CN117257970A - 靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统及其在制备抗肿瘤产品中的应用 - Google Patents
靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统及其在制备抗肿瘤产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，包括有能够抑制表皮生长因子受体基因表达的RNA；能够抑制表皮生长因子受体基因表达的RNA包括：启动子元件以及能够抑制表皮生长因子受体基因表达的siRNA、编码siRNA中的至少一种。与现有技术相对比，本发明具有以下优点：该递送系统以合成生物学元件为基础，利用哺乳动物自身器官作为天然生物反应器，将靶向元件与能够抑制表皮生长因子受体EGFR基因表达的RNA在哺乳动物体内自组装为能够靶向治疗EGFR突变型疾病的复合结构，并分泌至循环系统，并且该复合结构在靶向元件的作用下将RNA定向运输到肿瘤细胞等待治疗的细胞中发挥治疗效果，治疗效果好，效率高。
Description
技术领域
本发明涉及本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统及其应用。
技术背景
肺癌是发病率和死亡率最高、对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。针对肺癌开发特效靶向药对临床治疗意义重大。
表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因C-erbB-1的表达产物，是一种跨膜蛋白，是表皮生长因子受体家族第1个成员。EGFR蛋白的突变与大约50％的中晚期非小细胞肺癌密切相关，是一个非常有应用前景的肺癌治疗靶点。目前临床针对EGFR突变型肺癌的治疗药物都是酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，其作用方式以蛋白为靶点，在临床治疗中常常伴随着继发性耐药问题，无法彻底治愈EGFR突变型肺癌。
目前，根据肺癌的基因型选择分子靶向药物的“个体化治疗”已成为临床上常用的治疗手段。而如何提高针对突变基因的疗效、减少毒副作用也已经是肺癌治疗研究的主要方向。随着研究的深入，新型靶向药物的开发和应用层出不穷，但大部分EGFR-TKI治疗有效的肺癌患者，9～14月后都会出现EGFR-TKI治疗耐药。尽管一些研究表明，联合治疗手段(如阿法替尼联合曲妥珠单抗(Cetuxumab))能够对这些耐药型NSCLC取得治疗效果，但是由于无法根本解决耐药性问题，且具有非常明显的副作用，大大限制了其临床应用潜力，成为了亟待解决的问题。
发明内容
针对上述存在的拘束局限性，本发明提出了靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统及其应用，克服了背景技术中提到的不足和缺陷。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明的发明点是提供了靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，所述递送系统中包括有能够抑制表皮生长因子受体基因表达的RNA；所述能够抑制表皮生长因子受体基因表达的RNA包括：启动子元件以及能够抑制表皮生长因子受体基因表达的siRNA、编码siRNA中的至少一种。
下列表1和表2所显示的均为siRNA或编码siRNA的DNA模板链。
进一步的，上述的靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，所述能够抑制表皮生长因子受体基因表达的siRNA的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1-SEQ ID No.11任一所示的序列，具体如下表1所示。
表1
| siRE-1(SEQ ID No.1) | tgttgcttctcttaattcct |
| siRE-2(SEQ ID No.2) | ataaccagccacctcctggat |
| siRE-3(SEQ ID No.3) | ttccaaaggaattcgctccac |
| siRE-4(SEQ ID No.4) | ttcaccagtacgttcctggct |
| siRE-5(SEQ ID No.5) | ttgataggcactttgcctcct |
| siRE-6(SEQ ID No.6) | ttccaatgccatccacttgat |
| siRE-7(SEQ ID No.7) | agaagttggagtctgtaggac |
| siRE-8(SEQ ID No.8) | aattgttgctggttgcactca |
| siRE-9(SEQ ID No.9) | atgtgctgttgacacaggtgg |
| siRE-10(SEQ ID No.10) | atttctatcaatgcaagccac |
| siRE-11(SEQ ID No.11) | taaagatgccatttggcttgg |
进一步的，上述的靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，所述能够抑制表皮生长因子受体基因表达的编码siRNA正义链核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.12-SEQ IDNo.22任一所示的序列；所述能够抑制表皮生长因子受体基因表达的编码siRNA反义链核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.23-SEQ ID No.33任一所示的序列；序列具体如下表2所示。
表2
表2中的正义链和反义链一一对应，并与SEQ ID No.1-SEQ ID No.11所示的siRNA序列分别对应；具体为：
正义链SEQ ID No.12和反义链SEQ ID No.23，对应SEQ ID No.1；
正义链SEQ ID No.13和反义链SEQ ID No.24，对应SEQ ID No.2；
正义链SEQ ID No.14和反义链SEQ ID No.25，对应SEQ ID No.3；
正义链SEQ ID No.15和反义链SEQ ID No.26，对应SEQ ID No.4；
正义链SEQ ID No.16和反义链SEQ ID No.27，对应SEQ ID No.5；
正义链SEQ ID No.17和反义链SEQ ID No.28，对应SEQ ID No.6；
正义链SEQ ID No.18和反义链SEQ ID No.29，对应SEQ ID No.7；
正义链SEQ ID No.19和反义链SEQ ID No.30，对应SEQ ID No.8；
正义链SEQ ID No.20和反义链SEQ ID No.31，对应SEQ ID No.9；
正义链SEQ ID No.21和反义链SEQ ID No.32，对应SEQ ID No.10；
正义链SEQ ID No.22和反义链SEQ ID No.33，对应SEQ ID No.11。
进一步的，上述的靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，所述递送系统中还包括有递送载体；所述携带能够抑制表皮生长因子受体基因表达的RNA的递送载体与靶向元件在哺乳动物的器官组织中自组装形成复合结构，所述复合结构通过所述靶向元件寻找并将能够抑制表皮生长因子受体基因表达的RNA送入目标组织，抑制目标组织中表皮生长因子受体的表达。
进一步的，上述的靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，所述表皮生长因子受体为EGFR。
进一步的，上述的靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，所述复合结构为外泌体。
进一步的，上述的靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，所述靶向元件包括至少一条靶向序列GE11；所述靶向序列GE11为序列表中SEQ ID No.34所示的序列或与SEQ IDNo.34所示的序列同源性大于等于90％的同源序列；具体如下：
靶向序列GE11 SEQ ID No.34：
atgtgcctctctccggttaaaggcgcaaagctcatcctgatctttctgttcctaggagccgttcagtccaatgcatt gatagttaatttgacagattcaaagggtacttgcctttatgctcgataccactggtacggctataccccccagaacgtgatctccggaggtgcagaatgggagatgaatttcacaataacatatgaaactacaaaccaaaccaataaaactataaccattgcagtacctgacaaggcgacacacgatggaagcagttgtggggatgaccggaatagtgccaaaataatgatacaatttggattcgctgtctcttgggctgtgaattttaccaaggaagcatctcattattcaattcatgacatcgtgctttcctacaacactagtgatagcacagtatttcctggtgctgtagctaaaggagttcatactgttaaaaatcctgagaatttcaaagttccattggatgtcatctttaagtgcaatagtgttttaacttacaacctgactcctgtcgttcagaaatattggggtattcacctgcaagcttttgtccaaaatggtacagtgagtaaaaatgaacaagtgtgtgaagaagaccaaactcccaccactgtggcacccatcattcacaccactgccccgtcgactacaactacactcactccaacttcaacacccactccaactccaactccaactccaaccgttggaaactacagcattagaaatggcaatactacctgtctgctggctaccatggggctgcagctgaacatcactgaggagaaggtgcctttcatttttaacatcaaccctgccacaaccaacttcaccggcagctgtcaacctcaaagtgctcaacttaggctgaacaacagccaaattaagtatcttgactttatctttgctgtgaaaaatgaaaaacggttctatctgaaggaagtgaatgtctacatgtatttggctaatggctcagctttcaacatttccaacaagaaccttagcttctgggatgcccctctgggaagttcttatatgtgcaacaaagagcaggtgctttctgtgtctagagcgtttcagatcaacacctttaacctaaaggtgcaaccttttaatgtgacaaaaggacagtattctacagcccaggagtgttcgctggatgatgacaccattctaataccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacctaattggcagaagaaagacctatgctggatatcagactctgtaacactaa。
同源性大于等于90％，具体可以为同源性为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
进一步的，上述的靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，所述递送载体为质粒载体或病毒载体；所述病毒载体优选的包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中的至少一种。
本发明的第二个发明点是提供了上述靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统在制备抗肿瘤产品中的应用。
进一步的，上述的应用，所述抗肿瘤产品包括抑制癌细胞或阻止表皮生长因子受体EGFR基因表达的试剂、对肿瘤具有预防和/或治疗作用的药物；所述肿瘤优选的包括乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、膀胱癌、卵巢癌中的至少一种。
与现有技术相对比，本发明具有以下优点：
本申请提供的靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，其包括能够抑制表皮生长因子受体基因表达的RNA和递送载体，递送载体携带能够抑制表皮生长因子受体基因表达的RNA与靶向元件在哺乳动物的器官组织中自组装形成复合结构，所述复合结构通过所述靶向元件寻找并将能够抑制表皮生长因子受体基因表达的RNA送入目标组织，抑制目标组织中表皮生长因子受体的表达。
该递送系统以合成生物学元件为基础，利用哺乳动物自身器官作为天然生物反应器，将靶向元件与能够抑制表皮生长因子受体EGFR基因表达的RNA在哺乳动物体内自组装为能够靶向治疗EGFR突变型疾病的复合结构，并分泌至循环系统，并且该复合结构在靶向元件的作用下将RNA定向运输到肿瘤细胞等待治疗的细胞中，发挥治疗效果，治疗效果好，效率高。
本申请提供的靶向抑制表皮生长因子受体EGFR的递送系统借助了天然存在的分泌机制，因此能够避免采用其他载体造成的毒性。靶向元件能够高效的将RNA递送到需要治疗的组织，递送效率高，几乎无副反应。
本申请提供的靶向抑制表皮生长因子受体EGFR的递送系统基于质粒载体建立，易于工业化生产和大批量纯化，相对于其他siRNA递送方式，大大降低了生产难度和生产成本。
本申请提供的靶向抑制表皮生长因子受体EGFR的递送系统应用于抗肿瘤产品中，无毒无副作用，起效快，疗效好，适于大规模推广和使用。此外，还可以根据不同疾病治疗的需要，对靶向元件、靶向基因进行调整，以针对不同疾病提供个性化治疗。
附图说明
图1是本申请一实施例提供的质粒骨架图；
图2是本申请一实施例提供的siRNA表达原件筛选结果；其中，图2a为11种CMV-siRE质粒所表现出的western blot电泳结果，图2b为11种CMV-siRE质粒所表现出的qRT-PCR检测蛋白表达水平结果，图2c为11种CMV-siRE质粒所表达出的qRT-PCR检测mRNA表达水平结果。
图3是本申请一实施例提供的相关RNA、蛋白表达水平对比图；其中，图3a-图3c为CMV-GE11-siRE和CMV-siRE两种质粒转染H358细胞系后的western blot、qRT-PCR检测蛋白和mRNA表达水平对比结果，图3d-图3f为CMV-GE11-siRE和CMV-siRE两种质粒转染H1975细胞系后的western blot、qRT-PCR检测蛋白和mRNA表达水平对比结果。
图4是本申请一实施例提供的siRNA在小鼠体内的代谢分布图；其中，图4a为将表达siRNA的基因环路(CMV-siRE和CMV-GE11-siRE)注射小鼠后，在不同时间段检测到的血清中的EGFR siRNAs表达量结果，图4b为将表达siRNA的基因环路(CMV-siRE和CMV-GE11-siRE)注射小鼠后，在不同时间段检测到的肺组织中的EGFR siRNAs表达量结果。
图5是本申请一实施例提供的小鼠体内外泌体示踪图；
图6是本申请一实施例(试验例2)提供的不同递送系统对小鼠肺癌模型的治疗效果对比图；其中，图6a为5种不同递送系统小鼠肺癌模型治疗前后的micro-CT扫描图像对比，图6b为5种不同递送系统小鼠肺癌模型治疗前后的肿瘤大小统计结果对比。
图7是本申请一实施例提供的小鼠肺组织病理分析图，显示了五组小鼠HE染色以及免疫组化染色IHC的对比结果。
图8是本申请一实施例提供的小鼠肺组织蛋白表达量检测图，显示了小鼠EGFR蛋白与mRNA表达量检测的对比结果；其中，图8a为5组小鼠的western blot电泳结果，图8b为5组小鼠的EGFR蛋白表达水平检测结果，图8c为5组小鼠的p-AKT蛋白表达水平检测结果，图8d为5组小鼠的p-ERK蛋白表达水平检测结果，图8e为5组小鼠的EGFR mRNA表达水平检测结果。
图9是本申请一实施例提供的siRNA脱靶效应评估图；其中，图9a为CMV-CMV-scrR治疗组小鼠和CMV-siRE治疗组小鼠的肺、肝、脾、肾、胸腺和肿瘤的表达差异对比，图9b为CMV-siRE和CMV-GE11-siRE治疗后的小鼠的肺、肝、脾、肾、胸腺和肿瘤中下调的转录本的显著性对比，图9c为CMV-siRE和CMV-GE11-siRE组排名靠前的20个GO簇中，与EGFR信号通路的密切相关性对比，图9d为CMV-siRE、CMV-GE11 siRE治疗后肝脏中miR-122所有靶基因的表达情况。
图10是本申请一实施例提供的给药安全性对比图，其中，图10a为CMV-siRE或CMV-GE11-siRE质粒处理后的功能异常生物标志物(丙氨酸转氨酶ALT、天冬氨酸转氨酶AST、总胆红素TBIL、血清尿素氮BUN、碱性磷酸酶ALP、肌酐CREA)检测结果对比，图10b为CMV-siRE或CMV-GE11-siRE质粒处理后的器官组织(肝、肾、心脏、脾)染色检测结果对比。
图11是本申请一实施例提供的不同递送系统对小鼠肺癌模型的治疗效果对比图；其中，图11a为5组小鼠治疗前后的CT成像结果对比；图11b为5组小鼠治疗前后的肿瘤体积大小及生存情况结果对比。
图12是本申请一实施例提供的五组小鼠肺组织病理分析图(即HE染色及IHC免疫组化染色结果对比)。
图13是本申请另一实施例提供的小鼠肺组织蛋白表达量检测图，显示了小鼠EGFR蛋白与mRNA表达量检测的对比结果；其中，图13a为5组小鼠的western blot电泳结果，图13b为5组小鼠的EGFR蛋白表达水平检测结果，图13c为5组小鼠的p-AKT蛋白表达水平检测结果，图13d为5组小鼠的p-ERK蛋白表达水平检测结果，图13e为5组小鼠的EGFR mRNA表达水平检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术
语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本发明。本文中所使用的试剂和仪器均商购可得，所涉及的表征手段均可参阅现有技术中的相关描述，本文中不再赘述。
为了进一步了解本发明，下面结合最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，包括有能够抑制表皮生长因子受体基因表达的RNA；能够抑制表皮生长因子受体基因表达的RNA包括：启动子元件以及能够抑制表皮生长因子受体基因表达的siRNA、编码siRNA中的至少一种。
上述RNA可以为启动子元件+能够抑制表皮生长因子受体基因表达的siRNA，还可以为启动子元件+能够抑制表皮生长因子受体基因表达的编码siRNA。
表1和表2所显示的均为siRNA或编码siRNA的DNA模板链。
靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，能够抑制表皮生长因子受体基因表达的siRNA的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1-SEQ ID No.11任一所示的序列，具体如表1所示。
靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，能够抑制表皮生长因子受体基因表达的编码siRNA正义链核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.12-SEQ IDNo.22任一所示的序列；能够抑制表皮生长因子受体基因表达的编码siRNA反义链核苷酸序列为序列表中SEQ IDNo.23-SEQ ID No.33任一所示的序列；序列具体如表2所示。
表2中的正义链和反义链一一对应，并与SEQ ID No.1-SEQ ID No.11所示的siRNA序列分别对应；具体为：
正义链SEQ ID No.12和反义链SEQ ID No.23，对应SEQ ID No.1；
正义链SEQ ID No.13和反义链SEQ ID No.24，对应SEQ ID No.2；
正义链SEQ ID No.14和反义链SEQ ID No.25，对应SEQ ID No.3；
正义链SEQ ID No.15和反义链SEQ ID No.26，对应SEQ ID No.4；
正义链SEQ ID No.16和反义链SEQ ID No.27，对应SEQ ID No.5；
正义链SEQ ID No.17和反义链SEQ ID No.28，对应SEQ ID No.6；
正义链SEQ ID No.18和反义链SEQ ID No.29，对应SEQ ID No.7；
正义链SEQ ID No.19和反义链SEQ ID No.30，对应SEQ ID No.8；
正义链SEQ ID No.20和反义链SEQ ID No.31，对应SEQ ID No.9；
正义链SEQ ID No.21和反义链SEQ ID No.32，对应SEQ ID No.10；
正义链SEQ ID No.22和反义链SEQ ID No.33，对应SEQ ID No.11。
上述的siRNA能够特异性的与表皮生长因子受体(EGFR)mRNA结合并使之降解，进而起到抑制EGFR表达的作用。
靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统中还包括有递送载体；携带能够抑制表皮生长因子受体基因表达的RNA的递送载体与靶向元件在哺乳动物的器官组织中自组装形成复合结构，复合结构通过所述靶向元件寻找并将能够抑制表皮生长因子受体基因表达的RNA送入目标组织，抑制目标组织中表皮生长因子受体的表达。
表皮生长因子受体为EGFR。
复合结构为外泌体。
目标组织优选为发生EGFR突变/具有EGFR表达的癌细胞。
靶向元件包括至少一条靶向序列GE11；所述靶向序列GE11为序列表中SEQ IDNo.34所示的序列或与SEQ ID No.34所示的序列同源性大于等于90％的同源序列；具体如下：
靶向序列GE11 SEQ ID No.34：
atgtgcctctctccggttaaaggcgcaaagctcatcctgatctttctgttcctaggagccgttcagtccaatgcatt gatagttaatttgacagattcaaagggtacttgcctttatgctcgataccactggtacggctataccccccagaacgtgatctccggaggtgcagaatgggagatgaatttcacaataacatatgaaactacaaaccaaaccaataaaactataaccattgcagtacctgacaaggcgacacacgatggaagcagttgtggggatgaccggaatagtgccaaaataatgatacaatttggattcgctgtctcttgggctgtgaattttaccaaggaagcatctcattattcaattcatgacatcgtgctttcctacaacactagtgatagcacagtatttcctggtgctgtagctaaaggagttcatactgttaaaaatcctgagaatttcaaagttccattggatgtcatctttaagtgcaatagtgttttaacttacaacctgactcctgtcgttcagaaatattggggtattcacctgcaagcttttgtccaaaatggtacagtgagtaaaaatgaacaagtgtgtgaagaagaccaaactcccaccactgtggcacccatcattcacaccactgccccgtcgactacaactacactcactccaacttcaacacccactccaactccaactccaactccaaccgttggaaactacagcattagaaatggcaatactacctgtctgctggctaccatggggctgcagctgaacatcactgaggagaaggtgcctttcatttttaacatcaaccctgccacaaccaacttcaccggcagctgtcaacctcaaagtgctcaacttaggctgaacaacagccaaattaagtatcttgactttatctttgctgtgaaaaatgaaaaacggttctatctgaaggaagtgaatgtctacatgtatttggctaatggctcagctttcaacatttccaacaagaaccttagcttctgggatgcccctctgggaagttcttatatgtgcaacaaagagcaggtgctttctgtgtctagagcgtttcagatcaacacctttaacctaaaggtgcaaccttttaatgtgacaaaaggacagtattctacagcccaggagtgttcgctggatgatgacaccattctaataccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacctaattggcagaagaaagacctatgctggatatcagactctgtaacactaa。
同源性大于等于90％，具体可以为同源性为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
递送载体为质粒载体或病毒载体；病毒载体优选的包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中的至少一种。
递送载体优选为质粒载体，在递送载体为质粒载体的情况下，上述递送系统可以视为质粒分子。
具体地，质粒携带能够抑制EGFR基因表达的siRNA，此质粒分子能够在哺乳动物的器官组织中富集，并与靶向元件GE11在所述哺乳动物器官组织中内源性地自发形成外泌体，该外泌体通过靶向元件GE11将siRNA递送入发生EGFR突变的细胞，进而抑制抑制EGFR的表达。
基于质粒载体形成的递送系统，更加易于大规模的工业化生产和纯化，相对于其他siRNA递送系统，生产难度和生产成本得以大幅降低。
在实际应用中，分别构建了针对EGFR基因的递送系统(质粒分子)，将启动子元件与能够抑制EGFR基因表达的siRNA串联，构建了siRE并分别连入骨架载体，该GE11-siRE质粒骨架结构如图1所示。
为了扩大潜在的治疗范围，使表达的siRNA能够同时抑制突变型和野生型EGFR，siRNA被设计为靶向EGFR编码区中没有常见突变(如，外显子19缺失、外显子21中的L858R点突变和T790M外显子20突变)的区段。在设计过程中还考虑了种子区域(2-8位碱基)介导的siRNA脱靶可能性。利用BLOCK-iTMRNAi Designer设计了11条siRNA序列，针对EGFR编码序列不同位点的siRNA，成功构建11种CMV-siRE质粒，然后转染人肺癌细胞系H358，24h后提取细胞总RNA，36h后提取细胞蛋白，分别进行qRT-PCR和western blot实验，结果表明，与CMV-scrR相比，第10个CMV-siRE质粒(即CMV-siRE-10)对EGFR mRNA和蛋白表达水平的抑制效果最为明显(图2a-图2c所示)。因此，选取该质粒用于检测siRNA、体内体外示踪以及对于肿瘤的抑制效果验证等后续实验。
因此，本实施例提供的靶向抑制EGFR的递送系统，以合成生物学元件为基础，利用哺乳动物自身器官作为天然生物反应器，将靶向元件与能够抑制EGFR基因表达的RNA在哺乳动物体内自组装为能够靶向治疗EGFR突变型疾病的外泌体，并分泌至循环系统，并且该外泌体在靶向元件的作用下将RNA定向运输到肿瘤细胞等待治疗的细胞中，发挥治疗效果，治疗效果好，效率高。
尤其是对于EGFR突变型肺癌，此递送系统能够精准快速的将相关RNA靶向运输至癌细胞内，抑制癌细胞内EGFR的表达，进而起到抑制肿瘤的效果，效果极佳。
实施例2
在实施例1的基础上，本实施例提供一种靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统在制备抗肿瘤产品中的应用。
抗肿瘤产品包括抑制癌细胞或阻止表皮生长因子受体EGFR基因表达的试剂、对肿瘤具有预防和/或治疗作用的药物；肿瘤优选的包括乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、膀胱癌、卵巢癌中的至少一种。
其中，本实施例的药物在包括上述递送系统的基础上，还可以包括药学上可以接受的载体，该载体包括但不限于稀释剂、缓冲剂、乳剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、佐剂、干燥剂、吸附载体等。
本实施例提供的药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、丸剂、栓剂、软膏剂、溶液剂、混悬剂、洗剂、凝胶剂、糊剂等。
本实施例的药物对肿瘤及肿瘤相关疾病具有良好的治疗效果。肿瘤相关疾病可以是肿瘤形成过程/治疗过程中产生的疾病或肿瘤引起的并发症、后遗症等与肿瘤具有一定相关性的疾病。
肿瘤包括乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、膀胱癌、卵巢癌中的至少一种。
本实施例的药物还可以与其他具有抗肿瘤效果的治疗药物或治疗手段联合使用对抑郁症患者进行治疗，以提高治疗效果。
比如，若肿瘤为乳腺癌，则可与紫杉醇、环磷酰胺、氟尿嘧啶、他莫昔芬、来曲唑、赫赛汀等药物联用；若肿瘤为肺癌，则可与易瑞沙、特罗凯等药物联用；若肿瘤为胃癌，则可与赫赛汀、阿帕替尼等药物联用；若肿瘤为肠癌，则可与爱必妥、表阿霉素、阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素、氟脲嘧啶脱氧核等药物联用；若肿瘤为膀胱癌，则可与表阿霉素、阿霉素、吡柔比星、丝裂霉素、羟基喜树碱、吉西他滨、卡介苗、干扰素、白介素-2、吉西他滨、顺铂、紫杉醇、多西他赛等药物联用；若肿瘤为卵巢癌，则可与顺铂、卡铂、紫杉醇、环磷酰胺等药物联用。此外，在使用药物治疗的同时，还可以同时进行手术治疗、放射治疗等，以增强疗效。
本申请提供的靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统应用于抗肿瘤产品中，无毒无副作用，起效快，疗效好，适于大规模推广和使用。
