CN117304491B - 一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117304491B CN117304491B CN202311396248.XA CN202311396248A CN117304491B CN 117304491 B CN117304491 B CN 117304491B CN 202311396248 A CN202311396248 A CN 202311396248A CN 117304491 B CN117304491 B CN 117304491B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hemoglobin
- molecularly imprinted
- imprinted polymer
- preparation
- mips
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 title claims abstract description 116
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 title claims abstract description 116
- 229920000344 molecularly imprinted polymer Polymers 0.000 title claims abstract description 78
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 17
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 17
- 239000010703 silicon Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N Tetraethyl orthosilicate Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)OCC BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims abstract description 15
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 12
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 claims description 16
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 claims description 16
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 16
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 15
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- CPLASELWOOUNGW-UHFFFAOYSA-N benzyl(triethoxy)silane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CC1=CC=CC=C1 CPLASELWOOUNGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 10
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 9
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N hydrochloric acid Substances Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 55
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 abstract description 27
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 12
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- ALVYUZIFSCKIFP-UHFFFAOYSA-N triethoxy(2-methylpropyl)silane Chemical compound CCO[Si](CC(C)C)(OCC)OCC ALVYUZIFSCKIFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- XQGWAPPLBJZCEV-UHFFFAOYSA-N triethoxy(propyl)silane;urea Chemical compound NC(N)=O.CCC[Si](OCC)(OCC)OCC XQGWAPPLBJZCEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 4
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 4
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 3
- WBAREYVEDXIUGW-UHFFFAOYSA-N triethoxysilylurea Chemical compound CCO[Si](NC(N)=O)(OCC)OCC WBAREYVEDXIUGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 2
