CN117257994A - 动物模型的构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开动物模型的构建方法及应用。本发明在综合考虑人工绝经与自然绝经不同的绝经方式、免疫系统、以及雌雄性别本身的差异对芳香化酶抑制剂内分泌治疗的影响后，首先在年轻人工绝经雌鼠上进行不同浓度梯度的AI干预找出最佳造模浓度及作用时间，之后选用最佳造模浓度在雄鼠和老年自然绝经雌鼠身上对模型进行比较与验证，并且模拟临床上出现痛感觉、痛情绪不能缓解时停药的处理来进一步确定最佳模型的动物类型。

Description

动物模型的构建方法及应用
技术领域
本发明涉及乳腺癌治疗疼痛动物模型，具体地涉及一种贴合临床芳香化酶抑制剂(AI)治疗相关的疼痛动物模型及其应用。
背景技术
乳腺癌是全球最常见的恶性肿瘤。约60%的绝经前患者和75%的绝经后患者是激素受体阳性的肿瘤，雌激素可以与雌激素受体结合以加速乳腺癌发展和转移。女性绝经前的雌激素主要由卵巢产生，而绝经后卵巢萎缩，雌激素主要是在外周组织由肾上腺分泌的雄激素在芳香化酶的作用下转化而来。芳香化酶是这一转变过程的关键限速酶，能够使雄烯二酮和睾酮转化成雌酮和雌二醇。因此对于绝经后的乳腺癌患者，芳香化酶抑制剂(AI)是其一线治疗药物，能够提高无病生存期并降低对侧乳腺癌的发生率。研究结果显示，对于绝经前激素受体阳性乳腺癌患者而言，人工绝经联合AI能够显著降低8年远处转移和复发风险，延长无病生存期，<35岁患者的获益最多，并且之前使用人工绝经联合他莫昔芬后续更改为人工绝经联合AI可以进一步降低复发风险，因此AI的使用越来越广泛。
AI治疗是一个长期的过程，持续5-10年。临床实践中发现AI治疗过程中会诱导产生痛感觉、痛情绪、衰弱以及睡眠质量变差等不良反应，导致患者生活质量下降，用药依从性降低,而由此导致的早期自主停药与总体死亡率的增加有关。由于临床上乳腺癌患者化疗放疗等也可诱导周围神经病变进而引起疼痛等不良反应，因此难以严格评估AI与痛感觉和痛情绪之间的直接关系。目前没有能够对AI产生的不良影响进行有效评估的动物模型，特别是能够表现出较好的临床相关性，更贴合临床情况的动物模型。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明针对贴合临床实际情况的动物模型进行了深入研究，在综合考虑人工绝经与自然绝经不同的绝经方式、免疫系统、以及雌雄性别本身的差异对芳香化酶抑制剂内分泌治疗的影响后，发明人在年轻人工绝经雌鼠上进行不同浓度梯度的AI干预找出最佳造模浓度及作用时间，之后选用最佳造模浓度在雄鼠和老年自然绝经雌鼠身上对模型进行比较与验证，进一步确定最佳模型的动物类型，由此得到一种贴合临床实际情况的动物模型。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种动物模型的构建方法，其包括以下步骤：
(1) 取年轻雌性动物进行人工绝经；
(2) 以每天0.1-1.5mg/kg的剂量将芳香化酶抑制剂施用至人工绝经后的动物；和
(3) 检测步骤(2)后动物的行为特征和/或生物指标。
在某些实施方案中，根据本发明所述的动物模型的构建方法，其中，所述年轻雌性动物为5-20周的鼠。
在某些实施方案中，根据本发明所述的动物模型的构建方法，其中，所述人工绝经通过卵巢切除术进行。
在某些实施方案中，根据本发明所述的动物模型的构建方法，其中，所述行为特征包括痛感觉、痛情绪、运动协调性和运动耐力中的至少一种。
在某些实施方案中，根据本发明所述的动物模型的构建方法，其中，所述行为特征检测包括痛阈、热缩足反射潜伏期、运动能力、焦虑情绪和快感样行为中至少一种的测定或检测。
在某些实施方案中，根据本发明所述的动物模型的构建方法，其中，所述生物指标为IL-1β含量和/或胸腺细胞数量。
本发明的第二方面，提供一种模拟芳香化酶抑制剂治疗时临床症状的方法，其包括：
(1’) 确定所期望的临床症状；
(2’) 根据所期望的临床症状确定芳香化酶抑制剂的用量，并将其施用至人工绝经后的动物；
(3’) 检测步骤(2)后动物的行为特征和/或生物指标。
本发明的第三方面，提供一种用于鉴定对缓解疼痛症状有用的化合物的方法，其包括以下步骤：
(a) 测试动物模型的行为特征和/或生物指标得到第一测试数据；
(b) 向所述动物模型施用待测化合物；
(c) 测试施用待测化合物后所述动物模型的行为特征和/或生物指标得到第二测试数据；和
(d) 将第二测试数据与第一测试数据进行比较的步骤；
其中，所述动物模型通过第一方面所述的构建方法得到。
本发明的第四方面，提供一种对缓解疼痛症状有用的化合物，其通过第三方面所述的方法得到。
本发明的第五方面，提供一种用于缓解疼痛症状的药物组合物，其包括根据第四方面所述的化合物。
附图说明
