CN117186220A - 可结合白介素31的抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用 - Google Patents
可结合白介素31的抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及抗体领域，公开了可结合白介素31的抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用。本发明提供的抗体或其抗原结合片段高亲和力和高活性，通过阻断IL‑31及其受体结合，尤其是犬IL‑31，从而抑制犬科皮肤瘙痒性疾病，尤其是犬科特应性皮炎。
Description
技术领域
本发明涉及抗体领域，具体涉及可结合白介素31的抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用。
背景技术
犬猫皮肤病是宠物医院接诊量较大的疾病，其中犬特应性皮炎(Canine AtopicDermatitis，CAD)是一种常见的犬类皮肤瘙痒性疾病。犬特应性皮炎可能发生在任何年龄段，通常一岁左右在夏季表现出临床症状，如皮肤发痒、发红、肿胀和开裂，随着炎症持续导致皮损部位增厚。犬特应性皮炎的发病原因可能与遗传疾病、免疫系统功能障碍、环境暴露或皮肤渗透性障碍等相关。
已有研究发现，过表达白细胞介素31(IL-31)的转基因小鼠产生皮肤炎症和瘙痒等症状，另外，注射IL-31可诱发小鼠的急性瘙痒行为，这些研究表明IL-31与皮肤炎症和瘙痒密切相关。IL-31主要由活化的辅助性Th2细胞产生，IL-31受体主要在巨噬细胞、角质形成细胞和背根神经节中表达。IL-31受体由IL-31RA和OSMR形成异二聚体，IL-31与其受体结合后，能激活下游JAK激酶和STAT的磷酸化。在特应性皮炎的小鼠模型中，皮损部位IL-31mRNA高表达，抑制IL-31信号通路可以抑制瘙痒。因此，IL-31拮抗型抗体有可能抑制瘙痒行为，缓解特应性皮炎。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种可结合白介素31的抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用。
定义
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明中，术语“抗体”意指免疫球蛋白分子，是指表现所需生物学活性的抗体的任何形式。包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)，甚至包括抗体片段。典型地，全长抗体结构优选包含4条多肽链，通常通过二硫键相互连接的2条重(H)链和2条轻(L)链。每条重链包含重链可变区和重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区和轻链恒定区。在此典型全长抗体结构外，其结构还可包括其他衍生形式。
术语“抗原结合片段”包含完整抗体分子的一部分，其保留母体抗体的至少某些结合特异性，通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗原结合片段的实例包括但不限于Fv片段、Fab片段、Fab′片段、Fab′-SH片段、F(ab′)2片段、Fd片段、Fd'片段、单链抗体分子(例如scFv，di-scFv或tri-scFv、双体抗体或scFab)、单域抗体。
“Fv片段”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1结构域及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
“Fab′片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CHI结构域和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1结构域和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。
“单链Fv抗体”(或“scFv抗体”)是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。一般而言，Fv多肽另外在VH和VL结构域之间包含多肽接头，该接头使得scFv能形成用于抗原结合的所需结构。对于scFv的综述，可参见Pluckthun(1994)THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES(单克隆抗体药理学)，第113卷，Rosenburg和Moore主编，Springer-Verlag，NewYork，第269-315页。还参见国际专利申请公开号WO88/01649和美国专利第4,946,778号和第5,260,203号。以引用的方式将上述文献的内容并入本文作为参考。
“双抗体”也称为“双特异性抗体”，为具有两个抗原结合位点的小抗体片段。所述片段包含在相同的多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH-VL或VL-VH)。通过使用短至不能在同一链的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。
术语“可变区”指抗体重链或轻链中涉及抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)一般具有类似的结构,可进一步细分为穿插在更保守的区域(称为框架区(FR))中的高变区(称为互补决定区(CDR))。术语“互补决定区”(CDR，例如CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变区的这样一些氨基酸残基，其存在对于抗原结合来说是必需的。每个可变区通常具有3个被鉴别为CDR1、CDR2和CDR3的CDR区域。
术语“恒定区”是指抗体的轻链和重链上的这样一些氨基酸序列，不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性。
术语“嵌合抗体”具有衍生自一个物种的重链可变区的至少一部分和轻链可变区的至少一部分；以及衍生自另一物种的恒定区的至少一部分。例如，在一个实施例中，嵌合抗体可以包括鼠类可变区和犬恒定区。