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 108010031480 Artificial Receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006068 polycondensation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000003980 solgel method Methods 0.000 description 1
- 238000002336 sorption--desorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G77/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing silicon with or without sulfur, nitrogen, oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule
- C08G77/04—Polysiloxanes
- C08G77/06—Preparatory processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J9/00—Working-up of macromolecular substances to porous or cellular articles or materials; After-treatment thereof
- C08J9/26—Working-up of macromolecular substances to porous or cellular articles or materials; After-treatment thereof by elimination of a solid phase from a macromolecular composition or article, e.g. leaching out
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2383/00—Characterised by the use of macromolecular compounds obtained by reactions forming in the main chain of the macromolecule a linkage containing silicon with or without sulfur, nitrogen, oxygen, or carbon only; Derivatives of such polymers
- C08J2383/04—Polysiloxanes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2383/00—Characterised by the use of macromolecular compounds obtained by reactions forming in the main chain of the macromolecule a linkage containing silicon with or without sulfur, nitrogen, oxygen, or carbon only; Derivatives of such polymers
- C08J2383/04—Polysiloxanes
- C08J2383/08—Polysiloxanes containing silicon bound to organic groups containing atoms other than carbon, hydrogen, and oxygen
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物及其制备方法和应用，属于分离纯化技术领域。本发明以正硅酸乙酯作为交联剂，以吐温溶液为反应溶液和乳化剂，并通过限定共功能单体的种类可增强结合作用，使模板血红蛋白分子可以稳固印迹到聚合物上；本发明制备的分子印迹聚合物表面富含空穴，具有良好的吸附性能与优良的特异性。本发明提供的方法操作简单，步骤少，制备周期短，且不需要任何酸碱催化剂，反应条件温和，在将制备的血红蛋白分子印迹聚合物用于牛血中分离血红蛋白时，具有快速且选择性良好的特点。
Description
技术领域
本发明涉及分离纯化技术领域，尤其涉及一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白质是包括人类在内的各种生物有机体的重要组成成分，是生命的物质基础之一。因此，蛋白质是揭示生命活动现象和分子生物学机理的重要研究对象。而获得高质量、高纯度以及高天然保真性的蛋白质是科研中的关键环节，所以将蛋白质从复杂的生物液体中分离纯化出来至关重要。然而传统分离纯化蛋白质的方法步骤繁琐，选择性较差。
蛋白质印迹聚合物作为一种新型的能够识别蛋白质的人工受体，在蛋白质的表达与纯化方面发挥了重要作用。以二氧化硅纳米颗粒为基础的分子印迹聚合物在蛋白质等大分子印迹中有很好的识别应用，但在传统的溶胶-凝胶法制备二氧化硅纳米颗粒中，有机试剂和酸碱催化剂是必不可少的，这种条件易使蛋白质变性失活，进而导致蛋白质印迹聚合物的识别性能下降，传统方法存在步骤多、制备周期长的问题，限制了此类蛋白质印迹聚合物的应用。
因此，亟需提供一种步骤少、制备周期短、反应条件温和的分子印迹聚合物制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物及其制备方法和应用。本发明提供的制备方法步骤少、制备周期短、反应条件温和。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将共功能单体、正硅酸乙酯、吐温溶液和血红蛋白混合进行聚合反应，得到悬浊液；