图1：不同浓度来曲唑对年轻雌性、老年自然绝经雌性以及年轻雄性C57BL/6J小鼠体重的影响。结果以平均值±标准误表示，图1的A：年轻雌性(AI治疗30d): F(24,504) =8.7, P =＜0.0001，各组中n = 16-20; 图1的B：年轻雌性(AI治疗11d后停药): F(24,396)= 7.1, P =＜0.0001，各组中n = 12，重复测量方差分析；图1的C：老年雌性(AI治疗11d后停药)：(F(6,59) = 5.6, P =0.0001，各组中n = 5-6，方差分析)；图1的D：年轻雄性(AI治疗11d后停药)：(F(18,144) = 40.4, P ＜0.0001，各组中n = 10，重复测量方差分析)，*：与基线(0d)相比，#:与假手术空白组(Sham-vehicle)或老年空白组(Old-vehicle)相比，方差分析；*P < 0.05; **P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001；OVX：卵巢切除术，AI：芳香化酶抑制剂。
图2：来曲唑对年轻雌性、老年自然绝经雌性以及年轻雄性C57BL/6J小鼠机械痛阈的影响及停药后机械痛阈的变化情况。结果以平均值±标准误表示, 图2的A：年轻雌性(AI治疗30d): (F(28，401)= 8.38，P=＜0.0001，各组中n =10-20)；图2的B：年轻雌性(AI治疗11d后停药)：(F(22,563) = 3.28，P < 0.0001，各组中n = 10-20；图2的C：老年雌性(AI治疗11d后停药)：(F(8,144) = 4.77, P ＜0.0001, 各组中n = 10-12)；图2的D：年轻雄性(AI治疗11d后停药)：(F(8,283) = 28.49, P ＜0.0001, 各组中n = 12-20), *：与基线相比，#:与OVX-vehicle相比，方差分析 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P <0.0001) OVX：卵巢切除术，AI：芳香化酶抑制剂。
图3：来曲唑对年轻雌性、老年自然绝经雌性以及雄性C57BL/6J小鼠热痛阈的影响。结果以平均值±标准误表示。图3的A：年轻雌性(AI治疗30d): (F(24,897) = 1.67, P=0.02, 各组中n = 22-38); 图3的B：老年雌性(AI治疗11d)：(F(3,33) = 0.26, P =0.9,各组中n = 5-8)；图3的C：年轻雄性(AI治疗11d)：(F(4,78) = 1.51, P=0.2, 各组中n =10-24), #:与OVX-vehicle相比，方差分析; ##P < 0.01) OVX：卵巢切除术，AI：芳香化酶抑制剂。
图4：不同浓度来曲唑对年轻人工绝经雌性、老年自然绝经雌性以及年轻雄性C57BL/6J小鼠旷场总距离以及中心区域停留时间的影响。结果以平均值±标准误表示。图4的A：年轻雌性(AI治疗11d总距离): (F(8,253) = 0.09，P =0.99，各组中n = 15-19); 图4的B：年轻雌性(AI治疗11d中心区域活动时间)：(F(8,244) = 2.84, P =0.005, 各组中n =15-19，#:与假手术空白组相比，#P＜0.05，##P < 0.01) 图4的C：老年雌性(AI治疗11d总距离)：(F(1，10)= 0.75，P=0.4，各组中n = 6)；图4的D：老年雌性(AI治疗11d中心区域活动时间)：(F(1,10) = 0.09，P=0.8，各组中n = 6)；图4的E：年轻雄性(AI治疗11d总距离)：(F(1，12) = 1.2，P=0.3，各组中n =7)；图4的F：年轻雄性(AI治疗11d中心区域活动时间)：(F(1,12) = 0.008, P=0.9，各组中n =7)，OVX：卵巢切除术，AI：芳香化酶抑制剂。
图5：不同浓度来曲唑对年轻雌性、老年自然绝经雌性以及雄性C57BL/6J小鼠糖水偏好指数的影响。结果以平均值±标准误表示。图5的A：年轻雌性(AI治疗30d): (F(24,511)= 2.4，P=0.0003, 各组中n = 14-18, *:与基线(0d)相比，*，P<0.05；**，P<0.01；#:与OVX-vehicle相比，#，P<0.05；##，P<0.01；###，P<0.001,方差分析); 图5的B：老年雌性(AI治疗11d)：(F(3,36) = 0.6, P=0.6, 各组中n = 5-6)；图5的C：年轻雄性(AI治疗11d)：(F(3,48) = 0.5, P=0.7，各组中n = 7) OVX：卵巢切除术，AI：芳香化酶抑制剂。
图6：不同浓度来曲唑对年轻雌性、年轻雄性C57BL/6J小鼠在棒时间的影响。结果以平均值±标准误表示。图6的A：年轻雌性(AI治疗30d): (F(4,591) = 4.8, P =0.0008 n=各组中17-19, *:与基线(0d)相比，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001, 2-way RepeatedMeasures ANOVA; Holm–Sidak post hoc analysis); 图6的B：年轻雄性(AI治疗11d)：(F(2.73,46.5) = 4.9, P=0.006, 各组中n = 9-10， *：与基线相比，*，P<0.05，重复测量方差分析) OVX：卵巢切除术，AI：芳香化酶抑制剂。
图7：来曲唑对年轻雌性C57BL/6J小鼠血清IL-1β的影响。结果以平均值±标准误表示。*：与基线(假手术空白组)相比，**，P<0.01；#：与OVX-vehicle相比，#，P<0.05；####，P<0.0001，n=各组中12-20，非配对学生t检验，OVX：卵巢切除术，AI：芳香化酶抑制剂。
图8：不同浓度来曲唑对年轻雌性C57BL/6J小鼠胸腺细胞计数的影响。结果以平均阈值±标准误表示。*：与基线(假手术空白组)相比，*，P<0.05；#：与OVX-vehicle相比，##，P<0.01；###，P<0.001，各组中n=8-9，非配对学生t检验，OVX：卵巢切除术，AI：芳香化酶抑制剂。
图9：不同浓度IL-2对年轻雌性C57BL/6J小鼠疼痛的影响。结果以平均值±标准误表示。7500单位，10，000单位和15，000单位IL-2使C57BL/6J小鼠疼痛减轻: (F (28, 320)= 26.28，P<0.0001), 其中10，000单位效果最佳。各组中n = 5-6, *:与对照组相比，方差分析); OVX：卵巢切除术，AI：芳香化酶抑制剂。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本领域技术人员应理解，表示步骤的编号(1)、(2)，或(a)、(b)，或(1’)、(2’)等仅为了区别不同步骤目的，并没有表示步骤先后顺序的含义。只要能够实现本发明的目的，上述步骤的顺序并不特别限定。此外，两个以上的上述步骤可合并同时进行。另外，本领域技术人员还应理解的是，在步骤之间例如步骤(1)-(3)前后，或这些任意步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。
[动物模型的构建]
本发明的第一方面，提供一种动物模型的构建方法，本文有时简单为“本发明的构建方法”，其包括以下步骤：
(1) 取年轻雌性动物进行人工绝经；
(2) 以每天0.1-1.5mg/kg的剂量将芳香化酶抑制剂施用至人工绝经后的动物；和
(3) 检测步骤(2)后动物的行为特征和/或生物指标。
本发明的构建方法中，用于构建动物模型的动物只要为雌性，则不特别限定，一般为非灵长类动物哺乳动物，如猪、狗、猫、鼠等。优选鼠，包括大鼠、小鼠等。本发明用于构建动物模型的动物一般为雌性动物，优选为非绝经期雌性动物。在某一实施方案中，本发明的动物为雌性鼠，其一般为5-20周，如6-18周、8-15周等。
本发明的构建方法中，人工绝经的方式不特别限定，只要能够使动物卵巢不产生雌激素的方式即可，包括药物方式或手术方式。在示例性实施方案中，本发明通过卵巢切除术进行人工绝经。
本发明的构建方法中，进一步包括向人工绝经的动物施用芳香化酶抑制剂药物的步骤。芳香化酶抑制剂的用量一般为0.1-1.5mg/kg，如0.5-1.2 mg/kg，0.6-1 mg/kg等。如果用量过高，则可能对动物产生不利影响，甚至产生毒性，或者使动物死亡。另一方面，如果用量过低，则倾向于不能对外周组织由肾上腺分泌的雄激素产生有效抑制。本发明的构建方法中，用药频率不限定，例如3天1次至1天10次不等。如3天2次、3天4次、2天3次、2天5次、1天1次、1天2次、1天3次、1天4次等。具体用药量及用药频率一般根据临床情况而定。示例性地，芳香化酶抑制剂以0.1-1.5mg/kg，每天1次施用。
本发明的构建方法中，在人工绝经和施用化合物后进一步检测动物的行为特征和/或生物指标，从而确认或优化构建条件的步骤。其中，行为特征的检测包括痛感觉、痛情绪、运动协调性和运动耐力中至少一种的检测或测定。在某些实施方案中，本发明的行为特征包括痛阈、热缩足反射潜伏期、运动能力、焦虑情绪和快感样行为中的至少一种。其中，生物指标包括IL-1β含量和/或胸腺细胞数量。优选地，IL-1β含量为血清中的含量。胸腺细胞数量为胸腺组织内的数量。本发明中，检测动物的行为特征和/或生物指标的时间不特别限定，示例性地，可以是用药后或持续用药后第5-20天，如第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天等。
[模拟芳香化酶抑制剂治疗时临床症状的方法]
本发明的第二方面，提供模拟芳香化酶抑制剂治疗时临床症状的方法，本文有时简称为“本发明的模拟方法”，其包括：
(1’) 确定所期望的临床症状；
(2’) 根据所期望的临床症状确定芳香化酶抑制剂的用量，并将其施用至人工绝经后的动物；和
(3’) 检测步骤(2)后动物的行为特征和/或生物指标。
本发明的模拟方法中，所期望的临床症状是指需要模拟的芳香化酶抑制剂治疗时的临床症状，其包括AI治疗期间出现的痛感觉、痛情绪以及停药后恢复的症状，特别是能够模拟焦虑、抑郁症状，而此类症状在老年自然绝经雌鼠与年轻雄鼠中并不会出现。
在某些实施方案中，所期望的临床症状为患者因服用来曲唑出现难以缓解的痛感觉，建议患者停药以缓解症状。根据该症状确定来曲唑的用量为0.6mg/kg，在施用至人工绝经的小鼠11天后对小鼠进行停药处理。进一步包括检测小鼠机械痛阈的变化的步骤。
[用于鉴定对缓解疼痛症状有用的化合物的方法]
本发明的第三方面，提供用于鉴定对缓解疼痛症状有用的化合物的方法，本文中有时简称为“本发明的鉴定方法”，其包括以下步骤：
(a) 测试动物模型的行为特征和/或生物指标得到第一测试数据；
(b) 向所述动物模型施用待测化合物；
(c) 测试施用待测化合物后所述动物模型的行为特征和/或生物指标得到第二测试数据；和
(d) 将第二测试数据与第一测试数据进行比较的步骤；
本发明的鉴定方法中，动物模型通过本发明第一方面所述的构建方法得到，其已经施用特定量的AI药物或持续施用特定量的AI药物。
在某些实施方案中，行为特征为机械痛阈，如果施用待测化合物后所述动物模型的机械痛阈升高，则将所述待测化合物鉴定为对缓解疼痛症状有用。
在某些实施方案中，行为特征为旷场实验中记录的中心区域停留时间，如施用待测化合物后所述动物模型的中心区域停留时间提高，则将所述待测化合物鉴定为对缓解疼痛症状有用。
在某些实施方案中，行为特征为焦虑时，如施用待测化合物后所述动物模型的焦虑消失或缓解，则将所述待测化合物鉴定为对缓解疼痛症状有用。
在某些实施方案中，行为特征为运动协调性，如果施用待测化合物后所述动物模型的运动协调性提高，则将所述待测化合物鉴定为对缓解疼痛症状有用。
在某些实施方案中，生物指标为血清IL-1β含量，如果施用待测化合物后所述动物模型血清中IL-1β含量降低，则将所述待测化合物鉴定为对缓解疼痛症状有用。
在某些实施方案中，生物指标为胸腺细胞数目，如果施用待测化合物后所述动物模型的胸腺细胞数目提高，则将所述待测化合物鉴定为对缓解疼痛症状有用。
[用于缓解疼痛症状的化合物和药物组合物]
本发明的第四方面，提供一种用于缓解疼痛症状的化合物，其为根据本发明第三方面所述方法得到的化合物。优先地，本发明的化合物为IL-2。通过本发明的动物模型，发明人筛选得到一种对于缓解疼痛症状有效的化合物IL-2。当以1,000IU至50,000IU剂量施用时能够显著减轻来曲唑引起的疼痛。优选地，剂量范围为2,000IU至40,000IU、4,000IU至30,000IU、6,000IU至20,000IU、8,000IU至10,000IU。
实施例1
一、实验方法：
1、动物
本发明的研究已经获得北京大学人民医院伦理委员会的批准。8-10w雌性C57BL/6J小鼠480只、雄性C57BL/6J小鼠113只和24month老年绝经雌鼠58只(购自北京大学医学部动物实验中心)在SPF级动物房饲养。动物饲养环境安静，室温维持在23℃左右，湿度55％左右，明暗各12小时，自由摄食水，动物适应环境1w后开始进行基线测试。为了避免不同行为范式对小鼠行为的干扰，每组小鼠只进行一种行为学范式进行研究。
2、双侧卵巢切除术实现年轻小鼠人工绝经
为了模拟绝经后的状态，年轻雌性C57BL/6J(年轻雌性)小鼠在10w大时接受卵巢切除术(ovariectomized, OVX)。动物单次给予三溴乙醇(240mg/kg，腹腔注射)行全身麻醉。动物被放置在腹侧卧位的暖地毯上，采用碘伏消毒皮肤，确保消毒效果。在小鼠背部正中开长约１厘米的纵切口，逐层切开皮肤和皮下组织，在两侧的肌肉下暴露卵巢白斑(覆盖在卵巢上的脂肪垫)。在双侧白斑上做一个小切口，轻轻地将带有脂肪垫的卵巢与子宫角分开，显露出双侧卵巢并取下，用6.0可吸收丝缝线环扎。假手术组(sham surgery)显露卵巢后用镊子夹持１秒，但不切除卵巢。切口肌肉和皮肤进行缝合后，在手术部位滴2滴4%利多卡因以降低术后疼痛。术后1w单笼单只饲养小鼠，待伤口恢复后每笼6只饲养。连续5天进行阴道涂片，如镜检呈现不规则动情周期即人工绝经成功，挑选人工绝经成功的小鼠进行试验。
3、干预药物的选择及研究步骤
选取来曲唑作为示例性AI药物进行研究。来曲唑的临床推荐剂量为2.5mg，一天一次，根据说明书推荐的小鼠与人的体表面积换算，小鼠的等效剂量为0.6mg/kg。本发明选取0、0.06mg/kg、0.6mg/kg、6mg/kg进行研究。
研究分为几个步骤：
3.1 人工绝经年轻小鼠不同剂量芳香化酶抑制剂诱导的行为学改变：根据给药剂量不同实验分组为Sham、OVX-vehicle、OVX-AI-0.06、OVX-AI-0.6、OVX-AI-6。确定人工绝经成功后，连续4周每天1次对年轻雌性C57BL/6J小鼠进行灌胃处理。
3.2 等效剂量AI在老年自然绝经鼠(老年空白和Old-AI)中的作用：
3.3 等效剂量AI在年轻雄鼠(Male-vehicle和Male-AI)中的作用：
3.4 临床上当患者因服用来曲唑出现难以缓解的痛感觉时，临床医生会建议患者停药以缓解症状，因此我们也模拟了这种临床现象，在用药11d后对小鼠进行停药处理，观察不同组别小鼠机械痛阈的变化。
4、行为学测试
4.1 痛感觉的测定：
(1) 后爪机械痛阈测定
用 Von Frey 纤维丝法，以up-down法检测鼠的机械缩足阈值。测定前小鼠先适应30 min，从金属筛网下部垂直刺激鼠双侧后肢足底正中，持续4-6s，鼠出现缩足和舔足视为阳性反应，否则为阴性反应。刺激强度从0.4g开始，当该强度不能引起阳性反应，则增加刺激强度；如出现阳性反应则减小刺激强度，顺序为0.02g、0.04g、0.07g、0.16g、0.4g、0.6g、1.0g、1.4g、2.0g、4.0g，直至连续出现阳性反应和阴性反应时，从第1次阳性反应开始继续依照 up and down 法测试5次，最大强度为4.0g。若小鼠对刺激最大值4.0g或最小值0.04g纤维丝无反应，50% PWT分别记为4.0 g或0.04 g。依据文献算法得出 50%机械缩足阈值。根据来曲唑的药效动力学，在每次灌胃3h后进行机械痛的测定。
(2) 后爪热缩足反射潜伏期测定
将清醒动物放置于具有光滑表面、温度传导良好的玻璃板子上的有机盒子内适应20 min，按Hargreaves'法用热辐射刺激仪辐射热光源照射小鼠足底。照射开始和鼠抬腿回避之间的时间为热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency, TWL)。热刺激强度调整为对照组基础值6-8 S，并在整个实验过程中保持一致，自动切断时间设为20 S，以免造成热辐射组织损伤。为避免或减少前一次刺激对随后造成的影响，同一部位刺激的间隔时间为 10 min，连续测定3次，取平均值为鼠TWL值。
4.2 痛情绪的测定：
(1) 旷场实验
为了确定小鼠的总体健康状况以及焦虑的发生情况，在旷场实验中评估运动能力以及焦虑情绪。将小鼠放在圆形不透明容器的中心(直径70 cm)，没有任何先前的习惯，进行10分钟的监测。自动视频跟踪系统(ANY-maze，美国)可记录不同的参数(包括总距离、中心区域停留时间、直立次数等)并进行分析。每只小鼠测试后，空地被清理干净。
(2)糖水偏好实验
快感缺乏被认为是抑郁症的核心症状之一，糖水偏好实验能够评估研究中啮齿类动物快感样行为。在实验开始前2d，单笼单只饲养小鼠以提前适应环境。糖水偏好实验包括适应训练以及测试部分。在前24h每笼放入两瓶1%(w/v)的蔗糖溶液，紧接着24h将其中的一瓶换成纯水，适应结束后，选择事前称量好的两个瓶子，一瓶为1%(w/v)的蔗糖溶液，另一瓶为纯水， 60h 后，取走两瓶并称重，记录小鼠的总液体消耗、糖水消耗和纯水消耗。糖水偏好指数计算公式：糖水消耗量／(糖水消耗量＋纯水消耗量)×100％。
4.3 运动协调以及耐力的测定：
使用转棒式疲劳仪(旋转杆的直径，3.0 cm)评估了小鼠运动协调性以及耐力(YLS-4C型，济南益延科技发展有限公司，济南，中国)。使用前先对小鼠进行筛选训练，训练时捏住小鼠尾尖，使其在转棒上爬行，转速调到10转/分，爬行一段时间后逐渐放松鼠尾，使其不再依靠鼠尾平衡身体时可完全放手，挑选时对于跳跃和团身抱轴的鼠弃之不用，每批训练30分钟连续训练两天就可进行实验使用。正式实验时参数设置为0-40 rpm，加速5分钟，维持5分钟。从将小鼠放置在固定杆上到杆加速后脱落的时间，以秒为单位测量其运动协调功能。
5、免疫相关生物指标
5.1 血清IL-1β含量
使用小鼠IL-1β试剂盒(酶免，江苏，中国)测量白细胞介素-1β(IL-1β)的血清水平，该试剂盒是一种体外酶联免疫吸附测定法，用于定量测量小鼠白细胞介素-1β。结果以pg/mL表示。
5.2 胸腺免疫细胞计数：
对C57BL/6J小鼠胸腺组织进行免疫细胞计数。首先将组织剪成1-2mm大小组织块，放入组织研磨器中，转动研棒，研至匀浆，加入10ml生理盐水，冲洗研磨器，收获细胞悬液，并经200目尼龙网过滤，1500rpm离心5min，弃上清液，加红细胞裂解液重悬沉淀，室温作用5min，加等体积的PBS中和后，1500rpm离心5min，弃上清，用PBS洗涤一次，再用PBS重悬，之后进行细胞计数。
6、统计分析
行为学数据以平均值(MEAN)±标准误差(SEM)表示，同一组小鼠，不同时间点之间使用重复测量ANOVA (或必要时进行非参数 Friedman 检验)之后进行Tukey-Kramer或Holm–Sidak 检验，以比较组间和组内的差异。如果观察到时间和组之间有显著的相互作用，则对所有时间点进行单因素或双因素方差分析。对于血清IL-1β含量和胸腺细胞计数结果，使用非配对t检验进行统计分析。所有统计检验的显著性水平设定为P＜0.05。使用GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, USA)进行作图和统计分析。
二、实验结果
1、动物的一般健康状况
对于年轻雌性和雄性C57BL/6J小鼠而言(如图1的A、B、D所示)，各组小鼠基线体重分别为：23.3±0.5g、23.7±0.07g、22.9±0.8g、22.8±0.3g、23.5±0.8g和22.7±0.1g、22.0±0.2g，各组相比无统计学意义。AI治疗后，除了OVX-AI-6组小鼠体重与OVX-vehicle组相比显著降低，其余均增加。该结果表明OVX-AI-6组药物剂量可能过高，对小鼠有毒性作用。AI治疗后，与基线相比，Male-vehicle和Male-AI-0.6组体重均增加，但是两组相比没有统计学差异。
老年自然绝经雌性C57BL/6J小鼠(图1的C)基线体重为37.2±1.3g、36.2±1.1g；AI治疗后Old-AI-0.6小鼠体重一直降低，停药后未恢复，并且在3d、11d、停药7d时分别死亡1、1和2只，而其余各组小鼠在此期间均未发生死亡情况。
2、不同浓度来曲唑对不同性别、不同绝经方式小鼠痛感觉的影响
2.1 来曲唑导致年轻人工绝经雌性小鼠、雄性小鼠和老年自然绝经雌鼠机械阈值均降低，但是年轻人工绝经雌性小鼠疼痛程度更重，并且停药后年轻人工绝经小鼠机械痛阈恢复时间更长。
为了与临床上患者服用来曲唑后出现的痛感觉的实际情况相一致，首先使用不同浓度梯度的来曲唑对C57BL/6J 年轻人工绝经小鼠进行机械痛阈的测定(图2的A)，与Sham组相比，OVX后14d时各组机械痛阈均显著降低(0.2±0.02，P＜0.0001)，来曲唑处理后，与OVX-vehicle组相比，OVX-AI-0.06组用药后其机械痛阈在7d和21d时明显降低(0.09±0.02，P=0.003；0.07±0.007，P=0.0007)。OVX-AI-0.6组小鼠给药3d后机械痛阈降至最低(0.03±0.01，P＜0.0001)，之后均维持在较低的水平(0.04±0.01，P=0.004)，这和临床上AI治疗后出现痛感觉并且3-6个月达到顶峰相一致。OVX-AI-6组给药后1d、3d机械痛阈无变化，7d时机械痛阈降低(0.03±0.01，P＜0.0001)，21d之后维持在较低的水平(0.03±0.01，P＜0.0001)。
临床上当患者因服用来曲唑出现难以缓解的痛感觉时，临床医生会建议患者停药以缓解症状，因此发明人模拟了这种临床可逆现象，在用药11d后对小鼠进行停药处理(图2的B)，年轻人工绝经雌鼠用药后的机械痛阈结果如前所述，从停药后3d开始，机械痛阈开始回升但直到停药后21d机械痛阈才基本恢复(0.2±0.02)。
考虑到OVX与自然绝经的不同，以及雌雄鼠本身性别差异，发明人之后又在老年自然绝经雌鼠(图2的C)以及年轻雄鼠(图2的D)上做了模型验证与比较，在雄鼠以及老年自然绝经雌鼠实验中，参考前一部分研究结果，只对来曲唑等效剂量组进行了研究。
2.2 不同浓度来曲唑对年轻人工绝经雌鼠、老年人工绝经雌鼠和年轻雄鼠热痛阈的影响
对于年轻雌性C57BL/6J小鼠而言，OVX前的热痛阈基线水平如图3的A所示，分别为10.2±0.4；9.7±0.4；10.3±0.9；9.7±0.39和9.9±0.3，与OVX-vehicle组相比，11d和30d时OVX-AI-6组小鼠热痛阈均升高(7.9±0.4 vs 10.1±0.5，P=0.002；8.8±0.4 vs 11.6±0.8，P=0.009)，表明10倍的等效剂量可能对小鼠有一定的毒性，导致其对热痛不敏感。
对于老年自然绝经雌鼠以及年轻雄鼠(图3的B-C)而言，其热痛阈基线和用药处理后各时间点均无统计学差异。
3、不同浓度来曲唑对不同性别、不同绝经方式小鼠痛情绪的影响
3.1 来曲唑使年轻人工绝经雌鼠中心区域停留时间缩短，对老年自然绝经雌鼠及年轻雄鼠无影响
在总距离无统计学差异的前提下，中心区域活动时间减少表明小鼠出现焦虑状态。由于重复测量会使小鼠总距离缩短进而影响中心区域活动时间的统计，因此我们只选取-14d、0d、11d对小鼠进行旷场实验的检测。结果表明各时间点各组间的总距离均没有统计学差异。用药前中心区域活动时间基线水平均无差异，与假手术空白组(45.9±4.7)相比，OVX后各组中心区域活动时间均降低(分别为25.2±4.1，P=0.02； 27.3±4.3，P=0.04；22.5±5.6，P=0.002；23.3±4.3，P=0.005)，表明OVX后小鼠出现焦虑状态。AI治疗11d后，与假手术空白组(44.8±2.7)相比，OVX-AI-0.06组中心区域活动时间为24.3±3.6(P=0.02)、OVX-AI-0.6组为21.2±3.9(P=0.001)，OVX-AI-6组为26.1±4.3(P=0.03)，OVX-vehicle组中心区域活动时间增多(28.7±5.3)，表明单纯OVX后一段时间身体出现了适应现象，焦虑状态消失，而不同浓度AI治疗的小鼠仍然存在焦虑状态。
对于老年自然绝经雌鼠以及年轻雄鼠(4C-F)，AI治疗前后各组总距离和中心区域活动时间均没有统计学差异。
3.2不同浓度来曲唑对不同性别、不同绝经方式小鼠糖水偏好指数的影响
OVX前及OVX后14d各组糖水偏好指数无统计学差异(图5的A)，0d时分别为80.4±5.6；89.6±0.9；87.7±1.8；87.2±1.3; 84.3±2.5。与基线相比，OVX-vehicle组小鼠7d时糖水偏好指数降至最低(89.6±0.9 vs 76.9±1.2，P=0.02)，之后逐渐回升。OVX-AI-0.6组和OVX-AI-6组小鼠均在3d时糖水偏好指数降至最低(分别为87.2±1.3 vs 75.2±1.5，P=0.001；84.3±2.5 vs 77.6±1.5，P=0.02)。与OVX-vehicle组(88.6±1.3)相比，30d时OVX-AI-0.06组、OVX-AI-0.6组和OVX-AI-6组糖水偏好指数均降低(分别为78.6±3.5，P=0.0007；80.0±1.1，P=0.004；80.1±1.2(P=0.02)。结果表明OVX-vehicle组小鼠在OVX后21d(AI后7d)左右出现抑郁症状，而AI治疗后使抑郁症状提前发生(AI后3d)并且在AI治疗30d时仍然存在。
为了评估来曲唑对老年自然绝经鼠及年轻雄性鼠抑郁状态的情况，发明人也对其进行了实验(图5的B、图5的C)，基线及用药处理后各时间点均无统计学差异。
4、不同浓度来曲唑对不同小鼠运动协调以及耐力影响
为了反映小鼠的整体运动协调以及耐力，使用了转棒平衡仪对小鼠进行了实验。OVX前后各组基线水平无差异，与基线(0d)相比，AI治疗21d后， OVX-vehicle、OVX-AI-0.06、OVX-AI-0.6、OVX-AI-6组小鼠在棒时间均降低，分别为292.2±14.1 vs 212.8±12.6，P=0.0004；263±15.1 vs 203.4±19.1，P=0.02；268.2±19.1 vs 223.3±26.7，P=0.02；272.6±18.1 vs 188.2±14.6，P=0.001。30d时各组在棒时间分别为191.1±11.4(P＜0.0001)；171.5±14.5(P=0.0001)；201.5±20.8(P=0.0001)；207.2±10.6，(P=0.004)。与OVX-vehicle组相比，各时间点OVX-AI-0.06、OVX-AI-0.6、OVX-AI-6组均无统计学意义。结果表明AI治疗21d后导致的在棒时间减少主要为OVX所致，AI治疗并未进一步损害小鼠运动能力。
由于老年自然绝经鼠年龄较大，运动能力不足，不能完成转棒平衡仪的检测，所以未对老年自然绝经雌鼠进行这部分实验。年轻雄鼠(图6的B)在棒时间的基线水平分别为362.6±57.5和354.3±45.9，与年轻人工绝经雌鼠不同的是，与基线相比(0d)，Male-AI-0.6组小鼠AI治疗3d、7d后在棒时间延长(354.3±45.9 vs 536.6±37.6，P=0.02和354.3±45.9 vs 543.5±33.1，P=0.04)，与Male-AI-vehicle组相比，各时间点两组均无统计学差异。
5、不同浓度来曲唑对年轻雌性C57BL/6J小鼠血清炎症因子IL-1β的影响
对不同浓度组AI治疗11d后的小鼠血清进行了IL-1β的检测，发明人发现，与假手术空白组相比，OVX-vehicle组IL-1β水平升高(6.9±0.8 vs 10.6±0.9, P=0.006)。与OVX-vehicle组相比，OVX-AI-0.6组小鼠IL-1β水平升高(10.6±0.9 vs 15.2±1.9，P=0.03)，OVX-AI-6组降低(10.6±0.9 vs 6.4±0.5, P＜0.0001)。这与OVX-vehicle组和OVX-AI-0.6组机械痛阈降低相一致，而OVX-AI-6组IL-1β水平降低可能是药物浓度过高导致的毒性反应。
6、不同浓度来曲唑对年轻雌性C57BL/6J小鼠胸腺细胞数目的影响
对不同浓度AI处理30d的年轻雌性C57BL/6J小鼠胸腺进行细胞计数，来明确不同浓度AI治疗后对胸腺细胞数目的影响，与假手术空白组相比，OVX-vehicle组胸腺细胞计数增多(3.2±1.1 vs 4.7±0.9，P=0.02)。AI治疗30d后，与OVX-vehicle组相比，各组小鼠胸腺细胞数目均有不同程度的减少，分别为OVX-AI-0.06 组(4.7±0.9 vs 2.0±1.2，P=0.003)、OVX-AI-0.6组(4.7±0.9 vs 2.8±0.6，P=0.001)以及 OVX-AI-6组(4.7±0.9 vs1.6±0.6，P=0.0002)。