术语“犬源化抗体”含有衍生自非犬抗体的CDR，和衍生自犬抗体的框架区以及恒定区。例如，本文提供的抗IL31抗体可以包含衍生自一种或多种鼠类抗体的CDR以及犬框架区和恒定区。本发明提供了示范例犬源化抗体。包含本发明提供的重链CDR和轻链CDR的另外的抗IL31抗体或其变体可以使用任何犬框架序列产生，并且也包括在本发明中。在一个实施方案中，适用于在本发明中使用的框架序列包括在结构上与本文提供的框架序列类似的那些框架序列。可以在框架区中进行另外修饰以改进本文提供的抗体的特性。此类另外的框架修饰可以包括化学修饰；点突变以降低免疫原性或去除T细胞表位；或使突变回复为原始种系序列中的残基。在一些实施例中，此类修饰包括对应于本文示例的突变的那些修饰，包括对种系序列的回复突变。例如，在一个实施方案中，本文提供的犬源化抗体的VH和/或VL的犬框架区中的一个或多个氨基酸被回复突变为亲本鼠类抗体中对应的氨基酸。例如，在犬源化抗体的VH和VL，上述模板犬抗体的框架氨基酸的几个位点被回复突变为小鼠IL31抗体中对应的氨基酸序列。在一个实施方案中，在一些实施例中，优选为1个或多个选自2I、4L、36Y、46L、68R的氨基酸回复突变；另一优选为1个或多个选自68G、73F、78L的氨基酸回复突变；另另一优选为1个或多个选自2I、12S、37Q、46V、49K、59P、60S、69S、77S的氨基酸回复突变。另外的或另选的回复突变可以在本文提供的犬源化抗体的框架区中进行以改进抗体的特性。本发明还包括恒定区突变，以改进抗体的特性，在一些实施例中，对犬IgG B重链恒定区进行突变，在234位置由M突变为A，在235位置由L突变为A，在237位置由G突变为A，以降低犬IgG B与犬FcγRI和C1q的亲和力，从而避免犬IgG B的效应功能。
本发明中，术语“抗体偶联药物(Antibody Drug Conjugate)”是指由靶向肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的单克隆抗体与不同数目的小分子毒素通过连接子偶联组成，是将细胞毒药物连接到靶向肿瘤的单克隆抗体而构成的复合体，抗体偶联药物分子进入体内后，可通过单克隆抗体的导向作用与靶细胞表面的抗原结合，进入靶细胞内，进入细胞内的抗体偶联药物分子可通过化学和/或酶促作用释放出效应分子以达到消灭靶细胞的目的。
本发明中，术语“结合亲和力”是指分子的单个结合位点与其结合伴侣之间非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，用于本文中的“结合亲和力”是指固有的结合亲和力，其反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间1:1的相互作用。“亲和力KD”、“结合速率常数Kon”和“解离速率常数Koff”通常用于描述分子(例如抗体)与其结合伴侣(例如抗原)之间的亲和力，即，配体结合特定蛋白的紧密程度。结合亲和力受非共价分子间相互作用的影响，例如氢键，静电相互作用，两个分子之间的疏水和范德华力。另外，配体与其靶分子之间的结合亲和力可能受到其他分子的存在的影响。
本发明中，抗体中CDR编号系统是指精确定义互补的决定区(CDR)，框架(FR)以及影响抗体—抗原相互作用的结合亲和力和特异性的轻链和重链的残基。常用的CDR编号系统有Kabat、Chothia、IMGT，还有AbM、Contact、North等，使用不同的编号系统，可能会有差异。
本发明中，两条多肽或核酸序列之间的“序列同一性”表示所述序列之间相同残基的数目占残基总数的百分比。在计算同一性百分数时，将正在比较的序列以产生序列之间最大匹配的方式比对，通过特定算法解决比对中的空位(如果存在的话)。确定两个序列之间同一性的优选计算机程序方法包括，但不限于，GCG程序包，包括GAP、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)。上述程序可以公开地从国际生物技术信息中心(NCBI)和其他来源得到。熟知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。
本发明中，细胞系模型为在细胞的基础上，通过细胞内的变化用于研究患者疾病、药物的研发和毒性测试等领域。本发明中，在一些实施例中，构建膜表达犬IL-31受体(犬IL-31RA和犬OSMR)的HEK293细胞，评估所述IL31抗体阻断犬IL-31重组蛋白与其受体结合的能力。在另一些实施例中，采用DH82细胞(犬巨噬细胞/狗肾恶性组织细胞增生症细胞)，研究所述IL31抗体，阻断IL-31与细胞表面共受体IL-31RA和OSMR结合，从而抑制下游JAK/STAT信号通路，降低STAT3磷酸化程度。
本发明中，动物模型是指将不同的动物作为可控制的实验对象，用于通过动物的不同变化研究患者疾病、药物的研发和毒性测试等领域，常用的动物为哺乳动物、鸟类和爬行动物。本发明中，在一些实施例中，构建重组犬IL31诱导的犬瘙痒模型，评估所述IL31抗体对犬瘙痒的抑制。在另一些实施例中，构建跳骚诱导的犬瘙痒模型，评估所述IL31抗体对犬瘙痒的抑制。
本发明中，术语“重组细胞”是指从活细胞中将细胞器及其组分分离出来，再在体外一定条件下将不同来源的细胞器及其组分重新组合，使之重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器。
本发明中，术语“皮肤瘙痒症”指的是由IL-31介导的疾病，即一般的炎症；尤其是具有皮炎和瘙痒症状的一系列疾病，包括特应性皮炎、接触性皮炎、结节性瘙痒、湿疹等过敏性疾病。
术语“药物组合物”表示含有一种或多种本发明所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。治疗性组合物一般应当是无菌的并且在制造和储存条件下稳定。可以将组合物配制为溶液、微乳液、分散剂、脂质体或适合高抗体浓度的其他有序结构。可以通过将活性化合物(即抗体或其抗原结合片段部分)以要求的量连同上文所列举的一种成分或成分组合在适宜的溶剂中并入，根据需要，随后过滤消毒，制备无菌可注射溶液剂。
本发明中，术语“核苷酸分子”是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(简称RNA)和脱氧核糖核酸(简称DNA)。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用-其中转运核糖核酸，简称tRNA，起着携带和转移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸，简称mRNA，是合成蛋白质的模板，核糖体的核糖核酸，简称rRNA，是细胞合成蛋白质的主要场所。
本发明第一方面提供了一种可结合白介素31的抗体或其抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NOs：1-6和/或SEQ ID NOs：7-12和/或SEQ ID NOs：13-18中的一个或多个CDR区(抗体互补决定区)序列或其突变体序列。
在一些方案中，本发明所述的IL31抗体或其抗原结合片段，其包含任选自SEQ IDNOs：1-3和/或SEQ ID NOs：7-9和/或SEQ ID NOs：13-15的的重链可变区CDR或其突变序列。