所述共功能单体为氨丙基三乙氧基硅烷、苄基三乙氧基硅烷、脲丙基三乙氧基硅烷和异丁基三乙氧基硅烷一种或多种；
(2)将所述步骤(1)得到的悬浊液依次进行固液分离和洗脱，得到血红蛋白分子印迹聚合物；
所述洗脱采用的洗脱液包括0.5～10％SDS-冰醋酸、甲醇-冰醋酸、0.5～10％SDS-盐酸或NaCl溶液。
优选地，所述步骤(1)中的吐温溶液为0.1～2％吐温-20。
优选地，所述步骤(1)中的共功能单体和正硅酸乙酯的体积之比为1:(2～10)。
优选地，所述步骤(1)中的血红蛋白的质量与共功能单体的体积之比为(100～400)mg:(50～400)μL。
优选地，所述步骤(1)中的混合在震荡下进行。
优选地，所述步骤(1)中聚合反应的温度为4～40℃。
优选地，所述聚合反应的时间为2～12h。
本发明还提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的血红蛋白分子印迹聚合物。
本发明还提供了上述技术方案所述的血红蛋白分子印迹聚合物在分离血红蛋白中的应用。
本发明提供了一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：将共功能单体、正硅酸乙酯、吐温溶液和血红蛋白混合进行聚合反应，得到悬浊液；所述共功能单体为氨丙基三乙氧基硅烷、苄基三乙氧基硅烷、脲丙基三乙氧基硅烷和异丁基三乙氧基硅烷一种或多种；将所述悬浊液依次进行固液分离和洗脱，得到血红蛋白分子印迹聚合物；所述洗脱采用的洗脱液包括0.5～10％SDS-冰醋酸、甲醇-冰醋酸、0.5～10％SDS-盐酸或NaCl溶液。本发明以正硅酸乙酯作为交联剂，以吐温溶液为反应溶液和乳化剂，并通过限定共功能单体种类可增强血红蛋白和聚合物之间的结合作用，使模板血红蛋白稳固地印迹到聚合物上；本发明制备的分子印迹聚合物表面富含空穴，具有良好的吸附性能与优良的特异性。本发明提供的方法操作简单，步骤少，制备周期短，且不需要任何酸碱催化剂，反应条件温和。实施例结果显示，本发明制备的血红蛋白分子印迹聚合物用于牛血中分离血红蛋白时，在反应2h的情况下能够选择性地从牛血中分离出血红蛋白，具有快速且选择性良好的性质。
附图说明
图1为血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)和非分子印迹聚合物(Hb-NIPs)SEM图；
图2为血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)与非分子印迹聚合物(Hb-NIPs)制备的功能单体用量条件优化图；
图3为血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)制备的模版蛋白用量条件优化图；
图4为血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)与非分子印迹聚合物(Hb-NIPs)等温吸附曲线图；
图5为血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)与非分子印迹聚合物(Hb-NIPs)Langmuir模型拟合图；
图6为为血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)与非分子印迹聚合物(Hb-NIPs)Freundlich模型拟合图；
图7为血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)与非分子印迹聚合物(Hb-NIPs)动力学吸附曲线图；
图8为血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)与非分子印迹聚合物(Hb-NIPs)一级动力学模型拟合图；
图9为血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)与非分子印迹聚合物(Hb-NIPs)二级动力学模型拟合图；
图10为血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)与非分子印迹聚合物(Hb-NIPs)选择性吸附图；
图11为血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)的重复利用性图；
图12为分子印迹聚合物在牛血中分离血红蛋白的应用效果图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将共功能单体、正硅酸乙酯、吐温溶液和血红蛋白混合进行聚合反应，得到悬浊液；
所述共功能单体为氨丙基三乙氧基硅烷、苄基三乙氧基硅烷、脲丙基三乙氧基硅烷和异丁基三乙氧基硅烷一种或多种；
(2)将所述悬浊液依次进行固液分离和洗脱，得到血红蛋白分子印迹聚合物；
所述洗脱采用的洗脱液包括0.5～10％SDS-冰醋酸、甲醇-冰醋酸、0.5～10％SDS-盐酸或NaCl溶液。
本发明将共功能单体、正硅酸乙酯、吐温溶液和血红蛋白混合，进行聚合反应，得到悬浊液。
在本发明中，所述共功能单体为氨丙基三乙氧基硅烷、苄基三乙氧基硅烷、脲丙基三乙氧基硅烷和异丁基三乙氧基硅烷一种或多种，优选为氨丙基三乙氧基硅烷、苄基三乙氧基硅烷、脲丙基三乙氧基硅烷和异丁基三乙氧基硅烷中的一种或两种，更优选为由氨丙基三乙氧基硅烷和苄基三乙氧基硅烷组成或者由脲丙基三乙氧基硅烷和异丁基三乙氧基硅烷组成；所述氨丙基三乙氧基硅烷和苄基三乙氧基硅烷的体积之比优选为3:1～1:3，更优选为3:1、1:1或1:3，进一步优选为1:1；所述脲丙基三乙氧基硅烷和异丁基三乙氧基硅烷的体积之比优选为3:1～1:3，更优选为3:1、1:1或1:3，进一步优选为1:1。本发明采用上述共功能单体可加强血红蛋白和聚合物之间的结合作用，使模板血红蛋白稳固印迹到聚合物上；当共功能单体的体积之比为上述范围时，能够提高血红蛋白分子印迹聚合物结构的稳定性。
在本发明中，所述正硅酸乙酯作为交联剂；所述正硅酸乙酯的化学结构中含有硅酸酯键，这种键能够与共功能单体中的硅酸酯键发生水解缩聚反应形成交联网络结构，提高聚合物结构的稳定性。