胸腺细胞数目OVX后增多而AI后减少的现象与人类临床情况类似。原因可能在于，在小鼠和人类中，胸腺随着年龄的增长而萎缩，大多数实质组织在中年时被脂肪取代并且只产生较少的新T细胞输出到次级淋巴器官，直到老年。在内环境改变的情况下，胸腺输出量会增加出现胸腺反弹现象，以维持内环境稳态。OVX后雌激素迅速降低可能作为一种应激源，激活其靶向的众多肾上腺素能神经元，使机体的交感神经活性增强，一方面，交感神经支配原发(骨髓和胸腺)和继发淋巴器官(脾脏和淋巴结)，刺激骨髓来源祖细胞和成熟T细胞分化导致功能性胸腺反弹。另一方面活化的T细胞激活巨噬细胞集落刺激因子系统，直接或间接上调IL-1并产生IL-1β。
本发明使用了不同的绝经方式、不同性别以及不同种类的小鼠来研究AI导致的痛感觉和痛情绪，最终建立了能够模拟临床上激素受体阳性乳腺癌患者AI治疗期间出现的疼痛、焦虑、抑郁、衰弱等临床症状的动物模型。本发明发现与自然绝经老年雌鼠以及年轻雄鼠相比，通过对年轻雌鼠采用卵巢切除的方式达到人工绝经，之后使用等效剂量的AI处理能够获得与临床最贴近的动物模型。此外，通过动物模型意外发现IL-1β介导的免疫变化在痛感觉与痛情绪的发生发展中发挥了重要作用。
不同浓度的AI作用于不同绝经方式、不同性别的小鼠时，其机械痛阈显著降低而热痛阈变化不明显，在停药后7d和11d年轻雄鼠与老年自然绝经雌鼠机械痛阈恢复，并且老年自然绝经雌鼠与年轻雄鼠并没有出现焦虑、抑郁状态。年轻人工绝经雌鼠AI给药后，其机械痛阈降低更明显，停药后疼痛恢复所需的时间更长(21d)，并且同时出现焦虑、抑郁等痛情绪。这表明在自然绝经老年女性以及男性这种雌激素极低的人群中，芳香化酶抑制剂的使用所导致的疼痛和情绪的变化，可能与人工绝经的这种短时间内激素水平快速降低的年轻女性患者中的机制有所不同。
实施例2
利用实施例1得到的小鼠作为药物筛选模型，通过向其施用各种待测化合物，发现当施用IL-2时能够减轻AI引起的疼痛。接下来，利用不同浓度IL-2处理，结果表明10,000IU能够显著减轻来曲唑引起的疼痛(见图9)。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (10)

1.一种动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 取年轻雌性动物进行人工绝经；
(2) 以每天0.1-1.5mg/kg的剂量将芳香化酶抑制剂施用至人工绝经后的动物；和
(3) 检测步骤(2)后动物的行为特征和/或生物指标。
2.根据权利要求1所述的动物模型的构建方法，其特征在于，所述年轻雌性动物为5-20周的鼠。
3.根据权利要求1所述的动物模型的构建方法，其特征在于，所述人工绝经通过卵巢切除术进行。
4.根据权利要求1所述的动物模型的构建方法，其特征在于，所述行为特征包括痛感觉、痛情绪、运动协调性和运动耐力中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的动物模型的构建方法，其特征在于，所述行为特征检测包括痛阈、热缩足反射潜伏期、运动能力、焦虑情绪和快感样行为中至少一种的测定或检测。
6.根据权利要求1所述的动物模型的构建方法，其特征在于，所述生物指标为IL-1β含量和/或胸腺细胞数量。
7.一种模拟芳香化酶抑制剂治疗时临床症状的方法，其特征在于，包括：
(1’) 确定所期望的临床症状；
(2’) 根据所期望的临床症状确定芳香化酶抑制剂的用量，并将其施用至人工绝经后的动物；
(3’) 检测步骤(2)后动物的行为特征和/或生物指标。
8.一种用于鉴定对缓解疼痛症状有用的化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a) 测试动物模型的行为特征和/或生物指标得到第一测试数据；
(b) 向所述动物模型施用待测化合物；
(c) 测试施用待测化合物后所述动物模型的行为特征和/或生物指标得到第二测试数据；和
(d) 将第二测试数据与第一测试数据进行比较的步骤；
其中，所述动物模型通过根据要求1-6任一项所述的构建方法得到。
9.一种对缓解疼痛症状有用的化合物，其特征在于，其通过权利要求8所述的方法得到。
10.一种用于缓解疼痛症状的药物组合物，其特征在于，包括根据权利要求9所述的化合物。
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CN117982655A (zh) * 2023-11-21 2024-05-07 北京大学人民医院 芳香化酶抑制剂治疗相关的疼痛动物模型构建方法及应用
CN117982655B (zh) * 2023-11-21 2024-10-15 北京大学人民医院 芳香化酶抑制剂治疗相关的疼痛动物模型构建方法及应用

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