱状图。从图1中可以看出，在发现集中，DDX3Y和USP9Y在ICIs免疫治疗疗效良好患者中的表达显著高于疗效差的患者。
图2为验证集中DDX3Y和USP9Y在ICIs免疫治疗的患者中表达水平，蓝色为ICIs免疫治疗中疗效差的患者的表达水平柱状图，红色为ICIs免疫治疗中疗效良好的患者的表达水平柱状图。从图2中可以看出，在验证集中，DDX3Y和USP9Y在ICIs免疫治疗疗效良好患者中的表达显著高于疗效差的患者。
图3为DDX3Y和USP9Y在男性患者中的亚组分析，蓝色为ICIs免疫治疗中疗效差的患者的表达水平柱状图，红色为ICIs免疫治疗中疗效良好的患者的表达水平柱状图。从图3中可以看出，通过在男性患者中的亚组分析，排除性别相关因素的影响，证明了DDX3Y和USP9Y在不同ICIs免疫治疗疗效患者中的差异。
图4为DDX3Y在男性患者中的生存分析图。图5为USP9Y在男性患者中的生存分析图。图5的生存分析也表明，DDX3Y和USP9Y表达高的患者预后良好。
图6为发现集中DDX3Y高表达患者和DDX3Y低表达患者的无进展生存期可能性趋势图。图7为验证集中DDX3Y高表达患者和DDX3Y低表达患者的无进展生存期可能性趋势图。从图6和图7中可知，在发现集和验证集中，证明DDX3Y表达高的患者ICIs免疫治疗后的疾病进展风险较低，疾病无进展生存期较长，疗效较好。
图8为发现集中USP9Y高表达患者和USP9Y低表达患者的无进展生存期可能性趋势图。图9为验证集中USP9Y高表达患者和USP9Y低表达患者的无进展生存期可能性趋势图。从图8和图9中可知，在发现集和验证集中，证明USP9Y表达高的患者ICIs免疫治疗后的疾病进展风险较低，疾病无进展生存期较长，疗效较好。
图10为发现集中KDM5D高表达患者和KDM5D低表达患者的无进展生存期可能性趋势图。图11为验证集中KDM5D高表达患者和KDM5D低表达患者的无进展生存期可能性趋势图。从图10和图11可知，在发现集和验证集中，证明KDM5D表达高的患者ICIs免疫治疗后的疾病进展风险较低，疾病无进展生存期较长，疗效较好。
图12为发现集中RPS4Y1高表达患者和RPS4Y1低表达患者的无进展生存期可能性趋势图。图13为验证集中RPS4Y1高表达患者和RPS4Y1低表达患者的无进展生存期可能性趋势图。从图12和图13可知，在发现集和验证集中，证明RPS4Y1表达高的患者ICIs免疫治疗后的疾病进展风险较低，疾病无进展生存期较长，疗效较好。
图14为发现集中UTY高表达患者和UTY低表达患者的无进展生存期可能性趋势图。在发现集中，证明UTY表达高的患者ICIs免疫治疗后的疾病进展风险较低，疾病无进展生存期较长，疗效较好。
综上所述，本发明中DDX3Y、USP9Y、KDM5D、RPS4Y1和UTY中，低表达患者对比高表达患者，生存风险比以及置信区间范围均大于1，证明它们与ICIs免疫治疗后，患者的生存密切相关。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (8)

1.一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物选自Y染色体的DDX3Y、USP9Y、KDM5D、RPS4Y1、UTY基因中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的分子标志物，其特征在于：所述分子标志物选自Y染色体的DDX3Y、USP9Y、KDM5D、RPS4Y1和UTY基因。
3.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的分子标志物，其特征在于：所述分子标志物选自Y染色体的DDX3Y、USP9Y、KDM5D、RPS4Y1或UTY基因。
4.根据权利要求1～3任一项所述的一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的分子标志物，其特征在于：所述USP9Y基因的的上游引物的基因序列如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1序列具有至少90％同一性的同功能序列；所述USP9Y基因的的下游引物的基因序列如SEQID NO.2所示，或与SEQ ID NO.2序列具有至少90％同一性的同功能序列；
所述UTY基因的的上游引物的基因序列如SEQ ID NO.3所示，或与SEQ ID NO.3序列具有至少90％同一性的同功能序列；所述UTY基因的的下游引物的基因序列如SEQ ID NO.4所示，或与SEQ ID NO.4序列具有至少90％同一性的同功能序列；
所述KDM5D基因的的上游引物的基因序列如SEQ ID NO.5所示，或与SEQ ID NO.5序列具有至少90％同一性的同功能序列；所述KDM5D基因的的下游引物的基因序列如SEQ IDNO.6所示，或与SEQ ID NO.6序列具有至少90％同一性的同功能序列；
所述RPS4Y1基因的的上游引物的基因序列如SEQ ID NO.7所示，或与SEQ ID NO.7序列具有至少90％同一性的同功能序列；所述RPS4Y1基因的的下游引物的基因序列如SEQ IDNO.8所示，或与SEQ ID NO.8序列具有至少90％同一性的同功能序列。
所述DDX3Y基因的的上游引物的基因序列如SEQ ID NO.9所示，或与SEQ ID NO.9序列具有至少90％同一性的同功能序列；所述DDX3Y基因的的下游引物的基因序列如SEQ IDNO.10所示，或与SEQ ID NO.10序列具有至少90％同一性的同功能序列。
5.根据权利要求4所述的一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的分子标志物，其特征在于：所述USP9Y基因的的上游引物的基因序列为与SEQ ID NO.1序列具有至少95％同一性的同功能序列，所述USP9Y基因的的下游引物的基因序列为与SEQ ID NO.2序列具有至少95％同一性的同功能序列；
所述UTY基因的的上游引物的基因序列为与SEQ ID NO.3序列具有至少95％同一性的同功能序列，所述UTY基因的的下游引物的基因序列为与SEQ ID NO.4序列具有至少95％同一性的同功能序列；
所述KDM5D基因的的上游引物的基因序列为与SEQ ID NO.5序列具有至少95％同一性的同功能序列，所述KDM5D基因的的下游引物的基因序列为与SEQ ID NO.6序列具有至少95％同一性的同功能序列；
所述RPS4Y1基因的的上游引物的基因序列为与SEQ ID NO.7序列具有至少95％同一性的同功能序列，所述RPS4Y1基因的的下游引物的基因序列为与SEQ ID NO.8序列具有至少95％同一性的同功能序列；
所述DDX3Y基因的的上游引物的基因序列为与SEQ ID NO.9序列具有至少95％同一性的同功能序列，所述DDX3Y基因的的下游引物的基因序列为与SEQ ID NO.10序列具有至少95％同一性的同功能序列。
6.一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括权利要求1～5任一项所述的分子标志物。
7.一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1～6任一项所述的分子标志物，或所述检测试剂盒包括权利要求6所述的检测试剂。
8.一种用于肿瘤免疫治疗疗效预测的检测方法，其特征在于，包括：通过权利要求1～5任一项所述的分子标志物对样本RNA进行PCR扩增，检测DDX3Y、USP9Y、KDM5D、RPS4Y1、UTY基因中至少一种的表达量，即可预测肿瘤免疫治疗疗效。
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