在本发明中，所述功能单体和正硅酸乙酯的体积之比优选为1:(2～10)，更优选为1:(4～6)。本发明将功能单体和正硅酸乙酯的体积之比控制在上述范围能够提高血红蛋白分子印迹聚合物的吸附性。
在本发明中，所述吐温溶液优选为0.1～2％吐温-20，更优选为1％吐温-20。本发明以吐温溶液作为反应溶液，且吐温溶液能够作为乳化剂，促进聚合反应充分进行形成稳定的聚合物结构。本发明对吐温溶液的体积没有特殊限定，根据需要进行调整即可。在本发明中，当共功能单体的总体积为200μL时，1％吐温-20的体积优选为20mL。
本发明对所述血红蛋白的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的市售产品或者制备方法获得即可。在本发明中，所述血红蛋白作为模板蛋白分子。
在本发明中，所述血红蛋白的质量与所述共功能单体的体积之比优选为(100～400)mg:(50～400)μL，更优选为(100～300)mg:(100～200)μL，进一步优选为200mg:200μL。本发明将血红蛋白的质量与共功能单体的体积控制在上述范围血红蛋白分子印迹聚合物的吸附量较大。
在本发明中，所述共功能单体、正硅酸乙酯、吐温溶液和血红蛋白的混合优选在震荡下进行。本发明对所述震荡的参数没有特殊限定，能够将上述组分充分混合均匀即可。
在本发明中，所述聚合反应的温度优选为4～40℃，更优选为23～25℃；所述聚合反应的时间优选为2～12h，更优选为2～6h。本发明将聚合反应的温度和时间控制在上述范围能够促进功能单体充分反应。在本发明中，所述聚合反应优选在震荡下进行，本发明在震荡下进行聚合反应能够促进各组分混合均匀，并促使聚合反应充分进行。
得到悬浊液后，本发明将所述悬浊液依次进行固液分离和洗脱，得到血红蛋白分子印迹聚合物。
本发明对所述固液分离的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离的方法即可。在本发明中，所述固液分离的方法优选为离心。
本发明对所述洗脱的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的洗脱的方法即可。在本发明中，所述洗脱能够去除聚合物上的模板血红蛋白分子，形成印迹。
在本发明中，所述洗脱采用的洗脱液包括0.5～10％SDS-冰醋酸、甲醇-冰醋酸、0.5～10％SDS-盐酸或NaCl溶液，优选为2％SDS-冰醋酸或2～10％甲醇-冰醋酸；所述NaCl溶液的浓度优选为50％。本发明采用上述洗脱液能够充分去除印迹上的模板血红蛋白分子。
本发明还提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的血红蛋白分子印迹聚合物。本发明提供的血红蛋白分子印迹聚合物由于采用正硅酸乙酯作为交联剂，所述共功能单体为氨丙基三乙氧基硅烷、苄基三乙氧基硅烷、脲丙基三乙氧基硅烷和异丁基三乙氧基硅烷一种或多种，此共功能单体可加强蛋白质和聚合物之间的结合作用，使模板血红蛋白分子可以稳固印迹到聚合物上，得到的血红蛋白分子印迹聚合物表面富含空穴，具有良好的吸附性能与优良的特异性。
本发明还提供了上述技术方案所述的血红蛋白分子印迹聚合物在牛血中分离血红蛋白中的应用。本发明对所述血红蛋白分子印迹聚合物在牛血中分离血红蛋白中应用的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的血红蛋白分子印迹聚合物分离提纯血红蛋白的方法即可。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物的制备方法，步骤为：
(1)将100mg的血红蛋白溶解在20mL 1％的吐温-20里，加入800μL的正硅酸乙酯，摇匀使其均匀分散在吐温-20中；将溶液转移至50mL离心管，并依次加入100μL的APTES和100μL的BnTES进行震荡使各组分混合均匀，震荡结束后将离心管在摇床中继续震荡，在25℃下反应2h，得到悬浊液；其中：APTES和BnTES的体积之比为1:1；共功能单体和正硅酸乙酯的体积之比为1:4；血红蛋白的质量与共功能单体的体积之比为100mg:200μL；
(2)将所述步骤(1)得到的悬浊液混合进行离心，将离心得到的固体溶解在2％SDS-冰醋酸洗脱液中，震荡48h，重复进行离心和将离心得到的固体分散在2％SDS-冰醋酸中的操作5次，去除印迹上的模板血红蛋白分子，得到血红蛋白分子印迹聚合物，简称Hb-MIPs。
实施例2
一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物的制备方法，步骤为：与实施例1不同之处在于步骤(1)中APTES和BnTES的体积之比为3:1，其余步骤与实施例1相同。
实施例3
一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物的制备方法，步骤为：与实施例1不同之处在于步骤(1)中APTES和BnTES的体积之比为1:3，其余步骤与实施例1相同。
实施例4
一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物的制备方法，步骤为：与实施例1不同之处在于步骤(1)中血红蛋白的质量与共功能单体的体积之比为12.5mg:200μL，其余步骤与实施例1相同。
实施例5
一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物的制备方法，步骤为：与实施例1不同之处在于步骤(1)中血红蛋白的质量与共功能单体的体积之比为25mg:200μL，其余步骤与实施例1相同。
实施例6
一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物的制备方法，步骤为：与实施例1不同之处在于步骤(1)中血红蛋白的质量与共功能单体的体积之比为50mg:200μL，其余步骤与实施例1相同。
实施例7
