CN117255692A - Trem2激动剂生物标志物和其使用方法 - Google Patents

Trem2激动剂生物标志物和其使用方法 Download PDF

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I·N·福尔茨
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Abstract

本发明提供了一种治疗人类患者的与TREM2功能障碍相关的疾病或病状，如阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)的方法，所述方法包括向所述患者施用TREM2激动剂。另一方面，本发明提供了一种测定取自患有阿尔茨海默氏病的患者的生物样品的生物标志物以确定潜在的益处或所述疾病对用TREM2激动剂进行的治疗产生应答的概率是否增加的方法。

Description

TREM2激动剂生物标志物和其使用方法
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且特此通过引用整体并入。创建于2021年11月30日的所述ASCII副本命名为004WO_SL_ST25.txt并且大小为28,469字节。
技术领域
本发明总体上涉及使用TREM2激动剂治疗阿尔茨海默氏病(Alzheimer'sdisease，AD)。更具体地，本发明涉及某些阿尔茨海默氏病生物标志物和/或某些TREM2激动生物标志物，以及其在用于治疗阿尔茨海默氏病的方法中的用途，例如，在评估和/或预测患者对治疗的应答中的用途。
背景技术
阿尔茨海默氏病(AD)是老年人的进行性痴呆的最常见原因，影响超过550万美国人，并且代表美国第6大死亡原因。
小胶质细胞是大脑中的巨噬细胞，具有许多稳态和损伤应答作用，包含营养和吞噬功能。调节疾病进程的小胶质细胞应答是由AD病理触发的。AD的病理特征包含由淀粉样蛋白6(A6)肽组成的细胞外淀粉样斑块、由聚集的过度磷酸化的τ蛋白组成的神经元内神经原纤维缠结、神经免疫激活和突触密度降低(Long和Holtzman,《细胞(Cell)》,2019)。小胶质细胞在A6斑块周围聚集，对其进行包容和压缩，由此减少周围神经元的轴突营养不良的标志物(Yuan等人,《神经元(Neuron)》,2016)。在此过程期间，小胶质细胞改变其表型和转录性质，从“稳态”转变为激活状态，例如，向疾病相关的小胶质细胞轨迹(DAM)转变(Carmona等人,《阿尔茨海默氏病的遗传景观(The genetic landscape of Alzheimerdisease)》,第1版,2018)。
小胶质细胞向激活状态的转变已经显示出取决于髓样细胞中表达的触发受体2(TREM2)，这是一种在小胶质细胞中大量表达的巨噬细胞表面受体(Ulland和Colonna,《自然综述：神经病学(Nat.Rev.Neurol.)》,2018)。TREM2维持小胶质细胞对脑损伤刺激物，包含凋亡细胞、髓鞘损伤和淀粉样β(Aβ)的应答。由于其在代谢激活中的作用，TREM2被认为充当一种维持小胶质细胞激活轨迹的共刺激分子。
通过TREM2激活小胶质细胞可以为AD的治疗提供了一种有前景的治疗方法，然而，在阿尔茨海默氏病的小胶质细胞激活轨迹的情境中，使用TREM2激动剂进行疗法的影响尚未确定，产生了显著的未满足的需求。
发明内容
一方面，本发明提供了一种治疗人类患者的与TREM2功能障碍相关的疾病或病状的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的TREM2激动剂以增加髓样细胞上表达的触发受体2(TREM2)的活性。在一些实施例中，提供了一种治疗阿尔茨海默氏病的方法。
另一方面，本发明提供了一种测定取自患有阿尔茨海默氏病的患者的生物样品以确定潜在的益处或所述疾病对用TREM2激动剂进行的治疗产生应答的概率是否增加的方法。其它方面提供了一种评估和监测对TREM2激动剂疗法的患者生物标志物应答的方法。在一些实施例中，所述TREM2激动剂生物标志物选自CCL4、CCL2、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B和TMEM119。
又另一方面，本发明提供了一种在患者中诱导朝向特定的小胶质细胞类型轨迹，例如朝向干扰素应答(IFN-R)型、周期(Cyc-M)型或MHC-II表达(MHC-II)型小胶质细胞轨迹激活的小胶质细胞激活的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的TREM2激动剂。
附图说明
图1A-1J示出了hTREM2激动性抗体hT2AB的性质。图1A示出了hT2AB与hTREM2特异性结合，但不与hTREM1或mTREM2结合。数据示出了通过Octet测量的hTREM2-His与hT2AB的结合信号。1B12是专门与hTREM1-His结合的抗hTREM1抗体。不相关的hIgG2不与hTREM1-His或hTREM2-His结合(左图)。hT2AB与在HEK293细胞(克隆G13)中瞬时共表达hDAP12的hTREM2结合，但不与表达mTREM2和mDAP12的HEK293细胞结合(右图)。图1B-1C示出了克隆G13细胞(图1B)和人单核细胞源性巨噬细胞(hMac)(图1C)中的hT2AB的功能性EC50。在细胞暴露于不同浓度的hT2AB(n＝8)之后，通过测量Syk磷酸化的诱导来确定hTREM2的激活。图1D示出了hT2AB IgG1和hT2AB Fab对hTREM2的激活，这通过测量暴露于不同浓度抗体(n＝3)的克隆G13细胞中的Syk磷酸化来确定。图1E示出了来自在没有任何免疫攻击(每组n＝4)的情况下用不同浓度的hT2AB或对照hIgG1抗体处理24小时的hMac的条件培养基中sTREM2的定量。图1F示出了在不同时间点，在200nM下，来自用hT2AB或对照hIgG1抗体处理的hMac的条件培养基中的CCL4的定量。乙酰化LDL用作阳性对照(每组n＝2)。图1G示出了在用不同浓度的板结合的hT2AB或对照hIgG1处理48小时(每组n＝3)的CSF1撤除之后，来自TREM2CV小鼠的骨髓源性巨噬细胞(BMM)的细胞活力测定。图1H示出了来自TREM2CV和TREM2R47H的BMM的hT2AB的结合测定。来自Trem2–/–的BMM用作阴性对照。图1I示出了用不同量的平板结合hT2AB或对照hIgG1刺激的表达hTREM2(CV或R47H)的2B4报告细胞系。通过流式细胞术测量GFP表达(每组n＝2)。图1J示出了在用10μg/mL的板结合hT2AB或对照hIgG1处理CSF1撤除48小时之后，来自TREM2R47H小鼠的BMM的细胞活力测定。*,P<0,05；**,P<0.01，双向ANOVA和Sidak的多重比较测试(Sidak's multiple comparisons test)。图1中的所有数据都显示为平均值±SD，除了图1B-1C描绘了平均值±SEM。
图2A-2K示出了hT2AB的药代动力学和药效学。图2A-2E描绘了hT2AB在TREM2CV、TREM2R47H或Trem2–/–雄性小鼠中的药效学(PD)研究。不同的小鼠队列在24小时内静脉内接受0(媒剂)至100mg/kg范围内的单剂量hT2AB。趋化因子的浓度，包含CXCL10(图2A)、CCL4(图2B)、CCL2(图2C)和CXCL2(图2D)，以及小胶质细胞激活生物标志物CST7(图2E)通过美索规模发现公司(MSD)技术在脑裂解物中进行测量(媒剂，对于TREM2CV，n＝4，对于TREM2R47H或Trem2–/–，n＝5；1、3和10mg/kg，对于TREM2CV或TREM2R47H，n＝2；30mg/kg，对于所有三种基因型，n＝5；100mg/kg，对于TREM2CV或TREM2R47H，n＝2，对于Trem2–/–，n＝5)。图1F-K描绘了在TREM2R47H或Trem2–/–雄性小鼠中以30mg/kg静脉内施用的hT2AB的单剂量。在抗体处理后4、8和24小时后处死不同的小鼠队列，并且收集脑组织并裂解，用于测量hT2AB抗体水平和神经变性相关小胶质细胞激活生物标志物的表达(每组n＝5)。图2F示出了在静脉内施用30mg/kg hT2AB之后至多24小时，克隆G13细胞中hT2AB脑浓度(nM)比Syk磷酸化的EC50值(222pM)高约25倍。qRT-PCR分析示出了在hT2AB处理后Cxcl10(图2G)、Ccl2(图2H)、Ccl4(图2I)、Cst7(图2J)以及稳态小胶质细胞标志物Tmem119(K)的表达增加。*,P<0,05；**,P<0.01；****,P<0.0001，双向ANOVA和Sidak的多重比较测试；所有数据显示为平均值±SD。
图3A-3G示出了来自人TREM2-tg-5XFAD小鼠模型的小胶质细胞的采样。图3A示出了方案设计。注射抗体之后两天，从内源性Trem2敲除(Trem2-/-)的雄性和雌性5XFAD小鼠的皮质中收集CD45+细胞，这些小鼠具有或不具有人类TREM2敲入的两种变体之一：普通变体(CV)和R47H。71,303个细胞通过了scRNA-seq质量控制。图3B-3D示出了监督免疫细胞类型分类。将单独的细胞与由免疫学基因组计划产生的分选的小鼠免疫细胞的830个微阵列样品进行相似性评分。细胞被嵌入低维的潜在空间，同时阻止观察到的协变量。通过潜在空间的每个区段的富集细胞类型来校正细胞类型标记。图3E示出了代表全局数据结构的所有细胞的均匀流形逼近和投影(UMAP)；鉴定被10种经鉴定的免疫细胞类型所着色的细胞。图3F示出了小胶质细胞的差异基因表达。相对于其它CD45+细胞的表达水平的绝对差异通过效应大小来定量；基因表达特异性和基因检测率是使用条件概率来确定的，这些条件概率具有统一的细胞类型先验，以避免样品大小偏差。特异性由细胞表达特定基因时属于某一细胞类型的后验概率定义；检测水平由表达特定基因的细胞的相对比例来定义。图3G示出了符合特异性阈值0.6和效应大小阈值2.5的13个小胶质细胞签名基因和血管周基因标志物Mrc1和Pf4以及T细胞标志物Cd3g和Ms4a4的表达谱；示出了补体C1q亚组分a、b和c的平均表达。
图4A-4E示出了激活的小胶质细胞群体的表征。图4A示出了无监督聚类鉴定了10个不同的亚群，跨越了从稳态小胶质细胞到四种终端表型的轨迹。图4B示出了对由Keren-Shaul等人(9)描述的疾病激活的小胶质细胞群体(DAM)的表达谱与此研究中每个聚类之间的一致性(对角线)和不一致性(非对角线)进行计数的列联表；定量是基于相对于稳态群体的(log2)0.5倍上调和下调基因。通过从对角线值的总和中减去非对角线值来计算相似性评分；计算P值以测试两项研究之间的总体一致性。可以观察到，从t1到t6到此研究的DAM聚类，基因表达的相似性增加，以红色突出显示。图4C示出了细胞周期状态的评分。使用机器学习预测每个细胞处于G1、G2/M或S期。用黄色突出显示的一个聚类Cyc-M示出了循环细胞的强烈富集。图4D示出了差异表达分析，揭示了一个簇IFN-R，其示出了与干扰素通路相关的基因的富集(图4D)，和一个簇MHC-II，其富集了编码MHC II类蛋白复合物的成员的基因(图4E)。图4D示出了所选的标志物基因的表达，并且图4E示出了基因本体论(GO)中注释的所有MHC I/II类基因。使用带有错误发现率(FDR)校正的费希尔精确检验(Fisher's exacttest)进行GO术语富集分析。
图5A-E示出了对小胶质细胞命运的基因型驱动作用。图5A示出了从t5朝向每种末端细胞类型的轨迹树和计算的线性轨迹的可视化。拟时间通过拟合低维流形中的主曲线(黑线)来推断。每个数据点代表由其沿轨迹的伪时态位置着色的细胞。图5B-5E示出了每种基因型的相对分数和其在所有拟时间间隔内的重复(上图)；对不同样品大小的代表性进行了修正。下图示出了使用自举法(Bootstrapping)在90-100％拟时间间隔中细胞的估计部分的分布。
图6A-6B示出了hT2AB处理对小胶质细胞轨迹的作用。图6A示出了起始于分支点朝向终端类型的每条轨迹的每个时间间隔的估计相对群体大小。图6B示出了早期和晚期小胶质细胞分化阶段的基于轨迹的差异表达分析。使用Wald统计学计算P值，并且通过假发现率(FDR)对多重测试进行校正。FDR通过FDRS和-log10变换的对数变化倍数的符号S进行加权(wFDR)。负值表示hT2AB诱导的下调，正值指示上调。使用0.01的FDR截止值，转录变化被分为六类；两种暂时变化，早期上调/下调收敛到基线水平；四种永久变化，分别具有早期和晚期上调/下调或仅晚期上调/下调。
图7A-7B示出了用mT2AB进行的持续急性处理不同地影响小胶质细胞对病理的应答。图7A描绘了在TREM2CV-5XFAD或TREM2R47H-5XFAD小鼠中进行鼠mT2AB处理的示意图。二十周龄的小鼠每3天腹腔注射鼠mT2AB 30mg/kg，持续10天。向同窝仔施用相同浓度的对照mIgG1抗体。在最后一次抗体注射之后24小时处死小鼠，并且采集脑用于免疫组织化学和生化分析。图7B示出了不同处理组的皮质裂解物中细胞因子和趋化因子如IL-1β、CXCL10和CCL4的定量。*,P<0.05；***,P<0.001；****,P<0.0001，双向ANOVA和Sidak的多重比较测试。数据显示为(E)中的平均值±SD。TREM2CV-5XFAD，雄性，mIgG1，n＝8；TREM2CV-5XFAD，雄性，mT2AB，n＝9；TREM2CV-5XFAD，雌性，mIgG1，n＝5；TREM2CV-5XFAD，雌性，mT2AB，n＝6；TREM2R47H-5XFAD，雄性，mIgG1，n＝4；TREM2R47H-5XFAD，雄性，mT2AB，n＝4；TREM2R47H-5XFAD，雌性，mIgG1，n＝4；TREM2R47H-5XFAD，雌性，mT2AB，n＝6。
图S1A-S1D示出了单细胞RNA-seq质量控制。在图S1A中，收集了24个样品，并且对其进行了单独读段比对、液滴和细胞质量控制。图S1B示出了综合数据质量评估，揭示了数据中的技术伪影，可能是由低细胞转录组覆盖率驱动的。细胞由细胞质量(CQ)评分来着色，所述评分是从所选质量度量的主成分分析中得出的。指示了在具有低CQ评分的细胞中富集的组。图S1C示出了使用逆经验累积CQ评分分布函数来确定细胞过滤的截止值。确定的阈值—0.1保留了低CQ富集组中8.6％的细胞和所有其它细胞的88.9％。图S1D示出了每个样品的每个细胞的公共质量度量的分布。样品的特征在于人TREM2变体、性别和测得的hT2AB脑暴露。还示出了在所有收集的细胞中内源Trem2基因座与人TREM2转基因基因座的原始表达之间的比率。
图S2示出IFN-R小胶质细胞标志物基因的GO期富集。对符合特异性阈值0.75和效应大小1.5的IFN-R标志物基因进行基因本体术语富集分析。示出的是错误发现率(FDR)校正的费希尔精确检验P值<0.05的生物过程术语。术语根据其本体关系进行分组和着色，正方形大小对应于在此类别中发现的IFN-R标志物基因的数量，并且颜色深度通过FDR进行缩放。
图S3A-S3B示出了样品协调。图S3A示出了来自经对照hIgGl处理的雌性和雄性TREM2cv-5XFAD小鼠的注释的小胶质细胞，用作参照来对来自其余5种情况(查询Q1-Q5)的细胞进行分类。首先，使用扩散映射将每个查询集与每个参考集共同嵌入，并且随后使用相互最近邻校正来校正批量效应。然后使用在查询细胞的扩散组分上训练的极端梯度推进分类器来投影细胞类型。图S3B示出了模型准确度评估。参考或查询数据集上的训练准确度，以及使用在查询数据集上训练的分类器在参考数据集上投影细胞类型的预测准确度。
图S4A-S4E示出了小胶质细胞命运的小鼠性别相关差异。示出了使用自举法(上图)和DAM(图S4A)、Cyc-M(图S4B)、IFN-R(图S4C)和MHC-II(图S4D)聚类的前10个标志物基因(下图)的拟合表达动力学，在末端90-100％拟时间间隔中估计的细胞分数的分布。图S4E示出了在经对照hIgG1处理的5XFAD小鼠的海马裂解物中可溶性和不溶性Ar31_40和A13142的定量。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001，双向ANOVA和Sidak的多重比较测试。数据示出为平均值±SD；左侧条示出了雄性小鼠的数据，右侧条示出雌性小鼠的数据。
图S5A-C示出了鼠mT2AB的持续急性处理不改变Aβ负荷。图S5A示出了不同处理组中皮质裂解物中的可溶性和不溶性Ar31_40和Ar31_42的定量。图S5B示出了用通过6E10(白色)、甲氧基-X04(蓝色)和Aβ42(红色)染色的小鼠mT2AB处理的TREM2cv-5XFAD小鼠的代表性共聚焦图像，显示了Aβ在皮质中的分布。尺＝100Rm。图S5C示出了鼠mT2AB组与经对照mIgG1处理的组之间皮层中的6E10+、甲氧基-X04+或Aβ42+区域覆盖的变化倍数。数据显示为平均值±SEM。TREM2cv-5XFAD，雄性，mIgG1，n＝8；TREM2cv-5XFAD，雄性，mT2AB，n＝9；TREM2cv-5XFAD，雌性，mIgG1，n＝5；TREM2cv-5XFAD，雌性，mT2AB，n＝6；TREM2R47H-5XFAD，雄性，mIgG1，n＝4；TREM2R47H-5XFAD，雄性，mT2AB，n＝4；TREM2R47H-5XFAD，雌性，mIgG1，n＝4；TREM2R47H-5XFAD，雌性，mT2AB，n＝6。',P<0.001；****,P<0.0001，双向ANOVA和Sidak的多重比较测试(Sidak's multiple comparisons test)。数据显示为平均值±SEM。
具体实施方式
6.1.定义
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。因此，以下术语旨在具有以下含义。
“激动剂”或“激活”剂，如化合物或抗体，是在药剂结合靶标之后诱导(例如，增加)药剂的靶标(例如，TREM2)的一种或多种活性或功能的药剂。
“拮抗剂”或“阻断”剂，如化合物或抗体，是在药剂结合靶标之后减少或消除(例如，降低)靶标与一种或多种配体的结合，和/或在药剂结合靶标之后减少或消除(例如，降低)靶标的一种或多种活性或功能的药剂。在一些实施例中，拮抗剂或阻断剂显著或完全抑制靶标与其一种或多种配体的结合和/或靶标的一种或多种活性或功能。
“抗体”以最广泛的意义使用，指免疫球蛋白或其片段，并且涵盖包括抗体的抗原结合片段或区域的任何这种多肽。公认的免疫球蛋白基因包含κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链通常被分为κ链或λ链。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，这进而分别限定免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。免疫球蛋白类别还可以进一步分为亚类，包含IgG亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；和IgA亚类IgA1和IgA2。术语包含但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、天然抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体、接合抗体、抗体片段(例如，全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区，例如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、以及体外产生的抗体，只要它们表现出所需的生物活性即可。术语还包含单链抗体，例如单链Fv(sFv或scFv)抗体，其中可变重链和可变轻链连接在一起(直接或通过肽连接子)形成连续多肽。
在许多实施例中，本文所描述的抗体是使用单字母氨基酸符号通过其相应的多肽序列来描述的。除非另有说明，多肽序列是以N→C朝向提供的。
“分离的”是指从自然状态的改变，即从其原始环境中改变和/或去除。例如，当多核苷酸或多肽(例如，抗体)从天然环境中与其天然相关的物质中分离出来时，其就是分离的。因此，“分离的抗体”是已经从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。
“纯化的抗体”指抗体制剂，其中与制剂中的其它污染物(例如，其它蛋白质)相比，抗体重量为至少80％或更多、至少85％或更多、至少90％或更多、至少95％或更多，如通过在还原或非还原条件下使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或毛细管电泳(CE)SDS进行确定。
“细胞外结构域”和“胞外域”在用于指膜结合蛋白时可互换使用，并且指暴露在细胞脂质膜的细胞外侧的蛋白质部分。
在任何结合剂(例如，抗体)的上下文中,“特异性结合”是指如以高亲和力特异性地结合抗原或表位并且不显著结合其它不相关的抗原或表位的结合剂。
“功能性的”是指一种分子形式，其具有该类型天然存在的分子的天然生物活性，或任何特定的所需活性，例如通过其结合配体分子的能力来判断。“功能性”多肽的实例包含通过其抗原结合区与抗原特异性地结合的抗体。
“抗原”是指一种物质，如但不限于能够结合特定抗体的特定肽、蛋白质、核酸或碳水化合物。
“表位”或“抗原决定簇”是指能够被特定抗体识别并特异性地结合的抗原部分。当抗原是多肽时，表位可由通过蛋白质的三级折叠并置的连续氨基酸和/或非连续氨基酸形成。线性表位是由氨基酸线性序列上的连续氨基酸形成的表位。线性表位可在蛋白质变性时保留。构象或结构表位是由不连续的氨基酸残基构成的表位，因此包含通过分子折叠，如通过二级、三级和/或四级结构而彼此接近的氨基酸线性序列的分离部分。蛋白质变性后，构象或结构表位可能会丢失。在一些实施例中，表位可以在独特的空间构象中包括至少3个以及更通常至少5个或8-10个氨基酸。因此，如本文所用的表位涵盖定义的表位，其中抗体仅结合定义的表位的一部分。本领域已知许多方法用于定位和表征蛋白质上表位的位置，包含解析抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争测定法、基因片段表达测定法、突变测定法和基于合成肽的测定法，例如在以下文献中所描述的：《使用抗体：实验室手册(UsingAntibodies:ALaboratory Manual)》,第11章,Harlow和Lane,编辑,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York),(1999)。
“蛋白质”、“多肽”或“肽”表示由酰胺键共价连接的至少两个氨基酸的聚合物，而不考虑长度或翻译后修饰(例如，糖基化、磷酸化、脂质化、豆蔻酰化、泛素化等)。此定义包含D-和L-氨基酸、以及D-和L-氨基酸的混合物。除非另有说明，蛋白质、多肽或肽的氨基酸序列在本文中以常规的N末端到C末端朝向显示。
“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且是指共价连接在一起的两个或更多个核苷。多核苷酸可以完全包含核糖核苷(即，RNA)，完全包含2'脱氧核糖核苷(即，DNA)或包含核糖核苷和2'脱氧核糖核苷的混合物。核苷通常将通过糖-磷酸键(糖-磷酸骨架)连接在一起，但是多核苷酸可以包含一个或多个非标准键。这种非标准键的非限制性实例包含氨基磷酸、硫代磷酸和酰胺(参见例如，Eckstein,F.,《寡核苷酸和类似物：实用方法(Oligonucleotides and Analogues:APractical Approach)》,牛津大学出版社(OxfordUniversity Press)(1992))。
“可操作地连接”或“可操作地关联”是指两个或更多个多核苷酸序列被定位以允许执行它们的常规功能的情况。例如，如果启动子能够控制编码序列的表达，则启动子与所述编码序列可操作地连接。其它控制序列，如增强子、核糖体结合或进入位点、终止信号、聚腺苷酸化序列和信号序列也可操作地连接，以允许它们在转录或翻译中的正确功能。
“氨基酸位置”和“氨基酸残基”可互换使用，指多肽链中氨基酸的位置。在一些实施例中，氨基酸残基可表示为“XN”，其中X表示氨基酸，N表示其在多肽链中的位置。当两个或更多个变异(例如，多态性)出现在同一个氨基酸位置时，变异可用“/”表示，将变异分开。在特定残基位置将一个氨基酸残基用另一个氨基酸残基取代可用XNY表示，其中X表示原始氨基酸，N表示多肽链中的位置，Y表示替代或取代的氨基酸。当所述术语用于描述涉及较大多肽或蛋白质的多肽或肽部分时，引用的第一个数字描述多肽或肽开始的位置(即，氨基末端)，引用的第二个数字描述多肽或肽结束的位置(即，羧基末端)。
“多克隆”抗体是指不同抗体分子的组合物，其能够与相同或不同抗原上的几种不同特异性抗原决定簇结合或反应。多克隆抗体也可以被视为是“单克隆抗体的混合物”。多克隆抗体可以是任何来源的，例如嵌合的、人源化的或完全人类的。
“单克隆抗体”是指从基本上同质抗体群体中获得的抗体，即包括所述群体的单独抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变之外。每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。在一些实施例中，根据本公开使用的单克隆抗体可通过Kohler等人,1975,《自然(Nature)》256:495-7所描述的杂交瘤方法或通过重组DNA方法制备。单克隆抗体也可从例如噬菌体抗体文库中分离。
“嵌合抗体”指由至少两种不同来源的组分组成的抗体。嵌合抗体可以包括与另一个分子(例如，源自第二物种的抗体的一部分)融合的源自第一物种的抗体的一部分。在一些实施例中，嵌合抗体包括与源自人类的抗体的一部分融合的源自非人动物(例如，小鼠或大鼠)的抗体的一部分。在一些实施例中，嵌合抗体包括与源自人类的抗体的恒定区融合的源自非人动物的抗体的可变区的全部或一部分。
“人源化抗体”指包括供体抗体结合特异性的抗体，例如接合到人框架序列上的供体抗体(如小鼠单克隆抗体)的CDR区。“人源化抗体”通常与供体抗体结合相同的表位。
“完全人抗体”或“人抗体”指仅包括人免疫球蛋白序列的抗体。如果在非人细胞(例如，小鼠)中、在小鼠细胞中或在源自小鼠细胞的杂交瘤中产生，则完全人抗体可含有鼠糖链。
“全长抗体”、“完整抗体”或“整个抗体”可互换使用，指抗体(如本公开的抗TREM2抗体)呈其基本上完整的形式，与抗体片段相对。具体地，完全抗体包含具有包含Fc区的重链和轻链的抗体。恒定结构域可以是原生序列恒定结构域(例如，人类原生序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可以具有一个或多个效应子功能。
“抗体片段”或“抗原结合部分”指全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变结构域。抗体片段的实例包含Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体；和由结合两种或更多种不同抗原的抗体片段形成的多特异性抗体。含有增加的结合化学计量或可变化合价(2价、3价或4价)的抗体片段的几个实例包含三抗体、三价抗体和三聚抗体、四抗体、二双抗体和(sc(Fv)2)2分子，并且全部都可用作结合剂以高亲和力和亲合力结合可溶性抗原(参见例如，Cuesta等人,2010,《生物科技趋势(Trends Biotech.)》28:355-62)。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽进一步包括位于VH结构域与VL结构域之间的多肽连接子，所述多肽连接子使sFv能够形成用于抗原结合的所需的结构。关于sFv的综述，参见《单克隆抗体药理学(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)》中的Pluckthun,第113卷,第269-315页,Rosenberg和Moore编辑,纽约的斯普林格出版社(Springer-Verlag,New York),(1994)。
“双体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述抗原结合位点包括与相同多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。
“抗原结合结构域”或“抗原结合部分”指与抗原的部分或全部特异性地结合和互补的抗原结合分子的区域或部分。在一些实施例中，抗原结合结构域可以仅结合抗原的特定部分(例如，表位)，特别是当抗原很大时。抗原结合结构域可以包括一个或多个抗体可变区，特别是抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)，并且特别是VH和VL链的每条链上的互补决定区(CDR)。
“可变区”和“可变结构域”可互换使用，指赋予每种特定抗体的结合和特异性特征的多肽区域。抗体重链的可变区被称为“VH”，而抗体轻链的可变区被称为“VL”。序列中的主要可变性通常位于可变结构域的三个区域，在VL区和VH区的每个区中称为“高变区”或“CDR”，并且形成抗原结合位点。可变结构域中更保守的部分被称为框架区FR。
“互补决定区”和“CDR”可互换使用，指在抗体分子的重链和轻链多肽的可变区内发现的不连续抗原结合区。在一些实施例中，CDR也被描述为“高变区”或“HVR”。通常，天然存在的抗体包括六个CDR，VH中的三个(称为：CDR H1或H1；CDR H2或H2；和CDR H3或H3)以及VL中的三个(称为：CDR L1或L1；CDR L2或L2；和CDR L3或L3)。已经使用各种方法描绘了CDR结构域，并且应当理解，由不同方法定义的CDR也涵盖在本文中。用于定义CDR的“Kabat”方法使用序列可变性，并且是最常用的(Kabat等人,1991,“免疫学意义的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第5版”NIH 1:688-96)。“Chothia”使用结构环的位置(Chothia和Lesk,1987,《分子生物学杂志(J Mol Biol.)》196:901-17)。由“AbM”定义的CDR是Kabat和Chothia方法之间的折衷，并且可使用牛津分子AbM抗体建模软件来描绘(参见，Martin等人,1989,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl AcadSci USA.)》86:9268；另参见万维网www.bioinf-org.uk/abs)。“Contact”CDR描绘基于对已知抗体-抗原晶体结构的分析(参见例如，MacCallum等人,1996,《分子生物学杂志》262,732-45)。当相互进行比较时，通过这些方法描绘的CDR通常包含氨基酸残基的重叠或子集。
应当理解，涵盖特定CDR的确切残基数量将根据CDR的序列和大小而变化，并且给定抗体可变区的氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包括特定的CDR。
