CN117257824A - MiR-424在制备治疗脓毒症的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药用途技术领域，具体涉及MiR‑424在制备治疗脓毒症的产品中的应用。本发明中的MiR‑424能够有效逆转组织损伤、减少炎性细胞浸润、保护肠道屏障功能，并抑制炎症因子表达，具有高效抗脓毒症作用，并且能够实现脓毒症的早期诊疗，利于脓毒症的转归和预后，优化了临床脓毒症的治疗策略。
Description
技术领域
本发明属于医药用途技术领域，具体涉及MiR-424在制备治疗脓毒症的产品中的应用。
背景技术
脓毒症是严重外伤和大手术后的常见并发症，也是危重患者死亡的主要原因。虽然导致脓毒症的病理机制尚不完全清楚，但本行业已经知晓的是宿主免疫功能的改变会导致有害的细胞因子风暴、抗菌免疫受损、增加疾病的易感性和继发感染，在脓毒症发病机制中起关键作用。肝脏是脓毒症期间最常受伤的器官，其功能障碍是多器官功能障碍的关键标志之一。急性肝损伤可能发生在脓毒症的任何阶段，脓毒症患者通常被预测伴有肝功能异常恶化；此外，脓毒症引起的肝损伤可能不仅会导致肝功能衰竭，还会加重整体病情，直接影响其预后甚至死亡。因此，肝脏的早期治疗和保护可以显著改善脓毒症的预后。目前，临床脓毒症群体死亡率高，其临床治疗仍然严重依赖广谱抗生素和营养支持，很难改善预后。此外，过度使用抗生素已造成严重的公共卫生问题。因此，临床上迫切需要治疗脓毒症的有效方法。
成熟miRNA是一类进化高度保守的内源性非编码单链RNA，长约19～25个核苷酸，能够在转录后水平调控蛋白合成，参与多种生物学信号通路的调节。成熟miRNA的异常表达与多种人类疾病密切相关，在血液和组织中又能稳定存在，可以作为无创性的生物标记物，也能作为治疗工具改善疾病。MiR-424的差异表达与内皮细胞和上皮细胞的可塑性有关，并可以调节血管平滑肌细胞的表型，显示其对血管损伤后再狭窄的保护作用。事实上，该miRNA参与包括癌症、缺血性中风、急性脑梗死、缺血再灌注损伤和血脑屏障通透性等各种病理过程的调节。但现有技术中还并未有关于MiR-424对脓毒症有治疗作用的报导。
发明内容
本发明的目的在于提供MiR-424在制备治疗脓毒症的产品中的应用，提高脓毒症病人生存率，改善预后，优化临床脓毒症诊断和治疗策略。
本发明提供了MiR-424在制备治疗脓毒症的产品中的应用，所述MiR-424的序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，所述产品用于逆转组织损伤。
优选的，所述产品用于减少炎性细胞浸润。
优选的，所述产品用于保护肠道屏障功能。
优选的，所述产品用于抑制炎症因子表达。
优选的，所述炎症因子包括IL-10，IFN-γ，TNF-α，IL-6，MCP-1中的一种或多种。
优选的，所述产品包括药物。
本发明还提供了一种用于治疗或延缓脓毒症的药物，包括MiR-424和药学上可接受的辅料，所述MiR-424的序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，所述药物的剂型包括注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、外用溶液剂、贴剂、搽剂、膏剂或片剂。
优选的，所述MiR-424的有效剂量为0.56nM/kg。
有益效果：
本发明提供了MiR-R424在制备治疗脓毒症的产品中的应用，所述MiR-424的序列如SEQ No.1所示。本发明构建LPS诱导的脓毒症模型小鼠模型，利用MiR-R424给药，发现Mi-R424具有高效抗脓毒症作用，能够治疗脓毒症，为临床脓毒症的治疗提供了新的策略，并且能够实现脓毒症的早期诊疗，利于脓毒症的转归和预后。
此外，Mi-R424能够有效逆转组织损伤、减少炎性细胞浸润、保护肠道屏障功能，并抑制炎症因子表达。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为小鼠生存率实验结果；其中A表示对小鼠进行处理的时间节点，B为小鼠的生存率曲线；
图2为各处理组小鼠病理表型检测结果；标尺：100μm；
图3为各处理组小鼠病理表型检测结果；标尺：100μm；
图4为各处理组小鼠血清中抗炎因子和促炎因子的表达量；
图5为各处理组小鼠肝脏组织中抗炎因子和促炎因子的表达量；
图6为各处理组小鼠活体成像显示的肠道通透性及屏障损伤分布；
图7为MiR-424在正常人与脓毒症患者体内的表达量；
图8为MiR-424/MiR322-5p在正常对照组小鼠与脓毒症小鼠模型肝脏中的表达量；
图9为MiR-424/MiR322-5p在正常对照组小鼠与脓毒症小鼠模型巨噬细胞中的表达量；
图10为ROC曲线。
具体实施方式
本发明提供了MiR-424在制备治疗脓毒症的产品中的应用，所述MiR-424的序列如SEQ ID No.1所示，具体为：5’-CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA-3’。
本发明构建脓毒症模型，以MiR-424为活性成分进行给药，能够逆转组织损伤，减少炎性细胞浸润，保护肠道屏障功能，抑制炎症因子表达，达到治疗或延缓脓毒症的效果。
在本发明中，所述组织损伤优选为发生在肝脏、肺、肾脏和心脏中的一种或多种中的组织损伤；损伤后的组织结构被破坏，产生炎症细胞浸润现象，出血严重，本发明中MiR-424能有效逆转组织损伤，逆转后的组织损伤程度和充血程度减轻，减少了广泛分布的细胞死亡现象。
在本发明中，所述炎症因子优选为IL-10，IFN-γ，TNF-α，IL-6和MCP-1中的一种或多种。
在本发明中，所述产品优选为药物。
本发明还提供了一种用于治疗或延缓脓毒症的药物，包括MiR-424和药学上可接受的辅料，所述MiR-424的序列如SEQ No.1所示。
在本发明中，所述药物的剂型优选为注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、外用溶液剂、贴剂、搽剂、膏剂或片剂，更优选为注射剂。
在本发明中，所述药物中MiR-424的有效剂量为9～81nM/kg。所述MiR-424在人体中的单次使用剂量优选为9～81nM/kg，进一步优选为10～70nM/kg，更优选为15～50nM/kg，最优选为27nM/kg；用作注射剂时，所述MiR-424的注射浓度优选为90～270nM/kg/mL，更优选为90nM/kg/mL，所述MiR-424的注射量优选为0.1～0.3mL，更优选为0.3mL。本发明通过限定MiR-424的使用浓度，能够在确保疗效的情况下不产生细胞毒性。
在本发明中，所述MiR-424能够作为应激或诊断标志，在脓毒症中发挥潜在作用。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的MiR-424在制备治疗脓毒症的产品中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例对小鼠使用人MiR-424的同源序列MiR-322-5p来验证MiR-424对脓毒症的作用，所述MiR-322-5p的序列如SEQ ID No.2所示，具体为：5’-CAAAACAUGAAUUGCUGCUGUU-3’。
本发明实施例通过Student's t-test分析正态分布的数据(对于两组的比较)或方差分析(对于多个组比较)。对于不正常分布的值(由Kolmogrov-Smirnov检验确定)使用Mann-Whitney秩和检验。所有统计检验是双面的，P<0.05被认为是统计学上有意义。数据表示为平均值±SD(标准差)并用GraphPad Prism 5软件呈现(加利福尼亚州)。
实施例1
在动物水平上验证miR-424/miR-322-5p对脓毒症小鼠模型的早期保护性作用
(1)LPS诱导的脓毒症模型及干预
将7周龄大的C57BL/6雄鼠分为正常对照组(记为NC)、脓毒症组(记为LPS)、miR-424干预组(记为LPS+miR-424)、miRNA对照组(记为LPS+v)和单独miR-424组(记为miR-424)，每组各9只，并按照表1记载的方式分别对小鼠进行处理。
表1小鼠分组及其处理方式
(2)生存率实验
按照表1所记载的方式对小鼠进行处理后，对小鼠进行常规饲喂，连续观察7天，统计小鼠的生存率，结果如表2和图1所示。
其中，图1中A图的短线段表示后期的取材设在造模后24小时，长线段下的黑点表示时间省略。图1中的生存曲线表明，miR-424对LPS诱导的损伤有保护作用，能够使脓毒症小鼠死亡率显著降低。
表2小鼠存活率(％)
实施例2
(1)将7周龄大的C57BL/6雄鼠分为正常对照组(记为NC)、脓毒症组(记为LPS)、miR-424干预组(记为LPS+miR-424)，每组各6只，并按照表1记载的方式分别对小鼠进行处理，各组同时进行。
(2)小鼠病理表型检测
LPS诱导24小时后，使用异氟烷麻醉小鼠，取小鼠外周血、肝脏、肺、心、肾脏，病理学验证肝脏、肺、心、肾脏病理变化，采用4％多聚甲醛将组织浸润后包埋，石蜡切片进行HE染色，观察病理改变，结果如图2和图3所示。
由图2和图3可知，miR-424治疗能够逆转脓毒症小鼠肝脏、肺、肾脏、心的病理损伤，恢复其组织结构，减少炎性细胞浸润。
实施例3
q-pcr、ELISA检测炎症水平
3.1将7周龄大的C57BL/6雄鼠分为正常对照组(记为NC)、脓毒症组(记为LPS)、miR-424干预组(记为LPS+424)，每组各6只，并按照表1记载的方式分别对小鼠进行处理，各组同时进行。
3.2干预24小时后，麻醉安乐死小鼠后取外周血、肝脏组织。