一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物的制备方法，步骤为：与实施例1不同之处在于步骤(1)中血红蛋白的质量与共功能单体的体积之比为200mg:200μL，其余步骤与实施例1相同。
实施例8
一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物的制备方法，步骤为：与实施例1不同之处在于步骤(1)中血红蛋白的质量与共功能单体的体积之比为400mg:200μL，其余步骤与实施例1相同。
对比例1
一种印迹聚合物的制备方法，步骤为：
(1)向20mL 1％的吐温-20中加入800μL的正硅酸乙酯，摇匀使其均匀分散在吐温-20中；将溶液转移至50mL离心管，并依次加入100μL的APTES和100μL的BnTES进行震荡，震荡结束后将放入摇床中，在25℃下继续反应2h，得到悬浊液；其中APTES和BnTES的体积之比为1:1；共功能单体和正硅酸乙酯的体积之比为1:4；
(2)将所述步骤(1)得到的悬浊液混合进行离心，得到分子印迹聚合物，简称Hb-NIPs。
对比例2
一种印迹聚合物的制备方法，步骤为：与对比例1不同之处在于采用APTES和BnTES的体积之比为3:1，其余步骤与对比例1相同。
对比例3
一种印迹聚合物的制备方法，步骤为：与对比例1不同之处在于采用APTES和BnTES的体积之比为1:3，其余步骤与对比例1相同。
对比例4
一种印迹聚合物的制备方法，步骤为：与对比例1不同之处在于步骤(1)中血红蛋白的质量与共功能单体的体积之比为12.5mg:200μL，其余步骤与对比例1相同。
对比例5
一种印迹聚合物的制备方法，步骤为：与对比例1不同之处在于步骤(1)中血红蛋白的质量与共功能单体的体积之比为25mg:200μL，其余步骤与对比例1相同。
对比例6
一种印迹聚合物的制备方法，步骤为：与对比例1不同之处在于步骤(1)中血红蛋白的质量与共功能单体的体积之比为50mg:200μL，其余步骤与对比例1相同。
对比例7
一种印迹聚合物的制备方法，步骤为：与对比例1不同之处在于步骤(1)中血红蛋白的质量与共功能单体的体积之比为200mg:200μL，其余步骤与对比例1相同。
对比例8
一种印迹聚合物的制备方法，步骤为：与对比例1不同之处在于步骤(1)中血红蛋白的质量与共功能单体的体积之比为400mg:200μL，其余步骤与对比例1相同。
测试例1
(1)形貌测试
采用扫描电镜分别对实施例1制备的Hb-MIPs和对比例1制备的Hb-NIPs进行测试，得到SEM图如图1所示，在图1中，A为Hb-MIPs的SEM图，B为Hb-NIPs的SEM图；从图1可以看出，图1A显示了更多的颗粒状骨架结构，而图1B中Hb-NIPs表面较为光滑，没有太多的颗粒孔径。多孔结构有利于增大与模板蛋白的接触面积，可以证明Hb-MIPs具有良好的吸附性能。
(2)吸附性能评价
在2mL离心管中进行静态吸附实验：将2mg的分子印迹聚合物分散在300μL血红蛋白溶液(400μg/mL,PBS溶)中；室温下反应2h后，通过离心分离Hb-MIPs纳米颗粒；然后采用BCA法在测定上清液中Hb(Ce，μg/mL)的平衡浓度；
通过式(I)和式(II)计算：
在式(I)中，Qe为吸附量(μg/mg)，C0为原Hb溶液的浓度(μg/mL)，Ce为吸附平衡后上清液中Hb溶液的浓度(μg/mL)，V为反应溶液的体积(mL)，m为印迹聚合物的质量(mg)；
式(II)中，IF为印迹因子，Q1为分子印迹聚合物Hb-MIPs平衡时的吸附量(μg/mg)，Q2为非分子印迹聚合物Hb-NIPs平衡时的吸附量(μg/mg)。
分别将实施例1～3制备的Hb-MIPs和对比例1～3制备的Hb-NIPs采用上述方法进行静态吸附实验，并计算得到血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)与非分子印迹聚合物(Hb-NIPs)，制备的功能单体用量条件优化图如图2所示。从图2可以看出，APTES和BnTES的体积之比直接影响印迹因子，当APTES:BnTES＝1:1时，印迹因子的数值最大。
分别将实施例1、4～8制备的Hb-MIPs和对比例1、4～8制备的Hb-NIPs采用上述方法进行静态吸附实验，并计算得到血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)制备的模版蛋白用量条件优化图如图3所示。从图3可以看出，Hb-MIPs的吸附能力随着模板血红蛋白含量的增加而增加，当模板血红蛋白为200mg时，吸附量达到最大，400mg时开始成下降趋势，对此解释的原因可能是随着模板蛋白含量的增加，特异性识别腔数量也随之增加，使吸附量呈不断上升趋势，当模板蛋白的含量达到200mg时，印迹位点饱和。此时继续增加模板蛋白的含量会使印迹位点的数量远远小于吸附蛋白的量，导致以400mg为模板的Hb-MIPs小于以200mg为模板的Hb-MIPs，因此，当血红蛋白的质量与共功能单体的体积之比为(100～300)mg:200μL时，印迹位点较多，对血红蛋白的吸附量较大。
(3)等温吸附实验
为了评价Hb-MIPs和Hb-NIPs的结合等温线，取8份2mg的实施例1制备的Hb-MIPs分别加入到8个2mL离心管中，编号为1～8，然后依次向编号为1～8的离心管中分别加入1mL血红蛋白浓度为200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL和900μg/mL的血红蛋白溶液，然后在室温下反应2h，确保吸附平衡，随后对各离心管进行离心，取上清液采用BCA法测蛋白含量；以对比例1制备的Hb-NIPs采用同样的方法另做一组实验，探究Hb-NIPs的结合等温线。得到血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)与非分子印迹聚合物(Hb-NIPs)等温吸附曲线图如图4所示。从图4可以看出，当血红蛋白溶液浓度从200μg/mL增加到900μg/mL时，Hb-MIPs的Q值明显增加，这是因为Hb-MIPs中存在印迹空腔，可以不断吸附蛋白；当浓度为800μg/mL-900μg/mL时，可以看出Q值逐渐趋于平衡，达到最大量，说明所有印迹空腔均被占据；Hb-NIPs的动态曲线虽然吸附能力较低，但具有类似的吸附能力；图中所示Hb-MIPs对Hb的Qmax为400μg/mg，Hb-NIPs的Qmax为113μg/mg；由此表明Hb-MIPs表面的印迹位点适用于血红蛋白。