Kabat(同上)还定义了可变结构域序列的编号系统，所述系统适用于任何抗体。当涉及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人,《具有免疫学意义的蛋白质序列》,第5版马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院公共卫生服务部(Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.)(1991))。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU或Kabat编号系统”或“EU指数”(例如，Kabat等人(同上)报道的EU指数)。“Kabat的EU指数”是指人IgGl EU抗体的残基编号。提及抗体可变结构域中的残基编号意指通过Kabat编号系统进行的残基编号。提及抗体恒定结构域中的残基编号意指通过EU或Kabat编号系统进行的残基编号(例如，参见美国专利公开第2010-280227号)。本领域技术人员可将这种“Kabat编号”系统指定给任何可变结构域序列。
因此，除非另有说明，提及抗体或抗原结合片段中特定氨基酸残基的编号是根据Kabat编号系统。
“框架区”或“FR区”是指为可变区的一部分但不是CDR的一部分的氨基酸残基(例如，使用Kabat、Chothia或AbM定义)。抗体的可变区通常含有四个FR区：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，VL区中的FR区以下列顺序出现：FR L1-CDR L1-FRL2-CDR L2-FRL3-CDR L3-FRL4，而VH区中的FR区以下列顺序出现：FR1H-CDR H1-FRH2-CDR H2-FRH3-CDR H3-FRH4。
“恒定区”或“恒定结构域”是指免疫球蛋白轻链或重链中与可变区不同的区域。重链的恒定结构域通常包括CH1结构域、铰链(例如，上部、中间和/或下部铰链区)、CH2结构域和CH3结构域中的至少一个。在一些实施例中，抗体可具有另外的恒定结构域CH4和/或CH5。在一些实施例中，本文所描述的抗体包括含有CH1结构域的多肽；包括CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH2结构域的多肽；包括CH1结构域和CH3结构域的多肽；包括CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH3结构域的多肽，或包括CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域的多肽。在一些实施例中，抗体包括包含CH3结构域的多肽。轻链的恒定结构域被称为CL，并且在一些实施例中，可以是κ或λ恒定区。然而，本领域普通技术人员将理解，这些恒定结构域(例如，重链或轻链)可以被修饰，使得它们在氨基酸序列上不同于天然存在的免疫球蛋白分子。
“Fc区”或“Fc部分”是指免疫球蛋白重链的C末端区域。Fc区可以是天然序列Fc区或非天然存在的变体Fc区。通常，免疫球蛋白的Fc区包括恒定结构域CH2和CH3。尽管Fc区的边界可以变化，但在一些实施例中，人IgG重链Fc区可被定义为从位置C226的氨基酸残基或从P230延伸至其羧基末端。在一些实施例中，人IgG Fc区的“CH2结构域”(也称为“Cγ2”)通常从约氨基酸残基231延伸至约氨基酸残基340。在一些实施例中，N连接的糖链可以被插入完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。在一些实施例中，人IgG Fc区的“CH3结构域”包括CH2结构域C末端的残基，例如从Fc区的约氨基酸残基341至约氨基酸残基447。“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应功能”。示例性Fc“效应子功能”包含Clq结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，LT受体)的下调；等等。此类效应功能通常需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合，并且可以使用本领域已知的各种测定来评估。
“天然序列Fc区”包括与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包含天然序列人IgGl Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4Fc区及其天然存在的变体。
“变体Fc区”包括与天然序列Fc区的不同之处在于至少一个氨基酸修饰(优选地一个或多个氨基酸取代)的氨基酸序列。优选地，变体Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲本肽的Fc区中约一个至约十个氨基酸取代，并且优选地约一个至约五个氨基酸取代。本文的变体Fc区优选地与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，并且最优选地与其具有至少约90％同源性，更优选地与其具有至少约95％同源性。
“亲和力成熟的”抗体，如本公开的亲和力成熟的抗TREM2抗体，是其一个或多个HVR中具有一个或多个改变的抗体，所述一个或多个改变导致与不具有那些改变的亲本抗体相比抗体对抗原的亲和力提高。在一个实施例中，亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。通过本领域已知的程序产生亲和力成熟的抗体。例如，Marks等人,《生物技术(Bio/Technology)》,1992,10:779-783描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。HVR和/或构架残基的随机诱变由例如Barbas等人,《美国国家科学院院刊》,1994,91:3809-3813；Schier等人《基因(Gene)》,1995,169:147-155；Yelton等人,《免疫学(Immunol.)》,1995,155:1994-2004；Jackson等人,《免疫学》,1995,154(7):3310-9；以及Hawkins等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,1992,226:889-896所描述。
“结合亲和力”是指配体和其结合配偶体之间非共价相互作用的总和的强度。在一些实施例中，结合亲和力是反映配体和结合配偶体之间一对一相互作用的固有亲和力。亲和力通常用平衡缔合(KA)或解离常数(KD)来表示，它们依次是离解速率常数(koff)和缔合速率常数(kon)的倒数比。
“序列同一性百分比(％)”和“序列同源性百分比”在本文中可互换使用，是指多核苷酸或多肽之间的比较，并且通过在比较窗内比较两个最佳比对的序列来确定，其中为了实现两个序列的最佳比对，在比较窗内的多核苷酸或多肽序列部分与参考序列相比可以包括缺口。百分比可以通过以下计算：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配的位置的数目、将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置总数并且将结果乘以100以得到序列一致性百分比。可替代地，百分比可以通过以下计算：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数或者核酸碱基或氨基酸残基与缺口对齐的位置数以产生匹配的位置的数目、将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置总数并且将结果乘以100以得到序列一致性百分比。本领域技术人员了解到，有许多既定算法可用于比对两个序列。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过以下进行：局部同源性算法，Smith和Waterman,1981,《高等应用数学(Adv Appl Math.)》2:482，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法,1970,《分子生物学杂志》48:443，通过Pearson和Lipman,1988《美国国家科学院院刊》85:2444-8的相似性搜索法，以及特别是通过这些算法的计算机化实施方案(例如，BLAST、ALIGN、GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；参见例如，Mount,D.W.,《生物信息学：序列和基因组分析(Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis)》,第2版,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(2013))。
适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0、FASTDB或ALIGN算法，所述算法是公开可获得的(例如，NCBI：国家生物技术信息中心)。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数。例如，BLASTN程序(对于核苷酸序列)可以使用字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较作为默认值。使用BLASTP进行氨基酸序列的比较可使用默认值字长(W)为3、期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,1989,《美国国家科学院院刊》89:10915-9)。
“氨基酸取代”是指多肽中的一个氨基酸被另一个氨基酸替代。“保守氨基酸取代”是指具有相似侧链的残基的可互换性，因此通常涉及将多肽中的氨基酸用相同或相似定义的氨基酸类别内的氨基酸取代。作为实例而非限制，具有脂肪族侧链的氨基酸可被另一种脂肪族氨基酸取代，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸；具有羟基侧链的氨基酸被另一个具有羟基侧链的氨基酸取代，例如丝氨酸和苏氨酸；具有芳香族侧链的氨基酸被另一个具有芳香族侧链的氨基酸取代，例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸；具有碱性侧链的氨基酸被另一个具有碱性侧链的氨基酸取代，例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有酸性侧链的氨基酸被另一个具有酸性侧链的氨基酸取代，例如天冬氨酸或谷氨酸；并且疏水性或亲水性氨基酸分别被另一个疏水性或亲水性氨基酸取代。
“氨基酸插入”是指将至少一个氨基酸并入到预定氨基酸序列中。插入可以是一个或两个氨基酸残基的插入；然而，本文考虑了约三个至约五个，或至多约十个或更多个氨基酸残基的更大插入。
“氨基酸缺失”是指从预定的氨基酸序列中去除一个或多个氨基酸残基。缺失可以是一个或两个氨基酸残基的去除；然而，本文考虑了约三个至约五个，或至多约十个或更多个氨基酸残基的更大缺失。
“受试者”是指哺乳动物，包含但不限于人类、非人灵长类动物，以及非灵长类动物，如山羊、马和牛。在一些实施例中，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，指代人类受试者。
“治疗有效剂量”或“治疗有效量”或“有效剂量”是指化合物(包含生物化合物或药物组合物)在施用于有需要的哺乳动物后足以产生期望活性的量。如本文所用，关于包括抗体的药物组合物，术语“治疗有效量/剂量”是指在施用于哺乳动物后足以产生有效应答的抗体或其药物组合物的量/剂量。
“药学上可接受的”是指通常安全、无毒且既不是生物学上也不是其它方面不期望的化合物或组合物，并且包含人类药学和兽医学使用上可接受的化合物或组合物。所述化合物或组合物被或可以被监管机构批准，或者被列入美国药典或其他认可的药典，用于动物(包含人类)。
“药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂”是指可与至少一种治疗剂(例如，本公开的抗体)一起施用于受试者的赋形剂、载体或佐剂，并且当以足以递送治疗量的药剂的剂量施用时，所述赋形剂、载体或佐剂不会破坏其药理活性，并且通常是安全的、无毒的，既不是生物学上也不是其它方面不期望的。
术语“治疗”在本文中与术语“治疗方法”可互换地使用，并且是指1)治愈、减缓、减轻所诊断的病理病状、疾病或病症的症状和/或中止其进展的治疗性治疗或措施，以及2)以及预防/预防性措施两者。需要治疗的患者可以包含已经患有特定医学疾病或病症的个体以及最终可能获得所述病症的个体(即，处于风险中或需要预防性措施的个体)。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指对其执行主题方法的任何个体。通常，受试者是人，但是如本领域的技术人员将理解的，受试者可以是任何动物。
在一些实施例中，本发明的化合物能够穿过血脑屏障(BBB)。如本文所用，术语“血脑屏障”或“BBB”是指BBB本身以及血脊髓屏障。血脑屏障由脑血管内皮、基底膜和神经胶质细胞组成，用于限制物质渗透到脑中。在一些实施例中，在施用于患者(例如口服或静脉内施用)之后，总药物的脑/血浆比为至少大约0.01。在一些实施例中，总药物的脑/血浆比为至少大约0.03。在一些实施例中，总药物的脑/血浆比为至少大约0.06。在一些实施例中，总药物的脑/血浆比为至少大约0.1。在一些实施例中，总药物的脑/血浆比为至少大约0.2。
如本文所用的术语“同源物”，尤其是“TREM同源物”是指具有共同生物活性(包含抗原性/免疫原性和炎症调节活性)和/或结构性结构域并且具有如本文所定义的足够氨基酸或核苷酸序列同一性的一系列肽或核酸分子的任何成员。TREM同源物可以来自相同或不同种类的动物。
如本文所用的术语“变体”是指给定肽的天然存在的等位基因变异，或者是给定肽或蛋白质的重组制备的变异，其中一个或多个氨基酸残基已经通过氨基酸取代、添加或缺失而被修饰。
如本文所用的术语“衍生物”是指给定肽或蛋白质的变异，其以其它方式被修饰，即通过将任何类型的分子(优选地具有生物活性的分子)与肽或蛋白质共价连接，包含非天然存在的氨基酸。
6.2.本发明的某些实施例的一般描述
通过对斑块微环境中细胞的水平和类型的变化、与斑块微环境相关的细胞基因组的表达模式、细胞因子表达水平、免疫应答因子或斑块微环境中的其它变化的鉴定极大地有助于患者的阿尔茨海默氏病的诊断、预后和治疗，其它变化在本文中通常被称为“生物标志物”，或者更具体地，与基因表达模式相关的被称为“基因签名”、“基因表达生物标志物”或“分子签名”，或者与蛋白质表达模式相关的被称为“蛋白质标签”、“蛋白质表达生物标志物”或“蛋白质组签名”，或者与细胞类型组成模式相关的被称为“细胞签名”(即，小胶质细胞签名)，这是阿尔茨海默氏病的特性。此类生物标志物可能与临床结果相关。如果此类关联是临床应答的预测，则生物标志物有利地用于选择或分层患者更可能(或更不可能，视情况而定)受益于治疗方案(如本文所公开的那些方案之一)的方法中。
来自具有预测对治疗的阳性应答的生物标志物谱的患者的生物样品在本文中被称为“生物标志物阳性”或“生物标志物高”。相反，来自具有不预测阳性应答的生物标志物谱的患者的生物样品在本文中被称为“生物标志物阴性”或“生物标志物低”。取决于生物标志物，可以使用替代性术语，但是较高的量或“生物标志物高”通常可以使用替代性术语来描述，如“生物标志物阳性”或“生物标志物+”，而较低量的生物标志物或“生物标志物低”通常可以使用替代性术语来描述，如“生物标志物阴性”或“生物标志物-”
在一些实施例中，本发明中使用的生物标志物是生物标志物组，如基因表达组。在其它实施例中，生物标志物组是细胞因子组。在其它实施例中，生物标志物组是斑块微环境中存在的细胞类型的表征。
如本文所用，此类“组”是指以倾向于预测特定临床结果可能性的方式对特定刺激(例如，用TREM2激动剂治疗患者)产生应答的一组特定的生物标志物，例如斑块微环境中的特定基因或特定细胞类型群体。在一组中，个体生物标志物，例如基因的表达或特定细胞类型的流行，不需要每个都以相同的方式产生应答。一些可能上调，并且一些可能下调；因此，组的总体应答通常在预测临床应答的可能性方面是最有用的。
在一些实施例中，本发明中使用的生物标志物是基因签名。在其它实施例中，生物标志物是细胞因子签名。在其它实施例中，生物标志物组是斑块微环境中细胞的细胞类型签名。类似于组，如本文所用的“标签”是指响应于刺激以提供对治疗的生物标志物应答的指纹(独特模式)的一组生物标志物，如存在于斑块微环境中的特定基因或特定细胞类型群体。
此外，尽管阿尔茨海默氏病患者源性生物标志物是改善阿尔茨海默氏病的诊断、预后和治疗的重要工具，但是收集生物样品的侵入性可能增加严重并发症的风险，所述并发症包含麻醉灾难、出血、感染、癫痫发作和死亡(Warren等人,《脑(Brain)》,2005)。手术移除脑组织(活检)和从斑块部位吸取细胞(细针吸取细胞学)两者都有可能将异常细胞暴露于颅腔。相对于活检而言，收集用于生物标志物分析的血清样品的侵入性降低允许更连续地监测患者对治疗的应答。因此，避免破坏颅骨完整性或引起炎症的微创诊断工具和方法，如“血清生物标志物”，提供了改善患者护理的机会，同时减轻了与当前治疗方案相关的风险。血清生物标志物包含可以通过远离斑块部位获得的体液样品(例如，静脉血和淋巴液)获得的生物标志物。血清生物标志物的实例包含例如循环细胞因子和生长因子，以及循环免疫细胞中的表型和基因型标志物。
6.3.疾病相关生物标志物
已经令人惊讶地发现，小胶质细胞对疾病激活(DAM)型、干扰素应答型(IFN-R)、周期型(Cyc-M)和MHC-II RNA表达型(MHC II)小胶质细胞类型轨迹的激活水平可以用作本文所描述的方法中的生物标志物，所述方法如治疗患者的阿尔茨海默氏病、诊断患者的阿尔茨海默氏病或预测对阿尔茨海默氏病治疗的患者应答的方法。在本发明的一些实施例中，生物标志物包括小胶质细胞状态转变的状况。在一些实施例中，小胶质细胞状态转变是从稳态开始的。在一些实施例中，小胶质细胞状态转变朝向DAM、IFN-R、Cyc-M或MHC-II小胶质细胞类型轨迹。在一些实施例中，通过细胞分选来确定小胶质细胞状态。
来自小胶质细胞的特征性表达谱的基因适合作为本文所描述方法中的生物标志物。在一些实施例中，生物标志物是选自以下各项的基因：C1QA/B/C、CD81、HEXB、IL1B、LGMN、OLFML3、P2RY12、SPARC、TMEM119、MRC1、PF4、CD3G或MS4A4B。在一些实施例中，生物标志物是由选自以下各项的基因编码的蛋白质或其变体：C1QA/B/C、CD81、HEXB、IL1B、LGMN、OLFML3、P2RY12、SPARC、TMEM119、MRC1、PF4、CD3G或MS4A4B。
来自特定小胶质细胞状态轨迹(例如，朝向DAM、Cyc-M、IFN-R或MHC-II小胶质细胞类型)的表达谱特性的任何基因适合作为本文所描述的方法中的生物标志物。在一些实施例中，生物标志物是来自DAM小胶质细胞轨迹的表达谱特性的基因。在一些实施例中，生物标志物是选自以下各项的基因：FTL1、MLF、CD63、LPL、CTSB、CST7、APOE、CCL4、CD9或CCL3。在一些实施例中，生物标志物是由选自以下各项的基因编码的蛋白质或其变体：Ftl1、MLF、CD63、LPL、CTSB、CST7、APOE、CCL4、CD9或CCL3。在一些实施例中，生物标志物是来自Cyc-M小胶质细胞轨迹的表达谱特性的基因。在一些实施例中，生物标志物是选自以下各项的基因：H2AFZ、HMGB2、TUBA1B、HMGN2、H2AFV、IFI2712A、TUBB5、BIRC5、STMN1或CCNB2。在一些实施例中，生物标志物是由选自以下各项的基因编码的蛋白质或其变体：H2AFZ、HMGB2、TUBA1B、HMGN2、H2AFV、IFI2712A、TUBB5、BIRC5、STMN1或CCNB2。在一些实施例中，生物标志物是来自IFN-R小胶质细胞轨迹的表达谱特性的基因。在一些实施例中，生物标志物是选自以下各项的基因：CCL12、IFITM3、ISG15、IFIT3、BST2、OASL2、LGALS3BP、RTP4、IFI204或IRF7。在一些实施例中，生物标志物是由选自以下各项的基因编码的蛋白质或其变体：CCL12、IFITM3、ISG15、IFIT3、BST2、OASL2、LGALS3BP、RTP4、IFI204或IRF7。在一些实施例中，生物标志物是来自MCH II小胶质细胞轨迹的表达谱特性的基因。在一些实施例中，生物标志物是选自以下各项的基因：H2-K1、H2-Q7、H2-EB1、CD74、H2-AA、H2-D1、H2-AB1、H2-DMA、H2-T23或LY6E。在一些实施例中，生物标志物是由选自以下各项的基因编码的蛋白质或其变体：H2-K1、H2-Q7、H2-EB1、CD74、H2-AA、H2-D1、H2-AB1、H2-DMA、H2-T23或LY6E。
在一些实施例中，生物标志物是与干扰素通路相关的基因。在一些实施例中，生物标志物是选自以下各项的基因：BST2、CCL2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IRF7、ISG15、LGALS3BP、OASL2、RTP4、SLFN2或USP18。在一些实施例中，生物标志物是由选自以下各项的基因编码的蛋白质或其变体：BST2、CCL2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IRF7、ISG15、LGALS3BP、OASL2、RTP4、SLFN2或USP18。
在一些实施例中，生物标志物是与MHC I类蛋白复合物相关的基因。在一些实施例中，生物标志物是选自以下各项的基因：B2M、H2-D1、H2-K1、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23或MR1。在一些实施例中，生物标志物是由选自以下各项的基因编码的蛋白质或其变体：B2M、H2-D1、H2-K1、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23或MR1。在一些实施例中，生物标志物是与MHC II类蛋白复合物相关的基因。在一些实施例中，生物标志物是选自以下各项的基因：CD74、H2-AA、H2-AB1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-OA或H2-OB。在一些实施例中，生物标志物是由选自以下各项的基因编码的蛋白质或其变体：CD74、H2-AA、H2-AB1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-OA或H2-OB。
已经发现，用TREM2激动剂治疗进行增加了阿尔茨海默氏病动物模型中CCL4、CCL2、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B和TMEM119的水平，其水平可以用作本文所描述的方法中的生物标志物，所述方法如治疗患者的阿尔茨海默氏病、诊断患者的阿尔茨海默氏病或预测对阿尔茨海默氏病治疗的患者应答的方法。在一些实施例中，生物标志物是选自以下各项的基因：CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在其它实施例中，生物标志物是由选自以下各项的基因编码的蛋白质或其变体：CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。
经考虑在本发明的某些方面，当用于本文所描述的方法中时，来自相同类别或不同类别的生物标志物(即，基因生物标志物和小胶质细胞状态生物标志物)的一种或多种生物标志物可以单独使用，或者彼此以任何组合作为生物标志物组使用。在一些实施例中，生物标志物组包括选自以下各项的一种或多种生物标志物：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18。在一些实施例中，在施用TREM2激动剂之后，一种或多种上述生物标志物的表达水平增加。在一些实施例中，在施用TREM2激动剂之后，一种或多种上述生物标志物的表达水平降低。
在一些实施例中，所述生物标志物组包括选自以下各项的一种或多种生物标志物：CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在一些实施例中，在施用TREM2激动剂之后，选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119的一种或多种生物标志物的表达水平增加。在一些实施例中，在施用TREM2激动剂之后，选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119的一种或多种生物标志物中的一种、两种、三种、四种或五种生物标志物的表达水平增加。在一些实施例中，在施用TREM2激动剂之后，生物标志物CCL2、CCL4、CST7、CXCL2和CXCL10增加。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗人TREM2抗体。
还发现用TREM2激动剂进行的治疗调节选自下表A所示的一种或多种生物标志物的水平。在一些实施例中，在施用TREM2激动剂之后，选自表A中的一种或多种生物标志物的表达水平增加。在一些实施例中，施用TREM2激动剂之后，选自表A中的一种或多种生物标志物的表达水平降低。在一些实施例中，表A中列出的一种或多种生物标志物可以在本文设想的任何方法中与本公开的其它生物标志物一起测量。
表A：选定的另外生物标志物
在一些实施例中，患者的生物标志物水平的增加或降低是可测量的增加或降低，其与所述患者、或一组患者、或尚待选择的一名或一组患者的治疗益处的增加(或降低，视情况而定)可能性相关。在一些实施例中，增加或降低是统计上显著的增加或降低。术语“统计显著性”在本领域中是众所周知的，并且可以使用本领域中已知的方法来确定，如本文所描述的那些方法。在一些实施例中，统计显著性意指，例如，相对于基线，p<0.1，p<0.05，p<0.04，p<0.03，p<0.02或p<0.01。
在一些实施例中，在患者完成一个治疗周期后，观察到生物标志物水平的增加或降低。在一些实施例中，在两个或更多个治疗周期(如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或10个或更多个周期)之后观察到增加或减少。术语“治疗周期”在本领域中是众所周知的，并且是指医生限定的治疗方案，患者遵循所述方案一段时间，如1周、2周、3周或4周，任选地接着一段时间，例如1周、2周、3周或4周的患者恢复和/或疾病进展监测，在此期间，在一些情况下，施用较低剂量的治疗剂(或根本不施用治疗剂)。在一些实施例中，治疗周期是指施用TREM2激动剂，如本文所描述的hT2AB或其药学上可接受的盐，作为单一疗法，或与另一种疗法组合。
6.4.本发明的方法
本发明的某些方面提供了增加TREM2(即，TREM2激动剂)的活性的分子，用于治疗、预防或改善有需要的患者的发展与TREM2缺乏相关的病状的风险。根据本发明的方法可以预防、治疗或改善的与TREM2缺乏或TREM2功能丧失相关的病状或病症包含但不限于：那须-哈科拉病、阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆、多发性硬化症、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、肌萎缩性侧索硬化症、帕金森氏病(Parkinson's disease)、创伤性脑损伤、脊髓损伤、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、朊病毒病、中风、骨质疏松症、骨硬化症和骨质硬化症。尽管下文针对患有阿尔茨海默氏病的患者描述了本发明的某些方法的各方面，但是本发明的方法考虑涵盖患有与TREM2缺乏或TREM2功能丧失相关的任何上文所列出的病状或病症的患者。例如，下文所描述的方法旨在涵盖患有那须-哈科拉病、额颞叶痴呆、多发性硬化症、朊病毒病或中风的患者。因此，本文所描述的用于治疗阿尔茨海默氏病的方法也可以应用于本文所描述的另一种疾病。
一方面，本发明提供了一种鉴定将受益于用TREM2激动剂进行治疗的患有阿尔茨海默氏病的患者的方法，所述方法包括：
(a)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之前，从所述患者获得第一生物样品；
(b)测量所述第一生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(c)向所述患者施用有效量的TREM2激动剂；
(d)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之后，从所述患者获得第二生物样品；以及
(e)测量所述第二生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18。
在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。在一些实施例中，步骤(b)和(e)进一步包括测量选自表A中所列出的一种或多种生物标志物的水平。
另一方面，本发明提供了一种鉴定患有阿尔茨海默氏病的患者的方法，所述患者可能受益于用TREM2激动剂进行的治疗，或者相对于其它方面类似的患者，所述患者受益于所述治疗的可能性增加，所述方法包括：
(a)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之前，从所述患者获得第一生物样品；
(b)测量所述第一生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(c)向所述患者施用有效量的TREM2激动剂；
(d)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之后，从所述患者获得第二生物样品；以及
(e)测量所述第二生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
其中基于阿尔茨海默氏病的与一个或多个相似患者相比的更大或更小的应答并且如使用所述生物标志物中的一种或多种生物标志物所评估的，对步骤(c)的阿尔茨海默氏病应答预测成功治疗所述阿尔茨海默氏病的可能性。
在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。在一些实施例中，步骤(b)和(e)进一步包括测量选自表A中所列出的一种或多种生物标志物的水平。
另一方面，本发明提供了一种体外或离体测定取自患者的生物样品以确定所述患者的阿尔茨海默氏病是否会对用TREM2激动剂进行的治疗产生应答或产生应答的可能性增加的方法，所述方法包括：
(a)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之前，从所述患者获得第一生物样品；
(b)测量所述第一生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(c)如果所述患有阿尔茨海默氏病的患者将对用TREM2激动剂进行的治疗产生应答或产生应答的可能性增加，则向所述患者施用有效量的TREM2激动剂。