在前述针对EGFR编码序列不同位点的siRNA构建的11种CMV-siRE质粒分别进行qRT-PCR和western blot实验后的结果表明，第10个CMV-siRE质粒(即CMV-siRE-10)对EGFRmRNA和蛋白表达水平的抑制效果最为明显(图2a-图2c所示)。基于此结果，确定了siRE-10为最终筛选出的最优siRNA序列，后续的试验例1-4所示的实验效果验证均是针对此条序列的，无特殊标注，试验例1-4中的siRE均是指此条序列“siRE-10”。
试验例1
为了验证构建好的CMV-siRE、CMV-GE11-siRE质粒表达出的siRNA抑制肺癌细胞中EGFR靶基因的能力，采用了不包含EGFR突变的H358细胞株和包含EGFR突变的H1975细胞株进行验证。
用相同剂量的经无内毒素小提质粒试剂盒提取的CMV-GE11-siRE和CMV-siRE质粒转染H1975细胞系和H358细胞系，CMV-CMV-scrR质粒(表达一段无义序列)作为对照，转染24h后提取细胞总RNA，36h后提取细胞蛋白，通过qRT-PCR以及western blot实验，分别验证两种质粒在不同的NSCLC细胞系中的抑制效率。如图3所示，转染CMV-GE11-siRE和CMV-siRE质粒后，在上述两种NSCLC细胞中均达到了类似的抑制效果，说明靶向元件的插入并不影响siRNA表达元件的性能，同时也说明了利用该质粒构建的siRNA表达元件无论对野生型EGFR还是突变型EGFR均能发挥显著的抑制效果，提示了其具有较为广泛的治疗潜力。
本试验例设置CMV-siRE试验组和CMV-GE11-siRE试验组。上述两个试验组分别将表达siRNA的基因环路(CMV-siRE和CMV-GE11-siRE)按照10mg/kg的剂量对相同数量的正常小鼠进行尾静脉注射。
分别在注射3、6、9、12、24、48小时后，在每组中随机选取3只小鼠，取其血清及肺组织检测siRNA表达量，结果如图4所示。注射CMV-siRE或CMV-GE11-siRE质粒后，在两种质粒注射的EGFR DEL19小鼠血清中检测到等量的EGFR siRNAs表达，血清中EGFR siRNAs的积累呈时间依赖性，在9小时达到峰值，并在48小时后降至本底水平(图4a)。同时，在注射CMV-GE11-siRE或CMV-siRE质粒后，EGFR siRNA水平在EGFR DEL19小鼠的EGFR高表达肺组织中也呈时间依赖性增加，并且注射CMV-GE11-siRE质粒的EGFR高表达肺组织中EGFR siRNA含量约是注射CMV-siRE质粒的6.8倍(图4b)。
为了验证体外构建的基因环路也能在体内将EGFR siRNA特异性地递送到EGFR高表达肿瘤细胞，采用了一种由突变EGFR(外显子19缺失，DEL19)驱动的非小细胞肺癌转基因小鼠模型。在该模型中，强力霉素给药后，EGFR DEL19小鼠的肺组织中的突变EGFR蛋白持续高表达，最终形成自发的肺肿瘤。将CMV-GE11-siRE或CMV-siRE质粒转染HEK293T细胞，未处理的细胞当作空白对照组，36小时后收细胞上清，分离上清中的外泌体，并用PKH67染料(绿色)标记。然后将外泌体通过尾静脉注射到强力霉素诱导的EGFR DEL19小鼠体内。注射外泌体3小时后，对小鼠进行麻醉并心脏灌流，取其肺部组织，在-20℃用OCT包埋组织并使用冰冻切片机将其切成10μm的组织切片，4％PFA固定后进行免疫荧光实验，测定荧光外泌体的位置。与CMV-siRE转染细胞的外泌体结合EGFR高表达肺细胞的效率相比，CMV-GE11-siRE转染细胞分泌的外泌体更有效地与EGFR DEL19小鼠的EGFR高表达肺细胞结合，可见绿色荧光信号(外泌体)与红色荧光(EGFR蛋白)共定位信号增加(图5)。结果表明，与野生型外泌体相比，CMV-GE11-siRE质粒加工的外泌体对EGFR高表达细胞具有更高的亲和力。
试验例2
为了进一步确认靶向抑制EGFR的递送系统在体内的治疗效果，利用EGFR-DEL19转基因肺癌小鼠模型作为实验对象(DOX诱导30天后，肺部会自发产生肿瘤)，确认CMV-GE11-siRE递送系统对肺部肿瘤的治疗效果。
将造模成功的小鼠随机分为5组——PBS组、CMV-scrR组、Gefitinib组、CMV-siRE组、CMV-GE11-siRE组，分别按照10mg/kg的剂量注射PBS对照质粒、CMV-scrR质粒、CMV-siRE质粒、CMV-GE11-siRE质粒进行治疗，Gefitinib组小鼠通过灌胃的方式给药。每两天给药一次，共治疗7次，为期15天。治疗后，通过分析同一只小鼠治疗前后的micro-CT扫描图像，并结合全肺三维重建来评估小鼠肺部肿瘤生长情况。从图6中可以看出，注射了PBS和对照质粒的小鼠肿瘤体积显著增大且数量变多，双侧肺组织都出现了新发病灶。相较于这两组，吉非替尼和CMV-siRE治疗的小鼠肿瘤体积增长稍慢且无新发病灶，说明肿瘤负荷有所降低。而经过CMV-GE11-siRE基因环路治疗的小鼠没有产生新发病灶且原始肿瘤显著减小甚至达到检测不到的水平，说明该组小鼠肿瘤负荷显著降低。
对治疗后的五组小鼠的肺组织进行HE染色、IHC-EGFR/pAKT/pERK/PCNA以及蛋白与mRNA表达量分析检测，结果如图7，图8所示。图7为五组小鼠HE染色以及免疫组化染色IHC结果对比图，可以看出CMV-GE11-siRE组小鼠肺组织情况最好。图8是小鼠EGFR蛋白与mRNA表达量检测对比图，可以看出，PBS组小鼠和CMV-scrR组小鼠的EGFR蛋白表达水平最高，其次为siRE组，此组小鼠EGFR蛋白表达水平较低，CMV-GE11-siRE组小鼠EGFR蛋白表达水平最低，与正常小鼠相当。上述结果进一步证实了CMV-GE11-siRE治疗组的良好治疗效果。
试验例3