采用Langmuir与Freundlich两种吸附经典模型拟合平衡数据：
Langmuir与Freundlich两种吸附经典模型吸附平衡常数如表1所示：
表1 Hb-MIPs和Hb-NIPs的吸附平衡常数
lgQe＝mlgCe+lgKF 式(IV)
式(III)和式(IV)中，Qe和Qm分别表示吸附平衡下Hb-MIPs(或Hb-NIPs)(μg/mg)的结合能力和理论最大吸附能力(μg/mg)；Ce表示上清液中血红蛋白的平衡浓度(μg/mL)；KF表示Freundlich吸附常数。Langmuir的吸附曲线如图5所示，Freundlich的吸附曲线如图6所示，Freundlich模型拟合较好，证明Hb-MIPs和Hb-NIPs是多层吸附现象。
(4)吸附动力学
为了评价Hb-MIPs与Hb-NIPs的吸附动力学，将2mg实施例1制备的Hb-MIPs加入到2mL离心管中，该管中包含1mL，浓度为400μg/mL的血红蛋白溶液。然后将离心管密封，置于室温下反应5min、10min、15min、20min、30min、60min、90min、120min、150min、180min、210min；同样，在吸附结束后，采用BCA法测定上清液的蛋白含量，计算平衡吸附能力；以对比例1制备的Hb-NIPs采用同样的方法另做一组实验，探究Hb-NIPs的吸附动力学；Hb-MIPs与Hb-NIPs的动力学常数如表2所示：
表2：Hb-MIPs与Hb-NIPs的动力学常数
血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)与非分子印迹聚合物(Hb-NIPs)动力学吸附曲线图如图7所示。由图7可以看出，在5～60min之内，吸附量随着时间的增加而增加，60min以后逐渐缓慢直至平衡；Hb-NIPs的动态曲线虽然吸附能力较低，但具有类似的吸附能力。
为了进一步了解动态吸附过程，我们采用一级动力学模型和二级动力学模型对实验数据进行了分析，图8为血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)与非分子印迹聚合物(Hb-NIPs)一级动力学模型拟合图；图9为血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)与非分子印迹聚合物(Hb-NIPs)二级动力学模型拟合图。从图8和图9可以发现准二级动力学具有良好的线性关系，吸附能力的差异可以由以下因素来解释：在Hb-MIPs的制备过程中，模版蛋白的成功嵌入与洗脱使得Hb-MIPs具有大量的识别位点，在大小、形状和化学功能上都与吸附蛋白匹配良好；然而，Hb-NIPs中的功能单体保持在无序状态，从而导致模板位点不匹配；另一方面，Hb-MIPs表现出多孔，提供了许多可到达结合位点的途径，而Hb-NIPs表现出无孔的表面结构，导致模板的通道不可接近。
(5)吸附选择性
为了评估Hb-MIPs对Hb的特异性识别能力，我们以牛血清蛋白(BSA)、蛋白酶K(Proteinase K)、转铁蛋白(TRF)过氧化酶(Peroxidase)和细胞色素C(Cyt C)作为对照蛋白进行选择性实验。将2mg实施例1制备的Hb-MIPs加入到2mL离心管中，该管中包含1mL，浓度为400μg/mL的蛋白溶液，室温下反应120min，用BCA法测定上清液中蛋白质的含量；以对比例1制备的Hb-NIPs采用同样的方法另做一组实验，探究Hb-NIPs对Hb的吸附能力。
图10为血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)与非分子印迹聚合物(Hb-NIPs)选择性吸附图，由图10可以看出，Hb-MIPs的吸附能力远远大于Hb-NIPs；同样，与牛血清蛋白(BSA)、蛋白酶K(Proteinase K)、转铁蛋白(TRF)、过氧化酶(Peroxidase)和细胞色素C(CytC)相比，Hb-MIPs则表现出显著的选择性，上述实验结果进一步证实了合成的Hb-MIPs具有从复杂基质中快速选择性分离血红蛋白的巨大潜力。
(6)吸附再生性
将2mg Hb-MIPs和1mL浓度为800μg/mL的血红蛋白溶液在室温下反应120min，然后离心分离Hb-MIPs，用BCA法检测上清液中血红蛋白的含量；分离出来的Hb-MIPs用2％SDS-冰醋酸混合溶液进行洗涤，以确保完全洗净Hb，然后再将回收的Hb-MIPs进行重复结合实验5次。
图11为血红蛋白分子印迹聚合物(Hb-MIPs)的重复利用性图。从图11可以看出，经过5次吸附-解吸过程后，Hb-MIPs的Q值仅下降了24.2％，说明Hb-MIPs的再生性良好，具有良好的重复利用前景。
应用例1
将裂解血用pH＝10，1×pbs等比稀释150倍。在2mL含有血红蛋白的牛血中，加入5mg实施例1制备的Hb-MIPs，室温下反应2h后，离心收集上清液，然后将剩余的Hb-MIPs用2％SDS-冰醋酸进行洗脱，并将洗脱液一并收集起来，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对所得样品进行分析。
图12为分子印迹聚合物在牛血中分离血红蛋白的应用效果图。从图12可以看出，在吸附前，血样在其SDS-PAGE图谱上呈现一系列条带，表明存在许多蛋白质，包括BSA和Hb(泳道1)；泳道2是单纯用血红蛋白的样品做了一组对照。当Hb-MIPs处理后，我们可以观察到Hb的条带相对于泳道1的蛋白条带浅了很多，而其他条带的强度没有明显变化(泳道3)。出现这样的原因可以解释为Hb-MIPs在吸附过程中特异性的吸附了血样中的血红蛋白。从洗脱液的泳道中，仅发现Hb的条带(泳道4)。这些结果均表明Hb-MIPs可以选择性地从牛血中分离Hb。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将共功能单体、正硅酸乙酯、吐温溶液和血红蛋白混合进行聚合反应，得到悬浊液；