在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。在一些实施例中，步骤(b)进一步包括测量选自表A中所列出的一种或多种生物标志物的水平。
另一方面，本发明提供了一种治疗患者的阿尔茨海默氏病患者的方法，所述患者对先前的阿尔茨海默氏病治疗不产生应答，或者所述患者的阿尔茨海默氏病在最初对先前的阿尔茨海默病治疗产生应答之后已经变得难治，所述方法包括：
(a)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之前，从所述患者获得第一生物样品；
(b)测量所述第一生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(c)如果所述患有阿尔茨海默氏病的患者将对用TREM2激动剂进行的治疗产生应答或产生应答的可能性增加，则向所述患者施用有效量的TREM2激动剂；
(d)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之后，获得第二生物样品；以及
(e)测量所述第二生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
其中基于阿尔茨海默氏病的与一个或多个相似患者相比的更大或更小的应答并且如使用所述生物标志物中的一种或多种生物标志物所评估的，对步骤(c)的阿尔茨海默氏病应答预测成功治疗所述阿尔茨海默氏病的可能性。
在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。在一些实施例中，步骤(b)和(e)进一步包括测量选自表A中所列出的一种或多种生物标志物的水平。
另一方面，本发明提供了一种预测阿尔茨海默氏病是否会对用TREM2激动剂进行治疗后的第二次阿尔茨海默氏病治疗产生应答的方法，所述方法包括：
(a)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之前，从所述患者获得第一生物样品；
(b)测量所述第一生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(c)向所述患者施用有效量的TREM2激动剂；
(d)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之后，获得第二生物样品；以及
(e)测量所述第二生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
其中基于阿尔茨海默氏病的与一个或多个相似患者相比的更大或更小的应答并且如使用所述生物标志物中的一种或多种生物标志物所评估的，对步骤(c)的阿尔茨海默氏病预测成功治疗所述阿尔茨海默氏病的可能性。
在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。在一些实施例中，步骤(b)和(e)进一步包括测量选自表A中所列出的一种或多种生物标志物的水平。
在一些实施例中，用TREM2激动剂进行治疗使斑块微环境进行初免，使得斑块变得更有可能对第二种阿尔茨海默氏病治疗剂产生应答。在一些实施例中，所述斑块对阿尔茨海默氏病治疗的单一疗法不产生应答，但是当与TREM2激动剂组合时，所述斑块被初免并且对阿尔茨海默氏病治疗产生应答。在一些实施例中，斑块最初对阿尔茨海默氏病治疗的单一疗法产生应答，但变得难治。在一些实施例中，在用TREM2激动剂进行治疗之后，斑块可以用阿尔茨海默氏病治疗有效地治疗。
在一些实施例中，上述方法可用于鉴定将受益于用TREM2激动剂进行的治疗的患者。此类患者的特征在于，来自所述患者的所述第二生物样品中的一种或多种选自以下各项的生物标志物的水平高于来自所述患者的所述第一生物样品中的一种或多种生物标志物的水平：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18。在一些实施例中，当来自所述患者的所述第二生物样品中的一种或多种选自以下各项的生物标志物的水平高于来自所述患者的所述第一生物样品中的一种或多种生物标志物的水平时，则向所述患者施用一个或多个另外剂量的所述TREM2激动剂：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18。这是因为此类患者被视为可能受益于用TREM2激动剂进行的持续治疗。在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。在一些实施例中，所述患者的特征在于第二生物样品中的选自表A中列出的那些的一种或多种另外的生物标志物的水平也高于第一生物样品中的生物标志物的水平。
另一方面，本发明提供了一种用TREM2激动剂治疗阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括：
(a)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之前，从所述患者获得第一生物样品；
(b)测量所述第一生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(c)向所述患者施用有效量的TREM2激动剂；
(d)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之后，获得第二生物样品；以及
(e)测量所述第二生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
其中当来自所述患者的所述第二生物样品中的一种或多种选自以下各项的生物标志物的水平高于来自所述患者的所述第一生物样品中的一种或多种生物标志物的水平时，则向所述患者施用一个或多个另外剂量的所述TREM2激动剂：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18。
在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。在一些实施例中，步骤(b)和(e)进一步包括测量选自表A中所列出的一种或多种生物标志物的水平。
另一方面，本发明提供了一种评估对TREM2激动剂的患者应答的方法，所述包括以下步骤：
(a)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之前，从所述患者获得第一生物样品；
(b)测量所述第一生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(c)向所述患者施用有效量的TREM2激动剂；
(d)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之后，获得第二生物样品；以及
(e)测量所述第二生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
其中评估对步骤(c)的阿尔茨海默氏病应答，以基于与一个或多个相似患者相比斑块应答更大或更小，将患者分开、分类或归类为两个或更多个组中的一个组。
在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。在一些实施例中，步骤(b)和(e)进一步包括测量选自表A中所列出的一种或多种生物标志物的水平。
另一方面，本发明提供了一种预测对TREM2激动剂的患者应答的方法，所述包括以下步骤：
(a)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之前，从所述患者获得第一生物样品；
(b)测量来自所述患者的所述第一生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(c)向所述患者施用有效量的TREM2激动剂；
(d)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之后，从所述患者获得第二生物样品；以及
(e)测量来自所述患者的所述第二生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
其中基于阿尔茨海默氏病的与一个或多个相似患者相比的更大或更小的应答并且如使用所述生物标志物中的一种或多种生物标志物所评估的，对步骤(c)的阿尔茨海默氏病应答预测成功治疗的可能性。
在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。在一些实施例中，步骤(b)和(e)进一步包括测量选自表A中所列出的一种或多种生物标志物的水平。
另一方面，本发明提供了一种预测患者的阿尔茨海默氏病对TREM2激动剂的治疗应答的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之前，从所述患者获得第一生物样品；
(b)测量所述第一生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(c)处理来自所述患者的所述生物样品或参考样品；
(d)测量经处理的生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(e)将处理前的生物样品中的更多种生物标志物之一与所述经处理的生物样品或经处理的参考样品中的一种或多种生物标志物进行比较；以及
(f)任选地，继续向所述患者施用所述TREM2激动剂，如果预测此类施用相对于治疗所述阿尔茨海默氏病的替代方法具有等效或更高的成功可能性；
其中响应于步骤(c)的生物标志物变化基于与一个或多个相似患者相比更大或更小的生物标志物变化并且如使用所述生物标志物中的一种或多种生物标志物所评估的，预测成功治疗所述阿尔茨海默氏病的可能性。
在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。在一些实施例中，步骤(b)和(d)进一步包括测量选自表A中所列出的一种或多种生物标志物的水平。
在一些实施例中，所述参考样品来自另一个患者，如具有阿尔茨海默氏病的相似病理的患者；或者所述参考样品可以是阿尔茨海默氏病的相似病理的培养物或其它体外样品。
另一方面，本发明提供了一种监测对TREM2激动剂的患者应答的方法，所述包括以下步骤：
(a)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之前，从所述患者获得第一生物样品；
(b)测量来自所述患者的所述第一生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(c)向所述患者施用有效量的TREM2激动剂；
(d)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之后，从所述患者获得一个或多个后续生物样品；以及
(e)测量所述后续生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
其中可比较所述第一生物样品和所述后续生物样品中的更多种生物标志物中的一种生物标志物的水平，并且所述生物标志物中的一种或多种生物标志物的变化指示患者应答。
在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。在一些实施例中，步骤(b)和(e)进一步包括测量选自表A中所列出的一种或多种生物标志物的水平。
在一些实施例中，每周或每两周测量一次对TREM2激动剂的患者应答。在一些实施例中，每月测量一次患者应答。在一些实施例中，每两个月测量一次患者的应答。在一些实施例中，每季度(每三个月一次)测量患者的应答。在一些实施例中，每年测量患者的应答。
在一些实施例中，在进行治疗的同时监测对TREM2激动剂的患者应答。在一些实施例中，治疗结束之后，监测患者应答。
另一方面，本发明提供了一种获得预测对用TREM2激动剂进行的治疗的应答的生物标志物签名的方法，所述方法包括：
(a)从诊断患有阿尔茨海默氏病的患者队列中的每个患者获得处理前的生物样品；
(b)为所述队列中的每个患者获得用TREM2激动剂进行治疗后的应答值；
(c)测量生物标志物平台中每个基因的每个生物样品中的原始生物标志物水平，其中所述生物标志物平台包括具有以下各项的临床应答生物标志物组：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(d)对于每个生物样品，使用一组归一化生物标志物的测得的生物标志物水平来归一化临床应答生物标志物的每个测得的原始生物标志物水平；以及
(e)比较所有生物样品的生物标志物水平和所述队列中的所有患者的应答值，以选择生物标志物签名评分的截止值，所述截止值划分患者队列以满足目标生物标志物临床效用标准。
在一些实施例中，所述生物标志物平台包括基因表达平台，所述基因表达平台包括临床应答基因组。在一些实施例中，所述方法进一步包括以下步骤：
(f)对于每个生物样品和每个生物标志物，如所关注基因签名中的基因，使用所述基因的预定义倍增系数对归一化的生物标志物(例如，RNA生物标志物)表达水平进行加权；
(g)对于每个患者，将加权的生物标志物(例如，RNA生物标志物)表达水平相加，以产生所述队列中的每个患者的生物标志物签名评分，例如，基因签名评分。
在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。在一些实施例中，所述生物标志物平台进一步包括选自表A中列出的一种或多种生物标志物。
另一方面，本发明提供了一种测试来自患者的生物样品中阿尔茨海默氏病对TREM2激动剂的应答的基因签名生物标志物的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(a)测量基因表达平台中每个基因在生物样品中的原始RNA水平，其中所述基因表达平台包括临床应答基因组和管家基因的归一化基因组，并且任选地，其中约80％或约90％的所述临床应答基因表现出与阿尔茨海默氏病应答正相关的RNA水平，所述临床应答基因组选自APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(b)使用所述归一化基因的所述测得的RNA水平归一化所述生物样品的预定义基因签名中每个临床应答基因的测得的原始RNA水平，其中所述预定义基因签名由至少2个所述临床应答基因组成，从而获得基因签名评分；
(c)将所述基因签名评分与所述基因签名的参考评分进行比较；以及
(d)将所述生物样品分类为生物标志物高或生物标志物低；
其中如果产生的评分等于或大于所述参考评分，则所述生物样品被分类为生物标志物高，如果产生的评分小于所述参考评分，则所述生物样品被分类为生物标志物低。
在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。在一些实施例中，所述基因表达平台进一步包括选自表A中列出的一种或多种生物标志物。
在一些实施例中，在步骤(b)之后，所述方法包括以下另外的步骤：
(i)使用预定义的乘法系数对每个归一化的RNA值进行加权；
(ii)将加权的RNA表达水平相加以产生加权的基因签名评分。
在一些实施例中，所述归一化基因组包括约1至5个管家基因、5至10个管家基因、10至约20个管家基因或约30-40个管家基因。
另一方面，本发明提供了一种测试来自诊断患有阿尔茨海默氏病的患者的生物样品中阿尔茨海默氏病对TREM2激动剂的应答的生物标志物签名的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(a)测量生物标志物平台中每个生物标志物在所述生物样品中的原始生物标志物水平，其中所述生物标志物平台包括临床应答生物标志物组和归一化生物标志物组，并且任选地其中约80％或约90％的所述临床应答生物标志物表现出与所述阿尔茨海默氏病应答正相关的水平，所述临床应答生物标志物组选自APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(b)使用所述归一化生物标志物的所述测得的生物标志物水平归一化所述生物样品的预定义生物标志物签名中每个临床应答生物标志物的测得的原始生物标志物水平，其中所述预定义生物标志物签名由至少2个所述临床应答生物标志物组成；
(c)比较所述生物样品的归一化生物标志物水平和一组参考生物标志物水平；以及
(d)将所述生物样品分类为生物标志物高或生物标志物低；
其中如果归一化生物标志物水平等于或大于所述参考生物标志物水平，则所述生物样品被分类为生物标志物高，并且如果归一化生物标志物水平小于所述参考生物标志物水平，则所述生物样品被分类为生物标志物低。
在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。在一些实施例中，所述生物标志物平台进一步包括选自表A中列出的一种或多种生物标志物。
在一些实施例中，所述归一化生物标志物组包括约10至约12个管家基因或约30-40个管家基因。
另一方面，本发明提供了一种用于测试从患有阿尔茨海默氏病的患者中取出的生物样品的样品中对TREM2激动剂的应答的生物标志物签名的存在或不存在的系统，所述系统包括：
(i)用于测量生物标志物平台中的原始生物标志物水平的样品分析器，其中所述生物标志物平台由一组临床应答生物标志物和一组归一化生物标志物组成，所述一组临床应答生物标志物选自APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；以及
(ii)用于接收和分析测得的生物标志物水平的计算机程序，所述计算机程序用于：
(a)使用所述归一化生物标志物的所述测得的水平归一化所述生物样品的预定义生物标志物签名中每个临床应答生物标志物的测得的原始生物标志物水平；
(b)将所产生的生物标志物水平与所述生物标志物签名的参考水平进行比较；以及
(c)将所述生物样品分类为生物标志物高或生物标志物低，其中如果产生的评分等于或大于所述参考评分，则所述生物样品被分类为生物标志物高，如果产生的评分小于所述参考评分，则所述生物样品被分类为生物标志物低。
在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。在一些实施例中，所述生物标志物平台进一步包含选自表A中列出的一种或多种生物标志物。
另一方面，本发明提供了一种用于测试来自诊断患有阿尔茨海默氏病的患者的生物样品中阿尔茨海默氏病对TREM2激动剂的应答的生物标志物签名的存在或不存在的系统，所述系统包括：
(i)用于测量生物标志物平台中的原始生物标志物水平的样品分析器，其中所述生物标志物平台由一组临床应答生物标志物和一组归一化生物标志物组成，所述一组临床应答生物标志物选自APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；以及
(ii)用于接收和分析测得的生物标志物水平的计算机程序，所述计算机程序用于：
(a)使用所述归一化生物标志物的所述测得的水平归一化所述生物样品的预定义生物标志物签名中每个临床应答生物标志物的测得的原始生物标志物水平；
(b)使用预定义的倍增系数对每个归一化的生物标志物水平进行加权；
(c)将加权的生物标志物水平相加以产生生物标志物签名评分；
(d)将产生的评分与所述生物标志物签名的参考评分进行比较；以及
(e)将所述生物样品分类为生物标志物高或生物标志物低，其中如果产生的评分等于或大于所述参考评分，则所述生物样品被分类为生物标志物高，如果产生的评分小于所述参考评分，则所述生物样品被分类为生物标志物低。
在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。在一些实施例中，所述生物标志物平台进一步包含选自表A中列出的一种或多种生物标志物。
在一些实施例中，所述生物标志物包括本文所描述的基因的RNA表达水平，如APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18。在一些实施例中，所述生物标志物进一步包括表A中列出的一个或多个基因的RNA表达水平。在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自Ccl2、Ccl4、Cxcl10、Cst7或Tmem119。
另一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于测定来自用TREM2激动剂治疗的阿尔茨海默氏病患者的生物样品，以获得与斑块微环境相关的基因签名的归一化RNA表达评分，其中所述试剂盒包括：
(a)能够与由每个基因表达的转录物特异性结合的一组杂交探针；以及
(b)被设计为定量与每种杂交探针形成的特异性杂交复合物的数量的一组试剂。
在一些实施例中，所述基因签名选自以下各项中的一个或多个：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18。在一些实施例中，所述基因签名进一步包括选自表A中列出的一种或多种生物标志物。
在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。
另一方面，本发明提供了一种用于治疗患有阿尔茨海默氏病的患者的方法，所述方法包括确定来自所述患者的生物样品对于如基因签名生物标志物等生物标志物是阳性还是阴性，并且如果所述生物样品对于所述生物标志物是阳性的，则向所述患者施用TREM2激动剂，并且如果来自所述患者的所述生物样品对于所述生物标志物是阴性的，则向所述患者施用不包含TREM2激动剂的阿尔茨海默氏病治疗，其中如基因签名生物标志物等生物标志物用于包括至少两种临床应答生物标志物的生物标志物，例如基因签名生物标志物，所述临床应答生物标志物选自APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18。在一些实施例中，多基因签名评分，如CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119签名评分，可以用作与其它个体基因生物标志物相同分组中的一个“生物标志物”，以计算更具预测性的基因签名评分。在一些实施例中，所述临床应答生物标志物进一步包括表A中列出的一种或多种生物标志物。
另一方面，本发明提供了一种测试来自患者的生物样品以产生基因签名的签名评分的方法，所述基因签名与对TREM2激动剂的阿尔茨海默氏病应答相关，其中所述方法包括：
(a)测量所述生物样品中所述基因签名中每个基因和归一化基因组中每个基因的原始RNA水平，其中所述基因签名包括选自以下各项的基因：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(b)使用所述归一化基因的测得的RNA水平归一化所述基因签名中每个基因的测得的原始RNA水平；
(c)将每个归一化的RNA值乘以计算出的评分权重集，以产生加权的RNA表达值；以及
(d)将加权的RNA表达值相加以产生所述基因签名评分。
在某些实施例中，所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。在某些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。
在一些实施例中，多基因签名评分，如干扰素签名评分，可以用作与其它个体基因生物标志物相同分组中的一个“生物标志物”，以计算更具预测性的基因签名评分。
在本发明的一些实施例中，测量步骤包括从来自所述患者的所述生物样品中分离RNA，并且将所述样品与一组探针一起温育，所述探针被设计为与所述RNA的基因靶区域特异性杂交。在一些实施例中，来自所述患者的所述第一生物样品和/或来自所述患者的所述第二生物样品在体外或离体进行测定。
在任一前述方法的一些实施例中，所述方法进一步包括测量选自表A中所列的生物标志物中的一种或多种另外的生物标志物的水平，或适合于所述方法的基因表达水平。在任一前述实施例中，在其中测量生物标志物的水平的任何步骤期间，所述步骤任选地进一步包括测量选自表A中所列出的生物标志物中的一种或多种另外的生物标志物。在一些实施例中，所述方法任选地进一步包括测量选自表A中所列出的生物标志物中的两种或更多种另外的生物标志物。在一些实施例中，所述方法任选地进一步包括测量选自表A中所列出生物标志物中的三种或更多种另外的生物标志物。
另一方面，本发明提供了一种在患者中诱导朝向特异性小胶质细胞类型轨迹的小胶质细胞激活的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的TREM2激动剂。在一些实施例中，小胶质细胞激活朝向疾病相关(DAM)小胶质细胞类型轨迹。在一些实施例中，小胶质细胞激活朝向干扰素应答(IFN-R)小胶质细胞类型轨迹。在一些实施例中，小胶质细胞激活朝向循环(Cyc-M)小胶质细胞类型轨迹。在一些实施例中，小胶质细胞激活朝向MHC-II表达性(MHC-II)小胶质细胞类型轨迹。在一些实施例中，所述患者被诊断患有阿尔茨海默氏病。在一些实施例中，TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。
6.5.结合靶标
本发明涉及与TREM2，具体地人TREM2特异性结合的治疗分子的用途。TREM2是在髓系细胞上表达的受体Ig超家族的成员，所述髓系细胞包含巨噬细胞、树突细胞和小胶质细胞(Schmid等人,《神经化学杂志(Journal of Neurochemistry)》,第83卷:1309-1320,2002；Colonna,《自然免疫学综述(Nature Reviews Immunology)》,第3卷:445-453,2003；Kiialainen等人,《疾病的神经生物学(Neurobiology of Disease)》,2005,18:314-322)。TREM2是结合许多内源性底物((包含ApoE、LPS、暴露的磷脂、磷脂酰丝氨酸和淀粉样蛋白β)的免疫受体，并且通过与衔接蛋白DAP12复合的短的胞内结构域发出信号，所述衔接蛋白的胞质结构域包括ITAM基序(Bouchon等人,《实验医学杂志(The Journal of ExperimentalMedicine)》,2001,194:1111-1122)。在TREM2激活后，DAP12中的ITAM基序内的酪氨酸残基被激酶的Src家族磷酸化，所述Src家族通过它们的SH2结构域为酪氨酸激酶ζ链相关蛋白70(ZAP70)和脾酪氨酸激酶(Syk)提供停靠位点(Colonna,《自然免疫学综述》,2003,3:445-453；Ulrich和Holtzman,《ACS化学神经科学(ACS Chem.Neurosci.)》,2016,7:420-427)。ZAP70和Syk激酶诱导几种下游信号传导级联的激活，所述下游信号传导级联包含磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶C(PKC)、胞外调节激酶(ERK)和细胞内钙的升高(Colonna,《自然免疫学综述》,2003,3:445-453；Ulrich和Holtzman,《ACS化学神经科学》,2016,7:420-427)。
TREM2与若干髓样细胞过程相关，所述髓样细胞过程包含吞噬作用、增殖、存活和炎症细胞因子产生的调节(Ulrich和Holtzman,《ACS化学神经科学》,2016,7:420-427)。在过去几年中，TREM2与若干疾病相关。例如，TREM2和DAP12二者的突变与常染色体隐性遗传病Nasu-Hakola病相关，那须-哈科拉病的特征在于骨囊肿、肌肉萎缩和脱髓鞘表型(Guerreiro等人,《新英格兰医学杂志(New England Journal of Medicine)》,2013,368:117-127)。最近，TREM2基因的变异与阿尔茨海默氏病(AD)和其它形式的痴呆症(包含额颞叶痴呆和肌萎缩性侧索硬化症)的风险增加有关(Jonsson等人,《新英格兰医学杂志》,2013,368:107-116；Guerreiro等人,《美国医学会杂志神经学(JAMA Neurology)》,2013,70:78-84；Jay等人,《实验医学杂志》,2015,212:287-295；Cady等人,《美国医学会杂志神经学》2014年4月；71(4):449-53)。具体地，R47H变体已经在全基因组研究中被鉴定为与迟发性AD的风险增加相关，总调整优势率(针对所有年龄的群体)为2.3，仅次于ApoE与阿尔茨海默氏病的强遗传关联性。R47H突变位于TREM2蛋白的胞外Ig V-set结构域上，已经显示出影响凋亡细胞和Aβ的脂质结合和摄取(Wang等人,《细胞(Cell)》,2015,160:1061-1071；Yeh等人,《神经元(Neuron)》,2016,91:328-340)，这暗示与疾病相关的功能丧失。进一步，在存在和不存在R47H突变的AD患者大脑的死后比较支持突变携带者的新的小胶质细胞屏障功能丧失，R47H携带者小胶质细胞推定显示出压缩斑块的能力降低并且限制斑块传播(Yuan等人,《神经元》,2016,90:724-739)。已经在朊病毒病、多发性硬化症和中风的动物模型中报告了小胶质细胞增生的损伤，这表明TREM2可以在支持响应于中枢神经系统的病理或损伤的小胶质细胞增生方面发挥重要作用(Ulrich和Holtzman,《ACS化学神经科学》,2016,7:420-427)。
在人类中,TREM2基因定位于6p21.1染色体处的TREM基因簇内。TREM基因簇编码四种TREM蛋白(TREMl、TREM2、TREM4和TREM5)以及两种TREM样蛋白(TLT-1和TLT-2)。TREM2基因编码230个氨基酸的蛋白质，所述蛋白质由细胞外结构域、跨膜区和短的细胞质尾部组成(Paradowska-Gorycka等人,《人类免疫学(Human Immunology)》,Vol.74:730-737,2013)。细胞外结构域含有单个V型Ig-超家族结构域，具有三个潜在的N-糖基化位点。230个氨基酸的野生型hTREM2氨基酸序列(NCBI参考序列：NP_061838.1)作为SEQ ID NO:1在下文提供。
(SEQ ID NO:1)
野生型人TREM2蛋白(SEQIDNO:1)的氨基酸1至18是信号肽，通常从成熟蛋白中去除。成熟人TREM2蛋白包括SEQIDNO:1的氨基酸19-174处的细胞外结构域、SEQIDNO:1的氨基酸175-195处的跨膜结构域和SEQIDNO:1的氨基酸196-230处的胞质结构域。人TREM2的细胞外结构域(包含信号肽)的氨基酸序列在下文作为SEQIDNO:2提供。
(SEQ ID NO:2)
术语“在骨髓细胞上表达的人触发受体-2”或“人TREM2”可以指SEQ ID NO:1的多肽、SEQ ID NO:2的多肽、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多肽减去信号肽(氨基酸1-18)、人TREM2的等位基因变体或人TREM2的剪接变体。在一些实施例中，术语“人TREM2”包含TREM2的天然存在的变体，如突变R47H、Q33X(X是终止密码子)、Y38C、T66M、D87N、H157Y、R98W和S116C。