siRNA的脱靶会导致对非靶基因调节从而导致难以预料的后果，所以通过转录组测序的技术评估了EGFR驱动的NSCLC模型中由体内自组装EGFR siRNA引起的脱靶效应。在采用如上所述方案将EGFR DEL19小鼠中诱导成瘤后，按10mg/kg剂量对荷瘤小鼠分别用CMV-CMV-scrR、CMV-siRE或CMV-GE11-siRE质粒给药7次，通过转录组测序对多种正常组织和肿瘤中转录本的改变进行全面评估。使用较为严格的阈值条件(平均读数>500，foldchange>2，P<0.05)筛选出在CMV-siRE vs CMV-scrR、CMV-GE11-siRE vs CMV-scrR中表达发生显著性变化的转录本，结果表明，与CMV-CMV-scrR治疗的小鼠相比，CMV-siRE治疗组小鼠的肺、肝、脾、肾和胸腺中分别有165、206、307、111和65个转录本发生显著性改变。而在CMV-GE11-siRE治疗后则只有83、192、220、52和55个转录本分别在肺、肝、脾、肾和胸腺正常组织中产生差异表达(图9a)。
此外，还评估了EGFR siRNA是否会以与miRNA类似的方式与转录本结合，从而造成脱靶效应，使非目标转录本发生显著下调。通过分析发现，CMV-GE11-siRE治疗组在EGFRsiRNA的种子区序列和各组织发生显著性下调的转录本的3’-UTR之间没有具有统计学意义的相关性：仅在肺、肝脏、脾脏以及肾脏组织中各有1个转录本在其3’-UTR与EGFR siRNA种子区完全匹配，而在胸腺组织中无完全匹配的转录本，这些数字显着低于计算机预测的潜在脱靶基因数量(大约100-1000)。与之形成鲜明对比的是，与CMV-CMV-scrR治疗小鼠相比，CMV-siRE治疗小鼠的肿瘤中共有941个转录本被鉴定为显着差异表达，在经CMV-GE11-siRE治疗后的肿瘤中的4706个转录本发生了显着改变，转录变化的幅度均大大超过了在正常组织中观察到的变化。此外，CMV-siRE和CMV-GE11-siRE治疗后的小鼠肿瘤中下调的转录本的3’-UTR与EGFR siRNA的种子区域有显著相关性(图9b)。这些结果表明，EGFR siRNA引导链的miRNA样活性仅在肿瘤细胞中发生，而在正常组织中则几乎不发生脱靶效应。更重要的是，CMV-GE11-siRE治疗的小鼠在正常组织中转录本变化很少，但在肿瘤中的变化比CMV-siRE治疗的小鼠更强，表明siRNA能够通过GE11标记的sEV优先递送到EGFR高表达肿瘤细胞中，不仅减小了自组装基因环路对于正常组织的影响，进一步降低了脱靶效应风险，同时增加了自组装基因环路对于肿瘤组织的靶向作用，增强了治疗效果。
尽管在肿瘤组织发现了类似miRNA的脱靶效应，但是绝大多数下调的变化基因与EFGR siRNA被递送至肿瘤细胞造成的脱靶效应无关。事实上，只有非常有限的一部分下调的转录本实际上受到了种子序列介导的EGFR siRNA结合的影响。具体而言，在CMV-siRE治疗的肿瘤中，269个下调转录本中只有2个的3’-UTR序列能够被EGFR siRNA的种子序列结合；而在CMV-GE11-siRE治疗的肿瘤中，2114个下调转录本中只有24个的3’-UTR序列能够被EGFR siRNA的种子序列结合。而其它下调的转录本，甚至是上调转录本，可能是由于EGFR及其相关信号通路的沉默直接或间接导致的，同样也是靶向作用的一部分。为了对比靶向和脱靶对肿瘤细胞的作用，通过GO功能聚类分析来分析肿瘤细胞中改变基因富集的生物过程。如图9c所示，在CMV-siRE vs CMV-CMV-scrR组排名靠前的20个GO簇中，有6个与EGFR信号通路密切相关，如“血管系统发育”、“正调控细胞迁移”、“调节内皮细胞增殖”和“酶联受体蛋白信号通路”等。而在CMV-GE11-siRE vs CMV-CMV-scrR组排名前20位的GO簇中，有10个簇与EGFR信号通路密切相关，如“正调控细胞迁移”、“调节细胞骨架组织”、“肌动蛋白细胞骨架组织”和“血管发育”等。特别是EGFR下游信号分子，如PI3K和KRAS，均在CMV-GE11-siRE治疗后出现显著性的下调，并富集在“MAPK级联”的GO簇中。在CMV-GE11-siRE或CMV-siRE治疗后的肿瘤细胞中，GO簇的富集与EGFR信号通路相关，显示了体内自组装EGFRsiRNA在肿瘤细胞中对EGFR及其相关信号通路产生了显著影响，同时也表明了siRNA介导的靶向作用比miRNA介导的脱靶效应更强。
在哺乳动物细胞中，siRNA和miRNA都与AGO2蛋白组装成RNA诱导的沉默复合体(RISC)，形成RNAi的效应分子。因此，外源性siRNA和内源性miRNA介导的基因调控所需的细胞蛋白机器是相同的。在自然状态下，RISC自然地被内源性miRNA占据；然而当大量外源siRNA注入细胞后，可以想象，miRNA可能会被过饱和的siRNA从RISC中取代，从而导致miRNA的不稳定从失去对其靶向的内源mRNA的调控能力。此前已有研究揭示，在小鼠中与siRNA给药相关的肝毒性是由于干扰了肝细胞特异性miRNA，miR-122的作用导致的。鉴于EGFRsiRNA是在肝脏中表达、组装和分泌，过量生成的外源siRNA确实有可能占据RISC，继而对miRNA的加工和功能有广泛的影响。因此，在EGFR驱动的NSCLC模型的肝脏中重点分析了CMV-siRE、CMV-GE11-siRE治疗后miR-122所调控的下游靶基因的变化情况。发现在1566个miR-122的靶基因中，仅有13个靶基因在CMV-siRE、21个靶基因在CMV-GE11-siRE治疗组中发生显著变化，同时统计了在CMV-siRE、CMV-GE11-siRE治疗后，肝脏中miR-122所有靶基因的表达情况(图9d)，发现相对于CMV-CMV-scrR组，无论CMV-siRE治疗组还是CMV-GE11-siRE治疗组，都没有造成肝脏中miR-122靶基因的显著变化。以上结果说明体内自组装的EGFRsiRNA并非无节制地大量产生，其在体内的量非常适中，既保持了足够活性和作用，又不至于因为过饱和从而过分地与miRNA竞争RISC复合物造成miRNA失调导致的副作用。