所述共功能单体由氨丙基三乙氧基硅烷和苄基三乙氧基硅烷组成，所述氨丙基三乙氧基硅烷和苄基三乙氧基硅烷的体积之比为1:1；
所述聚合反应的温度为4~40℃，所述聚合反应的时间为2~12h；
（2）将所述步骤（1）得到的悬浊液依次进行固液分离和洗脱，得到血红蛋白分子印迹聚合物；
所述洗脱采用的洗脱液包括0.5~10% SDS-冰醋酸、甲醇-冰醋酸、0.5~10% SDS-盐酸或NaCl溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的吐温溶液为0.1~2%吐温-20。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的共功能单体和正硅酸乙酯的体积之比为1:(2~10)。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的血红蛋白的质量与共功能单体的体积之比为(100~400)mg:(50~400)μL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的混合在震荡下进行。
6.权利要求1~5任意一项所述制备方法制备得到的血红蛋白分子印迹聚合物。
7.权利要求6所述的血红蛋白分子印迹聚合物在分离血红蛋白中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311396248.XA CN117304491B (zh) | 2023-10-25 | 2023-10-25 | 一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311396248.XA CN117304491B (zh) | 2023-10-25 | 2023-10-25 | 一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117304491A CN117304491A (zh) | 2023-12-29 |
| CN117304491B true CN117304491B (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=89246266
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311396248.XA Active CN117304491B (zh) | 2023-10-25 | 2023-10-25 | 一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117304491B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6852818B1 (en) * | 1999-10-23 | 2005-02-08 | Cranfield University | Molecularly imprinted polymers produced by template polymerization |
| CN107383371A (zh) * | 2017-07-25 | 2017-11-24 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种基于量子点的蛋白质印迹聚合物微球及其制备和应用 |
| CN111103429A (zh) * | 2019-12-28 | 2020-05-05 | 西安交通大学 | 人血清白蛋白磁性仿生免疫分析试剂盒 |
-
2023
- 2023-10-25 CN CN202311396248.XA patent/CN117304491B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6852818B1 (en) * | 1999-10-23 | 2005-02-08 | Cranfield University | Molecularly imprinted polymers produced by template polymerization |
| CN107383371A (zh) * | 2017-07-25 | 2017-11-24 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种基于量子点的蛋白质印迹聚合物微球及其制备和应用 |
| CN111103429A (zh) * | 2019-12-28 | 2020-05-05 | 西安交通大学 | 人血清白蛋白磁性仿生免疫分析试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 血红蛋白荧光分子印迹聚合物的制备及其性能研究;张铭慧;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20210215(第2021年第02期期);第9, 16, 18页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117304491A (zh) | 2023-12-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Preparation and characteristics of protein molecularly imprinted membranes on the surface of multiwalled carbon nanotubes | |
| Pang et al. | Bovine serum albumin-imprinted polyacrylamide gel beads prepared via inverse-phase seed suspension polymerization | |
