CN117230070A - 一种靶向结合c-Myc蛋白的核酸适配体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种靶向结合c‑Myc蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体的序列包括Seq I D No：1或Seq I D No：2所示的核苷酸序列；该核酸适配体具有亲和力高、分子量小、免疫原性低等优点。本发明基于上述核酸适配体开发了其他相关物质，如核酸适配体的联合物、核酸适配体的衍生物、产品以及应用。尤其是将核酸适配体作为c‑Myc的结合配体与E3泛素连接酶的配体偶联，形成基于c‑Myc核酸适配体的PROTAC，通过泛素‑蛋白酶体途径降解c‑Myc蛋白，表现出良好的抗肿瘤活性，可应用在c‑Myc蛋白相关肿瘤治疗领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术及医药学领域，特别是涉及一种靶向结合c-Myc蛋白的核酸适配体及应用。
背景技术
MYC包括c-Myc、N-Myc、L-Myc，约在70％的人类恶性肿瘤中异常表达c-Myc，其中，c-Myc作为转录因子，主要调控关于核糖体生物发生、蛋白质总体翻译、细胞周期蛋白和细胞代谢相关基因的表达，当c-Myc表达出现异常，会诱导癌症的发生，因此，c-Myc是药物研发热点。然而，c-Myc是一种固有无序蛋白，单独的c-Myc蛋白没有稳定的构象，缺乏小分子特异结合的“口袋”，一直被认为是“不可成药”靶点。并且，c-Myc主要定位于细胞核内，因此，MYC这一“难以成药”靶点依然是当前抗癌药物研发的一大挑战。目前，c-Myc是药物研发热点和难点，直接靶向c-Myc通路的c-Myc-Max复合物的相互作用或抑制复合物与DNA结合，或间接调控c-Myc上下游通路，开发的药物形式多样，涉及小分子抑制剂、多肽、PROTAC、分子胶等，然而，目前仅有三款药物进入临床研究(Omomyc/PC002/WBC100)，多款药物尚处于早期阶段。另外，c-Myc在癌症中主要是过度表达，然而，针对c-Myc的敲低试验(I/II期)都被终止，原因尚未公布。一种新兴技术即蛋白质水解靶向嵌合体(proteolysis-targetingchimera,PROTAC)为克服小分子抑制剂的局限性提供了新的机会。PROTAC于2001年首次由Crews和同事提出，由3部分组成：靶蛋白配体、E3泛素连接酶配体、中间有一个连接子。将靶蛋白-PROTAC-E3连接酶三元复合物，随后靶蛋白被E3连接酶泛素化修饰，通过蛋白酶体途径进行降解。目前，针对c-Myc开发的PROTAC技术，涉及了基于小分子的PROTAC(US202/0390894A1)和基于寡核苷酸的PROTAC(Craig M.Crews，2022。)，目前也均处于早期研发阶段，因此开发直接靶向c-Myc蛋白的配体，解决c-Myc缺乏小分子配体的困境，是开发靶向c-Myc药物的关键。
核酸适配体，也被称为化学抗体。迄今为止，已经产生了许多针对广泛靶标的适体，包括蛋白质、小金属离子、多肽、细胞、病毒、细菌等。适配体能够包含不同官能团的靶标，区分密切相关的分子，如构象异构体，甚至氨基酸突变。与小分子配体对靶标具有特异性结合袋的要求相比，核酸适配体对靶标基本没有特殊要求。因此，核酸适配体作为一种化学生物学工具，在靶向不可药物蛋白以解决“不可药物”靶点缺乏配体的困境方面显示出很大的优势。目前，特异性靶向c-Myc蛋白的核酸适配体的还未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可以直接靶向结合c-Myc蛋白的核酸适配体，并基于此开发其他相关物质及应用，尤其是可以靶向降解c-Myc蛋白的物质及应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一方面，本发明提供了一种靶向结合c-Myc蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体的序列包括或由以下序列组成：
(1)Seq ID No：1所示的核苷酸序列；
或(2)Seq ID No：2所示的核苷酸序列；
或(3)具有与(1)或(2)的序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性且能特异性结合c-Myc蛋白的核苷酸序列；例如，本领域技术人员可以按本领域的常规技术，将上述(1)(2)中的核苷酸序列删除或增加部分互补的核苷酸、或替换部分序列，使修改后的序列与原序列具有一定的同源性并能保持特异性结合c-Myc蛋白的功能
或由(1)、(2)或(3)中的任意一条核苷酸序列在体内或体外转录且能特异性结合c-Myc蛋白的核糖核苷酸序列。
进一步地，基于上述靶向结合c-Myc蛋白的核酸适配体的获得，可以理解的是，本领域技术人员可以按本领域的常规技术对上述核酸适配体进行修饰，使其也具有相同的功能。例如，对上述核酸适配体进行修饰且修饰后的核酸适配体都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，且都能特异性结合c-Myc蛋白；所述化学修饰为以下任意一种或多种：磷酸化、氨基化、甲基化、巯基化、同位素化、将氧替代为硫、将氧替代为硒。
第二方面，本发明还提供一种核酸适配体的联合物，为能特异性结合c-Myc蛋白的核酸适配体联合物，包括上述的靶向结合c-Myc蛋白的核酸适配体及与所述核酸适配体连接的连接用物质。
进一步地，所述连接用物质为检测、标记、诊断或治疗物质；
或，所述联合物的连接方式采用如下任意一种或多种：T4 DNA ligase连接、PCR连接、生物合成连接；
或，所述连接用物质采用以下任意一种或多种：化学小分子类、生物大分子类、生物材料类。
进一步地，包括将所述靶向结合c-Myc蛋白的核酸适配体与E3泛素连接酶的配体，偶联形成基于c-Myc核酸适配体的PROTAC，靶向降解c-Myc。
进一步地，所述E3泛素连接酶为CRBN或VHL；
所述配体为化学小分子、多肽、核酸适配体或抗体。
第三方面，本发明还提供了一种核酸适配体的衍生物，以上述的核酸适配体或上述的核酸适配体的联合物为主体所改造的能特异性结合c-Myc蛋白的硫代磷酸脂类衍生物；
或以上述的核酸适配体或上述的核酸适配体的联合物的核苷酸序列为基础所合成的能特异性结合c-Myc蛋白的肽核酸；
条件是衍生物都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，且都与c-Myc蛋白结合。
第四方面，本发明还提供了一种产品，包括上述的核酸适配体或核酸适配体的联合物或核酸适配体的衍生物；所述产品为试剂、试剂盒或药物。
第五方面，本发明还提供了一种上述核酸适配体的应用，其特征在于，所述应用为以下所列各项组成的组中的任意一项或多项：
(1)分离纯化c-Myc蛋白；
(2)标记c-Myc蛋白；
(3)c-Myc蛋白的成像；
(4)定量或定性检测c-Myc蛋白；
(5)制备c-Myc蛋白的抑制剂；
(6)制备靶向c-Myc蛋白的试剂或药物；
(7)制备降解c-Myc蛋白的PROTAC降解剂；
(8)制备用于诊断和治疗c-Myc蛋白相关疾病的试剂或药物；
(9)制备用于检测、成像、诊断和治疗c-Myc蛋白相关疾病的试剂盒。
进一步地，所述c-Myc蛋白相关疾病为肿瘤疾病。
本发明利用体外筛选技术筛选核酸适配体，经过共12轮的筛选富集，进行高通量测序，最终得到了能特异性地，高亲和力地结合c-Myc蛋白的核酸适配体，该核酸适配体具有亲和力高、分子量小，免疫原性低等优点。基于上述获得的核酸适配体开发其他相关物质，如核酸适配体的联合物、核酸适配体的衍生物、相关试剂、试剂盒或药物产品以及应用。尤其是将核酸适配体作为c-Myc的结合配体与E3泛素连接酶的配体偶联，形成基于c-Myc核酸适配体的PROTAC，通过泛素-蛋白酶体途径降解c-Myc蛋白，表现出良好的抗肿瘤活性，可应用在c-Myc蛋白相关肿瘤治疗领域。
附图说明
上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
图1是MA9的结构及与其对应的KD值结果图；
图2是评估测定了MA9C1的KD值结果图；
图3是体外(A)和体内(B)MA9C1与c-Myc蛋白结合的特异性的结果图；
图4是基于MA9C1与E3泛素化连接酶配体构建的PROTAC嵌合体(MA9C1-CRBN和MA9C1-VH)的质谱分析结果图；
图5是评估构建的MA9C1-CRBN与c-Myc蛋白的结合情况结果图，其中，A为荧光分析结果图；B为流式分析结果图；
图6是评估两种PROTAC分子在肿瘤细胞中降解c-Myc蛋白的能力结果图；其中A为MA9C1-CRBN的结果图，B为MA9C1-VHL的结果图。
图7是不同时间点MA9C1-CRBN在肿瘤细胞中降解c-Myc蛋白的能力结果图；其中A为12小时结果图，B为24小时结果图；C为48小时结果图，D为免疫荧光实验结果图；
图8是评估MA9C1-CRBN的抗肿瘤活性结果图；其中，A为MA9C1-CRBN对于HCT116细胞的影响结果图；B为MA9C1-CRBN对于HCT116细胞的迁移能力(细胞划痕实验)的影响结果图；C为与B对应的柱状图；D为MA9C1-CRBN对于肿瘤细胞的增殖，侵袭能力的影响结果图；E为与D对应的柱状图；
图9是分析MA9C1-CRBN降解c-Myc蛋白的机制结果图；其中，A为CRBN蛋白小分子抑制剂泊马度胺(Pomalidomide),MA9C1和MA9C1-CRBN降解c-Myc蛋白的情况；B为在CRBN蛋白小分子抑制剂泊马度胺(Pomalidomide)存在的情况下是否能抑制MA9C1-CRBN的降解c-Myc蛋白的效果；C为MLN4924存在的情况下是否能抑制MA9C1-CRBN的降解c-Myc蛋白的效果；D为MG132存在的情况下是否能抑制MA9C1-CRBN的降解c-Myc蛋白的效果；E为MA9C1-CRBN是否能增强c-Myc蛋白的泛素化结果图；F为免疫共沉淀实验验证c-Myc、MA9C1-CRBN和CRBN三元复合物的形成结果图。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域技术人员。
实施例1：
传统体外筛选适配体技术，以磁珠法最为常用，但该方法适用于对含有标签蛋白的筛选，且存在筛选效率较低、筛选成功率不高的问题。本发明建立无标签蛋白的微孔板筛选技术，实现对无标签的人源c-Myc蛋白适配体的筛选。筛选过程是使用微孔板将蛋白固定，然后与游离的寡核苷酸文库孵育，通过不断增加筛选压力(包括增加洗杂液中Tween-20浓度，逐轮减少c-Myc蛋白量，加BSA和酵母tRNA进行竞争性筛选)，去除与c-Myc蛋白亲和力弱的序列，经15轮指数型富集，筛选到与c-Myc蛋白有高亲和力的核酸适配体MA9。
实施例2：评估MA9对于c-Myc蛋白的亲和力大小
本发明是通过体外筛选技术筛选核酸适配体，经过共12轮的筛选富集，进行高通量测序，最终得到了能特异性地，高亲和力地结合c-Myc蛋白的核酸适配体(MA9，Seq IDNo：1)。
本发明使用分子相互作用系统Pall forteBio Octet K2进行MA9的KD值测定。将生物素标记的MA9固定在生物传感器上，使用c-Myc蛋白作为分析物，经过固化，结合，解离等步骤，传感器所接收的光吸收值变化换算出相应的速率，经过计算得出MA9与c-Myc蛋白之间的亲和力常数KD值为27.37nM(图1),相比于c-MYC与其靶DNA的E-box的KD值189nM更低,相比与目前报道靶向结合c-Myc/Max二聚体的苏糖核酸适配体(TNA)(Xiaoxiang Guan，2023)，其Kd值是56nM，也更佳，因此，说明MA9与c-Myc蛋白结合的亲和力高。
所述序列信息：
MA9(Seq ID No：1)：
5’-CGTTACTTCTGTTCGTTCTCATGGCGAACCCTGTATGGCGCGTAAGTCGGGGAGTAACGTCTGCCTAGTTCCTTGTCTGATCTCCA-3’
实施例3：评估基于MA9改造的序列与c-Myc蛋白结合的亲和力大小
本发明通过分析MA9序列的二级结构，基于该序列进行剪短优化，得到了一条剪短序列命名为MA9C1(Seq ID No：2)。使用分子相互作用系统Pall forteBio Octet K2进行MA9C1的KD值测定。将生物素标记的MA9C1固定在生物传感器上，使用c-Myc蛋白作为分析物，经过固化，结合，解离等步骤，传感器所接收的光吸收值变化换算出相应的速率，经过计算得出MA9C1与分析物c-Myc蛋白之间的亲和力常数KD值为29.90nM。说明剪短序列MA9C1与c-Myc蛋白结合的亲和力高(图2)。
所述序列信息：
MA9C1(Seq ID No：2)：
5’-CGTTACTTCTGTTCGTTCTCATGGCGAACCCTGTATGGCGCGTAAGTCGGGGAGTAACG-3’
实施例4：评估MA9C1与c-Myc蛋白结合的特异性
本发明通过ELISA实验来验证MA9C1与c-Myc蛋白结合的特异性。本发明将Myc蛋白，IgG蛋白，PD1蛋白，LAG-3蛋白，GFP蛋白，VIIa蛋白，PDL1蛋白,BSA蛋白，MAX蛋白等包被在96孔板上，再将带生物素标记的MA9C1与这些蛋白结合30min后，洗杂3次。加入HRP-链霉亲和素孵育30min后，洗杂3次，再加入TMB反应，终止后在OD450nm处进行测量吸光值。结果显示，MA9C1特异性与c-Myc蛋白有较高的结合力，而不与其他蛋白结合(图3A)。
接着，本发明想检测MA9C1与细胞内表达的c-Myc蛋白是否有特异性的结合，本发明在HEK293T细胞中过表达c-Myc蛋白，将其裂解液和未过表达c-Myc蛋白的HEK293T细胞裂解液包被在96孔板上，与上述步骤相同，检测MA9C1与其结合情况。结果表明，MA9C1只与过表达c-Myc蛋白的HEK293T细胞裂解液有结合，说明MA9C1特异性结合c-Myc蛋白，不与其他细胞内的蛋白结合(图3B)。
实施例5：评估基于MA9C1与E3泛素化连接酶配体构建PROTAC嵌合体
为了构建靶向降解c-Myc蛋白的降解剂，将MA9C1与E3泛素化连接酶(CRBN和VHL)的小分子配体进行偶联，形成基于c-Myc适配体的PROTAC，实现对c-Myc蛋白的降解。本发明将MA9C1与E3泛素化连接酶(CRBN和VHL)的小分子配体通过脱水缩合反应进行连接反应。首先，本发明在MA9C1的5-端进行氨基修饰，之后将其与两种E3泛素化连接酶配体(Pomalidomide-PEG4-C-COOH(CRBN)和VH032-PEG5-COOH(VHL))在磷酸盐缓冲液里过夜连接，得到两种PROTAC嵌合体，分别命名为MA9C1-CRBN和MA9C1-VHL，两种嵌合体通过质谱分析，分子量大小符合预期，说明连接成功(图4)。
实施例6：评估构建的MA9C1-CRBN与c-Myc蛋白的结合情况。
为了评估本发明所构建的MA9C1-CRBN与c-Myc蛋白的结合情况，本发明将FAM-标记的MA9C1与结合了c-Myc蛋白的Co2+微珠进行孵育，通过洗杂后，在荧光显微镜下观察荧光情况。结果表明，与随机序列(RS)相比，MA9C1-CRBN跟MA9C1一致都能与c-Myc蛋白有较强的结合荧光(图5A)。
接着，本发明使用流式分析MA9C1-CRBN与c-Myc蛋白的结合情况。FAM-标记的MA9,MA9C1,MA9C1-CRBN都能与结合了c-Myc蛋白的Co2+微珠结合，而随机序列(RS)却不结合，说明本发明所构建的MA9C1-CRBN能有效的结合c-Myc蛋白(图5B)。
实施例7：评估两种PROTAC(MA9C1-CRBN和MA9C1-VHL)在肿瘤细胞中降解Myc蛋白的能力。
为了评估本发明所构建的两种PROTAC在肿瘤细胞中降解c-Myc蛋白的能力，本发明选取了人结肠癌细胞(HCT116细胞)进行实验。首先，本发明将两种不同浓度的PROTAC通过转染的方式转入HCT116细胞中，24h后收取细胞进行Western Blot分析，结果表明,与随机序列相比两种PROTAC都表现出对c-Myc蛋白的降解效果，并且MA9C1-CRBN在低浓度时表现出了更好的降解效果(图6)。因此，本发明选择MA9C1-CRBN进行接下来实验。
实施例8：评估不同时间点MA9C1-CRBN在肿瘤细胞中降解c-Myc蛋白的能力
为了验证处理时间和PROTAC浓度对c-Myc蛋白降解的影响,本发明分别在12h、24h、和48h下检测了不同浓度的MA9C1-CRBN对c-Myc蛋白降解的影响，结果显示：处理时间为12h时，在10nM时，c-Myc蛋白开始有降解，浓度为25nM时降解效果最强，灰度分析显示c-Myc蛋白水平降低了约80％，而随着浓度提高至50、75、100nM时，c-Myc蛋白的降解效果又被抑制了(图7A)，这可能是因为“Hook效应”，即PROTAC在高浓度时，优先形成c-Myc-PROTAC和CRBN-PROTAC两种二元复合物，影响了三元复合物的形成，导致降解效果降低；处理时间为24h时，浓度为25、50nM时降解效果最好，c-Myc蛋白水平降低75％以上，浓度为75、100nM时则出现降解效果减弱(图7B)。处理时间为48h时，MA9C1-CRBN仍然能够降解c-Myc蛋白，浓度为25nM时c-Myc蛋白水平降低了60％(图7C)，这表明MA9C1-CRBN能够在细胞内持续发挥降解作用。
免疫荧光实验能够观察细胞中蛋白靶点的亚细胞定位和蛋白量变化情况。因此，本发明想通过免疫荧光实验观察c-Myc蛋白的降解情况。本发明在HCT116细胞中转染50nMMA9C1-CRBN，处理细胞24h后，进行细胞固定，然后孵育Myc一抗和荧光二抗。共聚焦显微镜拍摄结果显示：相比于Blank组，50nM MA9C1-CRBN处理后，Myc蛋白的荧光明显减弱(图7D)。
实施例9：评估MA9C1-CRBN的抗肿瘤活性
MYC蛋白与肿瘤的发生发展相关，本发明已经验证了MA9C1-CRBN能够在肿瘤细胞体内降解c-Myc蛋白。于是，本发明想要评估MA9C1-CRBN是否具有抗肿瘤相关功能。首先，本发明通过细胞增殖实验(CCK8)来检测MA9C1-CRBN对于HCT116细胞的影响。将MA9C1-CRBN以转染的方式进入细胞后，发现与RS和MA9C1相比，50nM的MA9C1-CRBN对于HCT116细胞有明显的抑制增殖效果，说明MA9C1-CRBN具有抗肿瘤细胞增殖活性(图8A)。接着，本发明评估了MA9C1-CRBN对于HCT116细胞的迁移能力(细胞划痕实验)的影响，与Mut-MA9C1-CRBN和MA9C1相比，结果发现MA9C1-CRBN能有效抑制HCT116细胞的迁移能力(图8B，C)。此外，本发明检测了MA9C1-CRBN对于肿瘤细胞的增殖，侵袭能力的影响(克隆形成实验)，与Mut-MA9C1-CRBN和MA9C1相比，MA9C1-CRBN能有效抑制HCT116细胞的克隆形成(图8D，E)。以上结果说明MA9C1-CRBN表现出有效的抗肿瘤活性。
实施例10：评估MA9C1-CRBN降解c-Myc蛋白的作用机制
为了清楚知道MA9C1-CRBN在体内降解c-Myc蛋白的机制，本发明首先使用CRBN蛋白小分子抑制剂泊马度胺(Pomalidomide)和MA9C1一起进行降解实验。实验结果表明，在Pomalidomide的存在下，c-Myc蛋白不能被降解，而MA9C1-CRBN也不能发挥降解c-Myc蛋白的能力(图9A,B)，本发明可以得出MA9C1-CRBN是依赖于CRBN蛋白发挥降解功能的。
为了验证MA9C1-CRBN是否通过将c-Myc泛素化，进而降解c-Myc蛋白，本发明在MA9C1-CRBN处理前加入20μM MLN4924处理1h以抑制E3连接酶泛素化靶蛋白的能力，再转染50nM MA9C1-CRBN处理24h。Western blot结果显示MLN4924(类泛素化抑制剂)处理导致MA9C1-CRBN降解的c-My的效果消失(图9C)，说明MA9C1-CRBN对c-Myc的降解是需要泛素化的。为了验证MA9C1-CRBN是否通过26S蛋白酶体途径降解c-Myc蛋白，本发明在MA9C1-CRBN处理前加入20μM MG132(26S蛋白酶体抑制剂)处理1h，再转染50nM MA9C1-CRBN。Westernblot结果显示：MG132处理后，MA9C1-CRBN的c-Myc蛋白降解能力消失(图9D)，这说明MA9C1-CRBN通过蛋白酶体途径降解c-Myc蛋白。
为了验证MA9C1-CRBN能否将c-Myc蛋白泛素化，本发明在HEK293T细胞中进行了c-Myc蛋白泛素化实验。本发明先在HEK293T细胞中过表达泛素蛋白，然后使用MG132预处理1h以抑制c-Myc蛋白的降解，在HEK293T细胞中分别转染50Nm MA9C1-CRBN和RS-CRBN，处理6h后检测c-Myc蛋白的泛素化水平。Western blot实验结果表明：相比于RS-CRBN处理，c-Myc蛋白经MA9C1-CRBN处理后，c-Myc蛋白的泛素化水平提高(图9E)。这表明，MA9C1-CRBN能够将c-Myc蛋白泛素化进而降解。
为了确定c-Myc、MA9C1-CRBN和CRBN三元复合物是否形成，本发明通过共沉淀实验来验证。本发明先在293T细胞中过表达c-Myc-His和CRBN-Flag蛋白，然后在MG132预处理1h以抑制MYC蛋白的降解，在HEK293T细胞中转染200nM MA9C1-CRBN和RS-CRBN，处理12h后裂解细胞，将细胞裂解液置于室温孵育2h后加入Anti-Flag磁珠以结合CRBN蛋白，随后通过Western blot实验检测c-Myc蛋白是否被共沉淀。实验结果表明：相比于RS-CRBN处理，MA9C1-CRBN处理后，c-Myc蛋白和CRBN蛋白能够结合，出现了共沉淀现象(图9F)。以上结果说明MA9C1-CRBN连接c-Myc和CRBN，形成三元复合物，通过泛素-蛋白酶体途径实现对c-Myc的降解。
上述实施例重点阐述了本发明利用体外筛选技术筛选核酸适配体，最终得到了能特异性地，高亲和力地结合c-Myc蛋白的核酸适配体(MA9)，随后基于MA9进行改造成MA9C1，MA9C1与E3泛素连接酶的小分子配体偶联为嵌合体(MA9C1-CRBN)，该嵌合体靶向降解c-Myc蛋白，表现良好的抗肿瘤活性。
但是可以理解的是，对于本领域技术人员来说，可以在上述研发成果的基础上，基于常规的技术，对其进行常规的改进或扩展应用。
如可以对上述体外筛选技术筛选得到的靶向结合c-Myc蛋白的核酸适配体进行进一步常规修饰，如磷酸化、氨基化、甲基化、巯基化、同位素化、将氧替代为硫、将氧替代为硒等,经上述修饰后能特异性结合结合c-Myc蛋白的核酸适配体也均应在本发明的保护范围之内。
如将上述靶向结合c-Myc蛋白的核酸适配体与其他连接用物质连接，形成一种能特异性结合c-Myc蛋白的核酸适配体的联合物，其中的连接用物质为检测、标记、诊断或治疗物质；连接方式采用如下任意一种或多种：T4 DNA ligase连接、PCR连接、生物合成连接等；所述连接用物质采用以下任意一种或多种：DNA、RNA、荧光标记物、生物素、PROTAC、地高辛、小肽、纳米发光材料、生物小分子、治疗性物质、放射性物质、siRNA、酶标记。
如，可以以上述靶向结合c-Myc蛋白的核酸适配体或上述核酸适配体的联合物为主体进行改造形成能特异性结合c-Myc蛋白的硫代磷酸脂类衍生物；或以上述的靶向结合c-Myc蛋白的核酸适配体核酸适配体或上述的核酸适配体的联合物的核苷酸序列为基础合成能特异性结合c-Myc蛋白的肽核酸。
如，还可以将上述物质进一步做成产品，产品可为试剂、试剂盒或药物等。
如，也可以基于常规技术，开发其下述应用：
(1)分离纯化c-Myc蛋白；
(2)标记c-Myc蛋白；
(3)c-Myc蛋白的成像；
(4)定量或定性检测c-Myc蛋白；
(5)制备c-Myc蛋白的抑制剂；
(6)制备靶向c-Myc蛋白的试剂或药物；
(7)制备降解c-Myc蛋白的PROTAC降解剂；
(8)制备用于诊断和治疗c-Myc蛋白相关疾病的试剂或药物；
