CN117204444A - 松针提取液在调节茶树生长和虫害防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物提取液应用领域，具体公开了松针提取液在调节茶树生长和虫害防治中的应用，松针提取液的施用方式为喷施；喷施松针提取液能够促进茶树生长，提高茶树的发芽密度和叶片的叶绿素相对含量，提高茶叶产量，且不降低茶叶的品质；在这一过程中AP2/ERF转录因子下调表达，乙烯信号途径发挥了重要的负调节作用。茶园喷施松针提取液不影响茶园节肢动物的群落结构，且对螨类和茶小绿叶蝉有一定的防治效果。通过转录组和代谢组联合分析表明，松针提取液提高茶树抗虫能力主要是由于激活了茶树的多酚类和磷脂类的代谢通路，相应代谢物质的含量显著提高，提高了茶树抗氧化、清除自由基的能力，从而提高了茶树的抗逆性。

Description

松针提取液在调节茶树生长和虫害防治中的应用

技术领域

本发明涉及植物提取液应用领域，特别是松针提取液在调节茶树生长和虫害防治中的应用。

背景技术

松针提取液提取自松树的针叶，富含黄酮类物质、多种维生素，氨基酸和矿物质，具有较强抗氧化作用。在医药方面，松针用药历史悠久，在《本草纲目》及《太平圣惠方》等书籍中均有记载，松针具有镇痛、抗炎、镇咳、祛痰、抗突变、降血压、抑菌等作用。马尾松松针提取物对人毛乳头细胞具有保护作用，其机制可能与Wnt/β-Catenin信号传导途径有关。松针提取物α-蒎烯对肝癌HepG2细胞miR-221及其下游靶基因CDKN1B/P27和CDKN1C/P57表达具有抑制作用。雪松针叶提取物对H₉N₂禽流感病毒在体外和体内增殖均有抑制作用。在畜牧业中，松针提取物多被用作天然饲料添加剂，其含有丰富的营养成分及多种生物活性物质，可以提高动物的机体免疫力并提高动物的生产性能。松针提取物可提高蛋鸡生产性能、蛋品质、血清参数和肠道微生物群。在食品行业中，松针提取物多被用作天然保鲜剂。徐丽珊等通过测定32种无毒植物提取液的抗氧化和抑制多酚氧化酶的活性发现，松针提取液具有防治鲜切果蔬褐变的作用。叶清华等用松针提取液浸泡橄榄，可延缓果实可溶性总糖含量下降，提高橄榄果实的糖酚比，促进多酚含量下降，从而有效改善橄榄果实贮藏期内的鲜食品质。近年来，人们还发现松针提取液可作为一种植物源灭菌剂，对很多果蔬的病原性细菌和真菌等具有一定的抑制效果。沈佳鑫等研究表明，松针提取物对苦瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌、烟草赤星病菌和番茄早疫病菌等4种植物病原真菌均具有一定的抑菌效果。杨书珍等发现松针提取物对柑橘青霉病菌也具有一定的抑制效果，其中含量最多的α-蒎烯和β-蒎烯抑制柑橘青霉菌的活性最强，是马尾松松针抑制柑橘青霉病菌的主要活性成分。此外，崔义等发现樟子松鲜针叶提取物复配木醋液对榆紫叶甲的成虫具有较好的毒杀效果。

然而，松针提取液在调控茶树生长、以及茶树病虫害防治等方面的研究还较少。胡海涛等发现松针提取液可显著提高茶园土壤的pH，有效阻控茶园土壤酸化，促进茶树生长、叶绿素积累等。而关于松针提取液调控茶树生长的作用机制，以及对病虫害的防治效果和机制还未知。

中国专利申请号CN202211685915.1公开了松针提取液在提高水稻劣变种子萌发率和活力中的应用。本发明的实验结果表明，500倍稀释的松针提取液可以不同程度的提升水稻日本晴、中花11劣变种子的发芽指数、活力指数、芽长、鲜重，显著提升劣变种子的活力；且用不同浓度的松针提取液引发老化半年和一年的种子，其发芽率和活力显著高于未引发组和水引发组。松针提取液引发是一种非常有效的提高水稻劣变种子发芽率和活力的种子处理方式，松针提取液在提高水稻劣变种子萌发率和活力中具有很高的应用价值。但是无法确定松针提取液对茶树生长及茶叶产量的影响，及松针提取液对茶树虫害的防治效果。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了松针提取液在调节茶树生长和虫害防治中的应用。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

松针提取液在调节茶树生长和虫害防治中的应用，具体地，所述松针提取液的施用方式为喷施。

进一步地，松针提取液在调节茶树生长和虫害防治中的应用具体步骤如下：

自春茶开始采摘至秋茶采摘结束期间，每轮采摘开始前15天对茶树的茶蓬冠面喷施一次300倍水稀释的松针提取液，每月喷施一次，采摘期间不再喷施。

与现有技术相比，喷施松针提取液能够促进茶树生长，提高茶树的发芽密度和叶片的叶绿素相对含量，提高茶叶产量，且不降低茶叶的品质；在这一过程中AP2/ERF转录因子下调表达，乙烯信号途径发挥了重要的负调节作用。茶园喷施松针提取液不影响茶园节肢动物的群落结构，且对螨类和茶小绿叶蝉有一定的防治效果。通过转录组和代谢组联合分析表明，松针提取液提高茶树抗虫能力主要是由于激活了茶树的多酚类和磷脂类的代谢通路，相应代谢物质的含量显著提高，提高了茶树抗氧化、清除自由基的能力，从而提高了茶树的抗逆性。

附图说明

图1为喷施松针提取液后的茶树的产量指标统计：A为2019年喷施松针提取液后的茶叶增产量和增产率统计；B为2020年喷施松针提取液后的茶叶增产量和增产率统计；C为喷施松针提取液后的茶叶芽头密度增长量和增长率统计；D为3-12月，喷施松针提取液后的茶叶的老叶和嫩叶的相对叶绿素含量的增加量和增长率统计；其中柱形图表示增长量，折线图表示增长率。

图2为喷施松针提取液后的茶树的害虫数量统计：A为螨虫成虫数量/50张叶片；B为螨虫卵数量/50张叶片；C为茶小绿叶蝉成虫数量/100张叶片；D为茶小绿叶蝉幼虫数量/100张叶片。

图3为不同处理田间茶树节肢动物群落1-6月份总体多样性指数动态：A为总个体数；B为总类群数；C为总多样性指数；D为总均匀度指数；E为总优势度指数；F为总丰富度指数。

图4为不同处理田间茶树节肢动物群落1-6月份多样性指数动态：A为个体数变化；B为类群数变化；C为多样性指数变化；D为均匀度指数变化；E为优势度指数变化；F为丰富度指数变化。

图5为茶树不同处理的表达基因和差异表达基因：A为差异基因MA图，红点：上调基因；绿点：下调基因；蓝点：基因的表达没有显著差异；B为差异表达基因聚类分析。

图6为差异基因KEGG富集分析，其中，圆点的大小表示基因的数量，圆点的颜色表示不同的qvalue值。

图7为差异基因GO分析：A为GO富集分析；B为转录因子分析。

图8为差异基因和差异代谢物相关性系数聚类热图。

图9为差异基因和差异代谢物KEGG富集分析结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。

本实施例主要是涉及松针提取液在调节茶树生长和虫害防治中的应用，为验证松针提取液调节茶树生长和虫害防治的效果，通过以下实施例进行详细说明。

实施例1

本实施例是为了验证松针提取液对茶树生长的影响及红茶品质的影响试验材料

本试验以种植在广东省农业科学院茶叶研究所英德实验基地的‘英红九号’为实验材料，选取土地类型、栽培条件、水肥管理、茶树长势基本一致的两块茶园进行实验。实验期为2019年5月-2019年8月，2020年1月-2020年12月。实验前20d无施药记录，前30d无修剪茶树。本实验所使用的的松针提取液为广东佰治生物科技有限公司生产，使用量为300倍水稀释液。

试验方法

实验设置2个处理，每个处理3个重复。在土地类型、栽培条件、水肥管理、茶树长势基本一致的茶园划分8个10m*1.5m的小区，小区间设有1.0m宽的隔离带。每3个小区为一个处理，进行松针提取液(pin needle extractions，PNEs)喷施试验，并以喷施水作为对照(CK)。每月喷施一次茶蓬冠面。

叶芽密度和产量统计和叶绿素含量调查

实验地茶叶采摘期为2019年6月-2010年8月及2020年6月-2020年8月，每轮采摘开始前15天喷施松针提取液，采摘期间不再喷施。通过统计每轮每个小区茶叶采摘的重量，计算茶叶产量(Kg/hm2)。当茶树新梢长到一芽二叶时调查新梢密度，统计时每个小区采用对角线5点取样法，每个处理随机选取5个点，放置30cm×30cm的方框，调查方框内的芽梢数量。2020年3月-12月，使用手持式SPAD叶绿素仪测定每个处理小区的茶树叶片的相对叶绿素含量，每个小区分别检测100张幼嫩叶片(当年新长出)和老叶(去年长出)。

通过统计2019和2020年6-8月茶叶采摘量，计算2种处理的茶叶产量。与CK相比，松针提取液处理后茶叶的产量提高。如图所示，PNEs处理组在2019年6-8月，茶叶增产量为244.44-888.89Kg/hm²，增长率为14.23％-21.48％，且增长量与增长率逐渐升高(参见图1A)；2020年6-8月，茶叶增产量为377.78-1666.68Kg/hm²，增长率为13.38％-18.11％，且增长量与增长率逐渐升高(参见图1B)。这说明在一定范围内，喷施松针提取液与茶叶产量呈正相关，松针提取液能够促进茶树生长，且随着喷施时间增长，增幅逐渐增大(参见图1A-B)。

叶芽密度和叶绿素含量检测结果表明，与CK相比，PNEs处理组的茶树叶芽密度在不同采摘期均有不同程度的提高，且增长率保持在30％左右(参见图1C)。通过检测茶树蓬面的老叶和嫩叶叶绿素的相对含量发现，喷施松针提取液有利于提高茶树叶片的叶绿素含量。与CK相比，PNEs处理组的茶树老叶和嫩叶的相对叶绿素含量升高，增长比例均在4％-8％。在生长旺盛的6-8月，叶绿素的相对含量增长率较高，而在茶树休眠期叶绿素的相对含量增长率则无显著变化(参见图1D)。

不同处理组红茶制茶品质评价

2020年8月，收集PNEs和CK组鲜叶5kg，重复3次，用于红茶制备。根据茶叶感官审评标准GB/T 23776-2018《茶叶感官审评方法》对所取茶样进行感官审评。感官审评小组由5名高级评茶员组成，评茶小组对样品进行密码审评，审评结果由分数和评语共同构成。审评总分＝外形×25％+汤色×10％+香气×25％+滋味×30％+叶底×10％。PNEs与CK组红茶感官审评结果如表1所示。

表1

由表1可知，PNEs组红茶的感官评审分为88.80±0.989，CK组为88.95±0.919，两组评分没有显著差异(表1)，且两组红茶在外形、汤色、香气、滋味、叶底等5方面均未表现出显著差异。

红茶水分相对含量检测参照标准GB5009.3-2016；水浸出物总量参照标准GB/T8305-2013《茶水浸出物测定》；茶多酚含量参照GB/T 8313《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》测定；游离氨基酸总量的测定参照GB/T8314-2013《茶游离氨基酸总量的测定》；咖啡碱含量检测参照GB/T8312-2013《高效液相色谱法与紫外分光光度法检测固态速溶茶中咖啡碱含量的比较》。PNEs和CK红茶主要生化成分含量比较结果如表2所示。

表2

由表2可知，PNEs和CK组的水分、水浸出物、游离氨基酸含量没有显著差异，PNEs组的茶多酚含量比CK组高1.01％，CK组的咖啡碱含量比PNEs组高0.3％。

取茶叶样品1.0g，采用HS-SPME法富集并提取茶叶中的香气组分，重复3次。采用GC-MS检测香气组成成分及相对含量。采用NIST标准光谱库(https://www.nist.gov/)对香气成分进行定性。PNEs与CK组红茶分离鉴定出的香气组分及相对含量结果如表3所示。

表3

由表3可知，共鉴定出40中香气化合物，PNEs与CK红茶的香气组分组成相同，且相对含量没有显著差异。其中，含量排名前十位的主要有β-芳樟醇、水杨酸甲酯、苯乙醛、β-紫罗酮、苯甲醛、橙花叔醇、顺-己酸-3-己烯酯、香叶醇、2-己烯醛、二甲硫。

由本实施例可知，喷施松针提取液后茶树的芽头密度增长约30％，茶树蓬面的老叶和嫩叶的叶绿素相对含量增加4％-8％，茶叶全年总产量增加约22％，这说明松针提取液能够促进茶树生长(参见图1)，且不降低茶叶的品质(参见表1-表3)。

实施例2

本实施例是为了验证松针提取液对茶树害虫的田间防治效果

田间害虫调查

采用对角线5点取样法，调查危害茶树的主要害虫，包括螨虫、茶小绿叶蝉以及节肢动物。1-12月的月中旬调查螨类的成虫和卵的数量，调查时每个小区随机选取5个点，每个取样点调查100张茶树叶片或芽头。1-6月的月中旬调查茶小绿叶蝉的幼虫和成虫的数量，调查时每个小区随机选取5个点，每个取样点随机调查100张叶片或芽头。

2020年1-12月螨类成虫和卵的数量统计结果显示，PNEs处理组螨类的成虫和卵的数量显著少于CK，在不同的时间表现出不同的变化趋势。在2月、9月、12月，PNEs处理组螨类的成虫和卵被显著抑制；4-7月期间，PNEs处理组和CK螨类的成虫数量无明显差异，PNEs处理组螨类卵的数量显著减少(参见图2A,B)。这一结果说明，松针提取液对螨类的成虫和卵均有一定的防治效果。

2020年1-6月茶小绿叶蝉的成虫和幼虫数量统计结果显示，PNEs处理组和CK的茶小绿叶蝉成虫数量无明显差异，PNEs处理组茶小绿叶蝉幼虫的数量显著少于CK(参见图2C,D)。这一结果说明，松针提取液对茶小绿叶蝉的幼虫有防治效果，成虫无防治效果。

同时，本实施例还验证了松针提取液对田间节肢动物多样性的影响

田间节肢动物进行调查

2020年1-6月的月中旬使用直接观察法对每个小区茶树植株上的节肢动物进行调查，调查时每个小区采用对角线5点取样法，每个取样点调查10株茶树。计算每个处理的各个时期节肢动物的4个指标，即Shannon-Wiener多样性指数(H)、Pielou均匀度指数(E)、Simpson优势度指数(C)和Margalef丰富度指数(DMG)。

1-6月份PNEs和CK的田间节制动物的多样性总体分析结果如图3所示，分析比较2个处理材料的田间整个昆虫群落动态，以此研究喷施PNEs对田间节肢动物群落多样性是否产生影响。由图3可知，PNEs处理组和CK的节肢动物多样性，包括个体数、多样性指数、均匀度指数、优势度指数等均无明显差异，PNEs处理组的类群数、丰富度指数优于CK(参见图3A-F)。

1-6月份2个处理的茶树节制动物的多样性动态分析见图4，由图4可知，PNEs处理组和CK的节肢动物个体数无显著差异，但在不同生长月份的变化趋势有所不同(参见图4A)；PNEs处理组和CK的节肢动物的类群数在1、2、3、5月份无明显差异，在4月和6月，PNEs处理组的类群数优于CK(参见图4B)；PNEs处理组和CK的节肢动物的多样性指数、均匀度指数和优势度指数在1-6月份均无显著差异，且表现出不同趋势的动态变化(参见图4C-E)；PNEs处理组的丰富度指数在2、6月份优于CK(参见图4F)。

由本实施例可知，松针提取液对螨类的成虫和卵均有一定的防治效果，对茶小绿叶蝉的幼虫有防治效果，成虫无防治效果(参见图2)，这说明松针提取液在昆虫繁殖的不同阶段发挥的作用有不同。同时，可知松针提取液不影响茶园节肢动物的群落结构。

实施例3

本实施例是为了松针提取液对茶树生长和虫害防治的影响机制

转录组分析

2020年8月，收集PNEs和CK处理的茶树一芽二叶并迅速用液氮冷冻，放-80保存。茶叶样品送生物公司进行测序。将获得的原始数据将进行过滤，获得clean reads，并比对到参考基因组，再进行转录组重构，得到全部的转录本。用DEseq2软件筛选差异表达基因，对筛选出的差异表达基因进行GO(Gene ontology)功能富集分析和KEGG(KyotoEncyclopedia ofgenes and genomics)代谢通路富集分析。P＜0.5的GO和KEGG通路被认为是显著富集的，并采用TBtools制作热图。

过滤掉茶树两个测序样本数据的低质量读数后，CK(平均)获得51069530个过滤数据，PNEs(平均)获得54919200个过滤数据；各样品GC含量不低于43％，为正常水平；Q20碱基百分比约97％，Q30碱基百分比为91％-93％，测序质量较高。将各样品的过滤数据与茶树参考基因组进行序列对比，比对率均在85％-87％，可进行后续分析(参见表4)。

表4

对茶树PNEs处理组和CK的差异表达基因进行筛选，共筛选出68个差异表达基因，其中上调10个，下调58个(参见图5A)。从图5B可以清楚地看出茶树两个处理组的基因表达水平的差异。

对差异表达基因进行KEGG富集分析，筛选出富集最显著的20条代谢通路(参见图6)。植物激素信号转导、MAPK信号通路、谷胱甘肽代谢、RNA转运这4条代谢途径显著富集，其中，植物激素信号转导富集最为显著。另外，还富集到类胡萝卜素生物合成、内质网蛋白、脂类代谢、丙酮酸代谢等信号通路。

进一步对差异表达基因进行GO功能富集分析，富集最多的前15个GO功能分类如图7A所示，富集到的功能途径主要包括转录、植物激素信号转导、磷酸化信号转导、植物免疫应激过程、谷胱甘肽转移酶活性等。富集到的植物激素信号转导途径主要包括乙烯信号转导、茉莉酸信号转导、脱落酸信号转导，乙烯信号转导途径富集最为显著；富集到的转录因子家族主要包括AP2/ERF、NAC、MYB等，其中AP2/ERF转录因子数量最多(参见图7B)，其主要参与乙烯的信号转导过程，且这些基因均下调表达。

代谢组测序及分析

茶树样品用研磨仪研磨(30Hz、1.5min)至粉末状，称取100mg粉末置于2mL 70％甲醇提取液中，每30min涡旋一次。将混合物于4℃、12000r/min离心10min，吸取上清液，用微孔滤膜(0.22μm孔径)过滤并转存于进样瓶中，后续用于超高效液相色谱(ultraperformance liquid chromatography,UPLC)和串联质谱(tandem massspectrometry,MS/MS)分析。