| Altıntaş et al. | Efficient removal of albumin from human serum by monosize dye-affinity beads | |
| US3935299A (en) | Process for preparation of wide-pore adsorbent for use in chromatography | |
| Demiryas et al. | Poly (acrylamide‐allyl glycidyl ether) cryogel as a novel stationary phase in dye‐affinity chromatography | |
| Timin et al. | Synthesis and application of amino-modified silicas containing albumin as hemoadsorbents for bilirubin adsorption | |
| US7122381B2 (en) | Selective affinity material, preparation thereof by molecular imprinting, and use of the same | |
| Russo et al. | Tailoring the surface chemistry of mesocellular foams for protein adsorption | |
| Kartal et al. | Molecularly imprinted cryogel beads for cholesterol removal from milk samples | |
| Akgöl et al. | Magnetic dye affinity beads for the adsorption of β‐casein | |
| Ergün et al. | Ion imprinted beads embedded cryogels for in vitro removal of iron from β‐thalassemic human plasma | |
| CN117304491B (zh) | 一种基于硅乳液自组装的血红蛋白分子印迹聚合物及其制备方法和应用 | |
| Lei et al. | “Induced fit” recognition of proteins by surface imprinted silica with “soft” recognition sites | |
| Lee et al. | Protein-imprinted polysiloxane scaffolds | |
| Dinc et al. | Inhibitor-assisted synthesis of silica-core microbeads with pepsin-imprinted nanoshells | |
| Bayramoglu et al. | Preparation and characterization of sulfonyl-hydrazine attached poly (styrene-divinylbenzene) beads for separation of albumin | |
| Yavuz et al. | Affinity separation of immunoglobulin G subclasses on dye attached poly (hydroxypropyl methacrylate) beads | |
| Pang et al. | Soft-wet polyacrylamide gel beads with the imprinting of bovine serum albumin | |
| CN110437491B (zh) | 纳豆激酶表面分子印迹聚合物及其制备方法和应用 | |
| Tan et al. | Fabrication of a biomimetic adsorbent imprinted with a common specificity determinant for the removal of α-and β-amanitin from plasma | |
| Chai et al. | Combination of deep eutectic solvent and organic–inorganic hybrid monomer to prepare monolith for improvement of hydrophilic protein extraction | |
| CN102114416B (zh) | 一种蛋白质分子印迹聚合物颗粒的制备方法 | |
| Ye et al. | Molecular imprinting in particle-stabilized emulsions: enlarging template size from small molecules to proteins and cells | |
| Akgöl et al. | Porous dye affinity beads for albumin separation from human plasma | |
| Gu et al. | Surface-initiated ARGET ATRP of poly (glycidyl methacrylate) from macroporous hydrogels via oil-in-water high internal phase emulsion templates for specific capture of Enterovirus 71 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |