CN117281928A - 18f标记纳米抗体探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了18F标记纳米抗体探针及其制备方法和应用，涉及肿瘤诊断与治疗的分子影像、核医学和纳米抗体技术领域，包括人CD70、PD‑L1、CD38、CD47、BCMA、GPC3、CDH17、TROP2及EPCAM特异性单价纳米抗体探针和相应特异性纳米抗体融合蛋白探针；其制备方法包括：通过化合物修饰上述特异性纳米抗体，合成放射性核素标记前体，通过放射性核素标记，制备得到所述特异性分子影像探针；所制备探针应用于恶性肿瘤的免疫PET显像。本发明具有制备工艺简单、成本低廉、特异性高、稳定性高、易于临床转化等优点。可实现人CD70、PD‑L1、CD38、CD47、BCMA、GPC3、CDH17、TROP2及EPCAM异质性表达的无创可视化，用于多种实体及血液恶性肿瘤的诊断和分期。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤诊断与治疗的分子影像、核医学和纳米抗体技术领域，尤其涉及18F标记纳米抗体探针及其制备方法和应用。
背景技术
通过巧妙地融合抗体非凡的靶向特异性和正电子发射断层扫描(PET)的优越灵敏度和分辨率，免疫PET可以无创显示感兴趣靶点在体内表达情况(Chem Rev.2020；120(8):3787-3851)。研究表明免疫PET相较于免疫组织化学染色或其他传统预测标志物可以更好的显示体内感兴趣靶点的分布情况及分布丰度，并更好的预测对于靶向治疗的应答反应。单克隆抗体、抗体片段及单域抗体(其中包括纳米抗体)均可用于构建靶点特异性免疫PET显像探针。放射性标记单克隆抗体免疫PET显像探针的临床转化应用受到高成本、对患者及医务工作者辐射损伤大的限制；单克隆抗体免疫PET显像周期长达一周，因此临床操作较繁琐，推广应用难度较大；此外，单克隆抗体免疫PET显像探针的制备严重依赖于89Zr、64Cu、124I等长半衰期核素标记，而我国尚无此类核素的稳定供应。
为了推进免疫PET显像策略的临床推广应用，分子影像领域在积极探索预靶向成像策略或使用较小的抗体衍生物来实现当日分子成像(same-day imaging)。在小抗体形式中，来自骆驼科的纳米抗体或单结构域抗体是分子量约为15kDa的最小抗原结合部分(Nature.1993；363(6428):446-8)。小尺寸、高亲和力和易于工程设计使纳米抗体成为分子成像及诊疗一体化的优选载体。目前，多种短半衰期核素已用于标记纳米抗体，制备纳米抗体分子影像探针。锝-99m(99mTc；T1/2＝6.02h)标记靶向程序性死亡配体1(PD-L1)的纳米抗体探针已成功转化至临床，用于非小细胞肺癌患者的无创诊断(J Nucl Med.2019；60(9):1213-1220)；镓-68(68Ga；T1/2＝1.1h)标记靶向人类表皮生长因子受体(HER2)的纳米抗体探针也已成功转化至临床，用于乳腺癌的无创诊断(J Nucl Med.2016；57(1):27-33)。以上实例说明放射性核素标记纳米抗体探针极具临床转化应用前景，可用于人类恶性肿瘤的早期无创诊断、关键致病靶点的可视化、单克隆抗体(mAb)治疗患者的筛选以及单克隆抗体治疗后疗效评价。99mTc属于单光子发射放射性核素，所标记纳米抗体探针的显像性能欠佳；68Ga一般需要通过锗镓发生器或配置有固体靶的医用回旋加速器制备，制备价格昂贵，且半衰期较短，所标记纳米抗体探针不适宜运输及推广应用。氟-18(18F；T1/2＝109.8min)是临床正电子发射断层显像(PET)最常使用的放射性核素，其正电子发射率高达97％，正电子射程为0.5mm，不发射伽马射线，是创制PET显像探针的最佳核素之一。但是，因为放射化学产率(RCY)较低、标记条件苛刻(需要高温、有机溶剂)等原因的限制，18F并没有广泛用于纳米抗体的核素标记(Chem Rev.2020；120(8):3787-3851)。目前，多种前体已用于18F标记生物大分子。[18F]-对氟苯甲醛([18F]FBA)是最常用的18F标记前体；N-琥珀酰亚胺-4-[18F]-氟苯甲酸酯([18F]SFB)也是较常用的18F标记前体，该前体可与抗体赖氨酸氨基反应形成稳定的酰胺键；N-[2-(4-[18F]-氟苯甲酰胺基)-乙基]马来酰亚胺([18F]FBEM)是一种具有硫醇反应活性的标记前体，可用于纳米抗体的定点标记，但其合成步骤繁琐、放射化学产率较低；2,3,5,6-四氟苯基6-[18F]-氟烟酸酯([18F]TFPFN)虽然标记纳米抗体的条件较温和(37-40℃,15min,pH 8.5-9.0)，但放射化学产率只有5％左右，严重限制其应用。此外，其他18F标记方法常需乙腈等有机溶剂，且需要在酸性环境(pH＝2.0-2.5)中反应。但抗体在极端环境中易变性或失活，因此常用标记方法不适用于纳米抗体的标记。临床亟需一种标记条件温和、可重复性好、放射化学产率高的18F标记纳米抗体方法，以实现靶点特异性纳米抗体的室温、高效18F标记。
为了填补该领域的空白，本发明人在这里考虑了由纳米抗体衍生的人CD70、PD-L1、CD38、CD47、BCMA、GPC3、CDH17、TROP2及EPCAM靶向诊断探针的构建，并考虑表征其在细胞衍生异种移植(CDX)和患者衍生异种移植(PDX)模型中的诊断及治疗价值。
分化抗原簇CD70是一种二型跨膜糖蛋白，是肿瘤坏死因子超家族的一员，也是CD27的配体，其二者的结合可以诱导多种信号通路激活，促进基因转录、细胞增殖与分化。正常情况下，CD70只在活化的T细胞、B细胞和成熟的树突状细胞表面短暂表达。近年的研究发现，CD70在多种恶性血液肿瘤和实体瘤中表达增高。与正常肾组织相比，肾细胞癌中，特别是在肾透明细胞癌和肉瘤样肾细胞癌中，CD70表达明显升高，且CD70的高表达与预后不良相关。肿瘤细胞上表达的CD70可以与T细胞表面的CD27结合，启动凋亡蛋白Siva使免疫细胞产生细胞毒性作用而发生凋亡，达到免疫逃逸的效果。CD70在正常组织和肿瘤中的表达差异使其成为优秀的肿瘤特异性标志物，并且能避免潜在的副作用。目前已经有以CD70为靶点的单克隆抗体、抗体药物偶联物和嵌合抗原受体T细胞等药物进入临床试验。抗CD70的单克隆抗体SGN-CD70A已经在一期临床试验中用于转移性肾细胞癌患者，临床获益率为78％。(J Exp Clin Cancer Res.2022Jan 6；41(1):12)因此，目前迫切需要开发一种靶向CD70的诊断工具，以实现对实体瘤中CD70表达的可视化和监测。在研究伴随诊断工具的基础上，还可以进一步开发出针对CD70的新型治疗方法。申请人团队前期已提交68Ga标记CD70特异性纳米抗体探针及89Zr标记纳米抗体白蛋白结合域融合蛋白探针相关国家发明专利(申请专利名称：CD70特异性诊疗一体化分子影像探针的制备方法；申请公布号：CN115925951A；申请号：2022115277153；状态：在审)；但目前尚无18F标记CD70特异性免疫PET显像探针。
程序性死亡因子配体1(programmed death ligand 1，PD-L1)通过与T细胞表面的受体程序性死亡因子(programmed cell death protein 1，PD-1)相互作用，抑制T细胞激活及抗肿瘤免疫反应。基于单克隆抗体靶向PD-1/PD-L1的免疫治疗显著延长了多种肿瘤的生存。但是，目前临床尚缺乏有效预测靶向PD-1/PD-L1免疫治疗疗效的生物标志物。尤其值得注意的是，《Nature Medicine》杂志刊登的临床研究数据表明：免疫组织化学染色所揭示PD-L1表达水平不能预测PD-L1特异性单克隆抗体阿特珠单抗(atezolizumab)的治疗疗效(Nat Med.2018；24:1852–1858)。与此同时，另一项临床研究表明目前用于检测PD-L1表达水平的几种免疫组织化学染色方法的检测效能存在显著差异，且同一方法在不同样本间的染色结果差异较大(J Thorac Oncol.2017；12:208–222)。此外，免疫组织化学染色还面临穿刺活检取样误差、图像判断误差等缺陷。
CD47是免疫系统中唯一已知的5次跨膜受体，其在体内不同细胞类型中广泛表达。它通过与信号调节蛋白α(SIRPα)结合而发挥生理作用，影响红细胞、血小板和造血干细胞的稳态平衡，并在神经元发育过程中调节突触修剪。然而，肿瘤细胞利用这一机制，向巨噬细胞传递“不要吃我”的信号，以逃避巨噬细胞的清除。研究表明肿瘤细胞表面CD47的过表达与预后不良相关，例如急性髓系白血病，结直肠癌和淋巴瘤等。(Immunity.2020May 19；52(5):742-752)临床试验已证实靶向CD47单克隆抗体magrolimab在非霍奇金淋巴瘤及其他类型的实体瘤患者中的治疗作用。然而，CD47在正常组织中的广泛表达会导致靶向CD47抗体在体内的抗原沉没效应，从而不可避免地导致对于正常组织的损伤。因此，目前迫切需要开发一种靶向CD47的伴随诊断工具，以帮助对可能受益于抗CD47治疗的患者进行分层。在研究伴随诊断工具的基础上，还可以进一步开发出针对CD47的新型治疗方法。申请人团队前期已提交68Ga标记CD47特异性纳米抗体探针及89Zr标记纳米抗体白蛋白结合域融合蛋白探针相关国家发明专利(申请专利名称：一种CD47特异性分子影像探针及其制备方法和应用；申请公布号：CN115737845A；申请号：2022110338273；状态：在审)；但目前尚无18F标记CD47特异性免疫PET显像探针。