(9)制备用于检测、成像、诊断和治疗c-Myc蛋白相关疾病的试剂盒。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种靶向结合c-Myc蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的序列包括或由以下序列组成：
(1)Seq ID No：1所示的核苷酸序列；
或(2)Seq ID No：2所示的核苷酸序列；
或(3)与具有与(1)或(2)的序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性且能特异性结合c-Myc蛋白的核苷酸序列；
或由(1)、(2)或(3)中的任意一条核苷酸序列在体内或体外转录且能特异性结合c-Myc蛋白的核糖核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的靶向结合c-Myc蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列被化学修饰且修饰后的核酸适配体能特异性结合c-Myc蛋白，所述化学修饰为以下任意一种或多种：磷酸化、氨基化、甲基化、巯基化、同位素化、将氧替代为硫、将氧替代为硒。
3.一种核酸适配体的联合物，其特征在于，为能特异性结合c-Myc蛋白的核酸适配体联合物，包括权利要求1或2所述的靶向结合c-Myc蛋白的核酸适配体及与所述核酸适配体连接的连接用物质。
4.根据权利要求3所述的核酸适配体的联合物，其特征在于，所述连接用物质为检测、标记、诊断或治疗物质；
或，所述联合物的连接方式采用如下任意一种或多种：T4 DNA ligase连接、PCR连接、生物合成连接；
或，所述连接用物质采用以下任意一种或多种：化学小分子类、生物大分子类、生物材料类。
5.根据权利要求3所述的核酸适配体的联合物，其特征在于，包括将所述靶向结合c-Myc蛋白的核酸适配体与E3泛素连接酶的配体，偶联形成基于c-Myc核酸适配体的PROTAC，靶向降解c-Myc。
6.根据权利要求5所述的核酸适配体的联合物，其特征在于，所述E3泛素连接酶为CRBN或VHL；
所述配体为化学小分子、多肽、核酸适配体或抗体。
7.一种核酸适配体的衍生物，其特征在于，包括以权利要求1-2任一项所述的核酸适配体或权利要求3-6任一项所述的核酸适配体的联合物为主体所改造的能特异性结合c-Myc蛋白的硫代磷酸脂类衍生物；
或以权利要求1-2任一项所述的核酸适配体或权利要求3-6任一项所述的核酸适配体的联合物的核苷酸序列为基础所合成的能特异性结合c-Myc蛋白的肽核酸。
8.一种产品，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的核酸适配体或权利要求3-6任一项所述的核酸适配体的联合物或权利要求7所述的核酸适配体的衍生物；所述产品为试剂、试剂盒或药物。
9.一种权利要求1-2任一项所述的核酸适配体的应用，其特征在于，所述应用为以下所列各项组成的组中的任意一项或多项：
(1)分离纯化c-Myc蛋白；
(2)标记c-Myc蛋白；
(3)c-Myc蛋白的成像；
(4)定量或定性检测c-Myc蛋白；
(5)制备c-Myc蛋白的抑制剂；
(6)制备靶向c-Myc蛋白的试剂或药物；
(7)制备降解c-Myc蛋白的PROTAC降解剂；
(8)制备用于诊断和治疗c-Myc蛋白相关疾病的试剂或药物；
(9)制备用于检测、成像、诊断和治疗c-Myc蛋白相关疾病的试剂盒。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述c-Myc蛋白相关疾病为肿瘤疾病。
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- 2023-09-01 CN CN202311121305.3A patent/CN117230070A/zh active Pending
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