CN117255798A - Kv1.3阻断剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了新的钾通道Kv1.3阻断剂、编码其的多核苷酸、以及制备和使用其的方法。
Description
技术领域
本发明提供了新的钾通道Kv1.3阻断剂、编码其的多核苷酸、以及制备和使用其的方法。
背景技术
离子通道是在生物膜中形成孔以允许(和调节)离子流动通过相关膜的膜蛋白。有许多不同类型的离子通道，其可以以多种方式分类，例如按它们为其提供通道的离子种类、调节或“门控”离子通道的方式(例如“配体门控”或“电压门控”)，以及它们的细胞或亚细胞定位。
钾通道分为四大类，即电压门控钾通道、钙激活钾通道、内向整流钾通道和串联孔结构域钾通道。
电压门控钾通道与其他电压门控通道一样，响应于跨膜电压而打开或关闭。它们代表了具有多种生物学功能的复杂家族，所述生物学功能包括调节神经递质释放、心率、胰岛素分泌、神经元兴奋性、上皮电解质传递、平滑肌收缩和细胞体积。
Kv1.3(电压门控钾通道亚家族A成员3)通道在T细胞上表达并在调节T细胞活化中起作用。已显示Kv1.3的阻断剂抑制活化的T细胞在体外的增殖(综述于Cahalan andChandy，Immunol.Rev.231：59-87，2009中)，并抑制自身免疫病(包括实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)、实验性关节炎、迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity，DTH)、变应性接触性皮炎和肾小球肾炎)的多种实验模型中的T细胞依赖性疾病进展。参见，例如，Rangaraju et al.(ExpertOpin.Ther.Targets 13：909-24，2009)；Beeton et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.103：17414-9，2006)；Koo et al.(J.Immunol.158：5120-8，1997)；Hyodo et al.(Am.J.Physiol.Renal Physiol.299：F1258-69，2010)。WO 2016/112208描述了表面应用Kv1.3阻断剂以用于治疗皮肤和黏膜炎症。
因此，Kv1.3阻断剂具有相当大的潜力用于治疗炎性疾病，包括自身免疫病。
WO 2015/013330提出使用Kv1.3阻断剂肽以治疗眼病症，例如目涩和葡萄膜炎，包括当由自身免疫病(例如舍格伦综合征(Sjogren’s syndrome))引起时。
Kv1.3的阻断剂也可具有有益的代谢作用，例如与能量稳态、体重调节和葡萄糖控制有关。与对照同窝小鼠相比，Kv1.3敲除(Kv1.3(-/-))小鼠响应于高脂肪饮食表现出降低的体重增加、较高的胰岛素敏感性和降低的血浆葡萄糖水平(Xu et al.，Hum.Mol.Genet.12：551-9，2003)。此外，还已显示Kv1.3阻断剂提高葡萄糖转运体4(glucose transporter 4，GLUT4)在骨骼肌和脂肪组织中的表达，提高正常和ob/ob肥胖小鼠的胰岛素敏感性，并提高原代脂肪细胞的体外葡萄糖摄取(Xu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：3112-7，2004)。在人中，Kv1.3基因中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)也与胰岛素敏感性降低和糖耐量降低相关(Tschritter，Clin Endocrinol Metab 91：654-8，2006)。
Kv1.3也在增殖的人和小鼠平滑肌细胞中表达。Kv1.3的阻断剂可对平滑肌增生性疾病例如再狭窄有效，例如在经历血管手术(例如血管成形术)之后的患者中。已显示Kv1.3阻断剂在离体人静脉样品中抑制钙进入、降低平滑肌细胞迁移并抑制新生内膜增生(Cheong et al.，Cardiovasc.Res.89：282-9，2011)。
另外的证据表明，Kv1.3通道参与多种类型细胞(包括肿瘤细胞(Bielanska etal.，Curr.Cancer Drug Targets 9：904-14，2009)、小胶质细胞(Khanna et al.，Am.J.Physiol.Cell Physiol.280：C796-806，2001))的活化和/或增殖以及神经元祖细胞的分化(Wang et al.，J.Neurosci.30：5020-7，2010)。因此，Kv1.3阻断剂可有益于治疗神经炎性和神经退行性疾病以及癌症。
Kv1.3是密切相关的钾通道亚家族(称为Kv1.1至Kv1.8)的一部分。在处理大同源家族时，总是期望阻断剂对所期望靶标尽可能具有选择性和特异性，以提高效力和安全性，并避免不期望的脱靶效应。迄今为止确定的最具特异性的Kv1.3阻断剂是来源于多种类型的有毒生物体(例如蛇、蛛形动物(例如蝎子和蜘蛛)、海葵等)的毒肽(venom peptide)。这样的Kv1.3阻断剂包括肽ShK、Oskl、玛格毒素(margatoxin)和卡利蝎毒素(kaliotoxin)(由Chandy et al.，Trends in Pharmacol.Sci.25：280-9，2004综述)。另参见Abdel-Mottalebet al.，Toxicon 51：1424-30，2008和Mouhat et al.，Biochem.J.385(Pt 1)：95-104，2005。
已经描述了针对特定特性(包括特异性或效力)对毒素肽进行工程化的多种尝试，例如在WO2006/002850、WO2006/042151、WO2008/088422、WO2006/116156、WO2010/105184和WO2014/116937中。国际专利申请PCT/EP2020/076187也公开了Kv1.3阻断剂。
然而，仍然需要替代的Kv1.3阻断剂。与已知阻断剂相比具有改善的特异性的阻断剂可以是特别期望的，尽管其他特性例如稳定性和效力的改善也可以是有用的。
发明内容
本发明涉及来源于蝎子黑粗尾蝎(Parabuthus transvaalicus)的毒素肽的离子通道阻断剂。所述毒素肽具有氨基酸序列QMDMRCSASVECKQKCLKAIGSIFGKCMNKKCKCYPR(SEQID NO：1)。
除其他期望特性之外，已发现该分子及其衍生物或变体相比对其他电压门控钾通道对Kv1.3钾离子通道是极具选择性的阻断剂，并且通常还在阻断Kv1.3通道上具有高效力。
因此，本发明提供了具有Kv1.3抑制剂活性的离子通道阻断剂或其可药用盐，所述离子通道阻断剂或其可药用盐包含序列QMDMRCSASVECKQKCLKAIGSIFGKCMNKKCKCYPR(SEQID NO：1)的变体，其中在SEQ ID NO：1的第7、8、9、10或11位中的至少一个氨基酸被具有带正电荷侧链的氨基酸和/或具有芳族侧链的氨基酸替换，并且其中所述变体不包含以下序列中的任一者：
在一个方面中，本发明提供了具有Kv1.3抑制剂活性的离子通道阻断剂或其可药用盐，所述离子通道阻断剂或其可药用盐包含序列QMDMRCSASVECKQKCLKAIGSIFGKCMNKKCKCYPR(SEQ ID NO：1)的变体，其中在SEQ ID NO：1的第7、8、9、10或11位中的至少一个氨基酸被具有带正电荷侧链的氨基酸和/或具有芳族侧链的氨基酸替换。
在另一些方面中，本发明提供了编码本发明的离子通道阻断剂的核酸、包含本发明的核酸的表达载体、以及包含本发明的核酸或本发明的表达载体并能够表达本发明的离子通道阻断剂的宿主细胞。
本发明还提供了合成本发明的离子通道阻断剂或可药用盐的方法。
本发明还提供了包含本发明的离子通道阻断剂或可药用盐的药物组合物。
本发明又进一步提供了本发明的离子通道阻断剂、可药用盐或药物组合物的医学用途，以及使用本发明的离子通道阻断剂、可药用盐或药物组合物治疗疾病的方法。
具体实施方式
离子通道阻断剂
本发明提供了离子通道阻断剂。
本发明的离子通道阻断剂可以是可药用盐的形式。本文中对“离子通道阻断剂”的所有提及均应被认为涵盖其任何可药用盐，无论是否明确列举了“可药用盐”。
术语“离子通道阻断剂”用于表示对离子通道具有抑制剂(或阻断)活性的化合物，即通常通过与离子通道结合能够抑制或消除离子流动通过相应的离子通道。类似地，术语“Kv1.3抑制剂”和“Kv1.3抑制剂组分”是指通常通过与Kv1.3通道结合能够抑制或消除离子流动通过Kv1.3离子通道的肽。然而，术语“阻断剂”和“抑制剂”不应被理解为暗示任何特定的作用机制，或任何特定的与离子通道本身相互作用的模式。
术语Kv1.3是指钾电压门控通道亚家族A成员3，也称为KCNA3、HPCN3、HGK5、HuKIII和HLK3。“亚家族A”也可以称为“振荡器相关亚家族”。人氨基酸序列以UniProt登录号P22001，版本P22001.3(Q5VWN2)提供。
Kv1.3通道在T和B淋巴细胞上表达，并与T细胞活化有关。许多研究组正在开发用于抑制免疫应答以及用于多种其他适应证的Kv1.3阻断剂。然而，Kv1.3通道是相关离子通道的复杂家族的一部分，所述家族还包括具有不同生理作用的Kv1.1、Kv1.2和Kv1.6通道。因此，期望Kv1.3抑制剂优先于其他离子通道尽可能对Kv1.3具有选择性，所述其他离子通道尤其是其他电压门控钾通道，例如Kv1.1、Kv1.2、Kv1.4、Kv1.5、Kv1.6、Kv1.7和Kv1.8。
本发明的离子通道阻断剂或可药用盐具有Kv1.3抑制剂活性。换言之，本发明的离子通道阻断剂(以及分离的离子通道阻断剂的肽组分)在Kv1.3离子通道处具有抑制剂或阻断剂活性，即它能够抑制离子流动通过Kv1.3通道。
IC50值
IC50值可用作抑制剂(或阻断剂)活性或效力的量度。IC50值是在给定测定中实现该化合物对离子通道活性的最大抑制的一半所需的抑制剂浓度的量度。在特定离子通道下具有比参照化合物更低的IC50的化合物可以被认为是比参照化合物更有活性的抑制剂或更强效的抑制剂。术语“活性”和“效力”可互换使用。
IC50值可以使用任何适当的测定来确定，例如测量离子通量(例如铊离子通量)的基于荧光的测定和膜片钳测定。它们可以如以下实施例中所述进行。膜片钳测定可以是优选的，例如使用系统。
在一些实施方案中，本发明的离子通道阻断剂对人Kv1.3钾通道的IC50为50nM或更小，例如20nM或更小、例如10nM或更小、例如5nM或更小、例如2nM或更小、例如1nM或更小、例如0.5nM或更小、例如0.4nM或更小、例如0.3nM或更小、例如0.2nM或更小。优选地，本发明的离子通道阻断剂对人Kv1.3钾通道的IC50为0.5nM或更小，最优选为0.2nM或更小。
本发明的离子通道阻断剂包括如本文中所述的化合物1至12，其在本文实施例2中显示对人Kv1.3钾通道的IC50为50nM或更小。本发明的离子通道阻断剂包括如本文中所述的化合物1至5和7至12，其在本文实施例2中显示对人Kv1.3钾通道的IC50为5nM或更小。本发明的离子通道阻断剂包括如本文中所述的化合物1至5、7、8和10至12，其在本文实施例2中显示对人Kv1.3钾通道的IC50为0.5nM或更小。本发明的离子通道阻断剂包括如本文中所述的化合物1至5、7、8和11，其在本文实施例2中显示对人Kv1.3钾通道的IC50为0.3nM或更小。本发明的离子通道阻断剂包括如本文中所述的化合物1至5，其在本文实施例2中显示对人Kv1.3钾通道的IC50为0.2nM或更小。
半衰期
在一些实施方案中，本发明的离子通道阻断剂的体内半衰期为至少1小时，例如为至少1.5小时，例如为至少2小时，例如为至少2.5小时。
离子通道阻断剂的半衰期(T1/2)可以使用本领域已知的测定(例如本文实施例3中所述的)来确定。
选择性
本发明的离子通道阻断剂对Kv1.3具有选择性。在一个实施方案中，本发明的离子通道阻断剂对Kv1.1、Kv1.2、Kv1.4、Kv1.5、Kv1.6、Kv1.7和Kv1.8具有选择性。特别地，本发明的离子通道阻断剂对Kv1.3的选择性优先于对Kv1.1、Kv1.2和Kv1.6中的一种或更多种的选择性。
例如，它们对Kv1.3的选择性可优先于Kv1.1、对Kv1.3的选择性优先于Kv1.2、对Kv1.3的选择性优先于Kv1.6、对Kv1.3的选择性优先于Kv1.1和Kv1.2、对Kv1.3的选择性优先于Kv1.1和Kv1.6、对Kv1.3的选择性优先于Kv1.2和Kv1.6、或者对Kv1.3的选择性优先于Kv1.1、Kv1.2和Kv1.6。通常，离子通道阻断剂对Kv1.3的选择性优先于Kv1.1。另外地，其对Kv1.3的选择性可优先于Kv1.2和/或Kv1.6。
本文中的“选择性”意指离子通道阻断剂针对Kv1.3的抑制剂活性高于针对Kv1.1、Kv1.2和Kv1.6各自的抑制剂活性。因此，离子通道阻断剂针对Kv1.3的IC50通常低于针对相应的其他一种或更多种离子通道的IC50。
因此，对Kv1.3的选择性优先于对另一个离子通道X的选择性可以表示为各自的IC50值的比率，例如表示为IC50[X]/IC50[Kv1.3]。
因此，本发明的离子通道阻断剂对Kv1.3的选择性可优先于Kv1.1至少10、至少100、至少1000或至少10000，并且可以多至100000或甚至更高。通常，本发明的离子通道阻断剂对Kv1.3的选择性优先于Kv1.1至少100、或至少1000。
因此，本发明的离子通道阻断剂对Kv1.3的选择性可优先于Kv1.2至少10、至少100、至少1000或至少10000，并且可以多至100000或甚至更高。通常，其对Kv1.3的选择性优先于Kv1.2至少10，并且优选地至少50、或至少100、或至少1000。
因此，本发明的离子通道阻断剂对Kv1.3的选择性可优先于Kv1.6至少10、至少100、至少1000或至少10000，并且可以多至100000或甚至更高。通常，其对Kv1.3的选择性优先于Kv1.6至少100、或至少400、或至少1000。
本发明的离子通道阻断剂可以比已知的离子通道阻断剂例如ShK、莫卡毒素(Mokatoxin)(Moka1)、Vm24、Odk2或Osk1具有更高的选择性。因此，本发明的离子通道阻断剂可优先于离子通道X对Kv1.3具有更高的选择性，即IC50[X]/IC50[Kv1.3]，其大于比较分子的选择性。两种离子通道阻断剂的选择性将在相同条件下对每个离子通道进行确定，以便进行直接比较。如上所述，可以使用任何合适的测定，例如基于荧光的离子通量测定和膜片钳测定。
在Kv1.1、Kv1.2和/或Kv1.6中的任一者或全部的情况下，本发明的离子通道阻断剂可具有比已知离子通道阻断剂(例如Odk2或Osk1)更低的绝对抑制剂活性(即更高的IC50)。然而，以下是可以接受的：只要本发明的离子通道阻断剂对Kv1.3的选择性高于比较化合物的选择性，则在这些离子通道中的任一者或全部的情况下，本发明的离子通道阻断剂具有较高的绝对抑制剂活性。然而，通常本发明的化合物结合了对Kv1.3的高特异性和高效力。
肽
本发明的离子通道阻断剂包含肽序列QMDMRCSASVECKQKCLKAIGSIFGKCMNKKCKCYPR(SEQ ID NO：1)的变体。
SEQ ID NO：1是蝎子黑粗尾蝎的毒素肽的氨基酸序列。如本文中所述，该肽是选择性Kv1.3钾离子通道抑制剂。
氨基酸
在本说明书和权利要求书通篇，使用了用于天然存在氨基酸的常规三字母和单字母代码，即
A(Ala)，G(Gly)，L(Leu)，I(Ile)，V(Val)，F(Phe)，W(Trp)，S(Ser)，T(Thr)，Y(Tyr)，N(Asn)，Q(Gln)，D(Asp)，E(Glu)，K(Lys)，R(Arg)，H(His)，M(Met)，C(Cys)和P(Pro)；
以及公认的用于其他α-氨基酸的代码，例如肌氨酸(Sar)、正亮氨酸(Nle)、α-氨基异丁酸(Aib)、2，3-二氨基丙酸(Dap)、2，4-二氨基丁酸(Dab)、2，5-二氨基戊酸(鸟氨酸或Orn)、α-氨基丁酸(Abu，也称为高-丙氨酸)、hK(也称为hLys或高-Lys(高-赖氨酸))、hQ(也称为hGln或高-Gln(高-谷氨酰胺，也称为6-氧代赖氨酸))、L-5-氨基甲酰基正缬氨酸、6-氨基-6-氧代正亮氨酸、5-(氨基羰基)正缬氨酸)、F(4-F)(4-氟-苯丙氨酸)、F(4-NH2)(4-氨基-苯丙氨酸)、F(4-NO2)(4-硝基-苯丙氨酸)和F(4-CH3)(4-甲基-苯丙氨酸)。
名称[2-氨基-5-羧基戊酰基]表示2-氨基-5-羧基戊酸的肽残基，其具有类似于谷氨酸的侧链，但具有另外的亚甲基，如以下结构所示：
名称[2，3-二氨基丙酰基]表示2，3-二氨基丙酸的肽残基，其具有以下结构：
名称[2，4-二氨基丁酰基]表示2，4-二氨基丁酸的肽残基，其具有以下结构：
名称[2-氨基-3-胍基丙酰基]表示2-氨基-3-胍基丙酸的肽残基，其具有以下结构：
当用于本说明书中的通式或序列中时，尤其是当式或序列的其余部分使用单字母代码示出时，这样的另外的α氨基酸可以在中括号“[]”中示出(例如“[Nle]”)。除非另有说明，否则本发明的肽中的氨基酸残基具有L-构型。然而，可以并入D-构型氨基酸。在本发明的上下文中，用小写字母表示的氨基酸代码代表所述氨基酸的D-构型，例如“k”代表赖氨酸(K)的D-构型。
SEQ ID NO：1的变体含有六个半胱氨酸(C)残基，其在残基6C与27C之间、残基12C与32C之间以及残基16C与34C之间共同形成三个二硫键。
通过参考SEQ ID NO：1，二硫键可以如下形象地表示：
其中一对一起参与二硫键的半胱氨酸残基用括号中的同一数字表示。类似的符号可以应用于本申请中的任何其他序列。除非上下文另有要求，否则应理解活性抑制剂化合物包含适当的二硫键。
可以期望没有其他半胱氨酸残基通过替换或插入被引入到SEQ ID NO：1的变体中。因此，在一些实施方案中，除了在对应于SEQ ID NO：1的第6、12、16、27、32和34位的位置处的那些半胱氨酸残基之外，该变体不包含其他半胱氨酸残基。在一些实施方案中，SEQ IDNO：1的变体中的任何替换或缺失均不在SEQ ID NO：1的第6、12、16、27、32和34位氨基酸处。
变体
本发明的离子通道阻断剂包含SEQ ID NO：1的变体。在一些实施方案中，本发明的离子通道阻断剂由SEQ ID NO：1的变体组成。SEQ ID NO：1的变体是包含不同于SEQ ID NO：1的氨基酸的一个或更多个氨基酸的肽(即，与SEQ ID NO：1相比具有一个或更多个氨基酸变化)。这样的变体也可称为“衍生物”、“变体肽”、“肽”或“化合物”。
SEQ ID NO：1的变体与SEQ ID NO：1的不同之处可在于SEQ ID NO：1的一个或更多个氨基酸缺失和/或SEQ ID NO：1的一个或更多个氨基酸被替换为不同的氨基酸和/或一个或更多个氨基酸被插入到SEQ ID NO：1的序列中。氨基酸可以插入到SEQ ID NO：1的内部位置处、SEQ ID NO：1的N端处或SEQ ID NO：1的C端处。因此，SEQ ID NO：1的变体包含一个或更多个替换、插入和/或缺失。
除非另有说明，否则“替换”是指SEQ ID NO：1中单个氨基酸的替换(即替代)。因此，例如，SEQ ID NO：1中三个连续氨基酸的替换构成三个替换，而不是单个替换。同样，“插入”是指单个氨基酸插入到SEQ ID NO：1中(其可以在内部，在N端，和/或在C端)，因此，例如三个连续的氨基酸插入到SEQ ID NO：1中构成三个插入，而不是单个插入。“缺失”是指来自SEQ ID NO：1的单个氨基酸的缺失，因此，SEQ ID NO：1中例如三个连续氨基酸的缺失构成三个缺失，而不是单个缺失。
在一些特别优选的实施方案中，SEQ ID NO：1的变体与SEQ ID NO：1的不同之处在于总共最多十个替换、插入或缺失。在一些这样的实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，所述变体总共包含10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个替换、插入或缺失。优选地，与SEQ ID NO：1的序列相比，所述变体与SEQ ID NO：1的不同之处在于总共7个替换、插入或缺失。
编号
SEQ ID NO：1的氨基酸残基按照N端到C端的常规方向从1到37编号。在说明书通篇，SEQ ID NO：1的变体中的氨基酸位置根据当与SEQ ID NO：1最佳对齐时SEQ ID NO：1中的相应位置编号。因此，特别是对于与SEQ ID NO：1相比含有一个或更多个插入或缺失的变体，任何给定残基的编号反映了SEQ ID NO：1中的相应残基，而不一定反映其在变体序列中的线性位置。
处于特定位置的残基可以由相关位置的编号与所存在的残基的单字母代码或三字母代码一起表示。因此，1Q或Q1(两种形式可互换)表示第1位的谷氨酰胺(Q)残基，而2Nle、2[Nle]、Nle2或[Nle]2表示第2位的正亮氨酸残基。
星号可用于表示相对于SEQ ID NO：1序列的缺失位置。例如，“1*”表示与SEQ IDNO：1相比，第1位的残基缺失。
插入可以由单个位置处的一串连续残基来表示，例如“1QA”表示在第1位的谷氨酰胺(Q)残基之后插入了一个丙氨酸(A)残基。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比的任何替换都是保守替换。然而，下面提供的任何通式中列出的任何替换都可以在相应位置引入。
在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的变体中的任何替换或缺失都位于选自SEQ IDNO：1的第1至5、7至11、13至15、17至23、25、28至31、33和35至37位的氨基酸位置处。优选地，SEQ ID NO：1的变体中的任何替换或缺失都位于选自SEQ ID NO：1的第1至5、7至11、13、15、18、28和30位的氨基酸位置处。
末端基团
序列N端的“H”(或“Hy-”)部分表示氢原子[即R1＝氢]，对应于在N端存在游离伯氨基或仲氨基。或者，变体肽可包含替代的N端基团(即N端修饰)。
因此，在本发明的离子通道阻断剂或可药用盐的一些实施方案中，所述肽在N端包含选自C1-4烷基、乙酰基(Ac)、甲酰基、苯甲酰基和三氟乙酰基的基团。
序列C端的“-OH”部分表示在分子的C端存在作为羧基(COOH)基团的一部分的羟基(OH)。序列C端的“-NH2”部分表示在分子C端存在作为酰胺基(CONH2)基团的一部分的氨基(NH2)。C端的“CH2OH”部分表示在分子C端存在与烷基连接的羟基。
因此，在本发明的离子通道阻断剂或可药用盐的一些实施方案中，所述肽在C端包含氨基(-NH2)、羟基(-OH)或羟甲基(-CH2OH)，优选氨基(-NH2)或羟基(-OH)。
序列同一性
在一些实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：1具有至少60％的序列同一性，例如至少65％的序列同一性、例如至少70％的序列同一性、例如至少75％的序列同一性、例如至少80％的序列同一性、例如至少85％的序列同一性、例如至少90％的序列同一性、例如至少95％的序列同一性、例如至少96％的序列同一性、例如至少97％的序列同一性、例如至少98％的序列同一性、例如至少99％的序列同一性、例如100％的序列同一性。
关于本文中的肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大百分比序列同一性之后并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守替换的情况下，候选序列中与野生型毒素肽序列SEQ ID NO：1中的氨基酸相同的氨基酸的百分比。序列比对可由技术人员使用本领域公知的技术，例如使用公开可用的软件(例如BLAST、BLAST2或Align软件)进行。例如，参见Altschul et al.，Methodsin Enzymology 266：460-480(1996)或Pearson et al.，Genomics 46：24-36，1997。
本文中使用的百分比序列同一性在本发明的上下文中可使用这些程序以其默认设置来确定。更一般地，技术人员可容易地确定用于确定比对的合适的参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
特定的肽变体
第7至11位
本发明的离子通道阻断剂或可药用盐包含序列QMDMRCSASVECKQKCLKAIGSIFGKCMNKKCKCYPR(SEQ ID NO：1)的变体，其中SEQ ID NO：1的第7、8、9、10或11位中的至少一个氨基酸被具有带正电荷侧链的氨基酸和/或具有芳族侧链的氨基酸替换。
在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的第7、8、9、10或11位中的至少一个氨基酸被具有带正电荷侧链的氨基酸替换。在一些实施方案中，所述具有带正电荷侧链的氨基酸选自H、K、hK、R、Orn、2，3-二氨基丙酰基、2，4-二氨基丁酰基、2-氨基-3-胍基丙酰基和4-氨基-苯丙氨酸(F(4-NH2))。优选地，所述具有带正电荷侧链的氨基酸选自H、K、R、Orn、2，3-二氨基丙酰基、2-氨基-3-胍基丙酰基和2，4-二氨基丁酰基。优选地，所述具有带正电荷侧链的氨基酸选自H、R、Orn、2，3-二氨基丙酰基、2-氨基-3-胍基丙酰基和2，4-二氨基丁酰基。
在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的第7、8、9、10或11位中的至少一个氨基酸被具有芳族侧链的氨基酸替换。在一些实施方案中，所述具有芳族侧链的氨基酸选自F、W和Y。优选地，所述具有芳族侧链的氨基酸是Y。
在一些实施方案中，本发明的离子通道阻断剂或可药用盐包含序列QMDMRCSASVECKQKCLKAIGSIFGKCMNKKCKCYPR(SEQ ID NO：1)的变体，其中SEQ ID NO：1的第7、9或10中的至少一个氨基酸被具有带正电荷侧链的氨基酸和/或具有芳族侧链的氨基酸替换。
在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的第7、9或10位中的至少一个氨基酸被具有带正电荷侧链的氨基酸替换。在一些实施方案中，所述具有带正电荷侧链的氨基酸选自H、K、hK、R、Orn、2，3-二氨基丙酰基、2，4-二氨基丁酰基、2-氨基-3-胍基丙酰基和4-氨基-苯丙氨酸(F(4-NH2))。优选地，所述具有带正电荷侧链的氨基酸选自H、K、R、Orn、2，3-二氨基丙酰基、2-氨基-3-胍基丙酰基和2，4-二氨基丁酰基。优选地，所述具有带正电荷侧链的氨基酸选自H、R、Orn、2，3-二氨基丙酰基、2-氨基-3-胍基丙酰基和2，4-二氨基丁酰基。
在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的第7、9或10位中的至少一个氨基酸被具有芳族侧链的氨基酸替换。在一些实施方案中，所述具有芳族侧链的氨基酸选自F、W和Y。优选地，所述具有芳族侧链的氨基酸是Y。
在本发明的离子通道阻断剂的一些实施方案中，SEQ ID NO：1的第7、8、9、10或11位中的恰好一个氨基酸被具有带正电荷侧链或芳族侧链的氨基酸替换。在本发明的离子通道阻断剂的一些实施方案中，SEQ ID NO：1的第7、9或10位中的恰好一个氨基酸被具有带正电荷侧链或芳族侧链的氨基酸替换。
在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的第7位的氨基酸被具有带正电荷侧链或芳族侧链的氨基酸替换。优选地，SEQ ID NO：1的第7位的氨基酸被H、K、R、Orn、2，3-二氨基丙酰基、2-氨基-3-胍基丙酰基、2，4-二氨基丁酰基或Y替换。优选地，SEQ ID NO：1的第7位的氨基酸被H、R、Orn、2，3-二氨基丙酰基、2-氨基-3-胍基丙酰基、2，4-二氨基丁酰基或Y替换。
在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的第8位的氨基酸被具有带正电荷侧链或芳族侧链的氨基酸替换。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的第8位的氨基酸与SEQ ID NO：1中第8位的氨基酸(即A)相同。
在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的第9位的氨基酸被具有带正电荷侧链或芳族侧链的氨基酸替换。优选地，SEQ ID NO：1的第9位的氨基酸被K、Orn或2，3-二氨基丙酰基替换。优选地，SEQ ID NO：1的第9位的氨基酸被Orn或2，3-二氨基丙酰基替换。
在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的第10位的氨基酸被具有带正电荷侧链或芳族侧链的氨基酸替换。优选地，SEQ ID NO：1的第10位的氨基酸被R替换。
在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的第11位的氨基酸被具有带正电荷侧链或芳族侧链的氨基酸替换。优选地，SEQ ID NO：1的第11位的氨基酸被R替换。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的第11位的氨基酸与SEQ ID NO：1中第11位的氨基酸(即E)相同。
其他位置
在一些实施方案中，第1位的残基不是Q。谷氨酰胺(Q)残基在体内或体外(例如在水溶液中储存期间)可不稳定，当谷氨酰胺残基位于分子的N端时，这可能特别相关，因为侧链可能在空间上能够与游离的α氨基相互作用，导致脱水成焦谷氨酸。优选地，第1位的氨基酸是N或P，或者缺失(即，SEQ ID NO：1的变体可以包含1N、1P或1*)。
在一些实施方案中，第2、4和28位的氨基酸中的一个、两个或所有三个不是M，因为甲硫氨酸(M)残基易于氧化。优选地，第2、4和28位的一个、两个或所有三个甲硫氨酸氨基酸单独地被具有不可氧化侧链的残基替换，或者缺失。可以使用任何具有不可氧化残基的合适残基，其中Nle、I、V和L是特别合适的。优选地，第2、4和28位的氨基酸均为Nle。
在本发明的离子通道阻断剂的一些实施方案中，在SEQ ID NO：1的变体中，
第1位的氨基酸是N、P或Q，或者缺失，
第2位的氨基酸是M或Nle，或者缺失，
第3位的氨基酸是D或E，或者缺失，
第4位的氨基酸是M或Nle，或者缺失，
第5位的氨基酸是R或缺失，
第13位的氨基酸是A或K，
第15位的氨基酸是K或S，
第18位的氨基酸是A或K，
第28位的氨基酸是M或Nle，和/或
第30位的氨基酸是G或K。
在本发明的离子通道阻断剂的一些实施方案中，变体的第1至5位由选自NMDMR(SEQ ID NO：108)，N[Nle]D[Nle]R(SEQ ID NO：109)，N[Nle]E[Nle]R(SEQ ID NO：110)，和P[Nle]E[Nle]R(SEQ ID NO：111)，的氨基酸序列组成，或者第1至5位的氨基酸全部缺失。优选地，变体的第1至5位由氨基酸序列P[Nle]E[Nle]R组成。
在本发明的离子通道阻断剂的一些实施方案中，在SEQ ID NO：1的变体中，
第1至5位的氨基酸由氨基酸序列P[Nle]E[Nle]R组成，
第13位的氨基酸是A或K，
第15位的氨基酸是K或S，
第18位的氨基酸是A，
第28位的氨基酸是Nle，并且
第30位的氨基酸是G或K。
在本发明的离子通道阻断剂的一些实施方案中，第5、6、12、14、16、17、19至27、29和31至37位中的一个或更多个是与SEQ ID NO：1中相应位置相同的氨基酸。优选地，第5、6、12、14、16、17、19至27、29和31至37位全部是与SEQ ID NO：1中相应位置相同的氨基酸。在本发明的离子通道阻断剂的一些实施方案中，第5、6、8、11、12、14、16、17、19至27、29和31至37位中的一个或更多个是与SEQ ID NO：1中相应位置相同的氨基酸。优选地，第5、6、8、11、12、14、16、17、19至27、29和31至37位全部是与SEQ ID NO：1中相应位置相同的氨基酸。
SEQ ID NO 21的变体
在一些实施方案中，本发明的离子通道阻断剂包含序列P[Nle]E[Nle]RCSASVECKQKCLAAIGSIFGKC[Nle]NKKCKCYPR(SEQ ID NO：21)的变体或由其组成，
其中该变体与SEQ ID NO：21的不同之处在于4个、3个、2个或1个替换，
其中SEQ ID NO：21的第7、8、9、10或11位中的至少一个氨基酸被具有带正电荷侧链的氨基酸和/或具有芳族侧链的氨基酸替换。
SEQ ID NO：21是SEQ ID NO：1的特定变体。因此，应当理解，SEQ ID NO：21的变体是如本文中所述的SEQ ID NO：1的变体。
换言之，在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的变体包含序列P[Nle]E[Nle]RCSASVECKQKCLAAIGSIFGKC[Nle]NKKCKCYPR(SEQ ID NO：21)的变体或由其组成，
其中所述变体与SEQ ID NO：21的不同之处在于4个、3个、2个或1个替换，
其中SEQ ID NO：21的第7、8、9、10或11位中的至少一个氨基酸被具有带正电荷侧链的氨基酸和/或具有芳族侧链的氨基酸替换。
因此，本文中所述的SEQ ID NO：1的变体的实施方案的所有特征均可应用于SEQID NO：21的变体。
在一些实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：21的不同之处在于4个替换或1个替换。在一些实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：21的不同之处在于1个替换。
在一些实施方案中，SEQ ID NO：21的第7、9或10位中的至少一个氨基酸被具有带正电荷侧链的氨基酸和/或具有芳族侧链的氨基酸替换。在一些实施方案中，SEQ ID NO：21的第7、9或10位中的恰好一个氨基酸被具有带正电荷侧链的氨基酸和/或具有芳族侧链的氨基酸替换。
在一些实施方案中，任何替换均位于选自SEQ ID NO：21的第7、9、10、13、15和30位的氨基酸位置处。
在一些实施方案中，所述变体：
(i)与SEQ ID NO：21的不同之处在于1个替换，其中SEQ ID NO：21的第7或9位的氨基酸被具有带正电荷侧链的氨基酸和/或具有芳族侧链的氨基酸替换，或者
(ii)与SEQ ID NO：21的不同之处在于4个替换，其中SEQ ID NO：21的第7或10位中的恰好一个氨基酸被具有带正电荷侧链的氨基酸和/或具有芳族侧链的氨基酸替换。
在一些实施方案中，所述变体：
(i)与SEQ ID NO：21的不同之处在于1个替换，其中SEQ ID NO：21的第7或9位的氨基酸被具有带正电荷侧链的氨基酸和/或具有芳族侧链的氨基酸替换，或者
(ii)与SEQ ID NO：21的不同之处在于4个替换，其中SEQ ID NO：21的第7或10位中的恰好一个氨基酸被具有带正电荷侧链的氨基酸和/或具有芳族侧链的氨基酸替换，并且其中其他三个替换位于SEQ ID NO：21的第13、15和30位处。
在一些实施方案中，所述变体：
(i)与SEQ ID NO：21的不同之处在于1个替换，其中SEQ ID NO：21的第7或9位的氨基酸被具有带正电荷侧链的氨基酸和/或具有芳族侧链的氨基酸替换，或者
(ii)与SEQ ID NO：21的不同之处在于4个替换，其中SEQ ID NO：21的第7或10位中的恰好一个氨基酸被具有带正电荷侧链的氨基酸和/或具有芳族侧链的氨基酸替换，
其中其他三个替换位于SEQ ID NO：21的第13、15和30位处，并且其中：
(a)第13位的氨基酸是A；和/或
(b)第15位的氨基酸是S；和/或
(c)第30位的氨基酸是G。在一些实施方案中，所述变体：
(i)与SEQ ID NO：21的不同之处在于1个替换，其中SEQ ID NO：21的第7或9位的氨基酸被选自H、R、Orn、2，3-二氨基丙酰基、2，4-二氨基丁酰基、2-氨基-3-胍基丙酰基和Y的氨基酸替换，或者
(ii)与SEQ ID NO：21的不同之处在于4个替换，其中SEQ ID NO：21的第7或10位中的恰好一个氨基酸被选自R和2，4-二氨基丁酰基的氨基酸替换。
在一些实施方案中，所述变体：
(i)与SEQ ID NO：21的不同之处在于1个替换，其中SEQ ID NO：21的第7处的氨基酸被选自H、R、Orn、2，3-二氨基丙酰基、2，4-二氨基丁酰基、2-氨基-3-胍基丙酰基和Y的氨基酸替换，或者SEQ ID NO：21的第9位的氨基酸被Orn替换，或者
(ii)与SEQ ID NO：21的不同之处在于4个替换，其中SEQ ID NO：21的第7位的恰好一个氨基酸被选自R和2，4-二氨基丁酰基的氨基酸替换，或者SEQ ID NO：21的第10位的恰好一个氨基酸被R替换。
序列
在一些优选实施方案中，本发明的离子通道阻断剂包含以下序列中的一者或由其组成：
在一些优选实施方案中，本发明的离子通道阻断剂包含SEQ ID NO10或SEQ ID NO12。在一些优选实施方案中，本发明的离子通道阻断剂由SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 12组成。
化合物
在一些优选实施方案中，本发明的离子通道阻断剂包含以下化合物中的一者或由其组成：
在一些优选实施方案中，本发明的离子通道阻断剂包含Cpd No.1或Cpd No.3。在一些优选实施方案中，本发明的离子通道阻断剂由Cpd No.1或Cpd No.3组成。
免责声明
国际专利申请PCT/EP2020/076187公开了这样的离子通道阻断剂，其包含SEQ IDNO：2、3、4、5、6、7、8或9(在PCT/EP 2020/076187中分别为SEQ ID NO：25、27、42、47、63、143、144和145)的序列或由其组成。
国际专利申请PCT/EP2020/076187还公开了以下化合物：
国际专利申请PCT/EP2020/076187没有公开包含SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8或9的序列或其由组成的任何其他特定化合物。例如，PCT/EP2020/076187没有公开具有C端羟基(-OH)的SEQ ID NO：2、3、4、5或6，或者具有C端氨基(-NH2)的SEQ ID NO：7、8或9。
因此，本发明的离子通道阻断剂包含SEQ ID NO：1的变体，其中该变体不包含以下序列中的任一者：
本发明的离子通道阻断剂不是国际专利申请PCT/EP2020/076187中所公开的化合物25、27、42、47、63、143、144或145中的任一者。
在本发明的离子通道阻断剂的一些实施方案中，SEQ ID NO：1的变体不包含SEQID NO：2、3、4、5、6、7、8或9的序列或不由其组成。在一些实施方案中，本发明的离子通道阻断剂不包含国际专利申请PCT/EP2020/076187中所公开的任一序列。在一些实施方案中，本发明的离子通道阻断剂不是国际专利申请PCT/EP2020/076187中所公开的任一化合物。
合成离子通道阻断剂的方法
本文中所述的离子通道阻断剂可以通过固相或液相肽合成方法来合成。在这种情况下，可以参考WO 98/11125以及其他许多文献Fields，G.B.et al.，2002，“Principlesand practice of solid-phase peptide synthesis”.In：Synthetic Peptides(第2版)和本文的实施例。
或者，本文中所述的离子通道阻断剂可通过重组技术或通过重组技术与肽化学的组合来合成。
因此，在一个方面中，本发明提供了合成本发明的离子通道阻断剂的方法，该方法包括：
(a)通过固相或液相肽合成方法合成肽并回收由此获得的肽；
(b)由编码所述肽的核酸构建体表达所述肽并回收表达产物；或者
(c)由编码前体肽序列的核酸构建体表达前体肽，回收表达产物，并修饰所述前体肽以产生本发明的离子通道阻断剂。
前体肽可以通过引入一个或更多个非蛋白原性氨基酸(例如Nle)、引入合适的末端基团R1和R2等来修饰。
由编码肽或前体肽的核酸来表达肽或前体肽可以在包含这样的核酸的无细胞表达系统或细胞中进行。这样的表达通常需要肽或前体肽完全由蛋白原性氨基酸(即由标准遗传密码编码的20种氨基酸)构成。
对于重组表达，通常将编码前体肽的核酸片段插入合适的载体中以形成克隆或表达载体。根据应用目的和类型，载体可以是质粒、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒的形式，但是仅在某些细胞中瞬时表达的裸DNA也是重要的载体。优选的克隆和表达载体(质粒载体)能够自主复制，从而使得能够产生高拷贝数以用于高水平表达或高水平复制以进行后续克隆。
总体上，表达载体包含5’→3’方向上的且可操作地连接的以下特征：用于驱动核酸片段表达的启动子；任选地，编码能够分泌(分泌到胞外相或适当时分泌到周质(periplasma)中)的前导肽的核酸序列；编码前体肽的核酸片段；以及任选地，编码终止子的核酸序列。表达载体可包含另外的特征，例如可选择标志物和复制起点。当对生产菌株或细胞系中的表达载体进行操作时，优选的是所述载体能够整合到宿主细胞基因组中。技术人员对合适的载体非常熟悉，并且能够根据其特定要求来设计载体。
本发明的载体用于转化宿主细胞以产生肽或前体肽。这样的经转化细胞可以是用于扩增核酸片段和载体和/或用于重组产生所述前体肽的培养的细胞或细胞系。
优选的经转化细胞是微生物，例如细菌(例如以下物种：埃希菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌(E.coli))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))、沙门菌属(Salmonella)或分支杆菌属(Mycobacterium)(优选非致病性的，例如牛分枝杆菌(M.bovis)BCG))、酵母菌(yeast)(例如，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris))和原生动物。或者，经转化细胞可来源于多细胞生物，即，其可以是真菌细胞、昆虫细胞、藻类细胞、植物细胞或动物细胞(例如哺乳动物细胞)。为了克隆和/或优化表达的目的，优选的是经转化细胞能够复制本发明的核酸片段。表达核酸片段的细胞可用于小规模或大规模制备本发明的肽。
当通过经转化细胞来产生肽或前体肽时，将表达产物分泌到培养基中是方便的，尽管远不是必须的。
药物组合物
在另一个方面中，本发明提供了包含本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐的药物组合物。在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐以及可药用载体、赋形剂或载剂。
本发明的任何离子通道阻断剂可以是可药用盐的形式。本文中对“本发明的离子通道阻断剂”的所有提及均应被认为涵盖其任何可药用盐，无论是否明确列举了“可药用盐”。离子通道阻断剂也可被称为“溶剂合物”，其意指在溶质(根据本发明的肽或其可药用盐)和溶剂之间形成的确定化学计量的复合物。在这种情况下，溶剂可以是例如水、乙醇或另一些可药用的、通常为小分子的有机物质，例如但不限于乙酸或乳酸。当所讨论的溶剂是水时，这样的溶剂合物通常被称为水合物。
因此，本发明的化合物或其盐，尤其是其可药用盐，可以配制成制备用于储存或施用的组合物或药物组合物，并且其包含治疗有效量的本发明的化合物或其盐。
与碱形成的合适的盐包括金属盐，例如碱金属或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或镁盐；铵盐和有机胺盐，例如与以下形成的那些：吗啉、硫代吗啉、哌啶、吡咯烷、低级单-烷基胺、二-烷基胺或三-烷基胺(例如，乙基-叔丁基-、二乙基-、二异丙基-、三乙基-、三丁基-或二甲基丙基胺)、或低级单-(羟基烷基)胺、二-(羟基烷基)胺或三-(羟基烷基)胺(例如，单-乙醇胺、二-乙醇胺或三乙醇胺)。还可形成内盐。类似地，当本发明的化合物含有碱性部分时，可以使用有机酸或无机酸形成盐。例如，可由以下酸形成盐：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、草酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、丙二酸、苦杏仁酸、苹果酸、邻苯二甲酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、苯甲酸、碳酸、尿酸、甲磺酸、萘磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、对甲苯磺酸(即4-甲基苯磺酸)、樟脑磺酸、2-氨基乙磺酸、氨基甲基膦酸和三氟甲磺酸(trifluoromethanesulphonic acid)(后者也称为三氟甲磺酸(triflic acid))，以及其他已知的可药用酸。还可以与氨基酸(例如赖氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸)形成氨基酸加成盐。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物是其中化合物是可药用酸加成盐形式的药物组合物。
如对于医学领域的技术人员将明显的是，本发明的化合物或药物组合物的“治疗有效量”将尤其取决于待治疗对象(患者)的年龄、体重和/或性别而变化。可能相关的其他因素包括所考虑的具体患者的身体特征、患者的饮食、任何并用药物的性质、所使用的具体化合物、具体施用方式、所期望的药理学作用以及具体的治疗性适应证。因为这些因素及其在确定治疗有效量中的关系在医学领域中是公知的，所以确定用于实现所期望的治疗作用的治疗有效剂量水平将在技术人员的能力范围内。
本文中使用的术语“治疗有效量”是指减轻给定病症或病理状况之症状，并且优选使患有该病症或病理状况的个体中的生理响应正常化的量。症状的减轻或生理响应的正常化可使用本领域中常规的方法来确定，并且可随给定的病症或病理状况而变化。在一个方面中，本发明化合物或药物组合物的治疗有效量是将可测量的生理参数恢复至未患所涉及病症或病理状况的个体中的参数的基本上相同的值(优选在该值的30％以内，更优选在该值的20％以内，并且还更优选在该值的10％以内)。
在本发明的一个实施方案中，本发明化合物或药物组合物的施用以较低剂量水平开始，并且提高剂量水平直至实现预防/治疗相关医学适应证的期望作用。这将限定治疗有效量。对于本发明的化合物(单独或作为药物组合物的一部分)，活性化合物的这样的人剂量可以为约0.01pmol/kg至500μmol/kg体重、约0.01pmol/kg至300μmol/kg体重、0.01pmol/kg至100μmol/kg体重、0.1pmol/kg至50μmol/kg体重、1pmol/kg至10μmol/kg体重、5pmol/kg至5μmol/kg体重、10pmol/kg至1μmol/kg体重、50pmol/kg至0.1μmol/kg体重、100pmol/kg至0.01μmol/kg体重、0.001μmol/kg至0.5μmol/kg体重、0.05μmol/kg至0.1μmol/kg体重。
可通过常规手段来确定有效剂量和治疗方案，其在实验室动物中以低剂量开始，并且随后在监测效果的同时提高剂量，并且还系统地改变剂量方案。当确定用于给定对象的最优剂量时，临床医师可能考虑若干因素。这样的考虑是技术人员已知的。
医学用途和治疗方法
在另一个方面中，本发明提供了用于医学治疗方法的本发明的离子通道阻断剂或可药用盐。换言之，本发明提供了医学治疗的方法，其包括向对象施用本发明的离子通道阻断剂或可药用盐。
本文中描述了本发明的离子通道阻断剂或可药用盐的医学用途。在所有情况下，所述的医学用途也可被表述为治疗方法，其包括向需要治疗的对象施用本发明的离子通道阻断剂或可药用盐。
术语“患者”、“对象”和“个体”在本文中可以互换使用，并且是指人或非人动物。这些术语包括哺乳动物，例如人、灵长类、家畜动物(例如，牛和猪)、伴侣动物(例如，犬科动物和猫科动物)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。
如上所讨论的，已显示Kv1.3的阻断剂抑制活化的T细胞的增殖，并在多种疾病实验模型中具有有益效果。不希望受理论的束缚，认为需要细胞的通过Kv1.3通道的钾外向通量来维持T细胞活化所需的钙内向通量。
Kv1.3在以下中过表达：来自患有新发1型糖尿病的患者的Gad5/胰岛素特异性T细胞、来自MS患者的髓磷脂特异性T细胞和来自类风湿性关节炎患者的滑膜的T细胞(Beetonet al.，Proc Natl Acad Sci USA 103：17414-9，2006)、乳腺癌样本(Abdul et al.，Anticancer Res 23：3347，2003)和前列腺癌细胞系(Fraser et al.，Pflugers Arch 446：559，2003)。
已在以下模型中描述了在动物模型中使用Kv1.3阻断剂的积极结果：对卵清蛋白和破伤风类毒素的超敏反应模型(Beeton et al.，Mol Pharmacol 67：1369，2005；Koo etal.，Clin Immunol 197：99，1999)、用于多发性硬化的模型例如大鼠过继转移实验性自身免疫性脑脊髓炎(adoptive-transfer experimental autoimmune encephalomyelitis，AT-EAE)模型(Beeton et al.，Proc Natl Acad Sci USA 103：17414-9，2006)、炎性骨吸收模型(Valverde et al.，J Bone Mineral Res 19：155，2004)、关节炎模型(Beeton etal.，Proc Natl Acad Sci 103：17414，2006；Tarcha et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.342：642，2012)以及肥胖症、糖尿病和代谢紊乱(Xu et al.，Hum Mol Genet 12：551，2003；Xuet al.，Proc Natl Acad Sci 101：3112，2004)。
已提议表面应用Kv1.3阻断剂来治疗皮肤和黏膜炎症。
炎症的治疗
在一些实施方案中，本发明提供了本发明的离子通道阻断剂或可药用盐，其用于抑制或减轻炎症的方法。
在一些实施方案中，本发明提供了离子通道阻断剂或可药用盐，其用于治疗炎性病症或疾病。
炎性病症或疾病可以是其中期望减轻炎症的任何病症或疾病，例如其中炎症促成症状或发病机制的情况。
在一些实施方案中，炎性病症或疾病是自身免疫病、变态反应和超敏反应、同种移植物排斥和移植物抗宿主病。
在一些实施方案中，炎性病症或疾病是花粉症、哮喘、过敏反应、变应性鼻炎、荨麻疹、湿疹、斑秃、皮肌炎、包涵体肌炎、多肌炎、强直性脊柱炎、血管炎、关节炎(包括类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎)、舍格伦综合征、系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus，SLE)、葡萄膜炎、炎性纤维化(例如硬皮病、肺纤维化、肝硬化)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、肝炎、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、炎性肠病、结肠炎(例如克罗恩病(Crohn’s disease)和溃疡性结肠炎)、红斑、甲状腺炎、银屑病、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、硬皮病、肾小球肾炎、炎性骨吸收、多发性硬化、1型糖尿病、移植排斥或移植物抗宿主病。
代谢作用
Kv1.3的阻断剂也可以具有有益的代谢作用，例如与能量稳态、体重调节和葡萄糖控制相关。
因此，此处描述的离子通道阻断剂可以用于抑制体重增长、促进体重降低、减少超重体重或治疗肥胖症(例如通过控制食欲、摄食、食物摄入、卡路里摄入和/或能量消耗)，以及用于治疗相关病症和健康病症，包括肥胖症相关的炎症、肥胖症相关的胆囊疾病和肥胖症引起的睡眠呼吸暂停。
对体重的作用可以是治疗性的或美容性的。
离子通道阻断剂也可以用于治疗由葡萄糖控制受损引起或与葡萄糖控制受损相关的病症，包括代谢综合征、胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受、前驱糖尿病、空腹血糖升高或2型糖尿病。这些病症中的一些可能与肥胖症有关。离子通道阻断剂对这些病症的作用可能全部或部分通过对体重的作用来介导，或者可能与对体重的作用无关。
增殖细胞和癌症的治疗
Kv1.3也在增殖的人和小鼠平滑肌细胞中表达。Kv1.3的阻断剂可以对平滑肌增生性疾病例如再狭窄(例如在经历血管手术(例如血管成形术)之后的患者中)有效。
在一些实施方案中，本发明提供了根据本发明的离子通道阻断剂或可药用盐，其用于治疗平滑肌增殖性疾病。在一些实施方案中，所述疾病是再狭窄。
另外的证据表明，Kv1.3通道参与多种类型细胞(包括肿瘤细胞(Bielanska etal.，Curr.Cancer Drug Targets 9：904-14，2009)、小胶质细胞(Khanna et al.，Am.J.Physiol.Cell Physiol.280：C796-806，2001))的活化和/或增殖以及神经元祖细胞的分化(Wang et al.，J.Neurosci.30：5020-7，2010)。因此，Kv1.3阻断剂可以有益于治疗神经炎性疾病和神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)、多发性硬化(multiple sclerosis，MS)、帕金森病和肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateralsclerosis，ALS)(例如在病毒感染之后)。
在一些实施方案中，本发明提供了本发明的离子通道阻断剂或可药用盐，其用于治疗癌症。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌、前列腺癌或淋巴瘤。在一些实施方案中，淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)。非霍奇金淋巴瘤包括T细胞NHL和B细胞NHL。B细胞NHL的形式包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。T细胞NHL的形式包括蕈样肉芽肿病、间变性大细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、前体T淋巴母细胞性淋巴瘤和塞扎里综合征(Sézary syndrome)。
专利术语
除非本文中另有定义，否则本申请中所使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常来说，与本文中所述的化学、分子生物学、细胞和癌症生物学、免疫学、微生物学、药理学以及蛋白质和核酸化学相关使用的命名及其技术是本领域中公知并且通常使用的那些。
本申请中提及的所有专利、已公开的专利申请和非专利出版物具体地通过引用并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括其具体定义)为准。
本文中描述的本发明的每个实施方案可单独或与本发明的一个或更多个另外的实施方案组合使用。
本公开内容不受本文中所公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文中所述的那些类似或等同的任何方法和材料都可用于本公开内容的实施方案的实践或测试中。数字范围包括限定该范围的数字。除非另有说明，否则分别地任何核酸序列以5’至3’的方向从左至右书写；氨基酸序列以氨基至羧基的方向从左至右书写。
除非上下文另有明确规定，否则没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。
在本说明书通篇，词语“包含/包括(comprise)”及其语法变体(例如“comprises”或“comprising”)应理解为意指包括/包含指定的整体或组分或者整体或组分的组，但不排除任何其他整体或组分或者整体或组分的组。本文中使用的术语“包含/包括”和“由......构成”与“包括/包含”或“含有”同义，并且是包括性的或开放式的，而不排除另外的非记载成员、要素或方法步骤。术语“包含/包括”和“由......构成”还包括术语“由......组成”。术语“包括”用于意指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
本文中所讨论的出版物仅出于其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。本文中的任何内容都不应被解释为承认这样的出版物构成了本文所附方面的现有技术。
现在将通过实施例的方式进一步描述本发明，所述实施例旨在帮助本领域普通技术人员实施本发明，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：一般肽合成
下表提供了缩写和供应商的列表。
装置和合成策略
根据固相肽合成操作，使用9-芴基甲基氧基羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，Fmoc)作为N-α-氨基保护基和使用用于侧链官能团的合适的普通保护基，在肽合成仪(例如CEM Liberty肽合成仪或Symphony X合成仪)上分批合成肽。
使用了作为基于聚合物支持物的树脂，例如TentaGelTM。向合成仪装载在使用之前在DMF中溶胀的树脂。
偶联
CEM Liberty肽合成仪
将Fmoc保护的氨基酸溶液(4当量)与偶联试剂溶液(4当量)和碱溶液(8当量)一起添加至树脂。将该混合物通过微波单元加热至70至75℃并偶联5分钟或者在不加热的情况下偶联60分钟。在偶联期间，使氮鼓泡通过混合物。
Symphony X合成仪
将偶联溶液按以下顺序转移至反应容器：氨基酸(4当量)、HATU(4当量)和DIPEA(8当量)。除非另有说明，否则偶联时间为在室温(room temperature，RT)下10分钟。用DMF洗涤树脂(5×0.5分钟)。在重复偶联的情况下，偶联时间在所有情况下均为在室温下45分钟。
去保护
CEM Liberty肽合成仪
使用在DMF或其他合适的溶剂中的哌啶将Fmoc基团去保护。将去保护溶液添加至反应容器并将混合物加热30秒，达到约40℃。排空反应容器，并添加新的去保护溶液，并随后加热至70℃至75℃，持续3分钟。在排空反应容器之后，用DMF或其他合适的溶剂洗涤树脂。
Symphony X合成仪
使用在DMF中的40％哌啶进行Fmoc去保护，持续2.5分钟，并使用相同条件进行重复。用DMF洗涤树脂(5×0.5分钟)。
切割
将经干燥的肽树脂用TFA和合适的清除剂处理约2小时。降低过滤物的体积，并在添加乙醚之后使粗制肽沉淀。将粗制肽沉淀物用乙醚洗涤数次并最终干燥。
粗制肽的HPLC纯化
通过制备型反相HPLC纯化粗制肽：使用常规HPLC装置，例如Gilson GX-281，具有用于二元梯度应用的331/332泵组合，配备有柱(例如5×25cm Gemini NX 5u C18 110A柱)和级分收集器，使用缓冲液A(0.1％甲酸，水溶液)或A(0.1％TFA，水溶液)和缓冲液B(0.1％甲酸，90％MeCN，水溶液)或B(0.1％TFA，90％MeCN，水溶液)的适当梯度的20至40ml/分钟的流量。通过分析型HPLC和MS对级分进行分析，并合并所选择的级分并进行冻干。将最终产物通过HPLC和MS来表征。
二硫化物的形成
将具有六个半胱氨酸的粗制或部分纯化的线性肽溶解在缓冲液(例如碳酸氢钠(NaHCO3)或乙酸铵(NH4Ac))中，以得到最终浓度约为0.1mg/ml或25μM。将缓冲液的pH调节至pH 8.0并在室温下在磁力搅拌下搅拌溶液并打开通向大气的通道。反应进程由HPLC确定，并通常被评价为过夜完成。通过用有机酸(例如乙酸或三氟乙酸(pH＜4))降低溶液的pH来淬灭溶液。将溶液过滤并直接加载到制备型HPLC柱上用于纯化。
分析HPLC
通过配备有自动进样器、脱气装置(degasser)、20μl流动池(flow cell)和Chromeleon软件的分析型HPLC(Agilent 1100/1200系列)确定最终纯度。使用分析柱(例如Kinetex 2.6μm XB-C18 100A 100×4，6mm柱)在40℃下以1.2ml/分钟的流量操作HPLC。在215nm处对化合物进行检测和定量。缓冲液A(0.1％TFA，水溶液)和缓冲液B(0.1％TFA，90％MeCN，水溶液)。
质谱分析
在配备有具有锁定质量校准的电喷雾检测器和MassLynx软件的常规质谱仪(例如Waters Xevo G2 Tof)上进行最终MS分析。使用直接进样和如色谱图中指定的15V(1TOF)、30V(2TOF)或45V(3TOF)的锥孔电压(cone voltage)在正模式下操作。精度为5ppm，而典型分辨率为15,000至20,000。
化合物
合成的化合物在表1中示出。
表1
还合成了以下化合物以用作参照化合物：
表2
实施例2：FLIPR铊测定中的Kv1.3阻断剂活性
人Kv1.3电压门控K+通道细胞系购自Perkin Elmer(#TDS-AX-010-C-1)。该细胞系基于用人Kv1.3电压门控K+通道稳定转染的CHO-DUKX细胞。
使细胞系在具有核苷酸、GlutaMAX(Gibco#32571028)、10％胎牛血清(FoetalBovine Serum，FBS)、0.4mg/ml遗传霉素、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的MEMα中生长，并以10.000个细胞/孔接种到涂覆聚-D-赖氨酸的黑色96孔板中。
使用FluxORTM钾离子通道测定(Invitrogen#F10016)对由于对Kv1.3激活作出响应而进入细胞的铊离子的通量进行定量，所述Kv1.3激活用刺激缓冲液进行，导致细胞膜去极化，因此产生与通道活性成比例的荧光信号。该测定按照由测定试剂盒制造商所述的进行，其包括在含有0.02％w/v的来自牛乳的酪蛋白(Sigma#C4765)的测定缓冲液中进行化合物预孵育步骤(30分钟，37℃，5％CO2)，然后使用对应于0.2×FluxORTM无氯缓冲液、5mM K2SO4、1mM Tl2SO4的最终刺激缓冲液组合物进行细胞膜去极化。使用Tetra高通量筛选系统(Molecular Devices，Inc.)记录和定量荧光响应(最大响应在50秒处，37℃)。
使用4参数逻辑斯谛(4-parameter logistic，4PL)非线性浓度响应模型，基于式Y＝下限+(上限-下限)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))(其中Y是抑制百分比，X是化合物浓度并且上限、下限、Hill Slope和IC50是拟合参数)，将来自引起抑制铊通量进入细胞的受试化合物的数据相对于阳性(ShK，10nM)和阴性对照(载剂)进行归一化，以从浓度响应曲线计算IC50。结果在表3中示出(n≥2)。IC50可被视为对相应化合物的抑制效力的量度。IC50值是在给定测定中实现该化合物对离子通道活性的最大抑制的一半所需的抑制剂浓度的量度。在特定离子通道下具有比参照化合物更低的IC50值的化合物可被认为是比参照化合物更有活性的抑制剂或更强效的抑制剂。
表3
实施例3：药代动力学特征
方法
对Sprague Dawley(体重为约250g至350g的雄性)给予每种待测试肽的单次皮下(s.c.)注射。
s.c.施用选定的化合物(剂量100nmol/kg，给药体积2mL/kg)之后，在给药之后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时时抽取血液样品。在每个采样时间点，通过舌下采血从大鼠抽取样品。在最后一次采样之后，将大鼠通过O2/CO2麻醉处死。给药载剂是10mM磷酸盐、0.8％NaCl、0.05％聚山梨酯20(pH 6.0)。
血浆样品在固相萃取(solid phase extraction，SPE)之后通过液相色谱质谱法(LC-MS/MS)进行分析。在Phoenix WinNonlin 6.4或更高版本中，使用非房室方法使用平均血浆浓度来计算药代动力学参数。血浆终末消除半衰期(T1/2)被确定为ln(2)/λz，其中λz是终末期期间对数浓度相对于时间曲线的对数线性回归的斜率的大小。AUCinf是外推至无穷大的血浆浓度-时间曲线下面积(AUCinf＝AUClast+Clast/λz，其中Clast是最后观察到的血浆浓度)。Cmax是观察到的最大浓度，发生在Tmax处。所选化合物的结果在表4中示出。
表4
根据国际专利申请PCT/EP2020/076187的实施例6中所述的方法进行化合物14的药代动力学表征。化合物13的结果在下表5中示出。
表5
实施例4：膜片钳测定中的Kv1.3选择性
使稳定表达每个钾离子通道的外源人α-亚基的中国仓鼠卵巢(Chinese HamsterOvary，CHO)细胞系在标准培养条件下生长和传代。
使用自动化的基于芯片的平面膜片钳设备来定量离子电流。在建立千兆欧的密封之后，在常规的全细胞配置中进行所有记录。含有外部记录溶液(150mM NaCl、10mM KCl、10mM HEPES、1mM MgCl2、3mM CaCl2、10mM葡萄糖，用NaOH将pH调节至7.4)和内部记录溶液(20mM KCl、120mM KF、10mM HEPES、10mM EGTA、5mM NaATP，用KOH将pH调节至7.2)。在实验期间，将0.1％(v/v)BSA作为载剂包含在所有外部记录溶液中。使用电压协议，从-80mV的保持电位引出电流，该协议每15秒将电压转换为30mV，持续500毫秒。
浓度-响应关系是通过累积将七次递增浓度的受试样品应用于单独细胞来建立的，其中每次化合物应用的记录期为2分钟。
效力被确定为在每个浓度应用期结束时从光标(cursor)位置开始的最后三次扫描的平均电荷。每个测试剂量应用期的百分比抑制计算为平均光标值(电荷)相对于载剂期结束时测量的光标值的减少，并用于从浓度响应曲线计算IC50。
结果在表6中示出。
表6
化合物1和3二者都显示出对Kv1.3非常高的选择性，因为观察到对Kv1.1、Kv1.2和Kv1.6的选择性比率为6000或更高。因此，在化合物1或3的治疗相关浓度下，预期其对这些离子通道没有可检测出的抑制。
参照化合物的选择性也使用相同的方法进行测定。结果在表7中示出。
表7
实施例5a：Kv 1.3阻断剂参照化合物对人PBMC的抑制活性
使用人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)来评估Kv1.3阻断剂参照化合物对T细胞活化的作用，这通过在用抗CD3刺激之后的IL-2(细胞因子)释放来确定。
人PBMC获自Precision for Medicine(Frederick，MD)。使用来自5个供体的细胞。将板结合的抗CD3用于在PBMC制备物中刺激大量T细胞。简言之，在37℃下使用50μL的在1×PBS中稀释的0.5μg/mL抗CD3溶液将96孔板用抗CD3抗体包被2小时。此后将板洗涤两次。
将表8a中所示的Kv1.3阻断剂在培养基(RPMI 1640，其具有Glutamax-I，含有10％v/v胎牛血清，1％v/v青霉素-链霉素溶液)中稀释并以100μL的体积以0.01pM至100nM(十倍稀释)的浓度添加。将环孢素A(1μg/ml)和Vm24肽(100nM)用作阳性对照。最后，以100μL的体积将1×105个PBMC添加至每个孔，使每个孔的最终体积为200μL。将板在37℃/5％CO2培养箱中孵育20至24小时。将板离心之后，将25μl上清液转移至IL-2检测板(MSD人IL-2组织培养试剂盒，cat#K151AHB-2)，并按照制造商(Meso Scale Discovery，Rockville，Rockville，Maryland，USA)所述测量IL-2。
结果在表8a中作为从经抗CD3刺激的人PBMC测定中获得的IC50值的几何平均值示出。所有值均来源于至少4个重复。
表8a
在经抗CD3抗体活化的hPBMC并添加Kv1.3阻断剂的情况下孵育导致IL-2分泌的剂量依赖性降低。受试化合物的平均IC50值(如根据IL-2释放计算的)在0.05nM至0.4nM的范围内。这与使用ShK186观察到的IC50(IC50为0.07nM)相当，并且是Mokal(其抑制IL-2分泌的效力更低)的IC50的约1/10至1/100。
受试化合物与ShK186之间没有显著差异。ShK186和受试化合物均显著低于Mokal。
在所有实验中，环孢素完全阻断了CD3诱导的IL-2释放。
实施例5b：Kv1.3阻断剂参照化合物对人PBMC的抑制活性
使用人外周血单个核细胞(PBMC)来评估Kv1.3阻断剂参照化合物对T细胞活化的作用，这通过在用抗CD3刺激之后的IL-2释放来确定。
人PBMC获自Precision for Medicine(Frederick，MD)。使用来自5个供体的细胞。将板结合的抗CD3用于在PBMC制备物中刺激大量T细胞。简言之，在5℃下使用50μl的在PBS中稀释的1μg/ml抗CD3溶液用抗CD3抗体将96孔板包被约16小时。此后将板洗涤两次。
随后将Kv1.3阻断剂在培养基(RPMI 1640，其具有Glutamax-I，含有10％v/v胎牛血清，1％v/v青霉素-链霉素溶液)中稀释并以50μl体积添加。将表8b中所示的化合物以0.3pM至1000nM(半对数稀释，起始浓度不同)的浓度使用。将环孢素A(1μg/ml)和Vm24肽(100nM)用作阳性对照。
最后，将在相同培养基中的50.000个PBMC以50μl的体积添加至每个孔，使每个孔的最终体积为100μl。将板在37℃/5％CO2培养箱中孵育20至24小时。将板离心之后，将25μl上清液转移至IL-2检测板(MSD人IL-2组织培养试剂盒，cat#K151AHB-2)，并按照制造商(Meso Scale Discovery，Rockville，Maryland，USA)的描述测量IL-2。
结果在表8b中作为从经抗CD3刺激的人PBMC测定中获得的IC50值的几何平均值示出。所有值均来源于至少6个重复。
表8b
在经抗CD3抗体活化的hPBMC并添加本发明的化合物的情况下孵育导致IL-2分泌的剂量依赖性降低。
如表8b中所示，受试化合物的平均IC50值(如根据IL-2释放计算的)在0.01nM至0.09nM的范围内。这与使用ShK186观察到的IC50相当(IC50为0.05nM)。该测定使用与用于实施例5a的供体不同的供体进行，因此预计两组实验中Shk-186的值不会相同。
在所有实验中，环孢素完全阻断了抗CD3诱导的IL-2释放。
实施例6：Kv1.3阻断剂参照化合物在大鼠全血中的抑制活性
使用大鼠全血来评估Kv1.3阻断剂参照化合物对T细胞活化的效力，这通过在用毒胡萝卜素(thapsigargin)刺激之后的IL-17A释放来确定。添加毒胡萝卜素导致信号传导级联激活，最终激活T细胞增殖和细胞因子产生，其中Kv1.3离子通道起关键作用，因此可以在该实验系统中测量原代细胞中Kv1.3阻断剂的活性。
大鼠全血获自健康的、原初Lewis或Sprague-Dawley大鼠，将这些大鼠使用肝素钠采血管从心脏终末采血以进行收集。将受试化合物在测定缓冲液(DMEM+GlutaMAX)中稀释至4×最终测试浓度(GlutaMAX是包含3.97mM L-丙氨酸-L-谷氨酰胺(Gibco Cat#61965026)，补充有25mM HEPES缓冲液、1mM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.05％来自牛乳的酪蛋白(Sigma-Aldrich)的培养基)并将25μl添加至96孔板的孔。然后添加50μl大鼠全血并在室温下孵育至少5分钟以允许化合物结合。然后将在测定缓冲液中稀释的25μl 40μM毒胡萝卜素添加至测定板的所有孔中以活化细胞，然后在湿润的箱中在37℃/5％CO2下孵育24小时。将测定板在4℃下以300g离心10分钟，并将上清液转移到新的板中。使用大鼠IL-17A ELISA试剂盒(Abcam Cat#ab214028)按照制造商的推荐测量释放到上清液中的IL-17A的浓度。通过将20μl上清液转移到来自检测试剂盒的含有30μl缓冲液75BS的ELISA板上的孔中来将样品稀释2.5倍。
将来自引起对IL-17A的抑制的受试化合物的数据相对于完全毒胡萝卜素激活(未添加阻断剂)和未激活对照(添加测定缓冲液而不是毒胡萝卜素)进行归一化，以从浓度响应曲线计算IC50。
结果在表9中示出，以IC50表示，带有标准差(IC50_SD)。所有值均来源于至少2个重复。离体生物作用显示出与化合物效力的相关性。
表9
实施例7：Kv1.3阻断剂参照化合物处理对大鼠匙孔戚血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin，KLH)耳炎症模型的作用
在大鼠的一只耳中引发了经典的迟发型超敏反应(delayed-typehypersensitivity，DTH)。简言之，将8至10周龄的雄性Lewis大鼠在第-7天用200μL在完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)(Difco，目录号263810)中乳化的匙孔戚血蓝蛋白(KLH)(来自Sigma，目录号H7017)(4mg/mL)在尾基部皮下(SC)免疫接种。在第0天，将大鼠在左耳中用40μL KLH/NaCl 0.9％(2mg/mL)进行皮内攻击。在耳攻击之后，大鼠在KLH攻击的左耳中产生T细胞依赖性炎症。右耳保持未发炎并用作对照。
通过比较用载剂处理的大鼠(n＝8至10/gr)与用Kv1.3阻断剂处理的大鼠中的响应来研究Kv1.3阻断剂参考化合物处理降低DTH耳肿胀响应的能力。在KLH耳攻击之前24小时，SC施用载剂或溶解在载剂中的Kv1.3阻断剂(2mL/kg)。Kv1.3阻断剂的测试剂量为50、70或100nmol/kg。测试载剂是10mM磷酸盐、0.8％w/v NaCl、0.05％w/v聚山梨酯20，pH 6。在所有实验中，包含环孢素(CsA)作为阳性研究对照。在KLH耳攻击之前一小时经口施用环孢素(Sandimmune100mg/mL经口溶液，Novartis)(10mg/kg)并在KLH耳攻击之后6小时再次施用。
作为效力的主要读出，计算了每只动物在耳DTH反应诱导之后0至48小时的Δ耳厚度(mm)的曲线下面积(Area Under Curve，AUC)，其中变化(D)计算如下：左耳厚度-右耳厚度。然后将这些结果用于计算Kv1.3阻断剂处理对耳厚度的％抑制：％抑制：((1-(个体ΔAUC Kv1.3阻断剂/平均ΔAUC载剂组))×100。结果计算为％抑制+/-标准差(standarddeviation，SD)，并在表10和表11中示出。
表10
| Exp | 剂量(nmol/kg) | Cpd.17 | Cpd.45 | Cpd.56 | CsA＊ |
| #1 | 70 | 38.8(+/-9.7) | 46.9(+/-10.9) | 71.4(+/-4.8) | |
| #2 | 70 | 25.0(+/-12.5) | 27.7(+/-11.5) | 76.8(+/-13.4) | |
| #3 | 50 | 37.3(+/-13.8) | 22.2(+/-11.1) | 65.1(+/-4.5) | |
| #4 | 100 | 41.9(+/-12.5) | 25.1(+/-6.3) | 63.4(+/-5.9) |
表11
上述说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。本发明所述的方法和系统的多种修改和变化对于本领域技术人员而言是明显的，并且不脱离本发明的范围和精神。尽管已经结合一些具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，要求保护的本发明不应不适当地限制于这样的具体实施方案。事实上，对生物化学、分子生物学或相关领域的技术人员而言明显的用于实施本发明的所述方式的多种修改均旨在在所附权利要求书的范围内。
Claims (15)
1.具有Kv1.3抑制剂活性的离子通道阻断剂或其可药用盐，所述离子通道阻断剂或其可药用盐包含序列QMDMRCSASVECKQKCLKAIGSIFGKCMNKKCKCYPR(SEQ ID NO：1)的变体，
其中所述变体与SEQ ID NO：1的不同之处在于总共最多十个替换、插入或缺失，
其中SEQ ID NO：1的第7、8、9、10或11位中的至少一个氨基酸被具有带正电荷侧链的氨基酸和/或具有芳族侧链的氨基酸替换，并且其中所述变体不包含以下序列中的任一者：
2.前述权利要求中任一项所述的离子通道阻断剂，其中SEQ ID NO：1的所述变体中的任何替换或缺失位于选自SEQ ID NO：1的第1至5、7至11、13至15、17至23、25、28至31、33和35至37位的氨基酸位置处，优选位于选自SEQ ID NO：1的第1至5、7至11、13、15、18、28和30位的氨基酸位置处。
3.前述权利要求中任一项所述的离子通道阻断剂，其中所述离子通道阻断剂对人Kv1.3钾通道的IC50为50nM或更小，例如20nM或更小、例如10nM或更小、例如5nM或更小、例如2nM或更小、例如1nM或更小、例如0.5nM或更小、例如0.4nM或更小、例如0.3nM或更小、例如0.2nM或更小。
4.前述权利要求中任一项所述的离子通道阻断剂，其中：
所述具有带正电荷侧链的氨基酸选自H、K、hK、R、Orn、2，3-二氨基丙酰基、2，4-二氨基丁酰基、2-氨基-3-胍基丙酰基和4-氨基-苯丙氨酸(F(4-NH2))，优选选自H、K、R、Orn、2，3-二氨基丙酰基、2-氨基-3-胍基丙酰基和2，4-二氨基丁酰基；和/或
所述具有芳族侧链的氨基酸选自F、W和Y，优选Y。
5.前述权利要求中任一项所述的离子通道阻断剂，其中：
SEQ ID NO：1的第7位的氨基酸被具有带正电荷侧链或芳族侧链的氨基酸，优选H、K、R、Orn、2，3-二氨基丙酰基、2-氨基-3-胍基丙酰基、2，4-二氨基丁酰基或Y替换；
SEQ ID NO：1的第8位的氨基酸被具有带正电荷侧链或芳族侧链的氨基酸替换，或者所述变体的第8位的氨基酸与SEQ ID NO：1的第8位氨基酸，即A相同；
SEQ ID NO：1的第9位的氨基酸被具有带正电荷侧链或芳族侧链的氨基酸，优选K、Orn或2，3-二氨基丙酰基替换；
SEQ ID NO：1的第10位的氨基酸被具有带正电荷侧链或芳族侧链的氨基酸，优选R替换；和/或
SEQ ID NO：1的第11位的氨基酸被具有带正电荷侧链或芳族侧链的氨基酸，优选R替换。
6.前述权利要求中任一项所述的离子通道阻断剂，其中在SEQ ID NO：1的所述变体中：
第1位的氨基酸是N、P或Q，或者缺失，
第2位的氨基酸是M或Nle，或者缺失，
第3位的氨基酸是D或E，或者缺失，
第4位的氨基酸是M或Nle，或者缺失，
第5位的氨基酸是R或缺失，
第13位的氨基酸是A或K，
第15位的氨基酸是K或S，
第18位的氨基酸是A或K，
第28位的氨基酸是M或Nle，和/或
第30位的氨基酸是G或K。
7.前述权利要求中任一项所述的离子通道阻断剂，其中在SEQ ID NO：1的所述变体中：
第1至5位的氨基酸由氨基酸序列P[Nle]E[Nle]R组成，
第13位的氨基酸是A或K，
第15位的氨基酸是K或S，
第18位的氨基酸是A，
第28位的氨基酸是Nle，并且
第30位的氨基酸是G或K。
8.前述权利要求中任一项所述的离子通道阻断剂，其中SEQ ID NO：1的所述变体包含以下序列中的一者或由其组成：
9.前述权利要求中任一项所述的离子通道阻断剂，其中所述变体包含以下化合物中的一者或由其组成：
。
10.核酸，其编码如前述权利要求中任一项所限定的离子通道阻断剂。
11.表达载体，其包含根据权利要求10所述的核酸。
12.宿主细胞，其包含根据权利要求10所述的核酸或根据权利要求11所述的表达载体，并且能够表达如权利要求1至9中任一项所限定的离子通道阻断剂。
13.合成根据权利要求1至9中任一项所述的离子通道阻断剂的方法，所述方法包括：
(a)通过固相或液相肽合成方法合成所述离子通道阻断剂并回收由此获得的肽；
(b)由编码所述离子通道阻断剂的核酸构建体表达所述离子通道阻断剂并回收表达产物；或者
(c)由编码前体肽序列的核酸构建体表达前体肽，回收表达产物，并修饰所述前体肽以产生所述离子通道阻断剂。
14.药物组合物，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的离子通道阻断剂或可药用盐。
15.根据前述权利要求中任一项所述的离子通道阻断剂、可药用盐或药物组合物，其用于医学治疗的方法，优选用于治疗炎性病症或疾病。
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