CD38是多发性骨髓瘤特异性的生物标志物。靶向CD38的单克隆抗体达雷妥尤单克隆抗体注射液(daratumumab)在欧美和我国均已获批临床，用于新发或复发难治性多发性骨髓瘤的治疗。诸多因素介导达雷妥尤单抗的治疗疗效，其中最主要的因素是CD38蛋白表达水平。(Blood.2018Jan 4；131(1):13-29)目前，临床判断多发性骨髓瘤细胞CD38表达水平严重依赖于骨髓穿刺物的流式细胞学检测。但是，该方法创伤性较大、且可重复性较差。因此，临床亟需一种可用于无创可视化CD38表达水平、早期精准诊断多发性骨髓瘤的分子影像学方法。申请人团队前期已申请授权一项68Ga标记CD38特异性纳米抗体探针相关国家发明专利(专利名称：一种诊断多发性骨髓瘤的新型分子影像探针)及一项18F标记CD38特异性纳米抗体探针相关国家发明专利(专利名称：一种18F标记纳米抗体探针及其制备方法和应用)。但值得注意的是，该18F标记方法为点击化学介导的两步法标记，标记过程繁琐耗时且整体标记效率较低，对临床转化及推广应用而言，尚需要高效快捷的方法制备18F标记CD38特异性纳米抗体探针。
B细胞成熟抗原(BCMA)，也被称为TNFRSF17或CD269，是一种普遍表达的浆细胞膜抗原。BCMA的过度表达和/或激活与多发性骨髓瘤细胞的生存、增殖和进展有关。针对BCMA的抗体和CAR-T疗法正在迅速重塑多发性骨髓瘤的治疗格局，特别是对免疫调节药物、蛋白酶体抑制剂和CD38单克隆抗体难治的患者。(Nat Rev Clin Oncol.2021Feb；18(2):71-84)例如，belantamabmafodotin-blmf是一种被批准用于治疗多发性骨髓瘤的抗体-药物结合物(ADC)。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3,GPC3)是硫酸乙酰肝素糖蛋白家族成员之一，由核心蛋白、位于C端的两条硫酸乙酰肝素链及与细胞膜连接的磷脂酰肌醇锚组成，分子量大小约70kDa(Gastroenterology.2003；125(1):89-97)。包括Wnt及Hippo/YAP等在内的多条致癌信号通路及生长因子介导GPC3的信号转导，促进肿瘤的发生、发展及侵袭与转移。GPC3在HCC细胞中显著高表达，而在正常肝组织、肝脏良性疾病及胆管细胞癌中几乎不表达，是HCC最具特异性的肿瘤标志物(Genome Biol.2008；9(5):224)。利用显像用放射性核素标记GPC3用于HCC靶向成像，对实现HCC患者早期诊断，精准患者筛选及靶向治疗监测具有重要作用。
滋养层细胞表面抗原2(Trop2)是一种细胞膜表面糖蛋白，由一个36kDa的新生多肽经N-连接糖基化翻译修饰形成。它通过多种信号传导途径调节肿瘤的增殖、侵袭和迁移，并在干细胞生物学中发挥作用。在一项包含197个石蜡包埋的胰腺癌原发肿瘤组织的回顾性研究中，分析了Trop2抗原的表达，免疫组化结果发现55％的抗原呈过度表达，这与淋巴结转移、肿瘤分化不良和预后不良明显相关。Trop2的表达也与胃癌、女性生殖系统肿瘤、前列腺癌和结直肠癌等恶性肿瘤的生物学侵袭性和预后不良有关，表明其促进肿瘤的发生发展。Trop2在正常组织和肿瘤中的表达差异使其成为极具潜力的肿瘤特异性标志物，并且能避免潜在的副作用。目前已经有以Trop2为靶点抗体药物偶联物药物进入临床试验。(PharmacolTher.2022Nov；239:108296)因此，目前迫切需要开发一种靶向Trop2的诊断工具，以实现对实体瘤中Trop2表达的无创可视化和监测。在研究伴随诊断工具的基础上，还可以进一步开发出针对Trop2的新型治疗方法。
CDH17又称肝肠钙粘蛋白，是钙粘蛋白超家族的一个独特成员。在生理条件下，CDH17在人和小鼠中的表达主要局限于小肠和结肠的上皮细胞，而不在肝、胃、心、肺和脑等重要器官内表达。在功能上，CDH17参与细胞间的粘附，通过调节细胞间的裂隙，以Ca2+依赖的方式维持组织的完整性。在病理生理学上，CDH17的表达与消化系统的各种癌症密切相关。它在胃癌、结肠直肠癌、肝癌、胰腺癌和神经内分泌癌中的表达上调。敲除CDH17可以抑制胃癌、结肠直肠癌和肝癌的肿瘤发展和转移。因此，CDH17已被视为肿瘤预后的生物标志物和促进肿瘤生长的癌基因。(Nat Cancer.2022May；3(5):581-594)包括CDH17单克隆抗体、CDH17抗体与免疫毒素的偶联药物以及CDH17 CAR T细胞在内的多种CDH17治疗形式在临床前得到了良好的效果。
上皮细胞细胞粘附分子(EPCAM)是结直肠癌的肿瘤抗原，其在肿瘤中的高表达，使其成为循环肿瘤细胞的预后标志物。EpCAM是一种多功能跨膜蛋白，参与调节癌细胞的细胞粘附、增殖、迁移、干细胞和上皮-间充质转化(EMT)。EpCAM在绝大多数癌症，肿瘤原发细胞和播散肿瘤细胞中高度频繁地表达，这使EpCAM成为癌症治疗的潜在靶标(CancerMetastasis Rev.2020Sep；39(3):969-987)。
发明内容
鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是制备成本低廉、分子量小、体内循环时间短、显像周期短、辐射剂量低、易于临床转化应用的纳米抗体免疫PET显像探针。虽然本领域中已有相关68Ga标记纳米抗体探针，但68Ga半衰期较短(T1/2＝1.1h)，明显短于18F的半衰期(T1/2＝1.82h)；此外，18Fβ+电子发射比率高达97％且能峰较低(Eβ+max＝635keV)，而68Gaβ+电子发射比率较低(89％)且能峰较高(Eβ+max＝1899keV)。上述核素本身的物理特性致使18F标记探针的成像质量要优于68Ga标记探针的成像质量；并且18F标记探针更适宜配送至临近医学中心或研究型医院开展多中心临床试验，临床转化应用前景更加广阔。
为实现上述目的，在一个方面，本发明提供了一种18F标记纳米抗体探针，其包含经放射性核素18F标记的纳米抗体或纳米抗体融合蛋白。
进一步地，使用放射性核素18F标记纳米抗体或纳米抗体融合蛋白包括：
(1)使用化合物修饰纳米抗体或纳米抗体融合蛋白，得到放射性核素标记前体，和
(2)使用放射性核素18F标记所述前体，得到经放射性核素18F标记的纳米抗体或纳米抗体融合蛋白。
进一步地，步骤(1)中所述化合物包括配体(±)-H3RESCA-TFP。
进一步地，所述18F标记纳米抗体探针靶向人CD70、PD-L1、CD38、CD47、BCMA、GPC3、CDH17、TROP2或EPCAM。
进一步地，所述经放射性核素18F标记的纳米抗体或纳米抗体融合蛋白特异性结合人CD70、PD-L1、CD38、CD47、BCMA、GPC3、CDH17、TROP2或EPCAM。
在另一个方面，本发明提供了一种制备18F标记纳米抗体探针的方法，其包括：
(1)使用化合物修饰纳米抗体或纳米抗体融合蛋白，得到放射性核素标记前体，和
(2)使用放射性核素18F标记所述前体，得到经放射性核素18F标记的纳米抗体或纳米抗体融合蛋白。
进一步地，步骤(1)中所述化合物包括配体(±)-H3RESCA-TFP。
在另一个方面，本发明提供了一种纳米抗体或纳米抗体融合蛋白，其特异性结合人CD70、PD-L1、CD38、CD47、BCMA、GPC3、CDH17、TROP2或EPCAM。
在另一个方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码如本文所述的纳米抗体或纳米抗体融合蛋白，
在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含如本文所述的多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如本文所述的载体。
在另一个方面，本发明提供了如本文所述的18F标记纳米抗体探针用作免疫正电子发射断层扫描(PET)显像探针的用途。
在另一个方面，本发明提供了一种用于受试者中肿瘤的诊断、靶向治疗和/或治疗后疗效评价和/或用于免疫治疗受试者的筛选的试剂盒或组合物，其包含如本文所述的18F标记纳米抗体探针、纳米抗体或纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体或宿主细胞。
在另一个方面，本发明提供了如本文所述的18F标记纳米抗体探针、纳米抗体或纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体或宿主细胞在制备用于受试者中肿瘤的诊断、靶向治疗和/或治疗后疗效评价和/或用于免疫治疗受试者的筛选的药物中的用途。
下面将更详细地描述本发明。
纳米抗体或纳米抗体融合蛋白
本发明提供了可用于制备如本所述的18F标记纳米抗体探针的纳米抗体或纳米抗体融合蛋白。具体地，所述纳米抗体或纳米抗体融合蛋白可特异性结合CD70、PD-L1、CD38、CD47、BCMA、GPC3、CDH17、TROP2或EPCAM，特别是人CD70、PD-L1、CD38、CD47、BCMA、GPC3、CDH17、TROP2或EPCAM。
更具体地，本发明提供了一种CD70特异性纳米抗体，其是如本文所述的纳米抗体B3或B6。更具体地，所述CD70特异性纳米抗体是人CD70特异性纳米抗体。
更具体地，所述纳米抗体B3包含具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的CDR3。更具体地，所述纳米抗体B3包含SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
更具体地，所述纳米抗体B6包含具有SEQ ID No.6所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.7所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.8所示的氨基酸序列的CDR3。更具体地，所述纳米抗体B6包含SEQ ID No.9所示的氨基酸序列。
更具体地，本发明提供了一种PD-L1特异性纳米抗体，其是如本文所述的纳米抗体RW102。更具体地，所述PD-L1特异性纳米抗体是人PD-L1特异性纳米抗体。
更具体地，所述纳米抗体RW102包含具有SEQ ID No.18所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.19所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.20所示的氨基酸序列的CDR3。更具体地，所述纳米抗体RW102包含SEQ ID No.21所示的氨基酸序列。
更具体地，本发明提供了一种CD38特异性纳米抗体，其是如本文所述的纳米抗体1053。更具体地，所述CD38特异性纳米抗体是人CD38特异性纳米抗体。
更具体地，所述纳米抗体1053包含具有SEQ ID No.25所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.26所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.27所示的氨基酸序列的CDR3。更具体地，所述纳米抗体1053包含SEQ ID No.28所示的氨基酸序列。
更具体地，本发明提供了一种CD47特异性纳米抗体，其是如本文所述的纳米抗体C2。更具体地，所述CD47特异性纳米抗体是人CD47特异性纳米抗体。
更具体地，所述纳米抗体C2包含具有SEQ ID No.32所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.33所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.34所示的氨基酸序列的CDR3。更具体地，所述纳米抗体C2包含SEQ ID No.35所示的氨基酸序列。
更具体地，本发明提供了一种BCMA特异性纳米抗体，其是如本文所述的纳米抗体MMBC2。更具体地，所述BCMA特异性纳米抗体是人BCMA特异性纳米抗体。
更具体地，所述纳米抗体MMBC2包含具有SEQ ID No.39所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.40所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.41所示的氨基酸序列的CDR3。更具体地，所述纳米抗体MMBC2包含SEQ ID No.42所示的氨基酸序列。
更具体地，本发明提供了一种GPC3特异性纳米抗体，其是如本文所述的纳米抗体G2。更具体地，所述GPC3特异性纳米抗体是人GPC3特异性纳米抗体。
更具体地，所述纳米抗体G2包含具有SEQ ID No.46所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.47所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.48所示的氨基酸序列的CDR3。更具体地，所述纳米抗体G2包含SEQ ID No.49所示的氨基酸序列。
更具体地，本发明提供了一种CDH17特异性纳米抗体，其是如本文所述的纳米抗体CDH1。更具体地，所述CDH17特异性纳米抗体是人CDH17特异性纳米抗体。
更具体地，所述纳米抗体CDH1包含具有SEQ ID No.53所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.54所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.55所示的氨基酸序列的CDR3。更具体地，所述纳米抗体CDH1包含SEQ ID No.56所示的氨基酸序列。
更具体地，本发明提供了一种TROP2特异性纳米抗体，其是如本文所述的纳米抗体WWD98。更具体地，所述TROP2特异性纳米抗体是人TROP2特异性纳米抗体。
更具体地，所述纳米抗体WWD98包含具有SEQ ID No.60所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.61所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.62所示的氨基酸序列的CDR3。更具体地，所述纳米抗体WWD98包含SEQ ID No.63所示的氨基酸序列。
更具体地，本发明提供了一种EPCAM特异性纳米抗体，其是如本文所述的纳米抗体EPCD3。更具体地，所述EPCAM特异性纳米抗体是人EPCAM特异性纳米抗体。
更具体地，所述纳米抗体EPCD3包含具有SEQ ID No.67所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.68所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.69所示的氨基酸序列的CDR3。更具体地，所述纳米抗体EPCD3包含SEQ ID No.70所示的氨基酸序列。
本发明还通过将如上文所述的纳米抗体与白蛋白结合域融合得到具有改善的体内半衰期同时不显著影响纳米抗体与其靶标的特异性结合的纳米抗体融合蛋白。
具体地，本发明提供了一种纳米抗体融合蛋白，其包含纳米抗体和白蛋白结合域。
纳米抗体和白蛋白结合域可以直接融合或可以通过连接子间接融合。在一些实施方案中，所述纳米抗体和白蛋白结合域之间含有连接子。进一步地，所述连接子具有SEQ IDNo.11所示的氨基酸序列。
白蛋白结合域的序列是本领域技术人员熟知的，并且可以使用任何合适的白蛋白结合域序列。在一些实施方案中，所述白蛋白结合域具有SEQ ID No.13所示的氨基酸序列，
更具体地，本发明提供了一种CD70特异性纳米抗体融合蛋白，其包含如上文所述的CD70特异性纳米抗体和白蛋白结合域。更具体地，所述CD70特异性纳米抗体融合蛋白具有SEQ ID No.14或16所示的氨基酸序列(在本文中分别称为ABDB3或ABDB6)。
更具体地，本发明提供了一种PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白，其包含如上文所述的PD-L1特异性纳米抗体和白蛋白结合域。更具体地，所述PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白具有SEQ ID No.23所示的氨基酸序列(在本文中被称为ABDWW102)。
更具体地，本发明提供了一种CD38特异性纳米抗体融合蛋白，其包含如上文所述的CD38特异性纳米抗体和白蛋白结合域。更具体地，所述CD38特异性纳米抗体融合蛋白具有SEQ ID No.30所示的氨基酸序列(在本文中被称为ABD1053)。
更具体地，本发明提供了一种CD47特异性纳米抗体融合蛋白，其包含如上文所述的CD47特异性纳米抗体和白蛋白结合域。更具体地，所述CD47特异性纳米抗体融合蛋白具有SEQ ID No.37所示的氨基酸序列(在本文中被称为ABDC2)。
更具体地，本发明提供了一种BCMA特异性纳米抗体融合蛋白，其包含如上文所述的BCMA特异性纳米抗体和白蛋白结合域。更具体地，所述BCMA特异性纳米抗体融合蛋白具有SEQ ID No.44所示的氨基酸序列(在本文中被称为ABDMMBC2)。
更具体地，本发明提供了一种GPC3特异性纳米抗体融合蛋白，其包含如上文所述的GPC3特异性纳米抗体和白蛋白结合域。更具体地，所述GPC3特异性纳米抗体融合蛋白具有SEQ ID No.51所示的氨基酸序列(在本文中被称为ABDG2)。
更具体地，本发明提供了一种CDH17特异性纳米抗体融合蛋白，其包含如上文所述的CDH17特异性纳米抗体和白蛋白结合域。更具体地，所述CDH17特异性纳米抗体融合蛋白具有SEQ ID No.58所示的氨基酸序列(在本文中被称为ABDCDH1)。
更具体地，本发明提供了一种TROP2特异性纳米抗体融合蛋白，其包含如上文所述的TROP2特异性纳米抗体和白蛋白结合域。更具体地，所述TROP2特异性纳米抗体融合蛋白具有SEQ ID No.65所示的氨基酸序列(在本文中被称为ABDWWD98)。
如本文所用，术语“纳米抗体(nanobody)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，通常来源于重链抗体(例如骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体)的可变区。典型地，纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成，具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。纳米抗体可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。纳米抗体也称为单域抗体(single-domain antibody,sdAb)或VHH(Variable Domain of Heavy Chain of Heavy Chain Antibody)，它们可互换使用。
在一些实施方案中，本发明还涵盖如本文所述的纳米抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“抗原结合片段”是指包含纳米抗体的片段的多肽，其保持特异性结合纳米抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与纳米抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文以用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过本发明纳米抗体的酶促或化学断裂产生本发明抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述纳米抗体的“抗原结合片段”与全长纳米抗体相比可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的纳米抗体(例如本发明提供的纳米抗体)获得纳米抗体的抗原结合片段，并且以与用于完整纳米抗体的方式相同的方式就特异性筛选纳米抗体的抗原结合片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“纳米抗体”时，其不仅包括完整纳米抗体，而且包括纳米抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在纳米抗体中含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc等人,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的纳米抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc等人,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语“CD70(或PD-L1、CD38、CD47、BCMA、GPC3、CDH17、TROP2、EPCAM)特异性”是指特异性结合CD70(或PD-L1、CD38、CD47、BCMA、GPC3、CDH17、TROP2、EPCAM)。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以由该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。
两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见MalmqvistM,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数KD(参见Davies等人,AnnualRev Biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量KD、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用表面等离子体共振术(SPR)在Biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或Kinexa来测量解离常数。
在一些实施方案中，本发明还提供了如本文所述的纳米抗体的变体，其与所述纳米抗体的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且基本保留了其所源自的纳米抗体的生物学功能(例如特异性结合靶标的生物活性)。
更具体地，所述变体与如本文所述的纳米抗体相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、至多5个或至多1个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residuetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
多核苷酸
本发明提供了编码如本文所述的纳米抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白的多核苷酸。
更具体地，本发明提供了编码如本文所述的CD70特异性纳米抗体的多核苷酸，其包含SEQ ID No.5或10所示的核苷酸序列。更具体地，本发明提供了编码如本文所述的CD70特异性纳米抗体融合蛋白的多核苷酸，其包含SEQ IDNo.15或17所示的核苷酸序列。
更具体地，本发明提供了编码如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体的多核苷酸，其包含SEQ ID No.22所示的核苷酸序列。更具体地，本发明提供了编码如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白的多核苷酸，其包含SEQ ID No.24所示的核苷酸序列。
更具体地，本发明提供了编码如本文所述的CD38特异性纳米抗体的多核苷酸，其包含SEQ ID No.29所示的核苷酸序列。更具体地，本发明提供了编码如本文所述的CD38特异性纳米抗体融合蛋白的多核苷酸，其包含SEQ ID No.31所示的核苷酸序列。
更具体地，本发明提供了编码如本文所述的CD47特异性纳米抗体的多核苷酸，其包含SEQ ID No.36所示的核苷酸序列。更具体地，本发明提供了编码如本文所述的CD47特异性纳米抗体融合蛋白的多核苷酸，其包含SEQ ID No.38所示的核苷酸序列。
更具体地，本发明提供了编码如本文所述的BCMA特异性纳米抗体的多核苷酸，其包含SEQ ID No.43所示的核苷酸序列。更具体地，本发明提供了编码如本文所述的BCMA特异性纳米抗体融合蛋白的多核苷酸，其包含SEQ IDNo.45所示的核苷酸序列。
更具体地，本发明提供了编码如本文所述的GPC3特异性纳米抗体的多核苷酸，其包含SEQ ID No.50所示的核苷酸序列。更具体地，本发明提供了编码如本文所述的GPC3特异性纳米抗体融合蛋白的多核苷酸，其包含SEQ ID No.52所示的核苷酸序列。
更具体地，本发明提供了编码如本文所述的CDH17特异性纳米抗体的多核苷酸，其包含SEQ ID No.57所示的核苷酸序列。更具体地，本发明提供了编码如本文所述的CDH17特异性纳米抗体融合蛋白的多核苷酸，其包含SEQ IDNo.59所示的核苷酸序列。
更具体地，本发明提供了编码如本文所述的TROP2特异性纳米抗体的多核苷酸，其包含SEQ ID No.64所示的核苷酸序列。更具体地，本发明提供了编码如本文所述的TROP2特异性纳米抗体融合蛋白的多核苷酸，其包含SEQ IDNo.66所示的核苷酸序列。
更具体地，本发明提供了编码如本文所述的EPCAM特异性纳米抗体的多核苷酸，其包含SEQ ID No.71所示的核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
术语“编码多肽/蛋白/抗体的多核苷酸”可以是包括编码此多肽/蛋白/抗体的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，优选地至少70％，更优选地至少80％，最优选至少90％同一性的多核苷酸，并且它们编码的多肽/蛋白/抗体具有基本上相同的功能和活性。本发明特别涉及可在严格条件下与本发明所述多核苷酸杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的同一性至少在90％以上,更优选95％以上时才发生杂交。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将纳米抗体的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
载体
在另一个方面，本发明还提供了包含编码上述纳米抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白的多核苷酸的载体。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
宿主细胞
在另一个方面，本发明还提供了包含如本文所述的载体的宿主细胞。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或其他人细胞等的动物细胞。宿主细胞可以包括单个细胞或细胞群体。
将载体导入宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
18F标记纳米抗体探针
本发明人已发现，利用(±)-H3RESCA-TFP修饰如上文所述的纳米抗体或纳米抗体融合蛋白，可以在温和条件下使用放射性核素18F标记纳米抗体或纳米抗体融合蛋白，得到放射化学产率高的18F标记纳米抗体探针，并且基本上不影响纳米抗体与其靶标的特异性结合。
(±)-H3RESCA是一种具有N2O3配位的五齿配体，在室温下具有优异的标记性能。与Al18F配合所得到的复合物(±)-[18F][AlF(RESCA)]-在大鼠血浆和磷酸盐缓冲盐水中显示出至少4小时的优异稳定性。RESCA-四氟苯基酯((±)-H3RESCA-TFP)可用于通过胺偶联(例如赖氨酸的N端和/或ε-氨基)将螯合剂与生物分子缀合。Al18F-RESCA方法结合了基于螯合剂的放射性标记方法的优点和所选择的放射性核素18F的独特性质。其主要优点是螯合反应发生在室温pH为4.5-5.5的水介质中。这允许使用温和的条件一步标记热敏生物分子。Al18F-RESCA方法在相当短的总体合成时间内提供了更高的放射化学产量，更高的整体批次活性和更高的表观摩尔放射性。
因此，本发明提供了一种制备18F标记纳米抗体探针的方法，其包括：
(1)使用化合物修饰纳米抗体或纳米抗体融合蛋白，得到放射性核素标记前体，和
(2)使用放射性核素18F标记所述前体，得到经放射性核素18F标记的纳米抗体或纳米抗体融合蛋白。
进一步地，步骤(1)中所述化合物包括配体(±)-H3RESCA-TFP。
此外，本发明还涵盖使用其他放射性核素标记如上文所述的纳米抗体或纳米抗体融合蛋白。
这样的其他放射性核素可以包括例如Tc-99m、Ga-68、I-123、I-125、I-131、I-124、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188、Y-86、Mn-52、Sc-44、Lu-177、Y-90、Ac-225、At-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra-223、Ru-106、Na-24、Sr-89、Tb-149、Th-227、Xe-133、Yb-169或Yb-177。
使用其他放射性核素标记如上文所述的纳米抗体以及纳米抗体融合蛋白的方法可以是本领域技术人员熟知的任何方法，包括例如使用双功能螯合剂介导放射性核素对纳米抗体或纳米抗体融合蛋白的标记。
双功能螯合剂是同时具有金属螯合端和蛋白锚定端的一类螯合剂。双功能螯合剂可以选自NOTA、MAA-NOTA、p-SCN-Bn-NOTA、p-SCN-Bn-去铁胺(DFO)、p-SCN-NODA、MAA-GA-NODA、MAA-DOTA、DOTA-NHS、iEDTA或p-SCN-Bn-DTPA。
组合物
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含如本文所述的18F标记纳米抗体探针、纳米抗体或纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体或宿主细胞。所述组合物可用于受试者中肿瘤的诊断、靶向治疗和/或治疗后疗效评价和/或用于免疫治疗受试者的筛选。
在一些实施方案中，所述组合物可以是药物组合物。
在一些实施方案中，所述药物组合物还可包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。例如，所述另外的药学活性剂可以是抗炎药物或免疫抑制剂。
在一些实施方案中，在所述药物组合物中，如本文所述的18F标记纳米抗体探针、纳米抗体或纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体或宿主细胞与所述另外的药学活性剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。因此，如本文所述的18F标记纳米抗体探针、纳米抗体或纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体或宿主细胞与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂可以包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的如本文所述的18F标记纳米抗体探针、纳米抗体或纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体或宿主细胞。“预防有效量”是指足以预防、阻止或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
试剂盒
本发明还提供了一种试剂盒，其包含如本文所述的18F标记纳米抗体探针、纳米抗体或纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体或宿主细胞。
所述试剂盒可用于受试者中肿瘤的诊断、靶向治疗和/或治疗后疗效评价和/或用于免疫治疗受试者的筛选。
所述试剂盒还可包含还包括容器、使用说明书、以及实际应用所需的其他试剂和缓冲液，例如用于溶解样本的裂解介质，各种缓冲液，检测标记，检测底物等。
诊断和治疗应用
如本文所述的18F标记纳米抗体探针可用作免疫正电子发射断层扫描(PET)显像探针，无创可视化其靶标(CD70、PD-L1、CD38、CD47、BCMA、GPC3、CDH17、TROP2或EPCAM)的表达，从而用于受试者中肿瘤的诊断、靶向治疗和/或治疗后疗效评价和/或用于免疫治疗受试者的筛选。
本发明的纳米抗体对其靶标(CD70、PD-L1、CD38、CD47、BCMA、GPC3、CDH17、TROP2或EPCAM)具有极高的亲和力，因而可以用于受试者中与相应靶标(CD70、PD-L1、CD38、CD47、BCMA、GPC3、CDH17、TROP2或EPCAM)相关的肿瘤的诊断、靶向治疗和/或治疗后疗效评价和/或用于免疫治疗受试者的筛选。
因此，本发明还涉及如本文所述的18F标记纳米抗体探针、纳米抗体或纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体或宿主细胞在制备用于受试者中肿瘤的诊断、靶向治疗和/或治疗后疗效评价和/或用于免疫治疗受试者的筛选的药物中的用途。
如本文所述的18F标记纳米抗体探针、纳米抗体或纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体或宿主细胞可用于多种肿瘤例如实体瘤及血液系统恶性肿瘤的无创诊断与鉴别诊断、靶向治疗或免疫治疗患者的筛选及治疗后疗效评价。
这样的肿瘤可以包括但不限于非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食管癌、肝细胞肝癌、胰腺癌、结直肠癌、胃癌、肾细胞肾癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤等、多发性骨髓瘤、淋巴瘤等。例如，这样的肿瘤可以包括肾细胞癌、结直肠癌或乳腺癌。
本发明的有益效果：
本发明实现了对人CD70、PD-L1、CD38、CD47、BCMA、GPC3、CDH17、TROP2及EPCAM分子表达的无创可视化，进一步实现了多种实体及血液恶性肿瘤的无创诊断，本发明公开的探针具有制备工艺简单、成本低廉、特异性高、稳定性高、显像周期短、辐射剂量低，并且易于临床转化等优点。
其中，[18F]F-TFP-B3、[18F]F-TFP-B6、[18F]F-TFP-ABDB3、[18F]F-TFP-ABDB6、[18F]F-TFP-RW102、[18F]F-TFP-ABDWW102、[18F]F-TFP-1053、[18F]F-TFP-ABD1053、[18F]F-TFP-C2、[18F]F-TFP-ABDC2、[18F]F-TFP-MMBC2、[18F]F-TFP-ABDMMBC2、[18F]F-TFP-G2、[18F]F-TFP-ABDG2、[18F]F-TFP-CDH1、[18F]F-TFP-ABDCDH1和[18F]F-TFP-EPCD3为正电子核素发射型探针，用于免疫PET显像；通过开展基于上述探针的免疫PET显像，可实现人CD70、PD-L1、CD38、CD47、BCMA、GPC3、CDH17、TROP2及EPCAM在肿瘤组织及正常组织器官表达的无创可视化，进一步用于特定类型肿瘤的无创靶点特异性诊断。
附图说明
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
图1是本发明的实施例1中SDS-PAGE测定纳米抗体B3、B6及纳米抗体融合蛋白ABDB3、ABDB6表达情况的实验结果图；
图2是本发明的实施例1中SDS-PAGE测定纳米抗体RW102及纳米抗体融合蛋白ABDWW102表达情况的实验结果图；
图3是本发明的实施例1中SDS-PAGE测定纳米抗体1053表达情况的实验结果图；
图4是本发明的实施例1中SDS-PAGE测定纳米抗体C2及纳米抗体融合蛋白ABDC2表达情况的实验结果图；
图5是本发明的实施例1中SDS-PAGE测定纳米抗体MMBC2及纳米抗体融合蛋白ABDMMBC2表达情况的实验结果图；
图6是本发明的实施例1中SDS-PAGE测定纳米抗体G2及纳米抗体融合蛋白ABDG2表达情况的实验结果图；
图7是本发明的实施例1中SDS-PAGE测定纳米抗体CDH1及纳米抗体融合蛋白ABDCDH1表达情况的实验结果图；
图8是本发明的实施例1中SDS-PAGE测定纳米抗体EPCD3表达情况的实验结果图；
图9是本发明的实施例1中SDS-PAGE测定纳米抗体WWD98表达情况的实验结果图；
图10是本发明的实施例1中纳米抗体B3和B6及纳米抗体融合蛋白ABDB3、ABDB6与人CD70的亲和力测定的结果；
图11是本发明的实施例1中纳米抗体RW102及纳米抗体融合蛋白ABDWW102与人PD-L1的亲和力测定的结果；
图12是本发明的实施例1中纳米抗体1053与人CD38的亲和力测定的结果；
图13是本发明的实施例1中纳米抗体C2及纳米抗体融合蛋白ABDC2与人CD47的亲和力测定的结果；
图14是本发明的实施例1中纳米抗体MMBC2及纳米抗体融合蛋白ABDMMBC2与人BCMA的亲和力测定的结果；
图15是本发明的实施例1中纳米抗体G2与人GPC3的亲和力测定的结果；
图16是本发明的实施例1中纳米抗体CDH1与人CDH17的亲和力测定的结果；
图17是本发明的实施例1中纳米抗体EPCD3与人EPCAM的亲和力测定的结果；
图18是本发明的实施例1中纳米抗体WWD98与人TROP2的亲和力测定的结果；
图19是本发明的实施例2中以抗人CD70单克隆抗体(E3Q1A,69209,Cellsignaling technology)作为一抗，通过免疫组化染色(Immunohistochemical，IHC)发现肾透明细胞癌人源异种移植模型(Patient-derived tumor xenograft,PDX)No.62CD70表达阳性实验结果；
图20是本发明的实施例3中[18F]F-TFP-B6的质量控制图；
图21是本发明的实施例3中[18F]F-TFP-B6免疫PET显像诊断肾细胞癌PET/CT显像图；
图22是本发明的实施例3中[18F]F-TFP-B6免疫PET显像诊断肾细胞癌的感兴趣区(Region of interest，ROI)数据分析图及生物分布图；
图23是本发明的实施例3z中[18F]F-TFP-RW102免疫PET显像诊断结直肠癌PET/CT显像图、ROI数据分析图；
图24是本发明的实施例3中[18F]F-TFP-WWD98免疫PET显像诊断乳腺癌PET/CT显像图、ROI数据分析图；
图25是本发明的实施例4中[18F]F-TFP-B6免疫PET显像临床诊断肾细胞癌颈部淋巴结转移灶的PET/CT显像图。
图26是本发明的实施例4中[18F]F-TFP-B6免疫PET显像临床诊断肾细胞癌腹主动脉旁淋巴结转移灶的PET/CT显像图。
图27是本发明的实施例4中[18F]F-TFP-B6免疫PET显像临床诊断肾细胞癌术区复发灶的PET/CT显像图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：新型纳米抗体及纳米抗体融合蛋白的制备
制备了一种CD70特异性纳米抗体B3，其具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.5所示的基因序列。
制备了一种CD70特异性纳米抗体B6，其具有如SEQ ID No.9所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.10所示的基因序列。
制备了一种CD70特异性纳米抗体融合蛋白ABDB3，其具有如SEQ ID No.14所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.15所示的基因序列。
制备了一种CD70特异性纳米抗体融合蛋白ABDB6，其具有如SEQ ID No.16所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.17所示的基因序列。
制备了一种PD-L1特异性纳米抗体RW102，其具有如SEQ ID No.21所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.22所示的基因序列。
制备了一种PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白ABDWW102，其具有如SEQ ID No.23所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.24所示的基因序列。
制备了一种CD38特异性纳米抗体1053，其具有如SEQ ID No.28所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.29所示的基因序列。
制备了一种CD38特异性纳米抗体融合蛋白ABD1053，其具有如SEQ ID No.30所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.31所示的基因序列。
制备了一种CD47特异性纳米抗体C2，其具有如SEQ ID No.35所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.36所示的基因序列。
制备了一种CD47特异性纳米抗体融合蛋白ABDC2，其具有如SEQ ID No.37所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.38所示的基因序列。
制备了一种BCMA特异性纳米抗体MMBC2，其具有如SEQ ID No.42所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.43所示的基因序列。
制备了一种BCMA特异性纳米抗体融合蛋白ABDMMBC2，其具有如SEQ ID No.44所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.45所示的基因序列。
制备了一种GPC3特异性纳米抗体G2，其具有如SEQ ID No.49所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.50所示的基因序列。
制备了一种GPC3特异性纳米抗体融合蛋白ABDG2，其具有如SEQ ID No.51所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.52所示的基因序列。
制备了一种CDH17特异性纳米抗体CDH1，其具有如SEQ ID No.56所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.57所示的基因序列。
制备了一种CDH17特异性纳米抗体融合蛋白ABDCDH1，其具有如SEQ ID No.58所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.59所示的基因序列。
制备了一种TROP2特异性纳米抗体WWD98，其具有如SEQ ID No.63所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.64所示的基因序列。
制备了一种TROP2特异性纳米抗体融合蛋白ABDWWD98，其具有如SEQ ID No.65所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.66所示的基因序列。
制备了一种EPACM特异性纳米抗体EPCD3，其具有如SEQ ID No.70所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.71所示的基因序列。
然后在HEK293细胞中重组表达单价纳米抗体B3、B6、RW102、1053、C2、MMBC2、G2、CDH1、WWD98和EPCD3及相应的纳米抗体融合蛋白ABDB3、ABDB6、ABDWW102、ABD1053、ABDC2、ABDMMBC2、ABDG2、ABDCDH1和ABDWWD98，其具体步骤如下：质粒抽提、HEK293瞬转表达、抗体纯化及抗体基础质量控制。
下面以ABDB6为例，详述质粒抽提及纳米抗体融合蛋白重组表达所使用的实验材
料及具体实验步骤：
实验材料：
1)大量抽提试剂盒；
2)70％乙醇：取无水乙醇375mL加入到125mL的灭菌去离子水中，混匀后4℃保存；
3)异丙醇；
4)缓冲液P1：提前加入600μL Rnase A(20mg/mL)至120mL的P1溶液中，使Rnase A终浓度在100μg/mL。
实验步骤：
1)取50mL培养(15小时)的菌液加入做好标记干净的50mL离心管中，核对编号是否一致，4℃、5000rpm离心10分倒净上清。
2)向该离心管中加入5mL已加好Rnase A的悬浮液缓冲液P1,用漩涡混合器彻底悬浮细菌沉淀。
3)向该离心管中加入5mL的缓冲液P2(冬天放37℃预热20分钟)，立即轻柔地颠倒混匀，室温放置4分钟。此时菌液由浑浊变为清亮粘稠液体(若不是清亮粘稠液体，呈现浑浊或发白及时汇报并在表单上做上标记)。
4)向该离心管中加入5mL缓冲液P3，立即轻柔地颠倒混合,此时出现白色絮状沉淀。
5)4℃、9000rpm离心10分钟，上清用滤纸过滤至做好标记的干净的50mL离心管中，核对编号是否一致。
6)向收集的滤液中加入2mL的ER缓冲液，上下颠倒充分混匀，冰浴30分钟。
7)柱平衡：在收集菌液离心的过程中，将空柱子置于离心管架上，用ddH2O加满空柱，清洗填料，再用洗脱液加满空柱平衡填料。
8)上样：将ER缓冲液处理后的上清在重力下过已平衡的柱子。
9)将柱子内加满Wash缓冲液重力下洗柱子一次。
10)将柱子放入做好标记的干净的50mL离心管中，核对编号是否一致。用5mL洗脱缓冲液重力下洗脱质粒。
11)向收集的滤液中加入5mL冰冷异丙醇，上下颠倒混匀，12000rpm离心18min，小心轻轻倒去上清液，将其倒置在吸水纸上，随时观察沉淀的位置，防止沉淀被倒掉。
12)加入10mL、70％冰冷的乙醇充分漂洗沉淀，12000rpm离心10分钟。轻轻倒去上清液，将其倒置在吸水纸，随时观察沉淀的位置，防止沉淀被倒掉，最后将沉淀的位置做上标记。
13)将离心管于超净工作台内敞口放置10-20分钟左右，以使乙醇充分挥发。向离心管中加入500μL超纯水，用移液枪充分溶解沉淀。
14)将溶解液转移至干净的已做好标记的1.5mL离心管中，震荡混匀后取样检测浓度及内毒素水平。
所述HEK293瞬转表达所使用的实验材料及实验步骤如下：
实验材料：摇床、离心机、水浴锅、Expi293培养液、转染试剂、各种规格的移液管、各种规格的摇瓶。
| 试剂 | 厂商 | 编号 |
| 293培养液 | 百英生物 | BY20220701 |
| 293转染试剂 | 百英生物 | BY20220701 |
实验步骤：
1)细胞培养。
2)瞬时转染与表达：30mL表达。
溶液1：用1mL培养液稀释60μg质粒，混匀；
溶液2：用1mL培养液稀释15μL转染试剂，混匀；
将溶液2加入溶液1中，混匀，37℃孵育15分钟后，将混合转染液逐滴加入细胞液中，边摇边加，放至摇床培养，表达一周，收集上清，8000rpm离心5min。
所述抗体纯化所使用的实验材料及实验步骤如下：
实验材料：搅拌器、1xPBS、咪唑、Ni-Smart预装柱、各种规格的离心管：
| 试剂 | 厂商 | 编号 |
| 1xPBS | 百英生物 | BY20220807 |
| 150mM咪唑PH8.0 | 百英生物 | BY20220801 |
| 5mM咪唑PH8.0 | 百英生物 | BY20220801 |
实验步骤：Ni-Smart亲和层析柱纯化
1)平衡层析柱:1xPBS，流速1mL/min，20mL
2)上样：流速1mL/min
3)洗杂:1xPBS，流速1mL/min，20mL；5mM咪唑，流速1mL/min
4)洗脱：15 0mM咪唑，1mL/min，分管收集，每管约500uL。共收集10管，使用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值。
5)透析：将高浓度蛋白吸至透析袋放1XPBS的烧杯中透析。
所述抗体基础质量控制所使用的实验材料及实验步骤如下：
1)浓度检测。
2)纯度检测(SDS-PAGE)，检测结果如图2所示。
3)内毒素检测：
实验材料：旋涡振荡器、电热恒温培养箱、内毒素工作标准品、鲎试剂、内毒素检查用水。
实验步骤：
1)样品阳性对照液配制：2倍供试液浓度溶液+内毒素标准品(1.00EU/ml)，1:1混合。
2)供试液制备：
样品稀释倍数：MVD＝C·L/λ