因为TREM2的胞质结构域缺乏信号传导能力，所以它必须与其它蛋白质相互作用来转导TREM2激活信号。一种这样的蛋白质是12 kDa的DNAX激活蛋白(DAP 12)。DAP12也被称为杀伤细胞激活受体相关蛋白(KARAP)和酪氨酸激酶结合蛋白(TYROBP)。DAP 12是在其胞质结构域中包括ITAM基序的I型跨膜衔接蛋白。ITAM基序通过激活ZAP70和Syk酪氨酸激酶来介导信号传播，这进而激活几个下游信号级联，包含P13K、PKC、ERK和细胞内钙的升高(Colonna,《自然免疫学综述(Nature Reviews Immunology)》,第3卷:445-453,2003；Ulrich和Holtzman,《ACS化学神经科学(ACS Che Neurosci.)》,第7卷:420-427,2016)。DAP12和TREM2通过其跨膜结构域缔合；TREM2跨膜结构域内带电荷的赖氨酸残基与DAP12的跨膜结构域内带电荷的天冬氨酸残基相互作用。
人类DAP12由定位于染色体19q13.1上的TYROBP基因编码。人蛋白质的长度为113个氨基酸，并且包括前导序列(SEQ ID NO:3的氨基酸1-27)、短的细胞外结构域(SEQ IDNO:3的氨基酸28-41)、跨膜结构域(SEQ ID NO:3的氨基酸42-65)和胞质结构域(SEQ IDNO:3的氨基酸66-113)(Paradowska-Gorycka等人,《人类免疫学》,第74卷:730-737,2013)。DAP12通过短的细胞外结构域中的两个半胱氨酸残基形成同源二聚体。野生型人DAP12氨基酸序列(NCBI参考序列：NP_003323.1)在下文中作为SEQ ID NO:3提供。
(SEQ ID NO:3)
术语“人DAP 12”可以指SEQ ID NO:3的多肽、减去前导肽(氨基酸1-27)的SEQ IDNO:3的多肽、人DAP 12的等位基因变体或人DAP 12的剪接变体。
6.6.本发明的治疗方法
一个方面，本发明提供了一种治疗人患者的由TREM2功能障碍引起的和/或与之相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述患者施用增加TREM2活性的分子。在一些实施例中，所述增加TREM2活性的分子是TREM2激动剂。在一些实施例中，所述TREM2激动剂是抗hTREM2抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，所述TREM2激动剂是小分子。在一些实施例中，所述增加TREM2活性的分子是阻止TREM2降解的分子。在一些实施例中，所述增加TREM2活性的分子是抗hTREM2抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，所述增加TREM2活性的分子是小分子。
在一些实施例中，施用TREM2激动剂激活患者的DAP12信号传导通路，导致小胶质细胞增殖、小胶质细胞存活和/或小胶质细胞吞噬作用的增加。在一些实施例中，施用所述TREM2激动剂导致疾病进展减缓。
在一些实施例中，所述TREM2激动剂激活骨髓细胞中的TREM2/DAP12信号传导，所述骨髓细胞包含单核细胞、树突状细胞、小胶质细胞和/或巨噬细胞。在一些实施例中，所述TREM2激动剂激活、诱导、促进、刺激或增加一种或多种TREM2活性。由激动剂激活或增加的TREM2活性包含但不限于：TREM2与DAP12的结合；DAP12与TREM2结合；TREM2磷酸化、DAP12磷酸化；PI3K激活；可溶性TREM2(sTREM2)水平增加；可溶性CSF1R(sCSF1R)水平增加；选自由IL-12p70、IL-6和IL-10组成的组的一种或多种抗炎介体(例如，细胞因子)的表达增加；选自由以下组成的组的一种或多种促炎介体的表达减少：趋化因子蛋白质家族的IFN-a4、IFN-b、IL-6、IL-12p70、IL-1β、TNF、TNF-α、IL-10、IL-8、CRP、TGF-β成员、IL-20家族成员、IL-33、LIF、IFN-γ、OSM、CNTF、TGF-β、GM-CSF、IL-11、IL-12、IL-17、IL-18和CRP；选自由CCL2、CCL4、CXCL10、CXCL2、CST7组成的组的一种或多种趋化因子的表达增加；TNF-α、IL-6或这两者的表达减少；细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化；C-C趋化因子受体7(CCR7)的表达增加；诱导小胶质细胞向CCL19和CCL21表达细胞的趋化性；骨髓源性树突状细胞诱导抗原特异性T细胞增殖的能力的增加、归一化或这两者；破骨细胞产生的诱导、破骨细胞生成速率的增加或这两者；增加树突状细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、M1巨噬细胞和/或小胶质细胞、激活的M1巨噬细胞和/或小胶质细胞、M2巨噬细胞和/或小胶质细胞、单核细胞、破骨细胞、皮肤朗格汉斯细胞和库普弗细胞中的一种或多种的存活和/或功能；诱导一种或多种类型的清除，所述清除选自由以下组成的组：凋亡神经元清除、神经组织碎片清除、非神经组织碎片清除、细菌或其它异物清除、致病蛋白质清除、致病肽清除和致病核酸清除；诱导凋亡神经元、神经组织碎片、非神经组织碎片、细菌、其它异物、致病蛋白、致病肽或致病核酸中的一种或多种的吞噬作用；被破坏的TREM2/DAP12依赖性基因表达的归一化；Syk、ZAP70或这两者在TREM2/DAP12复合体中的募集；Syk磷酸化；CD83和/或CD86在树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞和/或小胶质细胞上的表达增加；选自由以下组成的组的一种或多种炎性细胞因子的分泌减少：趋化因子蛋白质家族的TNF-α、IL-10、IL-6、MCP-1、IFN-a4、IFN-b、IL-1β、IL-8、CRP、TGF-β成员、IL-20家族成员、IL-33、LIF、IFN-γ、OSM、CNTF、TGF-β、GM-CSF、IL-11、IL-12、IL-17、IL-18和CRP；一种或多种炎性受体的表达减少；在MCSF水平降低的条件下，增加巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞和/或小胶质细胞的吞噬作用；在存在正常水平的MCSF的情况下，降低巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞和/或小胶质细胞的吞噬作用；增加一种或多种TREM2依赖性基因的活性；或者其任何组合。
另一方面，本发明提供了一种用于制造用于治疗由TREM2功能障碍引起的和/或与之相关的疾病或病症的药物的TREM2激动剂。
6.7.疾病和病症
本发明的某些方面提供了一种用于治疗、预防或改善有需要的患者的发展与TREM2缺乏相关的病状的风险的TREM2激动剂。在特定实施例中，所述用途包括向所述患者施用有效量的TREM2激动剂。
根据本发明的方法可以预防、治疗或改善的与TREM2缺乏或TREM2功能丧失相关的病状或病症包含但不限于：那须-哈科拉病、阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆、多发性硬化症、格林-巴利综合征、肌萎缩性侧索硬化症、帕金森氏病、创伤性脑损伤、脊髓损伤、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、朊病毒病、中风、骨质疏松症、骨硬化症和骨质硬化症。在某些实施例中，根据本发明的方法要预防、治疗或改善的病状或病症是阿尔茨海默氏病、那须-哈科拉病、额颞叶痴呆、多发性硬化症、朊病毒病或中风。
在一些实施例中，要治疗、预防或改善的病状是阿尔茨海默氏病。在一些实施例中，将被施用TREM2激动剂抗原结合蛋白的患者是处于患有阿尔茨海默氏病的风险的患者。可以确定需要治疗的患者具有一种或多种与发展可以根据本发明的方法治疗的疾病或病状的风险增加相关的基因型。例如，在一些实施例中，患者具有与发展为阿尔茨海默氏病的风险增加相关的基因型，如本文所描述的基因型。在另外的实施例中，可以确定患者携带编码与发展阿尔茨海默氏病的风险增加相关的TREM2变体的等位基因。例如，在一个实施例中，已确定患者在TREM2基因中具有至少一个含有rs75932628-T突变的等位基因，例如患者在rs75932628处具有CT基因型。在相关的实施例中，患有阿尔茨海默氏病或处于患阿尔茨海默氏病风险的患者是已被确定携带TREM2变体等位基因的患者，所述等位基因编码代替SEQ ID NO:1中位置47处的精氨酸的组氨酸(R47H TREM2变体)。在其它实施例中，已确定患者在TREM2基因中具有至少一个含有rsl43332484-T突变的等位基因，例如患者在rsl43332484处具有CT基因型。在相关的实施例中，患有阿尔茨海默氏病或处于患阿尔茨海默氏病风险的患者是已被确定携带TREM2变体等位基因的患者，所述等位基因编码代替SEQID NO:1中位置62处的精氨酸的组氨酸(R62H TREM2变体)。在一些实施例中，已确定处于患阿尔茨海默氏病的风险的患者在TREM1基因中具有至少一个含有rs6910730-G突变的等位基因，在TREM2基因上游具有至少一个含有rs7759295-C突变的等位基因，和/或APOE基因的至少一个ε4等位基因。
在另一个实施例中，本发明提供了一种预防、治疗或改善有需要的患者的额颞叶痴呆或那须-哈科拉病的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的本文所描述的TREM2激动剂抗原结合蛋白。在一些实施例中，将被施用TREM2激动剂抗原结合蛋白的患者是处于患有额颞叶痴呆或那须-哈科拉病的风险的患者。例如，在一个此类实施例中，已确定患者在TREM2基因中具有至少一个含有rsl04894002-A突变的等位基因，例如患者在rs104894002处具有GA或AA基因型。在相关实施例中，处于患额颞叶痴呆或那须-哈科拉病的风险的患者是已被确定携带TREM2变体等位基因的患者，所述等位基因编码截短的TREM2蛋白，是由于SEQ ID NO:1中位置33处的终止密码子取代了谷氨酰胺的结果。在另一个实施例中，已确定患者在TREM2基因中具有至少一个含有rs201258663-A突变的等位基因，例如患者在rs201258663处具有GA或AA基因型。在相关的实施例中，处于患额颞叶痴呆或那须-哈科拉病的风险的患者是已被确定是具有任何TREM2变体等位基因的患者，所述等位基因编码代替SEQ ID NO:1中位置66处的苏氨酸的甲硫氨酸。在一些实施例中，处于患额颞叶痴呆或那须-哈科拉病的风险的患者是已被确定是携带任何TREM2变体等位基因的患者，所述等位基因编码代替SEQ ID NO:1中位置38处的酪氨酸的半胱氨酸。
在又另一个实施例中，本发明提供了一种用于预防、治疗或改善有需要的患者的多发性硬化症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的本文所描述的TREM2激动剂。在一些实施例中，要施用TREM2激动剂的患者是处于发展多发性硬化症风险的患者。
本发明还包含增加有需要的患者的骨髓细胞(例如，巨噬细胞、小胶质细胞和树突状细胞)存活率或增殖的方法。在一些实施例中，本文所描述的TREM2激动剂可以用于激活骨髓细胞中的TREM2/DAP12信号传导，由此调节这些细胞的生物活性。此类生物活性包含细胞因子释放、吞噬作用和小胶质细胞增生。
本文所描述的TREM2激动剂可以用于制造用于治疗或预防与本文所描述的TREM2缺乏或TREM2生物活性丧失相关的病状的药物组合物或药物，所述病状尤其包含阿尔茨海默氏病、那须-哈科拉病、额颞叶痴呆、多发性硬化症、朊病毒病或中风。因此，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本文所描述的TREM2激动剂抗原结合蛋白以及药学上可接受的赋形剂。
在一个实施例中，本发明提供了一种预防、治疗或改善有需要的患者的阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的本文所描述的TREM2激动剂抗原结合蛋白。在某些实施例中，向患者施用的TREM2激动剂是抗hTREM2单克隆抗体，如其CDR序列、可变区序列以及重链和轻链序列在表2A-2B和3中示出的抗体。
6.8.目标激动剂
本发明提供了治疗、预防或改善有需要的患者的患有与TREM2缺乏相关的病状的风险的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的与hTREM2特异性结合的分子，所述分子增加hTREM2的活性。在一些实施例中，所述分子是TREM2激动剂。在一些实施例中，所述TREM2激动剂是小分子。在一些实施例中，所述TREM2激动剂是抗体或其抗原结合片段。
TREM2激动剂例如以小于50 nM、小于25 nM、小于10 nM或小于5nM的平衡解离常数(KD)与人TREM2(SEQ ID NO:1)或人TREM2的细胞外结构域(ECD)(例如，SEQ ID NO:2中示出的ECD)特异性结合。
6.8.1.抗hTREM2抗体
抗体
一方面，本发明涉及施用抗hTREM2抗体或其抗原结合片段。虽然在完整抗体的上下文中提供了某些实施例，但是经考虑衍生自所述抗体的抗原结合片段的分子可以维持结合特异性，并且也可以用于本发明。
在一些实施例中，所述抗hTREM2抗体是hTREM2的激动剂。在一些实施例中，所述抗hTREM2抗体不与其它TREM蛋白，例如人TREM1(hTREM1)交叉反应。在一些实施例中，所述抗hTREM2抗体不与hTREM1或其同种型或截短物结合。前体hTREM1同种型1的氨基酸序列(NCBI参考序列：NP_061113.1)在下文作为SEQIDNO:4提供。
(SEQ ID NO:4)
在一些实施例中，抗hTREM2抗体与人TREM2 hTREM2残基19-174特异性结合。在一些实施例中，抗hTREM2抗体与人hTREM2的IgV区，例如人TREM2残基19-140特异性结合。
在某些实施例中，本公开的抗hTREM2抗体与hTREM 2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基29-112内的一个或多个氨基酸，或TREM2蛋白上的对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基29-112的氨基酸残基内的一个或多个氨基酸结合。在一些实施例中，本公开的抗hTREM2抗体与hTREM 2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基29-41内的一个或多个氨基酸，或TREM2蛋白上的对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基29-41的氨基酸残基内的一个或多个氨基酸结合。在一些实施例中，本公开的抗hTREM2抗体与hTREM 2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基47-69内的一个或多个氨基酸，或TREM2蛋白上的对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基47-69的氨基酸残基内的一个或多个氨基酸结合。在一些实施例中，本公开的抗hTREM2抗体与hTREM 2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基76-86内的一个或多个氨基酸，或TREM2蛋白上的对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基76-86的氨基酸残基内的一个或多个氨基酸结合。在一些实施例中，本公开的抗hTREM2抗体与hTREM2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基91-100内的一个或多个氨基酸，或TREM2蛋白上的对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基91-100的氨基酸残基内的一个或多个氨基酸结合。在一些实施例中，本公开的抗hTREM2抗体与hTREM 2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基99-115内的一个或多个氨基酸，或TREM2蛋白上的对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基99-115的氨基酸残基内的一个或多个氨基酸结合。在一些实施例中，本公开的抗hTREM2抗体与hTREM2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基104-112内的一个或多个氨基酸，或TREM2蛋白上的对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基104-112的氨基酸残基内的一个或多个氨基酸结合。在一些实施例中，本公开的抗hTREM2抗体与hTREM 2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基114-118内的一个或多个氨基酸，或TREM2蛋白上的对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基114-118的氨基酸残基内的一个或多个氨基酸结合。在一些实施例中，本公开的抗hTREM2抗体与hTREM 2(SEQ IDNO:1)的氨基酸残基130-171内的一个或多个氨基酸，或TREM2蛋白上的对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基130-171的氨基酸残基内的一个或多个氨基酸结合。在一些实施例中，本公开的抗hTREM2抗体与hTREM 2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基139-153内的一个或多个氨基酸，或TREM2蛋白上的对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基139-153的氨基酸残基内的一个或多个氨基酸结合。在一些实施例中，本公开的抗hTREM2抗体与hTREM 2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基139-146内的一个或多个氨基酸，或TREM2蛋白上的对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基139-146的氨基酸残基内的一个或多个氨基酸结合。在一些实施例中，本公开的抗hTREM2抗体与hTREM 2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基130-144内的一个或多个氨基酸，或TREM2蛋白上的对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基130-144的氨基酸残基内的一个或多个氨基酸结合。在一些实施例中，本公开的抗hTREM2抗体与hTREM 2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基158-171内的一个或多个氨基酸，或TREM2蛋白上的对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基158-171的氨基酸残基内的一个或多个氨基酸结合。
在一些实施例中，本公开的抗hTREM2抗体与hTREM 2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基43-50内的一个或多个氨基酸，或TREM2蛋白上的对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基43-50的氨基酸残基内的一个或多个氨基酸结合。在一些实施例中，本公开的抗hTREM2抗体与hTREM2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基49-57内的一个或多个氨基酸，或TREM2蛋白上的对应于SEQID NO:1的氨基酸残基49-57的氨基酸残基内的一个或多个氨基酸结合。在一些实施例中，本公开的抗hTREM2抗体与hTREM 2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基139-146内的一个或多个氨基酸，或TREM2蛋白上的对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基139-146的氨基酸残基内的一个或多个氨基酸结合。在一些实施例中，本公开的抗hTREM2抗体与hTREM 2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基140-153内的一个或多个氨基酸，或TREM2蛋白上的对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基140-153的氨基酸残基内的一个或多个氨基酸结合。在一些实施例中，抗hTREM2抗体与人TREM2的茎区，例如人TREM2的氨基酸残基145-174特异性结合。
在一些实施例中，抗hTREM2抗体或其抗原结合片段特异性地防止hTREM2的降解或切割。
如本文所用，术语“抗体”(Ab)是指与特定抗原(例如，hTREM2)特异性结合的免疫球蛋白分子。在一些实施例中，抗hTREM2抗体适于施用于人。
在一些实施例中，抗hTREM2抗体是多克隆抗体。在一些实施例中，抗hTREM2抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，抗hTREM2抗体是嵌合抗体。在一些实施例中，抗hTREM2抗体是人源化抗体。在一些实施例中，抗hTREM2抗体是人抗体，具体地完全人抗体。在一些实施例中，抗hTREM2抗体是双特异性或其它多价抗体。在一些实施例中，抗体是单链抗体。
在一些实施例中，抗体包括抗体的恒定区的全部或一部分。在一些实施例中，恒定区选自同种型，所述同种型选自：IgA(例如，IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或IgM。在具体实施例中，本文所描述的抗hTREM2抗体包括IgG1。在一些实施例中，IgG1的恒定区包括选自R292C、N297G、V302C、D356E或L358M(根据EU编号)的取代。在其它实施例中，抗hTREM2抗体包括IgG2。在其它实施例中，抗hTREM2抗体包括IgG4。如本文所用，抗体的“恒定区”包含天然恒定区，或其任何同种异型或天然变体。
抗hTREM2抗体的轻恒定区可以包括λ(λ)轻区或κ(κ)轻区。λ轻区可以是任何一种已知的亚型，例如λ1、λ2、λ3或λ4。
如本文所用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体通过本领域的任何可获得或已知的方式源自单个克隆，包含任何真核、原核或噬菌体克隆。可以使用本领域已知的各种技术来制备可用于本公开的单克隆抗体，包含使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指具有可变序列的抗体，所述可变序列源自一个物种的免疫球蛋白，如大鼠或小鼠抗体，以及另一物种的免疫球蛋白恒定区，如人免疫球蛋白模板。嵌合抗体的其它实例包含具有鼠免疫球蛋白恒定区的人源性免疫球蛋白可变区。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式基本上包括非人免疫球蛋白的所有CDR区和可变区以及人免疫球蛋白序列的所有或基本上所有FR区。人源化抗体还可以包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。
“人抗体”包含具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体。人抗体可以来自一种或多种人免疫球蛋白转基因的动物。例如，转基因动物可能缺乏一种或多种免疫球蛋白的内源性产生，如并且被工程化以在免疫后产生具有全人蛋白质序列的抗体。人抗体还可以通过本领域已知的多种方法制备，包含从人免疫球蛋白文库中分离，或使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。
本公开的抗hTREM2抗体包含全长(完整的)抗体分子或其部分。抗hTREM2抗体可以是其序列已经被修饰以改变至少一种恒定区介导的生物效应子功能(例如，提高或降低与一种或多种Fc受体(FcγR)，如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和/或FcγRIIIB的结合)的抗体。
对hTREM2具有高亲和力的抗hTREM2抗体可能是治疗和诊断用途所期望的。因此，本公开考虑了对hTREM2具有高结合亲和力的抗体。在具体实施例中，抗hTREM2抗体以至少约100nM的亲和力与hTREM2结合，但可表现出更高的亲和力，例如，至少约90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM或甚至更高。在一些实施例中，抗体以在约1pM至约10nM、约100pM至约10nM、约100pM至约1nM的范围内的亲和力或范围在任何前述值之间的亲和力与hTREM2结合。
抗hTREM2抗体对hTREM2的亲和力可以使用本领域公知的或本文所描述的技术来确定，例如但不限于ELISA、等温滴定量热法、表面等离子共振、生物层干涉测量术、滤膜结合或荧光偏振。
本公开的抗hTREM2抗体在轻链可变结构域和重链可变结构域两者中都包括互补决定区(CDR)。抗hTREM2抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3，所述重链可变区包括本文所描述的互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3。
在一些实施例中，TREM2激动剂抗原结合蛋白包括CDRL1或其具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的变体；CDRL2或其具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的变体；CDRL3或其具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的变体；CDRH1或其具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的变体；CDRH2或其具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的变体；以及CDRH3或其具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的变体，其中CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列以及示例性轻链和可变区在下表1A和1B中提供。
表1A：示例性抗hTREM2抗体轻链可变区
表1B：示例性抗hTREM2抗体重链可变区
如上所述，抗hTREM2抗体可以包括表1A中呈现的CDR(轻链CDR；即CDRL)和表1B中呈现的CDR(重链CDR，即CDRH)。
在一些实施例中，抗hTREM2抗体包括轻链，所述轻链包括具有根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDRL1、具有根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDRL2、具有根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDRL3或含有一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或更多个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、对SEQ ID NO:6-8中任一个的不超过五个、四个、三个、两个或一个氨基酸的缺失或插入的任何CDRL1、CDRL2或CDRL3氨基酸序列。此类取代、缺失和插入将保留显著的抗hTREM2结合活性。在这些和其它实施例中，抗hTREM2抗体包括具有根据SEQID NO:10的氨基酸序列的CDRH1、具有根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDRH2、具有根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDRH3或具有含有一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或更多个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、对SEQ ID NO:10-12中任一个的不超过五个、四个、三个、两个或一个氨基酸的缺失或插入的氨基酸序列的任何CDRH1、CDRH2或CDRH3。此类取代、缺失和插入将保留显著的抗hTREM2结合活性。
在一些实施例中，抗hTREM2抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括具有根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDRL1；具有根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDRL2；以及具有根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDRL3，所述重链可变区包括具有根据SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDRH1；具有根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDRH2；以及具有根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDRH3。
在一些实施例中，抗hTREM2抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有根据SEQID NO:5的氨基酸序列，或含有一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或更多个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、对SEQ ID NO:5的不超过五个、四个、三个、两个或一个氨基酸的缺失或插入的任何氨基酸序列。此类取代、缺失和插入将保留显著的抗hTREM2结合活性。在一些实施例中，抗hTREM2抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，或含有一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或更多个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、对SEQ ID NO:9的不超过五个、四个、三个、两个或一个氨基酸的缺失或插入的任何氨基酸序列。此类取代、缺失和插入将保留显著的抗hTREM2结合活性。
在具体实施例中，抗hTREM2抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列，所述重链可变区具有根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗hTREM2抗体包括选自表2的重链氨基酸序列和/或轻链氨基酸序列。
表2：示例性抗hTREM2抗体重链和轻链
在一些实施例中，抗hTREM2抗体包括轻链，所述轻链具有根据SEQ ID NO:13-15中任一个的氨基酸序列，或含有一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或更多个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、对SEQ ID NO:13-15中任一个的不超过五个、四个、三个、两个或一个氨基酸的缺失或插入的任何氨基酸序列。此类取代、缺失和插入将保留显著的抗hTREM2结合活性。在这些和其它实施例中，抗hTREM2抗体包括重链，所述重链具有根据SEQID NO:16-18中任一个的氨基酸序列，或含有一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或更多个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、对SEQ ID NO:16-18中任一个的不超过五个、四个、三个、两个或一个氨基酸的缺失或插入的任何氨基酸序列。此类取代、缺失和插入将保留显著的抗hTREM2结合活性。
在一些实施例中，抗hTREM2抗体包括轻链和/或重链可变区，所述轻链具有根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列，所述重链可变区具有根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在其它实施例中，抗hTREM2抗体包括轻链和/或重链可变区，所述轻链具有根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列，所述重链可变区具有根据SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在其它实施例中，抗hTREM2抗体包括轻链和/或重链可变区，所述轻链具有根据SEQ ID NO:15的氨基酸序列，所述重链可变区具有根据SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗TREM2抗体是hT2AB，其是hTREM2激动剂，所述激动剂包括轻链和重链可变区，所述轻链具有根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列，所述重链可变区具有根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在某些实施例中，抗TREM2抗体是具有N末端前导序列的hT2AB，其是包括轻链和重链可变区，所述轻链具有根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列，所述重链可变区具有根据SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在某些实施例中，抗TREM2抗体是mT2AB，其是hT2AB可变区与鼠κ恒定区和IgG1恒定区的嵌合体，包括轻链和重链，所述轻链具有根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其无效应子变体，所述重链具有根据SEQ ID NO:17的氨基酸序列或其无效应子变体。
多核苷酸
另一方面，本公开提供了编码本文所描述的抗体或抗原结合区的多核苷酸。具体地，多核苷酸是分离的多核苷酸。多核苷酸可以与一种或多种控制基因表达的异源控制序列可操作地连接，以产生能够表达所关注的多肽的重组多核苷酸。可以将含有编码相关多肽或蛋白质的异源多核苷酸的表达构建体引入合适的宿主细胞以表达对应的多肽。
如本领域技术人员所理解的，由于遗传密码的简并性，其中相同的氨基酸由替代或同义密码子编码，可产生极大量的核酸，所有这些核酸都编码本文所描述的抗原结合蛋白的CDR、可变区、重链和轻链或其它组分。因此，鉴定了特定的氨基酸序列，本领域的技术人员可通过以不改变编码蛋白质的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来产生任何数量的不同核酸。在这方面，本公开包含编码本文公开的多肽的多核苷酸的每一种可能的变异。
在从天然存在的来源分离的核酸的情况下，“分离的核酸”在本文中可与“分离的多核苷酸”互换使用，是指从分离核酸的生物体基因组中存在的相邻遗传序列中分离的核酸。在从模板酶促合成或化学合成核酸的情况下，例如PCR产物、cDNA分子或寡核苷酸，应当理解从此类过程产生的核酸是分离的核酸。分离的核酸分子是指呈分离片段形式或作为更大核酸构建体的组分的核酸分子。在一个优选的实施例中，核酸基本上不含污染的内源性物质。
在一些实施例中，多核苷酸编码本文所描述的轻链可变区的CDR L1、CDR L2和CDRL3。在一些实施例中，多核苷酸编码本文所描述的重链可变区的CDR H1、CDR H2和CDR H3。
在一些实施例中，多核苷酸编码本文所描述的轻链可变区的CDR L1、CDR L2和CDRL3以及重链可变区的CDR H1、CDR H2和CDR H3。
在一些实施例中，多核苷酸编码与本文公开的可变轻链的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的轻链可变区VL。
在一些实施例中，多核苷酸编码与本文公开的可变重链的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的重链可变区VH。
在一些实施例中，可以以多种方式操作本文的多核苷酸，以提供编码多肽的表达。在一些实施例中，多核苷酸与控制序列可操作地连接，其中包含转录启动子、前导序列、转录增强子、核糖体结合或进入位点、终止序列和用于表达多核苷酸和/或对应的多肽的聚腺苷酸化序列。取决于表达载体，在将分离的多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是期望的或必要的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸和核酸序列的技术是本领域众所周知的。以下提供了指导：Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,第3版,冷泉港实验室出版社(2001)；和《当代分子生物学实验指南》,Ausubel.F.编辑,格林出版协会(Greene Pub.Associates)(1998),更新到2013。
在一些实施例中，抗原结合蛋白的变体(包含本文所描述的变体)可以通过使用盒或PCR诱变或本领域熟知的其它技术对编码多肽的DNA中的核苷酸进行定点诱变来制备，以产生编码所述变体的DNA，此后如本文所概述的在细胞培养物中表达重组DNA。然而，可以通过使用已建立的技术通过体外合成来制备包括具有多达约100-150个残基的变体CDR的抗原结合蛋白。变体通常表现出与天然存在的类似物相同的定性生物活性，例如与抗原结合。此类变体包含例如抗原结合蛋白的氨基酸序列中残基的缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，其限制条件为最终构建体具有所期望的特性。氨基酸变化也可改变抗原结合蛋白的翻译后过程，如改变糖基化位点的数量或位置。在一些实施例中，制备抗原结合蛋白变体的目的是为了修饰那些直接参与表位结合的氨基酸残基。在其它实施例中，出于本文讨论的目的，不直接参与表位结合的残基或不以任何方式参与表位结合的残基的修饰是期望的。预期在任何CDR区、框架区和/或恒定区内进行诱变。熟练技术人员可使用协方差分析技术来设计抗原结合蛋白氨基酸序列的有用修饰。参见例如，Choulier等人,《蛋白质(Proteins)》41:475-484,2000；Demarest等人,《分子生物学杂志》,2004,335:41-48；Hugo等人,《蛋白质工程化(Protein Engineering)》,2003,16(5):381-86；Aurora等人,美国专利公开第2008/0318207A1号；Glaser等人,美国专利公开第2009/0048122A1号；Urech等人,WO 2008/110348 A1；Borras等人,WO 2009/000099A2。通过协方差分析确定的此类修饰可改善抗原结合蛋白的效力、药代动力学、药效学和/或可制造性特征。
另一方面，本发明还提供了载体，所述载体包括编码本文所描述抗原结合蛋白的一种或多种组分(例如，可变区、轻链和重链)的一种或多种核酸或多核苷酸。如本文所用，术语“载体”是指用于将将蛋白质编码信息转移到宿主细胞中的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。载体的实例包含但不限于质粒、病毒载体、非游离型哺乳动物载体和表达载体，例如重组表达载体。如本文所用，术语“表达载体”或“表达构建体”是指含有期望的编码序列和在特定宿主细胞中表达可操作地连接的编码序列所需的适当核酸对照序列的重组DNA分子。表达载体可以包含但不限于影响或控制转录、翻译，并且如果存在内含子，影响与其可操作地连接的编码区的RNA剪接的序列。在原核生物中进行表达所需的核酸序列包含启动子、任选地操纵基因序列、核糖体结合位点和可能地其它序列。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止信号和聚腺苷酸化信号。如果需要，分泌信号肽序列也可任选地由表达载体编码，与感兴趣的编码序列可操作地连接，使得所表达的多肽可由重组宿主细胞分泌，以便更容易地从细胞中分离感兴趣的多肽。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可以方便地进行重组DNA程序并且可以引起多核苷酸序列的表达。载体的选择通常将取决于载体与要引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。示例性表达载体其中包含基于T7或T7lac启动子的载体(pACY：Novagen；pET)；基于杆状病毒(Baculovirus)启动子的载体(例如，pBAC)；基于Ef1-α和HTLV启动子的载体(例如，pFUSE2；美国加利福尼亚州的英杰公司(Invitrogen,CA,USA))；基于CMV增强子和人铁蛋白轻链基因启动子的载体(例如，pFUSE：美国加利福尼亚州的英杰公司)；基于CMV启动子的载体(例如，pFLAG：美国的西格玛公司(Sigma,USA))；以及基于二氢叶酸还原酶启动子的载体(例如，pEASE：美国的安进公司(Amgen,USA))。各种载体可以用于所关注的多肽的瞬时表达或稳定表达。
宿主细胞
另一方面，编码本文所描述抗原结合蛋白的多核苷酸(例如，可变区、轻链和重链)与一个或多个控制序列可操作地连接，用于多肽在宿主细胞中的表达。因此，在另外的方面，本公开提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括编码本文所描述TREM2激动剂抗原结合蛋白的组分的一种或多种表达载体。
示例性宿主细胞包含原核生物、酵母或高等真核生物细胞。原核宿主细胞包含真细菌，如革兰氏阴性(Gram-negative)或革兰氏阳性(Gram-positive)生物体，例如肠内菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)；和志贺杆菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌属(Pseudomonas)；以及链霉菌属(Streptomyces)。真核微生物如丝状真菌或酵母是重组多肽的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其它属、物种和菌株通常可获得并可用于本文，如毕赤酵母属(Pichia)，例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，子囊菌酵母属(Yarrowia)；念珠菌属(Candida)；里氏木霉(Trichodermareesia)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌，如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属宿主(如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger))。
用于表达糖基化抗原结合蛋白的宿主细胞可以源自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包含植物和昆虫细胞。已鉴定多种杆状病毒株和变体以及对应的许可性昆虫宿主细胞，所述许可性昆虫宿主细胞来自于如以下等宿主：草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及斑蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。用于转染此类细胞的多种病毒株是公开可得的，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株。
脊椎动物宿主细胞也是合适的宿主，并且从此类细胞重组生产抗原结合蛋白已经成为常规程序。可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域熟知的，包含但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包含CHOK1细胞(ATCC CCL61)、DXB-11、DG-44和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,《美国国家科学院院刊》,1980,77:4216)；由SV40(COS-7、ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(针对悬浮培养物中的生长亚克隆的293或293细胞，Graham等人,《普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)》36:59,1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK、ATCC CCL 10)；小鼠支持细胞(TM4，Mather,《生殖生物学(Biol.Reprod.)》,1980,23:243-251)；猴肾细胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCCCCL51)；TRI细胞(Mather等人,《纽约科学院年报(Annals N.Y Acad.Sci.)》,1982,383:44-68)；MRC 5细胞或FS4细胞；哺乳动物骨髓瘤细胞和许多其它细胞系。在某些实施例中，可以通过确定哪些细胞系具有高表达水平并且组成型产生具有人TREM2结合特性的抗原结合蛋白来选择细胞系。在另一个实施例中，可选择来自B细胞谱系的细胞系，所述细胞系不产生自身抗体，但具有产生和分泌异源抗体的能力。在一些实施例中，CHO细胞是用于表达本发明TREM2激动剂抗原结合蛋白的优选宿主细胞。
在各个实施例中，用本公开的多核苷酸(如用于表达抗原结合蛋白的表达载体)引入和转化宿主细胞是通过如下方法来完成的，所述方法包含转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其它已知技术。在一些实施例中，所选择的方法可以由所用宿主细胞的类型来指导。合适的方法描述于例如Sambrook等人,2001。
表达和分离
在一些实施例中，将包括编码本文所描述的抗原结合蛋白的一种或多种组分(例如，可变区、轻链和重链)的多核苷酸的宿主细胞用于表达所关注抗原结合蛋白。在一些实施例中，用于表达抗原结合蛋白的方法包括在适于表达所关注蛋白质的合适培养基和条件下培养宿主细胞。
所选择的培养基类型和培养条件是基于宿主细胞的类型。在一些实施例中，用于哺乳动物宿主细胞的示例性培养基包含例如但不限于汉氏(Ham's)F10(西格玛公司)、最小必需培养基(MEM，西格玛公司)、RPMI-1640(西格玛公司)和杜尔贝克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium(DMEM)，西格玛公司)。在一些实施例中，培养基可以视需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙盐、镁盐和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素TM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。在一些实施例中，培养条件，如温度、pH、％CO2等，可以使用技术人员可用和已知的条件。
在一些实施例中，从宿主细胞中分离和/或纯化所表达的抗原结合蛋白。在所表达的蛋白质存在于培养基中的一些实施例中，含有所表达的蛋白质的培养基经受分离程序。在抗原结合蛋白在细胞内产生的一些实施例中，对细胞进行破碎，并且作为第一步骤，例如通过离心或超滤去除颗粒碎片，无论是宿主细胞还是裂解的片段。随后，可通过各种已知技术分离和进一步纯化抗原结合蛋白。此类分离技术包含用蛋白-A琼脂糖凝胶的亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、高效液相色谱法、差别溶解度等(参见例如，Fisher,《生物化学与分子生物学实验室技术(Laboratory Techniques,In Biochemistry AndMolecular Biology)》,Work和Burdon,编辑,爱思唯尔出版公司(Elsevier)(1980)；《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》,Greenfield,E.A.,编辑,纽约冷泉港实验室出版社(2012)；Coligan等人,同上,第2.7.1-2.7.12章节和第2.9.1-2.9.3章节；Barnes等人,免疫球蛋白G(IgG)的纯化(Purification of Immunoglobulin G(IgG)),《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》,第10卷,第79-104页,哈门那出版社(Humana Press)(1992))。
在一些实施例中，分离的抗体可进一步纯化，如可以通过以下方法测量的：(1)使用Lowry方法确定的蛋白质重量；(2)达到足以通过使用旋转杯测序仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选地银染达到同质性。如通过前述方法确定的，纯化的抗体可以是按重量计85％或更多、90％或更多、95％或更多或至少99％的。
抗体调配物
在某些实施例中，本发明提供了一种组合物(例如，药物组合物)，所述组合物包括一种或多种本文所公开的TREM2激活抗体和TREM2激动剂抗体和抗原结合蛋白，以及药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。本发明的药物组合物包含但不限于液体、冷冻和冻干组合物。“药学上可接受的”是指在所用的剂量和浓度下对人类接受者无毒和/或当施用于人类时不产生过敏或不良反应的分子、化合物和组合物。在一些实施例中，药物组合物可以含有用于修改、维持或保持例如组合物的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附性或渗透性的调配物材料。在此类实施例中，合适的调配物材料包含但不限于：氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；膨胀剂(如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；复合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖、二糖和其它碳水化合物(如蔗糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂；调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(如普郎尼克(pluronics)、PEG、脱水山梨醇酯、如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80等聚山梨醇酯、Triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇或泰洛沙泊(tyloxapal))；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物，优选地氯化钠或氯化钾、甘露醇、山梨醇)；递送媒剂；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。用于调配用于治疗用途的分子的方法和合适的材料在制药领域中是已知的，并且在例如《雷明顿氏药学全书(Remington's PharmaceuticalSciences)》,第18版,(A.R.Genrmo编辑),1990,麦克出版公司(Mack Publishing Company)中有所描述。
在一些实施例中，本发明的药物组合物包括标准药物载体，如无菌磷酸盐缓冲盐水溶液、抑菌水等。可以使用各种水性载体，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等，并且可以包含用于增强稳定性的其它蛋白质，如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等，经受温和的化学修饰等。
调配物中抗原结合蛋白的示例性浓度范围可以是约0.1mg/ml至约200mg/ml、或约0.1mg/mL至约50mg/mL、或约0.5mg/mL至约25mg/mL，或可替代地约2mg/mL至约10mg/mL。抗原结合蛋白的水性调配物可以在pH缓冲溶液中制备，例如，pH范围为约4.5至约6.5、或约4.8至约5.5或可替代地为约5.0。适于此范围内的pH的缓冲剂实例包含乙酸盐(例如，乙酸钠)、琥珀酸盐(如琥珀酸钠)、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其它有机酸缓冲剂。缓冲剂浓度可以是约1mM至约200mM、或约10mM至约60mM，这取决于例如缓冲剂和制剂所需的等渗性。
调配物中可以包含也可以稳定抗原结合蛋白的张力剂。示例性张力剂包含多元醇，如甘露醇、蔗糖或海藻糖。优选地，水性调配物是等渗的，尽管高渗或低渗溶液可能是合适的。调配物中多元醇的示例性浓度的范围可以是约1％至约15％w/v。
还可以向抗原结合蛋白调配物中添加表面活性剂，以减少所调配的抗原结合蛋白的聚集和/或使调配物中颗粒的形成最小化和/或减少吸附。示例性的表面活性剂包含非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)或泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)。表面活性剂的示例性浓度的范围可以是约0.001％至约0.5％、或约0.005％至约0.2％、或可替代地约0.004％至约0.01％w/v。
在一个实施例中，所述调配物含有上文鉴定的药剂(即，抗原结合蛋白、缓冲剂、多元醇和表面活性剂)，并且基本上不含一种或多种防腐剂，如苯甲醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇和苄索氯铵。在另一个实施例中，调配物中可以包含防腐剂，例如浓度范围为约0.1％至约2％、或可替代地约0.5％至约1％。一种或多种其它药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(如在《雷明顿氏药物科学(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES)》,第18版,(A.R.Genrmo编辑),1990,麦克出版公司中所描述的那些)可以包含在调配物中，条件是它们不会对调配物的所需特性产生不利影响。
通过将具有所需程度的纯度的抗原结合蛋白与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，制备抗原结合蛋白的治疗调配物用于储存(《雷明顿氏药物科学》,第18版,(A.R.Genrmo编辑),1990,麦克出版公司)，所述治疗调配物呈冻干制剂或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包含缓冲剂(例如，磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸)；抗氧化剂(例如，抗坏血酸和蛋氨酸)；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯己双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、儿茶酚；间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚)；低分子量(例如，少于约10个残基)多肽；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水性聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(例如，甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸)；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖、麦芽糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)或泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；或聚乙二醇(PEG)。
在一个实施例中，所要求保护的发明的合适调配物含有等渗缓冲剂，如磷酸盐、乙酸盐或TRIS缓冲剂，以及张力剂，如多元醇、山梨醇、蔗糖或氯化钠，它们具有张力和稳定性。此类张力剂的一个实例是5％山梨醇或蔗糖。另外，所述调配物可以任选地包含例如0.01％至0.02％wt/vol的表面活性剂，以防止聚集或提高稳定性。所述调配物的pH值可以在4.5至6.5、或4.5至5.5的范围内。用于抗原结合蛋白的药物调配物的其它示例性描述可以在美国专利公开号2003/0113316和美国专利第6,171,586号中找到，所述文献中的每一篇特此通过引用整体并入。
也考虑了抗原结合蛋白的悬浮液和晶体形式。制备悬浮液和晶体形式的方法是本领域技术人员已知的。
用于体内施用的调配物必须是无菌的。本发明的组合物可以通过常规的、熟知的灭菌技术灭菌。例如，通过无菌过滤膜的过滤很容易完成灭菌。所得溶液可以包装进行使用或在无菌条件下过滤并冻干，冻干制剂在施用前与无菌溶液组合。
冷冻干燥过程通常用于稳定多肽供长期存储，特别是当多肽在液体组合物中相对不稳定时。冻干循环通常由三个步骤构成：冷冻、初级干燥和二级干燥(参见Williams和Polli,《肠胃外科学与技术杂志(Journal of Parenteral Science and Technology)》,1984,38(2):48-59)。在冷冻步骤中，溶液被冷却直到充分冷冻。溶液中的大量水在这个阶段形成冰。冰在初级干燥阶段升华，这是通过使用真空将室压降低到冰的蒸汽压以下来进行的。最后，在降低的室压和升高的搁板温度下，在二级干燥阶段除去吸附或结合的水。所述过程产生了一种叫做冻干饼的物质。此后，所述饼可在使用前重构。
冻干材料的标准重构实践是加回一定体积的纯水(通常相当于冻干期间除去的体积)，尽管在生产肠胃外施用的药物中有时使用抗菌剂的稀释溶液(参见Chen,《药物开发与工业制药学(Drug Development and Industrial Pharmacy)》,第18卷:1311-1354,1992)。
已注意到赋形剂在一些情况下充当冻干产品的稳定剂(参见Carpenter等人,第74卷:225-239,1991)。例如，已知的赋形剂包含多元醇(包含甘露醇、山梨醇和甘油)；糖类(包含葡萄糖和蔗糖)；以及氨基酸(包含丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。
此外，多元醇和糖也经常用于保护多肽免受冷冻和干燥引起的损伤，并增强在干燥状态下储存期间的稳定性。一般而言，糖(特别是二糖)在冷冻干燥过程和存储期间都是有效的。其它种类的分子(包含单糖和二糖以及聚合物如PVP)也被报道作为冻干产品的稳定剂。
对于注射，药物调配物和/或药物可以是适于用适合的如上文所描述的溶液复原的粉末。这些粉末的实例包含但不限于冷冻干燥的粉末、旋转干燥的粉末或喷雾干燥的粉末、非晶形粉末、颗粒、沉淀物或微粒。对于注射，调配物可以任选地含有稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物可用性调节剂和这些的组合。
可以制备持续释放制剂。持续释放制备物的合适实例包含含有抗原结合蛋白的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质为成型制品的形式，例如薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包含聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和y-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如Lupron DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子超过100天，但某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当包封的多肽长时间保留在体内时，它们可能由于暴露于37℃的湿气而变性或聚集，导致生物活性的丧失和免疫原性的可能变化。根据所涉及的机制，可以设计合理的策略以实现稳定化。例如，如果发现聚集机制是通过硫代-二硫化物交换形成分子间S-S键，则可以通过改变巯基残基，从酸性溶液中冻干，控制水分含量，使用适当的添加剂以及开发具体聚合物基质组合物来实现稳定化。
本发明的调配物可以被设计成短效、快速释放、长效或缓释的。因此，药物调配物也可以经调配用于控制释放或缓慢释放。
取决于待治疗的疾病、障碍或病症、年龄、体重、一般健康状况、性别和受试者的饮食、剂量间隔、施用途径、排泄率和药物组合，可调整具体的剂量。
本发明的TREM2激动剂抗原结合蛋白可以通过任何合适的方式施用，包含肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、鞘内、脑内、脑室内和鼻内施用，并且如果需要进行局部治疗，还包含病灶内施用。肠胃外施用包含静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮内或皮下施用。另外，特别是在抗原结合蛋白剂量递减的情况下，抗原结合蛋白适宜通过脉冲输注施用。优选地，给药通过注射，最优选静脉内或皮下注射给予，这部分取决于施用是短暂的还是长期的。考虑了其它施用方法，包含局部施用，特别是经皮、经粘膜、直肠、口服或局部施用，例如通过放置在所需部位附近的导管。在某些实施例中，本发明的TREM2激动剂抗原结合蛋白在生理溶液中以在0.01mg/kg至100mg/kg之间的范围内的剂量以每天一次至每周一次至每月一次范围内的频率(例如每天一次、每隔一天一次、每三天一次或每周2次、3次、4次、5次或6次)，优选地以0.1至45mg/kg、0.1至15mg/kg或0.1至10mg/kg范围内的剂量以每周一次、每两周一次或每月一次的频率静脉内或皮下施用。
本文所描述的TREM2激动剂抗原结合蛋白(例如，抗TREM2激动剂单克隆抗体及其结合片段)可用于预防、治疗或改善在有需要的患者中的与TREM2缺乏或TREM2生物功能丧失相关的病症。如本文所用，术语“治疗(treating或treatment)”是为了防止障碍的发展或改变障碍的病理而进行的干预。因此，“治疗”是指治疗性治疗和防治性或预防性措施两者。需要治疗的患者包含那些已经被诊断患有或已经患有所述病症或病症的患者，以及那些将要预防所述病症或病症的患者，如基于例如遗传标志物而有风险发展所述病症或病症的患者。“治疗”包含任何成功改善损伤、病理或病症的标志，包含任何客观或主观参数，如症状的减轻、缓解、消失，或使损伤、病理或病症对患者更易耐受，减缓退行性变或衰退的速度，使退行性变的终点不那么使人虚弱，或改善患者的身体或精神健康。症状的治疗或改善可基于客观或主观参数，包含身体检查结果、患者自我报告、认知测试、运动功能测试、神经精神检查和/或精神病学评估。
7.实例
出于说明而非限制的目的，提供了强调本文所描述的抗体和结合片段的示例性实施例的某些特征和性质的以下实例。
7.1.实例1：在阿尔茨海默氏病小鼠模型中，预先激活状态影响对抗人TREM2抗体的小胶质细胞应答
7.1.1.概要
髓样细胞上表达的触发受体2(TREM2)维持小胶质细胞对脑损伤刺激物，包含凋亡细胞、髓鞘损伤和淀粉样β(Aβ)的应答。阿尔茨海默氏病(AD)风险与TREM2R47H变体相关，所述变体损害配体结合，并且因此损害对Aβ病理的小胶质细胞应答。此处示出了，在5XFAD转基因小鼠中，TREM2与作为替代配体的mAb hT2AB的接合激活了小胶质细胞，所述转基因小鼠积聚Aβ并且表达常见的TREM2变体(TREM2CV)或TREM2R47H。来自用对照hIgG1处理过一次的TREM2CV-5XFAD小鼠的小胶质细胞的scRNA-seq暴露了四种不同的小胶质细胞激活轨迹，导致疾病相关(DAM)、干扰素应答(IFN-R)、循环(Cyc-M)和表达MHC-II(MHC-II)的小胶质细胞类型。所有这些在TREM2R47H-5XFAD小鼠中表达不足，表明TREM2配体接合是小胶质细胞激活轨迹所必需的。此外，Cyc-M和IFN-R小胶质细胞在雌性小鼠中比雄性TREM2CV-5XFAD小鼠更丰富，可能是由于雌性5XFAD小鼠中Aβ负荷更大。在TREM2R47H-5XFAD小鼠中，hT2AB的单次全身注射补充了Cyc-M、IFN-R和MHC-II池。然而，在TREM2CV-5XFAD小鼠中，hT2AB使雄性Cyc-M和IFN-R小胶质细胞的表示更接近雌性的小胶质细胞，其中这些轨迹已经达到最大容量。此外，hT2AB在所有小胶质细胞池中诱导基因表达模式的改变，而不影响表示。用鼠化hT2AB版本重复处理超过10天，增加了TREM2R47H-5XFAD小鼠的脑中趋化因子的含量，与小胶质细胞的扩增一致。因此，hT2AB对小胶质细胞的影响是由TREM2内源性配体接合和基础小胶质细胞激活的程度决定的。
7.1.2.显著性
阿尔茨海默氏病(AD)是最常见的痴呆症；没有任何疗法可以阻止其发展。调节疾病进程的小胶质细胞应答由包含淀粉样β(Aβ)斑块、神经原纤维缠结和突触丢失的AD病理触发。TREM2受体促进对病理的小胶质细胞应答，并且变体TREM2R47H削弱配体结合并与AD风险增加相关。利用scRNA-seq，询问：一种抗TREM2抗体，充当替代配体，可以刺激小鼠的小胶质细胞积聚Aβ并表达普通TREM2变体(TREM2CV)或TREM2R47H吗？一次全身注射抗TREM2恢复了TREM2R47H小鼠的小胶质细胞激活，但促进了携带TREM2CV(其与内源性配体结合)的小鼠的有限激活。因此，抗TREM2可以增强AD期间的小胶质细胞应答，取决于预先存在的TREM2接合和基础激活。
7.1.3.简介
阿尔茨海默氏病(AD)是老年人的进行性痴呆的最常见原因，其影响超过550万美国人，其中大多数年龄在65岁或以上，并且代表美国第6大死亡原因(https://www.nia.nih.gov/health/alzheimers-disease-fact-sheet)。AD的病理特征包含由淀粉样蛋白β(Aβ)肽组成的细胞外淀粉样斑块、由聚集的过度磷酸化的τ蛋白组成的神经元内神经原纤维缠结、神经免疫激活和突触密度降低(1)。纵向自然史研究(如阿尔茨海默氏病神经成像倡议)已经证明，Aβ在中枢神经系统(CNS)中的沉积发生在疾病早期，并且随后出现τ病理，随后出现神经元细胞死亡和认知障碍(2)。Aβ积聚还会引发小胶质细胞(支持CNS的发育、功能和免疫防御的脑内巨噬细胞)的应答(3)。
虽然导致家族性早发性AD的所有显性突变都发生在产生Aβ的蛋白水解通路的底物(淀粉样前体蛋白，APP)或蛋白酶(早老素)中(4)，但全基因组关联研究发现许多与小胶质细胞表达的晚发性AD相关的基因多态性，如TREM2、CD33、SPI1、SHIP1和PLCγ2(5，6)，提供了强有力的证据表明小胶质细胞主动控制AD病理的发作和/或进展(7)。小胶质细胞在Aβ斑块周围聚集，对其进行包容和压缩，由此减少周围神经元的轴突营养不良的标志物(8)。在此过程期间，小胶质细胞改变了其表型和转录性质，从“稳态”转变为通常被定义为疾病相关小胶质细胞(DAM)的激活状态(6)。这种向DAM表型的转变在AD的转基因淀粉样鼠模型中被强烈激活(9，10)，但在人类AD死后脑中观察到的程度较低(11，12)，这潜在地反映了在发展为AD病理的个体中对CNS损伤的小胶质细胞应答不足。
小胶质细胞向DAM的转变已经显示出取决于髓样细胞中表达的触发受体2(TREM2)，这是一种在小胶质细胞中大量表达的巨噬细胞表面受体(13)。TREM2是免疫球蛋白超家族的与磷脂、凋亡细胞、脂蛋白(如HDL、LDL和ApoE)以及Aβ结合的成员。TREM2通过相关的衔接子DAP12传递细胞内信号，所述衔接子募集蛋白酪氨酸激酶Syk，导致促进增殖、存活、ATP的产生和蛋白质生物合成的蛋白酪氨酸磷酸化事件的级联。TREM2的胞外域被蛋白酶从细胞表面切割下来，由此限制TREM2信号传导并释放可溶性TREM2(sTREM2)(14，15)。TREM2的基因变体与包含那须-哈科拉病、额颞叶痴呆和AD的多种神经退行性疾病相关。由于其在代谢激活中的作用，TREM2可以充当共刺激分子在向DAM过渡期间维持小胶质细胞的激活，这是由CNS损伤刺激物(如Aβ、凋亡细胞碎片和髓鞘损伤)引起的各种受体启动的(13)。
若干观察结果表明，通过TREM2激活小胶质细胞可能为AD提供一种有前景的治疗方法。首先，在人类(11)和AD小鼠模型AD(8，19)中，氨基酸47(TREM2R47H)处的精氨酸到组氨酸的错义取代使AD风险增加2至5倍(16，17)，削弱了配体结合(18)并且减少了小胶质细胞激活。第二，在积聚Aβ斑块的小鼠中，Trem2表达的完全缺失削弱了小胶质细胞对Aβ斑块的包封，这增强了其神经毒性(20，21)，并阻断了小胶质细胞从稳态向DAM的转变(9)。相反，过度表达TREM2的小鼠表现出较少的Aβ诱导的病理(22)。最后，抗TREM2激活抗体最近被证明可在体外增强对Aβ的小胶质细胞应答(23)，短期处理后中度Aβ斑块负荷(24)，并且促进小胶质细胞增殖，以及在长期施用之后减弱Aβ斑块的神经毒性作用(25)。
在此研究中，表征了新的抗人激动剂TREM2 mAb(命名为hT2AB)和这种激动剂TREM2 mAb的小鼠化版本(被命名为mT2AB)在5XFAD模型中的生物学作用。此抗体与常见的TREM2变体(TREM2CV)和AD相关的TREM2R47H变体结合。hT2AB在表达TREM2CV或人TREM2R47H而非内源性TREM2的转基因小鼠中进行了测试(19)。这些小鼠与5XFAD转基因小鼠杂交，所述转基因小鼠表达人类APP和PSEN1转基因，总共有五个促进Aβ斑块的积聚的AD连锁突变(26)。此模型的一个特征是淀粉样病变中的性别偏见：雌性5XFAD小鼠比雄性具有更明显的淀粉样病变(27，28)。
首先表明hT2AB是一种TREM2激动剂，所述激动剂在全身施用之后可以穿过血脑屏障(BBB)。接下来，通过单细胞RNA-seq(scRNA-seq)检测了单次腹膜内注射hT2AB或对照hIgG1对小胶质细胞的影响。在经对照hIgG1处理的小鼠中，小胶质细胞获得了从稳态向四种不同类型的连续细胞状态转变，包含DAM，干扰素应答(IFN-R)，Cyc-M和MHC-II表达(MHC-II)，这可能反映了不同信号通路的参与。如通过与TREM2R47H-5XFAD和Trem2–/–-5XFAD小鼠相比，TREM2CV-5XFAD小鼠的末端小胶质细胞类型显著富集所指示，所有轨迹都需要TREM2。进一步，Cyc-M和IFN-R小胶质细胞在雌性中比雄性更丰富，这与雌性中更高程度的Aβ积聚相关。hT2AB促进TREM2R47H-5XFAD小鼠的细胞周期重入，并且在TREM2CV-5XFAD队列中，雄性比雌性更有效地促进Cyc-M扩增。同样地，hT2AB在两种性别的TREM2R47H-5XFAD以及TREM2CV-5XFAD雄性中诱导了末端IFN-R群体，但是在TREM2CV-5XFAD雌性中没有促进这种细胞命运，在所述雌性中此群体已经被强烈诱导。因此，当缺乏或次优时，mAb介导的TREM2参与主要增加循环和IFN-R的命运。单独基因的表达动力学分析表明，一旦细胞命运确定，hT2AB就共同刺激表达变化，但不改变终末细胞类型的转录同一性。
在每3天重复注射一次，持续较短的时间段之后，最终在5XFAD小鼠中测试了mT2AB对脑生化分析物和组织学图像的影响。mT2AB处理导致TREM2R47H-5XFAD小鼠中由小胶质细胞产生的CCL4、CXCL10和IL-1β的最大增加。这与scRNA-seq数据一致，表明mT2AB在TREM2R47H-5XFAD小鼠中比在TREM2CV-5XFAD小鼠中诱导更大的小胶质细胞激活。携带TREM2R47H和TREM2CV的雌性5XFAD小鼠相对于其雄性对应物显示出更高水平的淀粉样蛋白沉积，这与雄性相对于雌性更大的hT2AB诱导的转变的观察结果一致。结论是，hT2AB介导的对小胶质细胞作用的幅度是由其基础循环和分化状态、预先存在的TREM2参与和mAb介导的刺激前的基础小胶质细胞激活决定的。
7.1.4.结果
hT2AB是对人TREM2具有特异性的激动性mAb
hT2AB通过基因枪介导的用编码人TREM2和DAP12的cDNA进行的免疫小鼠动物而产生(29)。单克隆抗体hT2AB选自一组激动性抗TREM2抗体。hT2AB与纯化的人TREM2(亲和力(KD)＝50nM)选择性地结合(图1A)。在表达人TREM2和DAP12的HEK293细胞(克隆G13)和人单核细胞源性巨噬细胞(hMac)中，通过pSyk诱导确定功能效力，揭示EC50分别为222pM和166pM(图1-1C)。hT2AB对细胞内信号传导的诱导依赖于TREM2的二价结合和交联，如其单体抗原结合片段(Fab)缺乏活性所证明的(图1D)。此外，hT2AB减少了hMac刺激后sTREM2的释放(图1E)。
为了检测hT2AB介导的TREM2激活对原代巨噬细胞的影响，用hT2AB、同种型对照或乙酰化LDL作为阳性对照刺激hMac，随后评估刺激后不同时间点培养上清液中释放的趋化因子。hT2AB诱导了人巨噬细胞释放的CCL4量的时间依赖性增加(图1F)，证明hT2AB激活了原代巨噬细胞。先前的研究表明，TREM2能使巨噬细胞在含有有限浓度CSF1的培养物中存活(30)，并且诱导pSyk的工具小鼠TREM2抗体也能在相同的攻击条件下促进巨噬细胞的体外存活率(23)。因此，也测试了在CSF1撤除之后hT2AB是否影响巨噬细胞的体外存活率。通过与CSF1一起培养，由TREM2CV小鼠制备骨髓巨噬细胞(BMM)，并且然后在从培养基中去除CSF1之后48小时，在存在或不存在hT2AB的情况下测试其存活率(图1G)。事实上，hT2AB以剂量依赖的方式维持BMM的存活率。
最后，试图确定AD相关的R47H突变是否影响hT2AB结合和/或信号传导。首先，证明了由TREM2CV和TREM2R47H小鼠两者制备的hT2AB染色的BMM(图1H)。然后，测试了hT2AB是否可以诱导Ca2+-NFAT驱动的报告细胞系2B4中GFP的表达，所述细胞系用TREM2CV或TREM2R47H与DAP12一起稳定转染(图1I)(18)。hT2AB在经TREM2CV和TREM2R47H两者转染的报告细胞中诱导GFP。此外，hT2AB维持了源自无CSF1培养的TREM2R47H小鼠的BMM的存活(图1J)，最终证明hT2AB激活TREM2CV和TREM2R47H两者。
hT2AB可以穿过BBB并且达到有效的脑浓度
由于外周施用的mAb很难穿过血脑屏障(BBB)，进行了药代动力学/药效学研究，以限定确保hT2AB在大脑中的有效浓度的剂量方案。用不同剂量的hT2AB静脉(i.v.)注射各组TREM2CV、TREM2R47H和Trem2–/–小鼠。24小时之后，通过MSD测量作为小胶质细胞激活的替代物的脑裂解物中CXCL10、CCL4、CCL2、CXCL2和CST7的浓度。hT2AB在30至100mg/kg之间的剂量下放大了所有参数(图2A-2E)。TREM2R47H小鼠比TREM2CV小鼠应答稍强。在Trem2–/–小鼠中没有观察到高于基线的应答。在TREM2R47H和Trem2–/–小鼠中单次i.v.注射30mg/kg之后，hT2AB在脑裂解物中的浓度随时间的变化揭示，在所有时间点(4小时、8小时和24小时)，hT2AB在克隆G13细胞中的脑浓度比其EC50高25倍(图2F)。因此，注射之后8小时，在TREM2R47H的裂解物中可检测到CXCL10、CCL2、CCL4、CST7和TMEM119 mRNA的增加，但在Trem2-/-脑中未检测到，并且24小时之后进一步增加(图2G-2K)。得出结论，单次注射30mg/Kg的hT2AB足以在体内激活小胶质细胞至少24小时。
scRNA-seq揭示了经对照hIgG1处理的TREM2CV-5XFAD小鼠中的四个小胶质细胞轨迹。
为了检测hT2AB对体内小胶质细胞的影响，求助于scRNA-seq。将单剂量的hT2AB或对照hIgG1注射到与TREM2CV(TREM2CV-5XFAD)或TREM2R47H(TREM2R47H-5XFAD)小鼠杂交的8个月大的5XFAD小鼠的腹膜腔中。雌性和雄性两者均包含在内，并且也注射雌性Trem2–/–小鼠以控制hT2AB的脱靶效应(图3A)。注射之后48小时处死小鼠。对小脑中抗体水平的评估证实hT2AB穿过BBB并到达脑实质(表S1)。从大脑皮层分离CD45+细胞，并且使用10x GenomicsChromium平台提交用于scRNA-seq(图3A)。71,303个细胞通过了严格的多步骤质量控制过程(图S1)。应用了一种监督方法，通过将单细胞表达谱与ImmGen基因签名进行匹配，将细胞初步分类为主要的免疫细胞亚型(31)(图3B)。校正处理、性别和基因型协变量的低维的潜在空间，以及阻断技术混杂因素源自细胞表达谱。使用每个细胞最近邻域的Jaccard相似性系数产生编码细胞关系的图，并且使用鲁汶氏社区检测方法(Louvain's communitydetection method)进行无偏分段。每个细胞被分配到其区段中最富集的细胞类型，产生10个主要免疫细胞群体的总分类(图3C-3E)。小胶质细胞占总细胞的90％以上。剩余的细胞由T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、循环细胞、成纤维细胞以及具有巨噬细胞和T细胞混合表达谱(MΦ:T)的细胞群体构成，可能捕获了T细胞浸润小鼠大脑积聚Aβ的相互作用(32)。小胶质细胞差异表达常见的标志物基因，包含P2ry12、Hexb、Tmem119和C1q家族基因等，所述基因在其它细胞群体中不存在(图3F-G)。这些基因也优先在被鉴定为血管周围巨噬细胞的小簇中表达，所述巨噬细胞增加了Mrc1和Pf4的表达。值得注意的是，单核细胞和血管周围巨噬细胞并没有由于hT2AB处理而受到显著影响。从用对照hIgG1或hT2AB处理的小鼠中采样的单核细胞或血管周围巨噬细胞的相对分数保持不变(单核细胞:TREM2CV-5XFAD的hIgG1/hT2AB比率＝1.3％/0.9％，TREM2R47H-5XFAD＝1.0％/0.9％，Trem2–/–-5XFAD＝0.7％/0.4％，巨噬细胞:TREM2CV-5XFAD＝3.0％/3.0％，TREM2R47H-5XFAD＝2.4％/2.4％，Trem2–/–-5XFAD＝2.3％/1.8％)，并且未发现基因在处理队列之后差异表达(绝对效应大小阈值>1.5)。
表S1示出了单次i.p.注射之后hT2AB的小脑浓度。对血清/大脑中hT2AB给药样品的分析示出了暴露于hT2AB，且hT2AB的BBB通过率为约0.19％-0.76％。基因型：A＝TREM2CV-5XFAD；B＝TREM2 R47H-5XFAD；C＝Trem2-/--5XFAD
接下来定义了来自对照hIgG1注射TREM2CV-5XFAD小鼠的5,694个小胶质细胞的基线异质性。使用扩散映射来学习更好地表示数据中潜在时间轴的低维流形。使用鲁汶氏社区检测方法的聚类揭示了11个细胞状态，这些细胞状态随后沿着类似于分支细胞激活连续体的最大简约树被无偏地放置。所得轨迹起源于稳态小胶质细胞(高度表达Tmem119、P2ry12和Cx3cr1)，经过5个中间分化阶段(t1-t5)，并且然后分支成4种不同的末端类型：干扰素应答性小胶质细胞(IFN-R)、表达MHC-II的小胶质细胞(MHC-II)、循环小胶质细胞(Cyc-M)和进一步分化成DAM簇的t6阶段(图4A)。通过对Keren-Shaul等人,(9)报告的DAM的转录组相似性和不相等性进行评分，发现沿从t1至t6的轨迹和此处报告的DAM簇的表达相似性增加，最终导致两项研究中的末端DAM之间的显著相似性(P值＝1.4×10-19；图4B)。使用机器学习方法预测了每个细胞的细胞周期状态，所述方法是在细胞周期状态标志物表达对上训练的(33)。Cyc-M显示了在所有簇中G2/M期细胞的显著富集(63.0％)(剩余簇中的平均百分比＝1.1％；图4C)。IFN-R小胶质细胞大量表达干扰素刺激基因(ISG)，如Bst2、Ifit3、Ifitm3和Isg15(图4D)。GO术语富集分析证实了由IFN诱导的基因程序的表达，具体地I型IFN，即IFNα和IFNβ(图S2)。在所有簇中，MHC-II小胶质细胞表达最高水平的MHC II类通路基因，以及经典和非经典MHC I类基因(图4E)。有趣的是，此亚群也表达高水平的GPI相关Cd52和Ly6e，这两者都与免疫调节有关(34)。值得注意的是，现在在另一个小鼠AD模型中报告了IFN-印迹和MHC-II呈递簇(35)。总之，对经对照hIgG1处理的TREM2CV-5XFAD小鼠的小胶质细胞的无偏基线scRNA-seq分析揭示了对Aβ斑块的小胶质细胞应答的四种不同命运，这可能反映了不同信号传导通路的参与。
TREM2变体深刻影响小胶质细胞轨迹
预期对性别、基因型和处理对DAM、Cyc-M、IFN-R和MHC-II小胶质细胞分化的影响进行综合分析。出于此目的，采用了基于机器学习的方法来协调样品(图S3)，并且通过在所有条件下所有细胞的学习到的非线性流形上拟合主曲线来推断从分支簇t5到每个末端的轨迹(图5A)。使用此方法，首先评估了TREM2CV-5XFAD和TREM2R47H-5XFAD基因型对小胶质细胞轨迹的基线影响。特别关注雌性，因为其比雄性具有更明显的Aβ沉积(27，28)。进一步地，包含了Trem2–/–-5XFAD小鼠进行进一步比较。将每个细胞类型轨迹分成10个大小相等的拟时间间隔，并且定量每个间隔中来自经对照hIgG1处理的雌性小鼠的细胞数量。使用自举方法估计细胞群体的比例，以说明重复之间的技术差异(图5B-E)。发现了，对于所有四个末端时间间隔，TREM2CV-5XFAD小鼠具有最高的细胞比例(95％ CI的估计平均值±SE：DAM：15.5±0.1％，Cyc-M：13.9±0.1％，IFN-R：22.3±0.2％，MHC-II：5.6±0.1％)。这证实了TREM2是DAM完全分化所必需的，与先前的研究一致(9)，并且将此概念扩展到由Aβ积聚诱导的Cyc-M、IFN-R和MHC-II的命运。TREM2R47H-5XFAD小鼠具有更多的晚期DAM和MHC-II细胞(DAM：7.3±0.1％，Cyc-M：4.1±0.1％，IFN-R：10.3±0.1％，MHC-II：1.7±0.1％)，比Trem2–/–-5XFAD小鼠具有的多(DAM：5.0±0.0％，循环：4.8±0.1％，IFN-R：12.7±0.1％，MHC-II：0.0±0.0％)。这与先前的发现一致，先前的发现报告了TREM2R47H突变体虽然形态不良，但功能部分丧失，诱导DAM成熟的能力有限(19)。由于TREM2R47H与脂质配体的结合较差，因此需要TREM2与内源性配体的持续相互作用来维持DAM的分化，并在较小程度上维持MHC-II小胶质细胞的分化。
在经对照hIgG1处理的TREM2CV-5XFAD小鼠中，雌性小胶质细胞倾向于IFN-R命运。
比较了性别对TREM2CV-5XFAD小鼠的小胶质细胞轨迹的影响。没有观察到晚期DAM比例的差异(95％CI的估计平均值±SE，雌性：15.5±0.1％，雄性：14.5±0.1％；图S4A)。然而，Cyc-M、IFN-R和小范围的MHC-II细胞类型的表达是有偏见的。在末端Cyc-M(图S4B)和IFN-R(图S4C)间隔中的细胞的相对分数在雌性中显著高于雄性(Cyc-M雌性：13.9±0.1％，雄性：8.1±0.1％，IFN-R雌性：22.3±0.2，雄性：17.0±0.2)。估计的末端MHC-II细胞分数表明此细胞类型在雄性中比在雌性中更丰富的适度趋势(雌性：5.6±0.1％，雄性：8.0±0.2％；图S4D)。
还评估了分支簇t5之前和之后每个末端类型的前10个签名基因的基因表达动态(图S4A-S4D)。使用负二项式广义加性模型将基因表达建模为拟时间的函数(36)。这允许在单细胞水平上沿着分化轨迹评估基因表达模式，并且因此不依赖于细胞采样密度。对于每种细胞类型，在两种性别中，标签基因都对每种轨迹的末端显示出相似的连续上调模式。这意味着小胶质细胞类型表现出相似的转录组组成，并且因此，在雄性和雌性中可能执行定性相同的功能。然而，小胶质细胞可能以不同的方式初免，促进更动态的小胶质细胞应答，这最终导致两种性别之间的小胶质细胞群体景观的定量变化。例如，干扰素刺激基因Ifi27l2a的基础表达水平在雌性小鼠中沿着Cyc-M和IFN-R轨迹升高(对早期和晚期末端差异的Wald测试：早期Cyc-M P值＝9.9×10-9，晚期＝3.8×10-1；早期IFN-R P值＝1.0×10-4，晚期＝1.8×10-2；图S4B)。Ifi27l2a是NR4A核受体转录活性的调节剂，所述核受体协调细胞和全身代谢过程(37)，以及骨髓细胞分化和其对炎性刺激物的应答(38–40)。Ifi27l2a的诱导基础表达水平可能表明细胞暴露于病理生理环境线索的增加。事实上，先前的研究表明，雌性5XFAD小鼠比雄性5XFAD小鼠积累更多的Aβ(27，28)。因此，也检测到雌性小鼠的大脑中比雄性TREM2CV-5XFAD小鼠的大脑中的更多不溶性Aβ(图S4E)。因此，总的来说，这些数据表明雌性TREM2CV-5XFAD小鼠中IFN-R和Cyc-M类型的富集反映了小胶质细胞对更丰富的Aβ聚集体的应答。
hT2AB对循环、IFN-R和MHC-II命运的影响依赖于预先存在的小胶质细胞状态
接下来，研究了与对照hIgG1相比，hT2AB如何影响两种性别的TREM2CV-5XFAD和TREM2R47H-5XFAD小鼠的小胶质细胞命运。为了说明场外处理影响，包含了处理匹配的Trem2–/–-5XFAD小鼠的数据。hT2AB不诱导DAM的扩增(在TREM2CV/TREM2R47H/Trem2–/–-5XFAD的90-100％拟时间间隔R中，对照hIgG1与hT2AB细胞分数的估计比率，雌性：R＝0.6/1.0/0.9，雄性：R＝1.0/1.0/n.a.)。有趣的是，TREM2CV-5XFAD小鼠的hT2AB处理激活了雄性的小胶质细胞的细胞周期重新进入(R＝4.2)，但雌性的小胶质细胞没有经历另外的细胞周期诱导(R＝0.5；图6A)。在来自TREM2R47H-5XFAD的小胶质细胞中，对hT2AB增殖应答的增加幅度是明显的，因为此群体在雌性小鼠和雄性小鼠两者中都扩增了(雌性：R＝4.9，雄性：R＝7.9)。同样，hT2AB在TREM2CV-5XFAD雄性(R＝1.3)、TREM2R47-5XFAD雄性(R＝2.1)和TREM2R47H-5XFAD雌性(R＝3.2)中诱导了末端IFN-R群体，但不促进TREM2CV-5XFAD雌性(R＝0.9)的这种细胞命运。考虑到经对照hIgG1处理的TREM2R47H-5XFAD小鼠比TREM2CV-5XFAD小鼠具有更少的Cyc-M和IFN-R小胶质细胞，并且在TREM2CV-5XFAD雄性与雌性之间相似的不均衡是明显的，结果表明hT2AB在充当TREM2R47H的替代配体时或者在Aβ积聚仍然有限时激活小胶质细胞增殖和IFN-R分化两者。除了在携带TREM2CV的雌性5XFAD小鼠中强烈诱导这些激活状态外，hT2AB似乎没有进一步增加激活的小胶质细胞的百分比，这与先前描述的携带野生型TREM2的5XFAD动物中DAM信号传导高度升高一致。MHC-II小胶质细胞在两种性别的TREM2CV-5XFAD小鼠中相对稀少(尽管在雄性中比在雌性中发现更多)，在两种性别中都经历了hT2AB诱导的扩增，但是在雌性中应答更明显(雌性：R＝4.9，雄性：R＝1.9)。相抵地，hT2AB扩大了两种性别的TREM2R47H-5XFAD小鼠中的晚期MHC-II群体(在80-100％拟时间间隔中对照hIgG1与hT2AB细胞分数的估计比率，雌性：4.1，雄性：2.1)。总的来说，hT2AB触发了小胶质细胞周期的重新进入，并且补充了TREM2R47H-5XFAD小鼠的IFN-R和MHC-II细胞池。在TREM2CV-5XFAD小鼠中，hT2AB诱导的效应是由预先存在的细胞类型组成驱动的，以恢复较不丰富的群体。
抗TREM2共刺激末端小胶质细胞类型内单个基因的表达
由于数据描述了连续的发育过程，小胶质细胞簇代表了细胞混合物，每个细胞都涵盖了在不同发育阶段捕获的离散数量。因此，通过比较细胞簇，基因表达差异将变得模糊不清。为了避免此问题，拟合了每个细胞从分支点向末端表型分化时的基因表达动力学。所得表达模型不依赖于沿轨迹采样的细胞分数，使得能够精确定位潜在的差异基因表达。稳健检测的基因按轨迹过滤。在统计学上比较了hT2AB与经对照hIgG1处理的小鼠之间每条线的早期开始和晚期结束(图6B)。大多数hT2AB诱导的基因表达变化发生在拟时间轨迹的早期(平均值＝76.8％)，而这些变化中近少数在末端细胞类型中表现出来(平均值＝19.1％)。这表明转录转移主要是暂时的，并且hT2AB充当共刺激因子而不是末端小胶质细胞表型的转录修饰因子。进一步发现，平均而言，每个轨迹63.3％的转录应答适用于携带TREM2R47H亚等位基因的小胶质细胞，所述亚等位基因与内源性配体结合的效率较低，但可以被hT2AB激活；这表明hT2AB对小胶质细胞命运的激活状态依赖性效应。有趣的是，沿着DAM轨迹检测到最高数量的hT2AB诱导的基因表达变化(平均基因数/分析总数：DAM＝552/1735，Cyc-M＝321/3353，IFN-R＝187/5005，MHC-II＝148/4508)，表明此轨迹被刺激，但是hT2AB处理在此实验的时间过程中没有导致细胞完全分化为末端表型。总的来说，转录变化没有线性转化为末端细胞类型的扩增，因为其依赖于hT2AB介导的刺激前的分化状态。
用mT2AB进行的短期处理影响TREM2R47H-5XFAD的小胶质细胞增殖和激活标志物
接下来试图确定抗TREM2处理对5XFAD动物的脑生化和组织学标准物的影响。出于此目的，利用了鼠IgG1恒定区hT2AB嵌合变体(mT2AB)。5月龄的两种性别的TREM2CV-5XFAD和TREM2R47H-5XFAD小鼠每3天在腹腔内注射30mg/kg剂量的mT2AB或对照mIgG1，持续10天(图7A)。在实验结束时，将脑分成两半：一半被溶解用于小胶质细胞激活和增殖的可溶性标志物(包含趋化因子和细胞因子以及Aβ肽1-40和1-42)的生化测量；另一半切片，以使用抗Aβ和甲氧基-04通过共聚焦显微术分析Aβ覆盖率。5XFAD背景下hTREM2转基因小鼠的趋化因子和细胞因子的变化与野生型背景下hTREM2转基因小鼠中最初观察到的变化一致(图2)，其中在TREM2R47H-5XFAD小鼠中观察到CCL4、CXCL10和IL-1β的诱导(图7B)。值得注意的是，mT2AB在TREM2R47H-5XFAD小鼠中诱导的CCL4、CXCL10和IL-1β水平与在TREM2CV-5XFAD小鼠中观察到的水平相当(图7B)。鉴于CCL4、CXCL10和IL-1β由小胶质细胞产生，这些观察结果与增加的增殖和激活(具体地表达TREM2R47H变体的小胶质细胞)的scRNA-seq观察结果一致。在TREM2CV小鼠和TREM2R47H小鼠两者中，Aβ定量鉴定出雌性相对于雄性的淀粉样蛋白沉积水平增加(图S5A)。此结果证实了先前的观察结果(25，26)，并将其扩展到携带人TREM2的小鼠，从而为hT2AB处理之后观察到的雄性的小胶质细胞激活应答基因的更大的相对增加提供了潜在的解释。用mT2AB进行的短期处理对雄性或雌性小鼠的斑块或可溶性Aβ的总量没有可检测的影响，如通过可溶性或不溶性Aβ负荷的生化评估(图S5A)和用抗Aβ和甲氧基-04染色(图S5B-C)所测量的。这与最近的研究一致，在最近的研究中，用TREM2激动剂抗体进行的长期处理导致小胶质细胞屏障功能的强烈诱导和下游神经毒性的预防，而不改变总淀粉样蛋白的定量(25)。对淀粉样蛋白或其它AD病理的小胶质细胞应答的差异可能有助于阐明历史观察结果，即总淀粉样蛋白负荷与认知相关性差，并且在认知正常的老年人中可以观察到高水平的淀粉样蛋白沉积(41，42)。
7.1.5.讨论
在此研究中，研究了淀粉样蛋白沉积和抗人TREM2激动剂抗体对TREM2CV-5XFAD和TREM2R47H-5XFAD小鼠的小胶质细胞激活、增殖和基因表达的影响。首先建立了经对照hIgG1处理的TREM2CV-5XFAD小鼠的小胶质细胞的高分辨率单细胞图谱，证明小胶质细胞响应于Aβ积积聚从稳态逐渐分化为4种不同的类型。这些类型包含先前报告的DAM(9)、IFN-R、MHC-II(35)以及Cyc-M小胶质细胞。显示出小胶质细胞类型的相对分布依赖于TREM2基因型和小鼠性别。在未用hT2AB处理的小鼠中，TREM2CV对于所有类型的最佳分化是必需的，相反，其在携带TREM2R47H变体的小鼠中表达不足。此外，雌性TREM2CV-5XFAD小鼠中的IFN-R和Cyc-M小胶质细胞比雄性小鼠更丰富，这很可能反映了雌性中的Aβ积聚的加剧。接下来确定了hT2AB对小胶质细胞命运的影响，证明了两种主要作用：hT2AB促进了基础增殖较低的小鼠(包含两种性别的TREM2R47H-5XFAD小鼠和TREM2CV-5XFAD雄性小鼠)的Cyc-M小胶质细胞的扩增；此外，hT2AB补充了TREM2R47H-5XFAD小鼠的IFN-R和MHC-II细胞池。最后，在短期多剂量方案中，mT2AB导致TREM2R47H-5XFAD小鼠的脑中趋化因子含量升高，这与hT2AB诱导的小胶质细胞扩增平行。
本研究的一个重要结论是，TREM2的活性似乎是饱和的。表达不能有效地与生理配体结合的TREM2R47H的小鼠在小胶质细胞循环中有明显的缺陷。然而，TREM2R47H与替代配体如hT2AB的接合显著增加了小胶质细胞增殖。最近用不同的抗人TREM2 mAb证实了相似的结果(25)。相比之下，在表达与内源性配体结合并促进正常基础增殖的TREM2CV的小鼠中，hT2AB仅促进雄性小胶质细胞循环的适度增加，由于较少暴露于Aβ积聚，所述雄性小胶质细胞趋于比雌性小胶质细胞增殖得少。这一观察结果对于抗TREM2抗体的未来治疗应用是重要的，因为它表明这些抗体可能能够恢复在具有TREM2功能性突变的患者中观察到的受损激活状态，或者在其它情况下不能产生强有力的DAM应答，如在人AD死后脑中观察到的。这也表明，在缺乏有害刺激物，如Aβ或替代的生理性TREM2配体的情况下，TREM2激动剂对小胶质细胞的激活不太可能发生。
先前已经表明，TREM2对于诱导DAM的完全分化是必需的(9)。与此一致的是，TREM2R47H-5XFAD和Trem2–/–-5XFAD小鼠的DAM较少。数据将此概念扩展到IFN-R和MHC-II小胶质细胞，与在TREM2CV-5XFAD小鼠中相比，所述小胶质细胞在TREM2R47H-5XFAD和Trem2–/–-5XFAD小鼠中不太丰富。重要的是，研究还表明，尽管TREM2信号传导是必要的，但不足以诱导各种末端小胶质细胞类型，这与先前关于DAM表型的两步激活的报告一致(9)。小胶质细胞的命运首先由转变的神经病理学条件驱动，所述条件触发使TREM2分叉和拉拢的信号通路，以维持朝向四种末端细胞类型的扩增。因此，一旦作出细胞命运决定，hT2AB就在分支点附近诱导转录变化，这表明hT2AB可能刺激每个轨迹中的共同通过，促进朝向末端小胶质细胞类型的进展。鉴于先前的研究表明TREM2维持mTOR通路，TREM2信号传导可能通过提供对Aβ或其它损伤的小胶质细胞应答所需的构件和能量来共同刺激预激活通路(43)。
在由10天内频繁施用高剂量mAb组成的短期多剂量方案中，mT2AB诱导与小胶质细胞增殖和激活一致的应答，所述应答因TREM2基因型和性别而异，推测与TREM2R47H和雄性小鼠中TREM2接合水平降低有关。报告与最近的一项研究相一致，在所述研究中，用不同的抗人TREM2 mAb对TREM2CV-5XFAD和TREM2R47H-5XFAD小鼠进行长期处理，导致TREM2R47H-5XFAD的代谢活性和增殖性小胶质细胞群体比TREM2CV-5XFAD扩大到更大的程度(25)，并且在12周的实验范式中，导致了与诱导更有效的小胶质细胞屏障应答相一致的变化，包含斑块压缩的变化、小胶质细胞-斑块关联的改变和轴突营养不良的减少与Aβ神经毒性的降低一致。
总之，对抗人TREM2 mAb hT2AB的体内评估表明，在体内TREM2CV-5XFAD和TREM2R47H-5XFAD中全身施用此抗体：1)补充了TREM2R47H-5XFAD小鼠中的Cyc-M、IFN-R和MHC-II池；2)使雄性Cyc-M和IFN-R小胶质细胞的表达更接近TREM2CV-5XFAD小鼠中的雌性的小胶质细胞的表达，其中小胶质细胞转化已经被强烈激活；以及3)在每个轨迹中共刺激的共同通路，促进向末端小胶质细胞类型的进展。
7.1.6.参考文献
下文和本文讨论的具体参考文献全部并入本文。
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7.1.7.方法
动物
TREM2CV-5XFAD和TREM2R47H-5XFAD小鼠如先前所描述产生(19)。小鼠被圈养在圣路易斯华盛顿大学的动物设施中。所有动物实验都是根据华盛顿大学和安进南旧金山机构动物护理和使用委员会批准的授权协议#20160220和19-0981，按照机构规定进行的。在此研究中，仅雄性小鼠用于药代动力学和药效学分析，并且对雄性和雌性小鼠都进行了scRNA-seq分析。
完全人抗hTREM2抗体的产生
通过用编码人TREM2和DAP12的cDNA对XMG2-K和XMG2-KL转基因小鼠(29，44)进行基因枪免疫，产生了针对hTREM2的完全人(hT2AB)和鼠化(mT2AB)抗体。如SI方法中所描述进行抗体选择和产生。
用于评估TREM2激活的Syk磷酸化测定
表达hTREM2和hDAP12(克隆G13)或hMac的基于HEK293的稳定细胞系用于如SI方法中所描述的抗体活性评估。抗体活性(刺激)以对照(S/B)的倍数报告：S/B＝样品pSyk信号(计数)/基础pSyk信号(同种型对照pSyk信号计数)。hT2AB的EC50由GraphPad Prism 6.07版的四参数逻辑拟合模型确定。
通过MSD测量hMac的sTREM2和CCL4水平
hMac用于在用hT2AB或hIgG1同种型对照抗体处理之后测量条件培养基中的CCL4和sTREM2，如SI方法中所描述。乙酰化LDL用作每组CCL4测量的阳性对照。
BMM的存活率测定
在与CSF1培养的第5天收获来自TREM2CV、TREM2R47H和Trem2–/–的BMM，并将其转移至24孔平底，所述平底以5×104个细胞/孔在不含CSF1的完全RPMI中板结合有hT2AB或对照hIgG1。在培养48小时后，通过FACSCalibur检测存活率，以PI阴性细胞群体的％测量。
GFP报告基因测定
2B4 NFAT：表达hTREM2CV和hTREM2R47H的GFP报告细胞已有描述(45)，并且用于检测如SI方法中所描述的hTREM2变体的激活。
hT2AB的药效学和药代动力学
如SI方法中所描述进行hT2AB的药效学分析。为了进行药物代谢动力学分析，对8月龄的TREM2CV、TREM2R47H和Trem2–/–雄性或雌性小鼠组进行i.p.注射，单次注射30mg/kghT2AB。48小时后，用两种不同的测定测量小鼠血清样品和冷PBS灌注小脑匀浆中hT2AB的浓度。两种测定都是夹心免疫测定，使用重组人TREM2(加利福尼亚州的安进公司(Amgen,Inc.CA))和钌缀合的小鼠抗人Fc单克隆抗体(加利福尼亚州的安进公司)。血清和小脑匀浆测定的定量下限(LLOQ)分别为100ng/mL和1ng/mL。
单细胞RNA-seq
八月龄的小鼠在处死之前48小时i.p.注射30mg/kg的hT2AB或对照hIgG1。在用冷PBS灌注之后，分离皮质，使用FACS分选Cd45+细胞。使用10x Genomics Chromium单细胞3'v2基因表达试剂盒制备所有CD45+细胞文库，并在Illumina NovaSeq 6000流动细胞上测序，以实现每个细胞50,000个读段的读段深度。如SI方法所描述分析数据。没有表现出hT2AB暴露的样品被排除在下游分析之外。测序数据和样品质量报告可以从GeneExpression Omnibus获得，序列号为GSE156183。
用于Aβ和图像分析的免疫染色
如SI方法中所描述，游离浮动脑切片用于Aβ的免疫染色。使用20×0.95-NA物镜在Nikon A1Rsi+共聚焦激光扫描显微镜上拍摄共聚焦照片。记录z方向上具有1.1-μm步骤的z堆叠，1,024×1,024-像素分辨率。Aβ区域覆盖率的百分比通过ImageJ中的批处理自动计算。
Aβ和趋化因子/细胞因子定量
通过MSD V-plex 6E10试剂盒(美索规模发现公司(Meso Scale Discovery))测量人Aβ1-40和Aβ1-42，并且通过MSD U-plex生物标志物组1测定(美索规模发现公司)测量小鼠IL-1β、CXCL10(IP-10)和CCL4(MIP-1β),如SI方法中所描述。
统计分析
所有的图表示每组中所有样品的平均值±SD或SEM，如图例所指示。使用GraphPadPrism软件(v8)进行统计分析。除非另有说明，否则P<0.05视为不同治疗组之间的显著差异，通过具有Sidak多重比较检验的双向ANOVA确定。
7.1.8.补充方法(SI方法)
动物
小鼠被圈养在圣路易斯华盛顿大学的动物设施中。所有动物实验都是根据华盛顿大学和安进南旧金山机构动物护理和使用委员会批准的授权协议#20160220和19-0981，按照机构规定进行的。在本研究中，仅使用雄性小鼠进行药效学分析，对雄性和雌性小鼠进行药代动力学分析并执行scRNA-seq分析。
抗hTREM2抗体
通过活细胞FACS分析(Accuri FACS)监测从免疫小鼠获得的hTREM2特异性血清滴度。将来自具有针对hTREM2的最高抗原特异性血清天然滴度的动物排液淋巴结的淋巴细胞用于杂交瘤产生。使用用中性抗生物素蛋白包被的384孔板通过ELISA筛选杂交瘤上清液与人TREM2的结合，或在37℃下用2μg/mL对照hIgG1包被，持续1小时，随后用与hIgG1 Fc部分(hTREM2-Fc，安进公司)融合的生物素化hTREM2细胞外结构域包被。在洗涤步骤之后，用1％牛奶/1X PBS(1:5)稀释耗竭的杂交瘤上清液，并添加到hTREM2-Fc或对照hIgG1包被的384孔板中，并在室温下温育1小时。用山羊α-人κ-HRP(2060-05，南方生物技术公司(SouthernBiotech))和山羊α-人λ-HRP(2070-05，南方生物技术公司)的混合物进行检测。来自杂交瘤筛选活动中鉴定的先导候选物的可变重链和轻链序列被克隆并与缺乏效应子功能的hIgG1恒定区重组表达以产生hT2AB。通过将hT2AB可变结构域移植到无效应mIgG1骨架上，产生了hT2AB的鼠化版本mT2AB。对动物和基于细胞的实验中使用的hT2AB、mT2AB和无效应物同种型对照hIgG1和对照mIgG1的制剂进行内毒素检测，并且发现其与<0.5EU/mg相当，确保应答不是由TLR信号传导引起的。
抗体结合测定
将纯化的hT2AB在测定缓冲液(10mM Tris，0.13％ Triton X-100，150mM NaCl，1mM CaCl2，0.1mg/ml BSA，pH 7.6)中稀释至5μg/ml，并在抗hFc动力学传感器(18-5090，富迪生物公司(ForteBio))上捕获。重组hTREM1:GSS:Flag:6xHis和重组hTREM2:GSS:Flag:6xHis被最低限度地生物素化(0.3-0.4生物素/mol)并在70-80nM处固定到高精度链霉亲和素光纤生物传感器(SAX，#18-5119)上超过2000秒，达到约2nm的最终装载水平。然后将每个装载的TREM2蛋白与稀释系列的hT2AB Fab蛋白(30，10，3.3nM)一起温育300秒，并且然后在单独的缓冲液中温育500秒(解离)。用Octet数据分析软件(v10)处理原始数据，并且将经处理的数据整体拟合到1:1结合模型，并计算50nM的解离常数(KD)。抗hTREM1抗体和同种型匹配的hIgG2对照抗体用作对照。为了测试对hTREM2R47H突变的结合能力，在第5天采集来自TREM2CV、TREM2R47H和Trem2–/–小鼠的骨髓源性巨噬细胞(BMM)，并在具有hT2AB或对照hIgG1的FACS缓冲液(10％FCS的PBS)中温育30分钟，随后用抗hIgG Fc-PE(9040-09，南方生物技术公司)染色。通过DAPI染色排除死亡细胞。
分化的人单核细胞源性巨噬细胞的产生
通过白细胞分离和阴性免疫磁性选择(龙沙公司(Lonza))收集来自健康人去鉴定供体的大量、单个供体批次(每次分化运行5000万-1亿个细胞)冷冻保存的CD14+单核细胞，并且用于产生巨噬细胞(hMac)。使用植物源性重组M-CSF(50ng/mL，植物源性，超低内毒素0.05EU/μg，PromoCell#C-60442A)在RPMI-1640培养基中以半粘附方式用CellGenixVueLife 118-C生物工艺袋(圣戈班高性能塑料公司(Saint-Gobain PerformancePlastics))对冷冻回收的单核细胞悬浮液进行分化。每个袋中最多装载5000万个细胞的分化培养基(最初装载约30mL细胞悬液)。除50ng/mL M-CSF外，分化培养基由RPMI-1640+10％FBS(Gibco PerformancePlus认证，热灭活，≤5EU/mL内毒素，#10082139)、1X GlutaMAX(吉科博#35050061)、1X Pen/Strep(吉科博#15140122)、1X NEAA(吉科博#11140050)和1X丙酮酸钠(吉科博#11360070)构成。将袋放置在标准组织培养培养箱(湿化，5％ CO2，37摄氏度)的架子上以最大化气体交换，在第3天和第6天用新鲜分化培养基的输注进行总共9天的分化。分化9天之后，在搅动以去除细胞之后，从生物工艺袋中收集巨噬细胞，并冷冻保存在BamBanker无血清培养基(和光化学品美国公司#30214681)中。通过流式细胞术，相对于未分化的单核细胞，人巨噬细胞的每个大规模生产运行都符合一致的TREM2表达。在整个生产过程中，尽最大努力监测和减少内毒素暴露。
Syk磷酸化测定
将克隆G13细胞(8×105个细胞/mL)或hMac(2×105个细胞/mL)以每孔25μL接种于384孔PDL包被的测定板中过夜。在测定当天，细胞与hT2AB的系列稀释液在RT下温育45-60分钟。去除上清液后，用含有0.0625nM抗pSyk(Tyr525/526，2710，细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology))和0.5nM生物素化小鼠抗Syk抗体，定制顺序：BD生物科学公司(BD Bioscienes))的M-Per+在室温下裂解细胞，持续1小时，用2.5μg/mL抗兔IgG-受体珠(AL104C，珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))在室温下温育2小时，随后添加10μg/mL链霉亲和素-供体珠(6760002B，珀金埃尔默公司)，持续2小时。所述抗体和珠粒浓度是最终的。AlphaLISA信号(计数)由EnVision多标记阅读器测量。
通过MSD测量hMac的sTREM2和CCL4水平
hMac用于在用hT2AB或hIgG1同种型对照抗体处理之后测量条件培养基中的CCL4和sTREM2。简言之，将hMac(500000个细胞/孔/ml)铺板在6孔板中，并在37℃下温育过夜。用培养基(RPMI+GlutaMax+1％ FBS)替代生长培养基，持续24小时，并且第二天取出适量的培养基，并用含有hT2AB、hIgG1同种型对照抗体或乙酰化LDL的培养基替换，最终浓度为200nM。在指定的时间点(4、8或24小时)，从每个经处理的孔中取出培养基(条件培养基)并保存用于分析，直到收集到所有样品。CCL4(4、8或24小时)和sTREM2(24小时)水平在条件培养基中按照制造商说明用基于MSD平台的测定进行测量(美索规模发现公司)。
BMM的存活率测定
在与CSF1培养的第5天收获来自TREM2CV、TREM2R47H和Trem2–/–的BMM，并将其转移至24孔平底板，所述平底板以5×104个细胞/孔在不含CSF1的完全RPMI中板涂覆有hT2AB或对照hIgG1。在培养48小时后，通过FACSCalibur检测存活率，以碘化丙啶阴性细胞群体的％测量。
GFP报告基因测定
表达hTREM2CV和hTREM2R47H的2B4 NFAT:GFP报告细胞用于检测hTREM2变体的激活。简言之，在碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中将hT2AB或对照hIgG1的储备溶液稀释至所示浓度，并将50μl所得溶液添加到96孔板的不同孔中过夜。每种条件进行三次重复。在将表达hTREM2CV或hTREM2R47H的2B4 NFAT:GFP报告细胞以1000细胞/μl转移到相应的孔中之前，将抗体包被的板用冷PBS洗涤三次。在刺激16小时之后，将细胞转移到FACS管中，并在FACSCalibur上读取GFP表达。
hT2AB的药效学和药代动力学
给10周龄的TREM2CV、TREM2R47H和Trem2–/–雄性小鼠组静脉注射(i.v.)不同剂量的hT2AB。48小时之后，处死小鼠，并且脑裂解物用于通过MSD测量CXCL10、CCL4、CCL2、CXCL2和CST7的浓度。在不同的处理组中，给TREM2R47H和Trem2–/–雄性小鼠i.v.注射30mg/kg的hT2AB。注射之后4小时、8小时、24小时处死小鼠。通过qRT-PCR测量Cxcl10、Ccl2、Ccl4、Cst7和Tmem119的相对基因表达水平。为了进行药物代谢动力学分析，对8月龄的TREM2CV、TREM2R47H和Trem2–/–雄性或雌性小鼠组进行腹腔注射，单次注射30mg/kg hT2AB。48小时后，用两种不同的测定测量小鼠血清样品和冷PBS灌注小脑匀浆中hT2AB的浓度。两种测定都是夹心免疫测定，使用重组人TREM2(加利福尼亚州的安进公司)和钌缀合的小鼠抗人Fc单克隆抗体(加利福尼亚州的安进公司)。血清和小脑匀浆测定的定量下限(LLOQ)分别为100ng/mL和1ng/mL。
单细胞RNA-seq分析
计算资源
计算资源可从其相应的网站上在线获得。
读段比对
参考基因组通过用来自GRCh38的人TREM2延伸小鼠mm10而构建；使用来自Ensembl93的转录组注释。使用10x Genomics(www.10xgenomics.com)提供的CellRanger 3.0.2版，使用默认参数，对来自微流控液滴平台的测序读段进行解复用和比对。质量控制，进行了多步质量评估。首先，单独分析每个样品(图S1A)。这里，所有24个样品都通过了初始质量控制，评价了基因组上所有作图读段的分布和Phred质量分数(Q)>30的测序碱基的分数。每个样品涵盖数千个捕获的事件，k，其为真细胞或具有环境RNA的空液滴；每个事件由唯一的条形码b鉴定。为了区分单个细胞，使用基于总UMI计数的常规阈值的方法，
首先，满足含有自动产生的标识描述的被按照总UMI计数的递减数量的顺序进行等级变换，从而产生向量通常是低可信度自动产生的标识描述的对于UMI计数相等的条形码，使用排列，在每组指数系处具有增加的值。然后，通过拟合具有20个自由度的三次平滑样条，将总UMI计数建模为条形码等级ln()～ln()的函数。此函数的每个拐点可以被解释为具有更大数量的总UMI(即，潜在的包含细胞的液滴)的条形码子集与具有环境RNA的大多数条形码之间的转变。拐点由样条基函数的一阶微分的局部最小值确定。对于每个样品，选择最接近预期回收细胞数的拐点并保留所有符合的条形码。的选择还受到所选条形码组的以下描述性度量的指导：i)分配给所选条形码的所有读段的百分比，ii)每个条形码的读段的中间数，iii)每个条形码的定位于线粒体基因的读段的中间分数，iv)每个条形码的UMI的中间数，v)每个条形码具有至少一个UMI计数的基因的中间数，以及vi)源自已经观察到的UMI(饱和)的读段的中间分数。通过评估度量ii-vi)的分布来进一步细化细胞选择，以去除低质量细胞和双重细胞。最后，估计了每个样品的细胞周期效应。使用Scialdone等人提出的基于机器学习的方法来预测每个细胞的细胞周期阶段(1)。简言之，分类器是针对在细胞周期中改变表达方向的成对基因进行训练的。然后，通过检查新数据集中表达差异的符号，可以预测每个细胞的细胞周期状态。预测G1或G2M评分高于0.5的细胞分别被分配到G1或G2M期；如果预测的G1和G2M评分低于0.5，则细胞被分类为处于S期。所有计算都是使用R包scran中的cyclone函数进行的。预测的细胞周期评分和期不用于细胞过滤。
接下来，进行综合质量控制步骤，以识别数据中不需要的技术伪影。汇集来自所有样品的所有经过滤的94488个细胞，并对所得的UMI计数矩阵进行归一化和对数转换(参见归一化)。为了揭示数据中的技术伪影，在控制性别、年龄和治疗等明显变量的情况下，计算了捕捉数据中最大方差的主成分。出于此目的，显式变量从归一化UMI计数矩阵中分离出来。信息基因由数据中的平均表达依赖方差无偏确定(参见基因表达方差建模)，并用于计算校正UMI计数矩阵的主成分(参见光谱维数减少)。所得38维潜在空间进一步使用均匀流形逼近和投影(UMAP；Python包umap-learn)用模糊拓扑结构建模，(2)来展开由细胞类型或技术差异驱动的数据结构。虽然不同的文库大小可以在细胞之间标准化，但由于转录组覆盖率差而导致的大部分缺失值(即，漏失)无法在数据中准确恢复，并将显著影响下游分析。因此，为了对细胞质量进行评分，计算评估每个细胞转录组覆盖范围的一组七个质量度量的第一个主成分:i-iv)由最高{500,200,100,50}表达基因消耗的读段部分，v)线粒体读段部分，vi)与UMI最大总数的相对距离(即，)，vii)与具有至少一个UMI计数的基因最大数量的相对距离。然后将所得的细胞质量(CQ)评分叠加到UMAP上，揭示了数据中的技术混杂因素(图S1B)。使用基于密度的空间聚类(R包dbscan)，提取了一组具有低CQ评分的代表性细胞。通过确定逆经验累积CQ评分分布函数的拐点(图S1C)，确定了最佳CQ分数截止值为-0.1，其去除了该组中最大细胞分数(91.4％)和最小细胞分数(11.1％)。这产生了71303个高质量单细胞的最终数据集(图S1D)。
归一化
文库大小按照Lun等人的建议进行了归一化(3)。简言之，大小因子是从相似细胞池中计算出来的，然后将其解卷积为基于细胞的因子，并用于缩放每个细胞中的计数。首先，对于每个批次，使用R包scran计算每个细胞的缩放因子。通过在共享的最近邻图上使用函数quickCluster来计算包含在数据中的细胞群体的初始猜测；对于共享最近邻图的构建，要求最小聚类大小为细胞总数的10％，最小平均基因表达为1。然后使用函数computeSumFactors计算大小因子，池大小范围为然后，根据平均UMI计数的比率对各批次之间的缩放因子进行归一化，以提供与使用R包分批法的最低覆盖率批次相当的结果。最后，缩放的UMI计数矩阵X由log2(X+1)进行log2变换。
监督式CD45+细胞类型注释
不是通过有偏见地选择标志物基因来确定细胞身份，而是使用总的可用转录组来无偏见地表征细胞类型。为此，首先过滤至少50个细胞中具有4个以上分子的强表达基因，去除核糖体和线粒体基因(分别从基因本体GO:0005840和Ensembl获得)，仅保留蛋白质编码基因，并去除与解离诱导的应激应答高度相关的一组136个基因(4)。这产生了由n个数据向量xj构成的单细胞表达矩阵X，其中j∈1,…,71303的维数 使用由免疫基因组计划(ImmGen)(5)在830个分选细胞的纯样品中测量的20种免疫细胞类型的对数归一化微阵列基因表达数据；处理后的表达式矩阵从SingleR R包中获得。通过评估平均表达依赖方差，筛选出此数据集中高度可变的3697个基因(参见基因表达方差建模)。斯皮尔曼的等级相关系数ρ(xi,yj)是在所有单细胞，和所有ImmGen样品，之间计算的，使用了两个数据集之间重叠的992个基因。平均最大值jρ(xi,yj)将每个单细胞指定为具有最相似表达谱的细胞类型。在此步骤中，在数据集中检测到15种细胞类型。由于单细胞数据的原始表达空间充满了噪声，并且scRNA-seq UMI计数和微阵列信号强度的潜在分布不同，旨在完善初始细胞类型分类。出于此目的，显式变量性别、年龄和治疗，以及三个技术混杂因素(定位于线粒体基因的读段分数、读段总数、分配给解离相关应激应答基因的读段分数)从X中回归出来。然后，计算高度可变基因(参见基因表达差异建模)的39维主成分空间(参见光谱维度减少)，并进行UMAP(Python包umap-learn)，以展现由细胞身份驱动的数据结构。接下来，产生加权单元邻接矩阵；权重通过使用其15个最近邻域的重叠的单元格之间的Jaccard指数来计算。使用分辨率为3×10-4的Leiden算法(6)(Java软件包Leiden)在邻接矩阵中识别了30个细胞群落(区段)。然后通过计算每个区段i中细胞类型为j的细胞数量将数据制成表格，得到矩阵为了避免在随后的计算中被0除，添加了一个伪计数A＝A+1。富集分数矩阵由下式导出。
最后，每个取代中的每个细胞都被指定为具有最高富集评分的细胞类型。这揭示了数据集中的64274个小胶质细胞。
分化基因表达分析
为了识别两组细胞之间的差异表达基因，开发了一种基于贝叶斯统计的直观和可扩展的方法。在此，计算了每组中每个基因的特异性和检出率。用后验概率来定义特异性。定义了如果观察到特征i的表达高于阈值则细胞j是组Z的成员的概率。检测水平由后验概率定义，即组Z中表达基因i高于阈值的细胞的相对分数。阈值参数被设置为2(即，每个细胞至少4个分子)。所有条件概率都使用贝叶斯定理计算，调整边际概率以避免样品大小偏差：
两组的最大基数。另外，基因i的表达强度平均值之间的绝对差异使用Cohen的d:
其中μ是基因表达平均值，并且σ1,2是两个样品的合并标准差{1,2}：
其中σ2是一组中的基因表达方差。
小胶质细胞基线注释
对于随后的下游分析，我们通过在至少50个细胞中稳健表达超过2个分子的基因来筛选归一化和处理的基因表达矩阵X，去除核糖体和线粒体基因(分别从基因本体论GO:0005840和Ensembl获得)，仅保留蛋白质编码基因，并去除一组与解离诱导的应激应答高度相关的基因(4)。为了注释小胶质细胞基线细胞异质性，从雄性和雌性对照hIgG1处理的TREM2CV-5XFAD小鼠中提取了5694个细胞。这产生了过滤的单细胞表达矩阵X'＝(x'ij)∈高度可变基因的数据向量(参见基因表达方差建模)被嵌入到使用扩散映射的非线性低维流形的附近(参见光谱维数减少)。这揭示了数据中的时间轴，推测是小胶质细胞激活轨迹。通过使用每个像元的最近邻域的重叠的Jaccard指数，从扩散分量计算加权像元邻接矩阵。使用R包igraph中可用的Louvain的社区检测方法对得到的图进行聚类。为了更好地理解数据的基本时态拓扑，使用slingshot R包中的getLinages函数在所有11个聚类之间拟合了一个无约束最大简约树。它揭示了具有5个末端的分支轨迹。具有最高表达的普通小胶质细胞标志物的簇被确定为静息小胶质细胞群体。进一步将聚类与先前研究中DAM的参考表达谱进行了比较(7)。首先，计算了所有簇与静息小胶质细胞群体之间基因表达log2倍变化的载体。然后，在参考研究中，计算了2期DAM与静息群体之间log2倍变化的单一向量。总的来说，两项研究之间有10124个基因重叠，导致每个聚类和参考的log2倍变化向量只有绝对log2倍数变化>0.5的基因被认为是差异表达的，并保留用于随后的分析。通过使用signum函数符号(zi)将每个log2倍变化向量二值化。通过计算数据与参考研究之间在表达方向性上的一致和不一致来将数据制成表格，得到一个列联表，将此表解释为混淆矩阵，即数据预测参考DAM群体表达趋势的程度。在此，通过从矩阵迹线(真阳性+真阴性)中减去非对角线值(假阳性+假阴性)的总和来计算相似性评分。进一步测试了零假设，即由trace(A)/ΣiΣjaij定义的两个数据集之间的总体一致性小于或等于由数据中最大类的分数定义的无信息率；使用R包插入符号计算测试统计。
每个细胞的预测细胞周期阶段用于识别一群循环的小胶质细胞；细胞周期阶段预测和评分在质量控制步骤中进行(参见质量控制)。使用PANTHER分类系统(8)进行基因本体术语富集分析，以从功能上表征所选簇的表达谱。通过将一个簇与所有其它簇的细胞池进行对比来确定标志物基因(参见差异基因表达分析)；通过满足最小特异性/检测率/效应大小阈值(IFN-R：75.0％/10.0％/1.5，MHC-II：50.0％/10.0％/1.0)来选择基因。使用数据集中包含的11361个基因作为每个统计过度代表测试的参考列表。假发现率用于校正多重检验的Fisher精确检验P值。
样品协调
鉴于hT2AB和对照hIgG1注射是在不同性别并携带不同TREM2变体的小鼠中进行的，接下来开发了一种受监督的样品协调方法，以确定性别、基因型和治疗对四种小胶质细胞轨迹的影响(图S3A)。使用小胶质细胞对照hIgG1处理小鼠的基线分析结果作为参考，对不同条件下的样品细胞进行分类。为了最小化分类误差，计算参考数据集和每个查询数据集的扩散分量(参见光谱维数减少)。在低维流形上应用机器学习，以从参考集中学习细胞类型，并使用Xtreme梯度增强对查询数据集进行分类。使用R包caret提供的网格搜索来优化机器学习模型的超参数。由于流形描述了一个具有重叠细胞簇边界的发育连续体，接受了87.5％的合理平均训练精度，以避免过度拟合。为了评估整体分类的准确性，使用了反向投影。在查询数据集的预测类上训练了一个分类器，并为参考数据集投影了细胞类型。92.9％的平均训练准确度表明查询数据集的预测类是高度一致的。模型实现了86.3％的高总体平均预测准确度(图S3B)。
小胶质细胞型轨迹重建
为了分析每种小胶质细胞类型的不同轨迹，从包含所有样品的表达矩阵中提取了分支簇、所有末端簇和中间簇t6。然后将数据按细胞类型分割：DAM轨迹＝{t5,t6,DAM}，Cyc-M轨迹＝{t5,Cyc-M}，IFN-R轨迹＝{t5，IFN-R}，MHC-II轨迹＝{t5,MHC-II}。使用最高变量基因(参见基因表达方差建模)上的扩散映射(参见光谱维度减少)将每个细胞类型轨迹的细胞嵌入到较低维度的流形上，并使用UMAP投影到2维上以展开潜在时间轴。为了进一步按时间顺序排列细胞，使用主曲线拟合每条直线的平滑轨迹曲线，并使用R包slingshot正交投影数据点；这里，弧长被解释为拟时间值(9)。
细胞类型组成分析
旨在描述小胶质细胞类型比例因性别、基因型和治疗而产生的差异。由于技术上的人为因素，单细胞数据中的细胞类型分数与体内的真实比例不是线性对应的，这些人为因素包含样品制备和处理或细胞分选过程中压力变化引起的细胞损伤等。进一步地，小样品大小可能不能恰当地代表实际群体。这可能导致生物复制之间细胞类型比例的巨大差异。通过使用分层bootstrap重采样，可以估计总体均值，纠正单个重复的采样偏差，以及测量估计的不确定性。设由2维向量构成的标记矩阵，具有标记指示符(例如，细胞类型或时间间隔)和用于m个细胞、l个标记水平和d个生物复制的生物复制指示符。例如，w1.＝{10,2}是W中列出的第一个细胞的标记向量，其从时间间隔10和第二次生物复制中采样。构建了大小为k的分层重样品，其中k设置为最大重复大小。然后将每个重采样制成表格，得到矩阵所述矩阵含有每个细胞标记和复制的绝对细胞数。为了保守地纠正单次重复中的偏差，通过以下方式对重新取样进行汇总