3.2.1按照QIAGEN公司提供的miRNeasy Serum/PlasmaKit试剂盒的说明书中所记载的步骤提取外周血血清，进行ELISA实验，检测炎症因子IL-10，TNF-α，IL-6，MCP-1相对于β-actin的表达量，结果如表3和图4所示。
表3ELISA实验结果
注：表格中数据为检测结果±SEM、n＝6、*P<0.05、**P<0.01
根据表3和图4可知，脓毒症模型小鼠的血清中抗炎因子IL-10的表达量相比于正常对照组小鼠显著降低，MCP-1、TNF-α和IL-6的表达量相比于正常对照组小鼠大幅提升，显示造模成功。而miR-424干预组小鼠血清中抗炎因子IL-10的表达量相比于脓毒症模型小鼠显著提升，MCP-1、TNF-α和IL-6的表达量相比于脓毒症模型小鼠大幅降低，可见miR-424能够抑制脓毒症小鼠外周炎症因子TNF-α，IL-6，MCP-1的表达。
3.2.2提取肝脏组织RNA，逆转录成cDNA后，利用q-pcr分析组织中炎症因子IL-10，IL-17，IFN-γ，TNF-α，IL-6相对于β-actin的表达量。结果如表4和图5所示。
表4q-pcr实验结果
注：表格中数据为检测结果±SEM、n＝6、*P<0.05、**P<0.01
由表4和图5可知，脓毒症模型小鼠肝脏中抗炎因子IL-10的表达量相比于正常对照组小鼠显著降低，促炎因子IL-17，IFN-γ，TNF-α，IL-6的表达量相比于正常对照组小鼠显著升高，显示造模成功。而miR-424干预组小鼠肝脏中IL-10的表达量相比于脓毒症模型小鼠显著升高，促炎因子IL-17，IFN-γ，TNF-α，IL-6的表达量相比于正常对照组小鼠大幅降低，可见miR-424能够抑制脓毒症小鼠外周炎症因子IFN-γ，TNF-α，IL-6，MCP-1的表达。
实施例4
活体成像
4.1将7周龄大的C57BL/6雄鼠分为正常对照组(记为NC)、脓毒症组(记为LPS)、miR-424干预组(记为LPS+424)，每组各6只，并按照表1记载的方式分别对小鼠进行处理。
4.2处理后，通过IVIS spectrum对各组小鼠进行活体成像采集，暴露肠道位置进行图像采集，并且在24h后，安乐死标记了荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖(FITC-Dextran)的各组小鼠，暴露其肠道位置进行图像采集，荧光发光效率(radiant efficiency)检测及图像处理使用Living Image 3.1软件处理。结果如图6所示。
由图6可知，相比于正常对照组小鼠，脓毒症小鼠模型组的肠道通透性增加，屏障功能受损；而miR-424干预后，荧光信号分布在肠道中较弱，提示脓毒症小鼠肠道通透性明显改善，肠道屏障功能得到保护，提示上述肠功能损伤与过度炎症反应有关。
由以上实施例可知，Mi-R424能够有效逆转组织损伤、减少炎性细胞浸润、保护肠道屏障功能，并抑制促炎因子表达，促进抗炎因子表达，具有高效抗脓毒症作用，提示mir-424在脓毒症中有效改善疾病预后，也为脓毒症的治疗提供了新方案。
实施例5
临床水平验证miR-424与脓毒症的相关性
(1)临床样本的收集
选择江苏省宜兴市人民医院成人重症监护病房(ICU)2020年12月1日至2021年12月1日入住参与本次样本收集的病人病案资料，由课题组事先经过临床培训的2名研究生依据2002年美国胸科医师协会/美国危重病学会(ACCM/SCCM)联合会议通过的脓毒症相关定义及序贯器官功能不全评分系统(SOFA)，排除术后常规过渡病人，纳入符合标准的重症脓毒症患者20例，采集病人血清，收集基本人口学资料、临床诊断学资料、感染特点及原因、预后等数据，做好记录，录入系统，及时更新。同时收集门诊健康病人20例血清样本，收集临床诊断结果，供对照组使用。实验研究过程和操作遵循赫尔辛基宣言，并经南京大学和宜兴人民医院伦理委员会审议批准。
收集临床血液样本后，经室温3000rpm离心5min，吸取血清后统一编号管理，放置-80℃低温冰箱保存，供后续使用。
(2)临床样本的检测
使用miRNeasy Serum/Plasma Kit提取血清样本miRNA，逆转录后，以U6基因作为内参基因，用q-pcr检测临床患者(记为Sepsis)和正常人(记为)血清miR-424表达，计算相对U6基因的相对表达量，用于分析与临床诊断之间的关系，结果如表5和图7所示，图中的“*”表示数据有统计学意义，P＜0.05。
表5miR-424在正常人与脓毒症患者体内的相对表达量
由表5和图7可知，与正常组相比，miR-424在脓毒症病人血清中的表达显著降低，提示它可以作为应激或诊断标志，在脓毒症中发挥潜在作用。
实施例6
在本发明实施例中，7周龄大的C57BL/6雄鼠购自南京大学动物模式所，所有动物实验方案均获得南京大学医学院动物伦理委员会批准，并遵循《江苏省实验动物管理办法》条例。
(1)将7周龄大的C57BL/6雄鼠分为正常对照组(记为NC)、脓毒症组(记为LPS)、miR-424干预组(记为LPS+miR-424)，每组各6只，并按照按照表1所记载的方式对小鼠进行处理。
(2)干预24小时后，麻醉安乐死小鼠后取外周血、肝脏、肺等组织，提取外周血血清，提取方式如下：用促凝管采集所有样本新鲜外周血约5mL；将新鲜外周血于室温条件下3000rpm离心5min，小心收集上层血清，避免触及下层红细胞和白细胞；冻存于-80℃冰箱备用。
(3)按照QIAGEN公司miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒说明书所记载的步骤，提取血清中的总miRNA。
(4)miRNA的RT-qPCR检测：
a.将提取的miRNA逆转录合成cDNA(PrimeScript RT-PCR Kit,Takara)，过程如下：根据测定的浓度，计算好miRNA模板量，逆转录体系为30uL，模板总量1500ng。逆转录条件为：42℃15min，85℃5sec。
b.荧光定量PCR：以cDNA为模板，采用Roche UPL探针实时定量PCR方法，对miR-424在组织和血清中的表达水平进行分析。每份样本做三个复孔。以U6基因作为内参基因，采用StepOne v2.1软件和相对定量的方法分析实验数据，对结果取平均值。结果如表6、表7和图8、图9所示。
表6miR-424在正常对照组小鼠与脓毒症小鼠模型肝脏中的表达量
注：表格中数据为检测结果±SEM、n≥5
表7miR-424在正常对照组小鼠与脓毒症小鼠模型巨噬细胞中的表达量
注：*P<0.05。
由表6、表7和图8、图9可知，与正常组相比，miR322-5p在脓毒症小鼠模型肝脏、LPS刺激的巨噬细胞中的表达显著降低，提示它可以作为应激或诊断标志，在脓毒症中发挥潜在作用。
(5)诊断准确性评估：血浆中不同组之间miRNA表达水平采用了Tukey’stestfollowedby the Duncan's multiple range test进行统计学比较。受试者工作特征曲线(Receiver-operator characteristic，ROC)是以是否为脓毒症结局作为参比标准，将血浆中miRNA的表达量按照非参数假设制作的sensitivity％vs(100％-specificity％)分布图，并且计算了曲线下面积(area under ROC curve，AUC)。运用Logistic regression分析miRNA联合标记，作为诊断脓毒症的生物标记物。结果如表8和图10所示。
表8ROC曲线对应数值
由表8和图10可知，ROC曲线下面积为0.7619，ROC曲线下面积标准误差为0.07953，95％置信区间为0.6060～0.9178，P＜0.0041，说明以miR-424作为脓毒症的标志物具有较高的诊断价值。
综上所述，在LPS诱导的脓毒症小鼠中，MiR-424能够明显改善肺、心脏和肾水肿、炎症细胞浸润和严重出血。在肝脏中，miR-424也极大地逆转了LPS诱导的肝结构破坏、充血，减少广泛分布的细胞死亡。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.MiR-424在制备治疗脓毒症的产品中的应用，所述MiR-424的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.MiR-424在制备逆转组织损伤的产品中的应用，所述MiR-424的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.MiR-424在制备减少炎性细胞浸润的产品中的应用，所述MiR-424的序列如SEQ IDNO.1所示。
4.MiR-424在制备保护肠道屏障功能的产品中的应用，所述MiR-424的序列如SEQ IDNO.1所示。
5.MiR-424在制备抑制炎症因子表达的产品中的应用，所述MiR-424的序列如SEQ IDNO.1所示。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述炎症因子包括IL-10，IFN-γ，TNF-α，IL-6和MCP-1中的一种或多种。
7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物。
8.一种用于治疗或延缓脓毒症的药物，包括MiR-424和药学上可接受的辅料；
所述MiR-424的序列如SEQ ID No.1所示。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、外用溶液剂、贴剂、搽剂、膏剂或片剂。
10.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述MiR-424的有效剂量为9～81nM/kg。
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