*注：MVD：供试品最大有效稀释倍数；L：供试品细菌内毒素限值(1EU/mg)C:供试品浓度；λ：鲎试剂标示灵敏度；110uL供试液取样量＝C/MVD*110uL。
封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37℃恒温培养箱孵育60min
实验结果：鲎试剂状态是澄清透明不凝固。
实验结论：通过内毒素检测，结果是<1EU/mg，符合要求。
纳米抗体及纳米抗体融合蛋白亲和力测定：
SDS-PAGE测定纳米抗体B3和B6及纳米抗体融合蛋白ABDB3、ABDB6表达情况如图1所示，SDS-PAGE测定纳米抗体RW102及纳米抗体融合蛋白ABDWW102表达情况如图2所示，SDS-PAGE测定纳米抗体1053表达情况如图3所示，SDS-PAGE测定纳米抗体C2及纳米抗体融合蛋白ABDC2表达情况如图4所示，SDS-PAGE测定纳米抗体MMBC2及纳米抗体融合蛋白ABDMMBC2表达情况如图5所示，SDS-PAGE测定纳米抗体G2及纳米抗体融合蛋白ABDG2表达情况如图6所示，SDS-PAGE测定纳米抗体CDH1及纳米抗体融合蛋白ABDCDH1表达情况如图7所示，SDS-PAGE测定纳米抗体EPCD3表达情况如图8所示，SDS-PAGE测定纳米抗体WWD98表达情况如图9所示，可见纳米抗体B3、B6、RW102、1053、C2、MMBC2、G2、CDH1、EPCD3和WWD98分子量约为15kDa，纳米抗体融合蛋白ABDB3、ABDB6、ABDWW102、ABDC2、ABDMMBC2、ABDG2和ABDCDH1分子量约为21kDa，纯度可高达近99％。
表面等离子共振测定纳米抗体B3和B6及纳米抗体融合蛋白ABDB3、ABDB6与人CD70重组蛋白的亲和力的情况如图10所示，表面等离子共振测定纳米抗体RW102及纳米抗体融合蛋白ABDWW102与人PD-L1重组蛋白的亲和力的情况如图11所示，表面等离子共振测定纳米抗体1053与人CD38重组蛋白的亲和力的情况如图12所示，表面等离子共振测定纳米抗体C2及纳米抗体融合蛋白ABDC2与人CD47重组蛋白的亲和力的情况如图13所示，表面等离子共振测定纳米抗体MMBC2及纳米抗体融合蛋白ABDMMBC2与人BCMA重组蛋白的亲和力的情况如图14所示，表面等离子共振测定纳米抗体G2与人GPC3重组蛋白的亲和力的情况如图15所示，表面等离子共振测定纳米抗体CDH1与人CDH17重组蛋白的亲和力的情况如图16所示，表面等离子共振测定纳米抗体EPCD3与人EPCAM重组蛋白的亲和力的情况如图17所示，表面等离子共振测定纳米抗体WWD98与人TROP2重组蛋白的亲和力的情况如图18所示，可见纳米抗体及纳米抗体融合蛋白与相应靶点的人重组蛋白均具有高亲和力。
实施例2：建立CD70表达阳性荷瘤小鼠模型
建立CD70表达阳性荷瘤小鼠模型包括以下步骤：以抗人CD70单克隆抗体抗人CD70单克隆抗体(E3Q1A,69209,Cell signaling technology)作为一抗，通过免疫组化染色(Immunohistochemical，IHC)发现肾细胞癌人源异种移植模型(Patient-derived tumorxenograft,PDX)No.62CD70表达阳性，如图19所示。将2mm*2mm*2mm大小的No.62PDX组织块接种于NCG(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju)小鼠右侧肩部建立皮下肾细胞癌PDX模型。
实施例3：制备探针[18F]F-TFP-B6、[18F]F-TFP-RW102和[18F]F-TFP-WWD98及其在免疫PET显像诊断肾细胞癌、结直肠癌或乳腺癌的应用
(±)-H3RESCA-TFP修饰B6、RW102及WWD98制备中间体TFP-B6、TFP-RW102及TFP-WWD98。具体步骤如下：将1mg B6、RW102或WWD98溶解于0.05M NaHCO3溶液(pH＝8.6)，以摩尔比(±)-H3RESCA-TFP:纳米抗体＝12:1的比例，将新鲜溶于二甲基亚砜(DMSO)的(±)-H3RESCA-TFP加至上述纳米抗体溶液。将反应体系置于室温反应2小时，然后以0.1MCH3COONH4溶液(pH＝4.6)作为流动相，用预平衡的PD-10脱盐柱(GE Healthcare)纯化经(±)-H3RESCA-TFP修饰的纳米抗体，收集TFP-B6、TFP-RW102及TFP-WWD98；再用截断值为10KDa的超滤管(Merck Millipore)浓缩，用NanoDrop测定TFP-B6、TFP-RW102及TFP-WWD98浓度，分装置于-80℃备用。
18F标记TFP-B6、TFP-RW102及TFP-WWD98制备[18F]F-TFP-B6、[18F]F-TFP-RW102和[18F]F-TFP-WWD98。具体步骤如下：将500μL18F溶液(约100mCi)加入QMA柱(Waters GmbH,Germany)，使用500μL生理盐水冲洗QMA柱并收集18F溶液，向其中加入16μL 2mM氯化铝溶液(pH 4.4-4.6)，室温静置5分钟。向反应体系中加入偶连备用的TFP-B6、TFP-RW102及TFP-WWD98 200μg加至反应体系中，加入800μL 0.1M CH3COONH4溶液(pH＝4.6)，将反应体系置于恒温振荡器在室温反应12分钟，标记反应结束后以生理盐水作为流动相，再次用预平衡的PD-10脱盐柱分离游离68Ga、纯化终产物；按照上述步骤所得未衰减校正放射化学产率(Radiochemical yield，RCY)>50％。
[18F]F-TFP-B6、[18F]F-TFP-RW102和[18F]F-TFP-WWD98质量控制。吸取10μL[18F]F-TFP-B6、[18F]F-TFP-RW102和[18F]F-TFP-WWD98在硅胶板上点样，用生理盐水作为流动相，用放射性薄层色谱仪(Radio-TLC，Eckert&Ziegler Radiopharma Inc)测定探针的放射化学纯度(Radiochemical purity，RCP)。如图20所示，新鲜制备的[18F]F-TFP-B6的RCP大于99％。
[18F]F-TFP-B6免疫PET显像诊断肾细胞癌的实验结果如图21所示。包括以下步骤：本研究所涉及的小动物PET/CT显像采集均使用IRIS小动物PET/CT扫描仪(InviscanImaging Systems)完成。封闭组在注射显像剂([18F]F-TFP-B6)前48小时注射ABDB6(20mg/kg)，未封闭组则不注射。每只小鼠经尾静脉注射3.7-7.4MBq[18F]F-TFP-B6(每组3只)，在注射后的30分钟用混有氧气的异氟烷(浓度为2％)麻醉小鼠，并将进入深度麻醉状态的小鼠以仰卧位姿势置于PET/CT扫描床上，续惯采集PET和CT图像，用IRIS系统自带软件完成图像重建。用OsiriX Lite图像处理工作站(Pixmeo SARL)在重建后的PET图像上勾画心脏及主要组织脏器(肝、肺、肾脏、肌肉)等感兴趣区(Region of interest,ROI)，以％ID/g(percent of injected dose per gram)为单位计算重要组织器官的放射性摄取值。PET/CT结果如图21所示，左右部分分别显示封闭组和未封闭组的显像结果。如图可看出CD70特异性纳米抗体探针[18F]F-TFP-B6在肿瘤组织有较高的摄取，在主要排泄(肾脏)组织有较高的非特异性摄取，且ABDB6对肿瘤细胞表面CD70的封闭可显著降低单价纳米抗体探针在肿瘤组织的摄取。通过勾画ROI分析[18F]F-TFP-B6在体内的分布情况，此外，体外生物分布实验结果进一步揭示了探针在体内主要组织器官的分布情况。通过对ROI数据及体外生物数据进行统计分析，可看出封闭组的肿瘤摄取明显低于未封闭组，结果如图22所示，上方显示ROI图，下方显示体外生物分布数据图。上述结果表明[18F]F-TFP-B6探针可无创可视化CD70表达。
[18F]F-TFP-RW102免疫PET显像诊断结直肠癌的实验结果如图23所示。每只小鼠经尾静脉注射3.7-7.4MBq[18F]F-TFP-RW102(每组3只)，在注射后的30分钟后采集PET/CT图像。图23左侧显示PET/CT图，右侧显示ROI图。如图可看出PD-L1特异性纳米抗体探针[18F]F-TFP-RW102在肿瘤组织有较高的摄取，在主要排泄(肾脏)和代谢(肝脏)组织有较高的非特异性摄取。通过勾画ROI分析[18F]F-TFP-RW102在体内的分布情况，此外，体外生物分布实验结果进一步揭示了探针在体内主要组织器官的分布情况。上述结果表明[18F]F-TFP-RW102探针可无创可视化PD-L1表达。
[18F]F-TFP-WWD98免疫PET显像诊断乳腺癌的实验结果如图24所示。每只小鼠经尾静脉注射3.7-7.4MBq[18F]F-TFP-WWD98(每组3只)，在注射后的30分钟后采集PET/CT图像。图24左侧显示PET/CT图，右侧显示ROI图。如图可看出TROP2特异性纳米抗体探针[18F]F-TFP-WWD98在肿瘤组织有较高的摄取，在主要排泄(肾脏)和代谢(肝脏)组织有较高的非特异性摄取。通过勾画ROI分析[18F]F-TFP-WWD98在体内的分布情况，此外，体外生物分布实验结果进一步揭示了探针在体内主要组织器官的分布情况。上述结果表明[18F]F-TFP-WWD98探针可无创可视化TROP2表达。
实施例4：探针[18F]F-TFP-B6在免疫PET显像诊断肾细胞癌的临床应用