所得向量代表细胞类型比例的样品。执行了N＝500次自举迭代，得到矩阵细胞类型比例的估计值由以下得出。
标记j的估计细胞类型比例的95％置信区间的标准误差由下式得出：
表达动力学推断
使用负二项式广义相加模型(NB-GAM)(10)，在特定基因型、性别和治疗的细胞亚群上，将基因表达拟合为每个小胶质细胞类型轨迹的拟时间函数。如果基因的动态曲线的起点或终点在不同条件下不同，则进行Wald检验以检验假设，并使用NB-GAM平滑器的参数计算相应的对数变化倍数。这些计算是用R包tradeSeq进行的。为了对基因动力学进行统计分类，Wald检验P值通过假发现率对多重检验进行了校正。每个校正后的P值p通过pS和-log10转换的对数变化倍数S的符号进行加权。分别地，所得的负值表示下调，并且正值表示上调。
基因表达方差建模
通过假设生物异质性是由细胞间具有高差异的基因子集驱动的，旨在通过去除由技术噪声驱动的基因来提高分辨率。通过将方差拟合为平均表达的函数，将每个基因的总方差分解为其生物和技术成分(11)。通过用F分布对该拟合的残差建模来推断显著性。为了保留条件特异性变异，总是使用所有批次的所有高度可变基因的联合。方差分解和F分布统计使用R包scran进行计算。
光谱降维
这一步骤旨在减少冗余并提高数据中的信噪比，这最终将揭示数据中潜在的生物因素。出于此目的，采用了光谱降维方法。线性频谱嵌入通过主成分分析(PCA)获得。这种方法捕捉数据中的最大方差。它可能会遗漏数据中的子结构，但是对于具有低内在复杂性的数据来说是足够的，或者可以用于获得对数据结构的初步了解。用R包irlba计算PCA。通过使用扩散映射(12)进行非线性嵌入。此方法基于从每个细胞的表达谱上的距离函数D计算的细胞相异度矩阵来解析数据中的非线性和线性子结构。然而，如Haghverdi等人所提出的，使用多个局部sigma，而不是使用扩散核K中的估计的全局sigma来计算扩散分量，其中
将数据中的批次效应解释如下。对于PCA，通过每一批的中心向量的平均值使输入表达矩阵居中，并通过每一批的总细胞计数来缩放协方差矩阵。这确保了每个批次对加载向量的鉴定贡献相等(即，PCA不会被具有高细胞计数的样品所支配)。对于扩散映射，使用稳健的成对余弦相关距离。对于这两种技术，使用相互最近邻的批次校正(14)(R包分批法)对产生的低维矩阵进行批次效应校正。所选组分的数量由碎石图分析决定。
用于Aβ和图像分析的免疫染色
最初用含有0.25％Triton X-100的PBS+3％BSA溶液封闭和透化自由漂浮的脑切片。以1:1,000的稀释度添加Aβ1-16的初级抗体(6E10，联合Alexa Fluor 488，803013，百进生物公司(BioLegend))，以1:500的稀释度添加Aβ42的初级抗体(兔重组单克隆抗体，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))，在4℃过夜。次级抗体，抗兔IgG AlexaFluor 647(山羊重组多克隆，1:1,000；英杰公司(Invitrogen))和甲氧基-X04(3μg/ml；Tocris)在室温下添加，持续1.5小时。使用20×0.95-NA物镜在Nikon A1Rsi+共聚焦激光扫描显微镜上拍摄共聚焦照片。记录z方向上具有1.1-mm步骤的z堆叠，1,024×1,024-像素分辨率。Aβ区域覆盖率的百分比通过ImageJ中的批处理自动计算。
Aβ和趋化因子/细胞因子定量
通过MSD V-plex 6E10试剂盒(美索规模发现公司(Meso Scale Discovery))测量人Aβ1-40和Aβ1-42，并且通过MSD U-plex生物标志物组1测定(美索规模发现公司)测量小鼠IL-1b、CXCL10(IP-10)和CCL4(MIP-1b)。简言之，来自抗体或经对照hIgG1处理的小鼠的皮质组织用组织裂解剂II(凯杰公司(Qiagen))在含有0.5％Triton x-100和1x Halt蛋白酶抑制剂混合物的12x v/w PBS中匀浆。通过100,000g超速离心1小时沉淀不溶性级分。收集上清液作为可溶性PBS级分。将沉淀重悬于250μl的6M胍和50mM Tris，pH 8.0缓冲液中，并通过超声处理进一步匀浆，随后以75,000rpm超速离心以澄清变性沉淀。收集上清液作为不溶性胍级分。
7.1.9.补充参考文献
下文和本文讨论的具体参考文献全部并入本文。
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序列表
<110> 维吉尔神经科学公司（Vigil Neuroscience, Inc.）
<120> TREM2激动剂生物标志物和其使用方法
<130> 403433-004WO (187635)
<160> 18
<170> PatentIn版本 3.5
<210> 1
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 1
Met Glu Pro Leu Arg Leu Leu Ile Leu Leu Phe Val Thr Glu Leu Ser
1 5 10 15
Gly Ala His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Ala Gly Gln Ser Leu
20 25 30
Gln Val Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys
35 40 45
Ala Trp Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val
50 55 60
Ser Thr His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly
65 70 75 80
Ser Thr Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr
85 90 95
Leu Arg Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser
100 105 110
Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val
115 120 125
Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro
130 135 140
Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile Ser
145 150 155 160
Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser Ile Leu
165 170 175
Leu Leu Leu Ala Cys Ile Phe Leu Ile Lys Ile Leu Ala Ala Ser Ala
180 185 190
Leu Trp Ala Ala Ala Trp His Gly Gln Lys Pro Gly Thr His Pro Pro
195 200 205
Ser Glu Leu Asp Cys Gly His Asp Pro Gly Tyr Gln Leu Gln Thr Leu
210 215 220
Pro Gly Leu Arg Asp Thr
225 230
<210> 2
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 2
Met Glu Pro Leu Arg Leu Leu Ile Leu Leu Phe Val Thr Glu Leu Ser
1 5 10 15
Gly Ala His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Ala Gly Gln Ser Leu
20 25 30
Gln Val Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys
35 40 45
Ala Trp Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Trp Ser
50 55 60
Thr His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly Ser
65 70 75 80
Thr Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr Leu
85 90 95
Arg Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser Leu
100 105 110
His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val Leu
115 120 125
Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro Gly
130 135 140
Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile Ser Arg
145 150 155 160
Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser
165 170
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Ala Gln Ala Gln Ser Asp
20 25 30
Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met
35 40 45
Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu
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Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg
65 70 75 80
Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly
85 90 95
Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr
100 105 110
<210> 4
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 4
Met Arg Lys Thr Arg Leu Trp Gly Leu Leu Trp Met Leu Phe Val Ser
1 5 10 15
Glu Leu Arg Ala Ala Thr Lys Leu Thr Glu Glu Lys Tyr Glu Leu Lys
20 25 30
Glu Gly Gln Thr Leu Asp Val Lys Cys Asp Tyr Thr Leu Glu Lys Phe
35 40 45
Ala Ser Ser Gln Lys Ala Trp Gln Ile Ile Arg Asp Gly Glu Met Pro
50 55 60
Lys Thr Leu Ala Cys Thr Glu Arg Pro Ser Lys Asn Ser His Pro Val
65 70 75 80
Gln Val Gly Arg Ile Ile Leu Glu Asp Tyr His Asp His Gly Leu Leu
85 90 95
Arg Val Arg Met Val Asn Leu Gln Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gln
100 105 110
Cys Val Ile Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Pro His Met Leu Phe Asp Arg
115 120 125
Ile Arg Leu Val Val Thr Lys Gly Phe Ser Gly Thr Pro Gly Ser Asn
130 135 140
Glu Asn Ser Thr Gln Asn Val Tyr Lys Ile Pro Pro Thr Thr Thr Lys
145 150 155 160
Ala Leu Cys Pro Leu Tyr Thr Ser Pro Arg Thr Val Thr Gln Ala Pro
165 170 175
Pro Lys Ser Thr Ala Asp Val Ser Thr Pro Asp Ser Glu Ile Asn Leu
180 185 190
Thr Asn Val Thr Asp Ile Ile Arg Val Pro Val Phe Asn Ile Val Ile
195 200 205
Leu Leu Ala Gly Gly Phe Leu Ser Lys Ser Leu Val Phe Ser Val Leu
210 215 220
Phe Ala Val Thr Leu Arg Ser Phe Val Pro
225 230
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Asn Asn Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 6
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 7
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 8
Leu Gln Asp Asn Asn Phe Pro Pro Thr
1 5
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Ala Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Arg Gln Gly Ile Phe Gly Asp Ala Leu Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 10
Ser Tyr Trp Ile Gly
1 5
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Ala Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 12
Arg Arg Gln Gly Ile Phe Gly Asp Ala Leu Asp Phe
1 5 10
<210> 13
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 13
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Asn Asn Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 14
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 14
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr
20 25 30
Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
50 55 60
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile
65 70 75 80
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln
100 105 110
Asp Asn Asn Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 15
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 15
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Asn Asn Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 16
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Ala Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Arg Gln Gly Ile Phe Gly Asp Ala Leu Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr
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Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 17
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 17
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
20 25 30
Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly
35 40 45
Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Ala
65 70 75 80
Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys
85 90 95
Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp
100 105 110
Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Arg Gln Gly Ile Phe Gly Asp
115 120 125
Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
370 375 380
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405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 18
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Ala Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Arg Gln Gly Ile Phe Gly Asp Ala Leu Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly
210 215 220
Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
290 295 300
Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
305 310 315 320
Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro
340 345 350
Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr
355 360 365
Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly
385 390 395 400
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
405 410 415
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
420 425 430
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445

Claims (20)

1.一种鉴定将受益于用TREM2激动剂进行治疗的患有阿尔茨海默氏病(Alzheimer'sdisease)的患者的方法，所述方法包括：
(a)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之前，从所述患者获得第一生物样品；
(b)测量所述第一生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5和USP18；
(c)向所述患者施用有效量的TREM2激动剂；
(d)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之后，从所述患者获得第二生物样品；以及
(e)测量所述第二生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5和USP18。
2.一种预测患者的阿尔茨海默氏病对TREM2激动剂的治疗应答的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之前，从所述患者获得第一生物样品；
(b)测量所述第一生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(c)处理来自所述患者的所述生物样品或参考样品；
(d)测量经处理的生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(e)将处理前的生物样品中的更多种生物标志物中的一种生物标志物与所述经处理的生物样品或经处理的参考样品中的一种或多种生物标志物进行比较；以及
(f)任选地，如果预测此类施用相对于治疗所述阿尔茨海默氏病的替代方法具有等效或更高的成功可能性，则继续向所述患者施用所述TREM2激动剂；
(g)其中响应于步骤(c)的生物标志物变化基于与一个或多个相似患者相比更大或更小的生物标志物变化并且如使用所述生物标志物中的一种或多种生物标志物所评估的，预测成功治疗所述阿尔茨海默氏病的可能性。
3.一种用TREM2激动剂治疗阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括：
(a)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之前，从所述患者获得第一生物样品；
(b)测量所述第一生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(c)向所述患者施用有效量的TREM2激动剂；
(d)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之后，获得第二生物样品；以及
(e)测量所述第二生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
其中当来自所述患者的所述第二生物样品中的一种或多种选自以下各项的生物标志物的水平高于来自所述患者的所述第一生物样品中的一种或多种生物标志物的水平时，则向所述患者施用一个或多个另外剂量的所述TREM2激动剂：APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18。
4.一种监测对TREM2激动剂的患者应答的方法，所述包括以下步骤：
(a)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之前，从所述患者获得第一生物样品；
(b)测量来自所述患者的所述第一生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
(c)向所述患者施用有效量的TREM2激动剂；
(d)在向所述患者施用所述TREM2激动剂之后，从所述患者获得一个或多个后续生物样品；以及
(e)测量所述后续生物样品中一种或多种生物标志物的水平，所述一种或多种生物标志物选自APOE、B2M、BIRC5、BST2、C1QA/B/C、CCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCNB2、CD3G、CD63、CD74、CD81、CD9、CST7、CTSB、CXCL10、CXCL2、FTL1、H2-AA、H2-AB1、H2AFV、H2AFZ、H2-D1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-K1、H2-OA、H2-OB、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、HEXB、HMGB2、HMGN2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IL1B、IRF7、ISG15、LGALS3BP、LGMN、LPL、LY6E、MLF、MR1、MRC1、MS4A4B、OASL2、OLFML3、P2RY12、PF4、RTP4、SLFN2、SPARC、STMN1、TMEM119、TUBA1B、TUBB5或USP18；
其中可比较所述第一生物样品和所述后续生物样品中的更多种生物标志物中的一种生物标志物的水平，并且所述生物标志物中的一种或多种生物标志物的变化指示患者应答。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自FTL1、MLF、CD63、LPL、CTSB、CST7、APOE、CCL4、CD9或CCL3。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自C1QA/B/C、CD81、HEXB、IL1B、LGMN、OLFML3、P2RY12、SPARC、TMEM119、MRC1、PF4、CD3G或MS4A4B。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自H2AFZ、HMGB2、TUBA1B、HMGN2、H2AFV、IFI2712A、TUBB5、BIRC5、STMN1或CCNB2。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自CCL12、IFITM3、ISG15、IFIT3、BST2、OASL2、LGALS3BP、RTP4、IFI204或IRF7。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自H2-K1、H2-Q7、H2-EB1、CD74、H2-AA、H2-D1、H2-AB1、H2-DMA、H2-T23或LY6E。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自BST2、CCL2、IFI204、IFI2712A、IFIT3、IFITM3、IRF7、ISG15、LGALS3BP、OASL2、RTP4、SLFN2或USP18。
11.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自B2M、H2-D1、H2-K1、H2-Q10、H2-Q4、H2-Q6、H2-Q7、H2-T23、MR1、CD74、H2-AA、H2-AB1、H2-DMA、H2-DMB1、H2-DMB2、H2-EB1、H2-OA或H2-OB。
12.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自CCL2、CCL4、CST7、CXCL2、CXCL10、IL1B或TMEM119。
13.一种在患者中诱导朝向特异性小胶质细胞类型轨迹的小胶质细胞激活的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的TREM2激动剂，其中所述患者的所述小胶质细胞激活朝向：
(a)疾病相关(DAM)小胶质细胞类型轨迹；
(b)干扰素应答(IFN-R)小胶质细胞类型轨迹；
(c)循环(Cyc-M)小胶质细胞类型轨迹；和/或
(d)MHC-II表达性(MHC-II)小胶质细胞类型轨迹，
其中所述患者被诊断患有阿尔茨海默氏病。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述TREM2激动剂是抗hTREM2抗体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗hTREM2抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括：具有根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDRL1；具有根据SEQ IDNO:7的氨基酸序列的CDRL2；以及具有根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDRL3，所述重链可变区包括：具有根据SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDRH1；具有根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDRH2；以及具有根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDRH3。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗hTREM2抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列，所述重链可变区具有根据SEQ IDNO:9的氨基酸序列。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述抗hTREM2抗体是IgG，任选地IgG1。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述抗hTREM2抗体包括κ轻恒定区。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中根据EU编号，所述抗hTREM2抗体是包括具有一个或多个选自R292C、N297G、V302C、D356E或L358M的突变的变体恒定区的IgG1。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中所述抗hTREM2抗体包括轻链和重链可变区，所述轻链具有根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列，所述重链可变区具有根据SEQID NO:16的氨基酸序列。
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