由于观测到肿瘤细胞中靶向作用比脱靶效应更强，而在正常组织没有明显的脱靶效应，同时肝细胞富集的miR-122的下游通路也未受影响，因此理论上基因环路不会对正常组织有很大的副作用。实验结果也再次印证了这一理论，当用CMV-siRE或CMV-GE11-siRE质粒进行一个治疗周期(10mg/kg，两天一次，给药两周)的给药后，在C57BL/6J小鼠体内评估体内自组装EGFR siRNA的潜在副作用和组织毒性时，组织病理学检查未见明显肝毒性、肾毒性及组织损伤。此外，还对血清中各生化指标的变化进行了观察，由于体内自主装的siRNA主要在肝脏加工成熟，所以肝细胞的功能状态异常需要重点关注。然而，典型的肝功能异常生物标志物，如小鼠的血清中的丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总胆红素，并没有在CMV-siRE或CMV-GE11-siRE质粒处理后出现显著变化(图10)。这些结果表明，基因环路诱导的EGFR siRNA在体内自组装的生成和递送过程无明显毒副作用，具有良好的生物安全性。
试验例4：
本试验例研究GE11-siRE质粒对H1975细胞原位植瘤的肺癌小鼠模型(气管插管30天后，肺部产生肿瘤)的治疗效果，验证GE11-siRE递送系统对耐药性突变型小鼠肺癌的治疗效果。
利用CT成像验证该转基因小鼠造模成功后，将小鼠随机分为5组——PBS组、CMV-scrR组、Osimertinib(奥希替尼)组、CMV-siRE组、CMV-GE11-siRE组，分别按照10mg/kg的剂量注射PBS、CMV-scrR和CMV-GE11-siRE递送系统(质粒)，Osimertinib组通过灌胃的方式给药。每两天给药一次，共治疗15天，治疗前后分别利用CT成像结合全肺三维重建的方式检测肺部肿瘤变化情况，并统计小鼠的生存情况。
如图11a所示，在治疗前后，注射CMV-GE11-siRE质粒的小鼠肺部肿瘤体积明显减小，注射CMV-siRE质粒和CMV-scrR质粒的小鼠肺部肿瘤体积均有部分增长，而PBS组小鼠肿瘤体积明显增大。图11b为统计的造模小鼠治疗后的生存情况，可见CMV-GE11-siRE组的生存时间更长。
对治疗后的五组小鼠的肺组织进行HE染色、IHC-EGFR/pAKT/pERK/PCNA以及蛋白与mRNA表达量分析检测，结果如图12，图13所示。图12为五组小鼠HE染色以及IHC结果对比图，可以看出CMV-GE11-siRE组小鼠肺组织情况最好。图13是小鼠EGFR蛋白与mRNA表达量检测对比图，可以看出，PBS组小鼠和CMV-scrR组小鼠的EGFR蛋白表达水平最高，其次为CMV-siRE组，此组小鼠EGFR蛋白表达水平较低，CMV-GE11-siRE组小鼠EGFR蛋白表达水平最低，与正常小鼠相当。上述结果进一步证实了CMV-GE11-siRE治疗组的良好治疗效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，其特征在于，所述递送系统中包括有能够抑制表皮生长因子受体基因表达的RNA；所述能够抑制表皮生长因子受体基因表达的RNA包括：启动子元件以及能够抑制表皮生长因子受体基因表达的siRNA、编码siRNA中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，其特征在于，所述能够抑制表皮生长因子受体基因表达的siRNA的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1-SEQ IDNo.11任一所示的序列。
3.根据权利要求1所述的靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，其特征在于，所述能够抑制表皮生长因子受体基因表达的编码siRNA正义链核苷酸序列为序列表中SEQ IDNo.12-SEQ ID No.22任一所示的序列；所述能够抑制表皮生长因子受体基因表达的编码siRNA反义链核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.23-SEQ ID No.33任一所示的序列。
4.根据权利要求1-3任一所述的靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，其特征在于，所述递送系统中还包括有递送载体；所述携带能够抑制表皮生长因子受体基因表达的RNA的递送载体与靶向元件在哺乳动物的器官组织中自组装形成复合结构，所述复合结构通过所述靶向元件寻找并将能够抑制表皮生长因子受体基因表达的RNA送入目标组织，抑制目标组织中表皮生长因子受体的表达。
5.根据权利要求4所述的靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，其特征在于，所述表皮生长因子受体为EGFR。
6.根据权利要求5所述的靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，其特征在于，所述复合结构为外泌体。
7.根据权利要求6所述的靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，其特征在于，所述靶向元件包括至少一条靶向序列GE11；所述靶向序列GE11为序列表中SEQ ID No.34所示的序列或与SEQ ID No.34所示的序列同源性大于等于90％的同源序列。
8.根据权利要求7所述的靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统，其特征在于，所述递送载体为质粒载体或病毒载体；所述病毒载体优选的包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中的至少一种。
9.一种权利要求1-8任意一项所述的靶向抑制表皮生长因子受体的递送系统在制备抗肿瘤产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤产品包括抑制癌细胞或阻止表皮生长因子受体EGFR基因表达的试剂、对肿瘤具有预防和/或治疗作用的药物；所述肿瘤优选的包括乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、膀胱癌、卵巢癌中的至少一种。
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