[18F]F-TFP-B6在肾细胞癌术后患者体内的免疫PET显像的实验结果如图25至图27所示。包括以下步骤：本研究所涉及的患者PET/CT显像采集均使用西门子PET/CT联合扫描仪完成。患者经肘静脉注射3.7-5.55MBq/kg的[18F]F-TFP-B6，在注射后1小时进行图像采集，患者采取仰卧位，手臂抬高至头顶。扫描过程中患者保持呼吸平稳，尽量避免图像融合误差。CT扫描后立刻进行PET成像，每个床位采集时间为2分钟。PET/CT图像由两名核医学科医生进行评估，[18F]F-TFP-B6摄取增高或CT图像提示的肿瘤区域为感兴趣区(region ofinterest,ROI)，根据CT勾画出感兴趣区并通过以下公式计算ROI的最大标准化摄取值(maxium standardized uptake value,SUVmax)：SUV＝[局部感兴趣区平均放射性活度(MBq/mL)]/[注入放射性活度(MBq)/体重(g)]。图25至图27左上显示CT图，右上显示PET图，左下显示PET/CT融合图像，右下显示MIP图。如图可看出CD70特异性纳米抗体探针[18F]F-TFP-B6在肾细胞癌淋巴结转移部位(图25、图26)以及术后复发肿瘤部位(图27)有较高的摄取，在排泄(右肾)组织有较高的非特异性摄取。上述结果表明[18F]F-TFP-B6探针可无创可视化CD70表达。
需要说明的是，本发明的说明书及其附图中给出了本发明的较佳的实施例，但是，本发明可以通过许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例，这些实施例不作为对本发明内容的额外限制，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。并且，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；进一步地，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (11)
1.一种18F标记纳米抗体探针，其特征在于，包含经放射性核素18F标记的纳米抗体或纳米抗体融合蛋白，
优选地，使用放射性核素18F标记纳米抗体或纳米抗体融合蛋白包括：
(1)使用化合物修饰纳米抗体或纳米抗体融合蛋白，得到放射性核素标记前体，和
(2)使用放射性核素18F标记所述前体，得到经放射性核素18F标记的纳米抗体或纳米抗体融合蛋白，
优选地，步骤(1)中所述化合物包括(±)-H3RESCA-TFP。
2.根据权利要求1所述的18F标记纳米抗体探针，其特征在于，所述纳米抗体选自纳米抗体B3、B6、RW102、1053、C2、MMBC2、G2、CDH1、WWD98和EPCD3，
所述纳米抗体B3包含具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的CDR3，优选地，所述纳米抗体B3包含SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，
所述纳米抗体B6包含具有SEQ ID No.6所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.7所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.8所示的氨基酸序列的CDR3，优选地，所述纳米抗体B6包含SEQ ID No.9所示的氨基酸序列，
所述纳米抗体RW102包含具有SEQ ID No.18所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNo.19所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.20所示的氨基酸序列的CDR3，优选地，所述纳米抗体RW102包含SEQ ID No.21所示的氨基酸序列，
所述纳米抗体1053包含具有SEQ ID No.25所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNo.26所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.27所示的氨基酸序列的CDR3，优选地，所述纳米抗体1053包含SEQ ID No.28所示的氨基酸序列，
所述纳米抗体C2包含具有SEQ ID No.32所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.33所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.34所示的氨基酸序列的CDR3，优选地，所述纳米抗体C2包含SEQ ID No.35所示的氨基酸序列，
所述纳米抗体MMBC2包含具有SEQ ID No.39所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNo.40所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.41所示的氨基酸序列的CDR3，优选地，所述纳米抗体MMBC2包含SEQ ID No.42所示的氨基酸序列，
所述纳米抗体G2包含具有SEQ ID No.46所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.47所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.48所示的氨基酸序列的CDR3，优选地，所述纳米抗体G2包含SEQ ID No.49所示的氨基酸序列，
所述纳米抗体CDH1包含具有SEQ ID No.53所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNo.54所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.55所示的氨基酸序列的CDR3，优选地，所述纳米抗体CDH1包含SEQ ID No.56所示的氨基酸序列，
所述纳米抗体WWD98包含具有SEQ ID No.60所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNo.61所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.62所示的氨基酸序列的CDR3，优选地，所述纳米抗体WWD98包含SEQ ID No.63所示的氨基酸序列，
所述纳米抗体EPCD3包含具有SEQ ID No.67所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNo.68所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.69所示的氨基酸序列的CDR3，优选地，所述纳米抗体EPCD3包含SEQ ID No.70所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的18F标记纳米抗体探针，其特征在于，所述纳米抗体融合蛋白包含根据权利要求2所述的纳米抗体和白蛋白结合域，
优选地，所述纳米抗体和白蛋白结合域之间含有连接子，
优选地，所述连接子具有SEQ ID No.11所示的氨基酸序列，
优选地，所述白蛋白结合域具有SEQ ID No.13所示的氨基酸序列，
优选地，所述纳米抗体融合蛋白具有SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.23、SEQID No.30、SEQ ID No.37、SEQ ID No.44、SEQ ID No.51、SEQ ID No.58或SEQ ID No.65所示的氨基酸序列。
4.一种制备18F标记纳米抗体探针的方法，其特征在于，包括
(1)使用化合物修饰纳米抗体或纳米抗体融合蛋白，得到放射性核素标记前体，和
(2)使用放射性核素18F标记所述前体，得到经放射性核素18F标记的纳米抗体或纳米抗体融合蛋白，
优选地，步骤(1)中所述化合物包括配体(±)-H3RESCA-TFP。
优选地，所述纳米抗体是根据权利要求2所述的纳米抗体，
优选地，所述纳米抗体融合蛋白是根据权利要求3所述的纳米抗体融合蛋白。
5.一种纳米抗体或纳米抗体融合蛋白，其特征在于，所述纳米抗体是根据权利要求2所述的纳米抗体，所述纳米抗体融合蛋白是根据权利要求3所述的纳米抗体融合蛋白。
6.一种多核苷酸，其特征在于，编码根据权利要求5所述的纳米抗体或纳米抗体融合蛋白，
优选地，编码纳米抗体的多核苷酸包含SEQ ID No.5、10、22、29、36、43、50、57、64或71所示的核苷酸序列，
编码纳米抗体融合蛋白的多核苷酸包含SEQ ID No.15、17、24、31、38、45、52、59或66所示的核苷酸序列。
7.一种载体，其特征在于，包含根据权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种宿主细胞，其特征在于，包含根据权利要求7所述的载体。
9.如权利要求1-3中任一项所述的18F标记纳米抗体探针用作免疫正电子发射断层扫描(PET)显像探针的用途。
10.一种用于受试者中肿瘤的诊断、靶向治疗和/或治疗后疗效评价和/或用于免疫治疗受试者的筛选的试剂盒或组合物，其特征在于，包含根据权利要求1-3中任一项所述的18F标记纳米抗体探针、根据权利要求5所述的纳米抗体或纳米抗体融合蛋白、根据权利要求6所述的多核苷酸、根据权利要求7所述的载体或根据权利要求8所述的宿主细胞。
11.如权利要求1-3中任一项所述的18F标记纳米抗体探针、如权利要求5所述的纳米抗体或纳米抗体融合蛋白、如权利要求6所述的多核苷酸、如权利要求7所述的载体或如权利要求8所述的宿主细胞在制备用于受试者中肿瘤的诊断、靶向治疗和/或治疗后疗效评价和/或用于免疫治疗受试者的筛选的药物中的用途。
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