代谢产物基于武汉迈特维尔生物科技有限公司自建代谢数据库和二级质谱信息进行定性和定量分析。采用R软件包对鉴定的代谢物进行主成分分析(principalcomponent analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonalpartial leastsquares-discriminant analysis,OPLSDA)。从OPLS-DA模型获得变量重要性投影(variable importance inproject,VIP)评分，并将VIP≥1、差异倍数(fold change,FC)≥1作为筛选显著差异代谢物的标准，并对上述差异代谢物进行注释。使用SPSS22.0软件对数据进行差异显著性检验(单因素方差分析)，采用Heml软件制作热图。

差异代谢物分析表明，在PNEs处理组和CK中共鉴定出8种差异代谢物，其中PNEs处理组相比于CK上调4种，下调4种，主要包括酚酸类、黄酮类、脂质以及其他等4类物质(参见表5)。

表5

对差异基因、差异代谢物进行相关性分析，选取皮尔森相关系数大于0.8的结果绘制相关性系数聚类热图。如图所示，共计46个差异表达基因与这些差异代谢物产生正相关或负相关性(参见图8)。其中，参与酚酸类的基因最多，有27个基因与酚酸类代谢负相关，6个基因正相关，5个差异表达基因参与黄酮类代谢过程，其中正相关4个，负相关1个(参见表5)。

根据差异代谢物，以及差异基因的富集分析结果，绘制柱状图，展示同时具有差异代谢物和差异基因的通路的富集程度。如图9所示，4类差异代谢物和46个差异表达基因主要富集在甘油磷脂代谢途径(参见图9)。

由本实施例可知，喷施松针提取液后茶树中植物激素信号转导途径显著富集，其中乙烯信号转导途径富集最为显著，富集到的转录因子家族中AP2/ERF转录因子数量最多(参见图7B)，其主要参与乙烯的信号转导过程，且这些基因均下调表达。乙烯作为一种重要的植物激素，能够抑制植物根、叶、花等生长发育，调控乙烯信号途径的基因下调表达，能够部分解除乙烯的抑制作用，从而促进植物生长发育。因此，乙烯信号途径在松针提取液调控茶树生长这一过程中发挥了重要的负调节作用。另外，还富集到谷胱甘肽代谢、脂类代谢、丙酮酸代谢等信号通路(参见图6)，这些代谢通路在抗氧化、调节植物抗逆性等方面发挥了重要作用。代谢组学分析表明，喷施松针提取液的茶树样品酚酸类物质对羟基苯乙酸、黄酮类物质异泽兰黄素和三叶豆紫檀苷的含量均显著提高(参见表5)。谷胱甘肽、酚酸类和黄酮类化合物均属于多酚类化合物，均具有抗氧化、清除自由基、抑菌效应等作用。丙酮酸代谢途径亦属于黄酮类代谢途径的一条次要途径。另外，差异代谢物以及差异基因的联合富集分析表明，这些差异代谢通路主要富集在甘油磷脂代谢(参见图9)，这一途径蛋白主要在内质网合成，而转录组KEGG代谢通路分析富集到内质网蛋白相关通路。这些研究结果表明，松针提取液提高茶树抗虫能力主要是由于激活了茶树的多酚类和磷脂类的代谢通路，提高了茶树抗氧化、清除自由基的能力，从而提高了茶树的抗逆性。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.松针提取液在调节茶树生长和虫害防治中的应用。

2.根据权利要求1所述的松针提取液在调节茶树生长和虫害防治中的应用，其特征在于，所述松针提取液的施用方式为喷施。

3.根据权利要求1所述的松针提取液在调节茶树生长和虫害防治中的应用，其特征在于，具体步骤如下：

自春茶开始采摘至秋茶采摘结束期间，每轮采摘开始前15天对茶树的茶蓬冠面喷施一次300倍水稀释的松针提取液，每月喷施一次，采摘期间不再喷施。