在一些方案中，本发明所述的IL31抗体或其抗原结合片段，其包含任选自SEQ IDNOs：4-6和/或SEQ ID NOs：10-12和/或SEQ ID NOs：16-18的的轻链可变区CDR或其突变序列。
在一些方案中，本发明所述的IL31抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区CDR1，所述的重链可变区CDR1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1、7或13所示的氨基酸序列具有不低于约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
在一些方案中，本发明所述的IL31抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区CDR2，重链可变区CDR2的氨基酸序列与SEQ ID NO：2、8和14所示的氨基酸序列具有不低于约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
在一些方案中，本发明所述的IL31抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区CDR3，重链可变区CDR3的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、9和15所示的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
在一些方案中，本发明所述的IL31抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区CDR1，轻链可变区CDR1的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、10和16所示的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
在一些方案中，本发明所述的IL31抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区CDR2，轻链可变区CDR2的氨基酸序列与SEQ ID NO：5、11和17所示的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
在一些方案中，本发明所述的IL31抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区CDR3，轻链可变区CDR3的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、12和18所示的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
在一些方案中，本发明所述的IL31抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区CDR1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1、7或13所示的氨基酸序列具有不低于80％的同一性，重链可变区CDR2的氨基酸序列与SEQ ID NO：2、8和14所示的氨基酸序列具有不低于80％的同一性，重链可变区CDR3的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、9和15所示的氨基酸序列具有不低于80％的同一性；以及轻链可变区CDR1的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、10和16所示的氨基酸序列具有不低于80％的同一性，轻链可变区CDR2的氨基酸序列与SEQ ID NO：5、11和17所示的氨基酸序列具有不低于80％的同一性，轻链可变区CDR3的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、12和18所示的氨基酸序列具有不低于80％的同一性。
本发明中，根据不同的抗体编号系统SEQ ID NO：1也可以是SEQ ID NO：19或25；SEQ ID NO：7也可以是SEQ ID NO：21或30，SEQ ID NO：13也可以是SEQ ID NO：23或35，SEQID NO：2也可以是SEQ ID NO：20或26，SEQ ID NO：8也可以是SEQ ID NO：22或31，SEQ IDNO：14也可以是SEQ ID NO：24或36，SEQ ID NO：3也可以是SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：9也可以是SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：15也可以是SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：4也可以是SEQ IDNO：28，SEQ ID NO：10也可以是SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：16也可以是SEQ ID NO：38，SEQID NO：5也可以是SEQ ID NO：29(氨基酸序列为RA)，SEQ ID NO：11也可以是SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：17也可以是SEQ ID NO：39。其中，SEQ ID NO：1-18为采用Kabat编号系统得到的CDR，SEQ ID NO：3-6、9-12和15-24为采用Chothia编号系统得到的CDR，SEQ ID NO：6、12、18和25-39为采用IMGT编号系统得到的CDR。SEQ ID NO:34氨基酸序列为GA，SEQ ID NO:39氨基酸序列为YV。即SEQ ID NO：1为SEQ ID NO：19或25取代；SEQ ID NO：7为SEQ ID NO：21或30取代，SEQ ID NO：13为SEQ ID NO：23或35取代，SEQ ID NO：2为SEQ ID NO：20或26取代，SEQ ID NO：8为SEQ ID NO：22或31取代，SEQ ID NO：14为SEQ ID NO：24或36取代，SEQ IDNO：3为SEQ ID NO：27取代，SEQ ID NO：9为SEQ ID NO：32取代，SEQ ID NO：15为SEQ ID NO：37取代，SEQ ID NO：4为SEQ ID NO：28取代，SEQ ID NO：10为SEQ ID NO：33取代，SEQ IDNO：16为SEQ ID NO：38取代，SEQ ID NO：5为SEQ ID NO：29(氨基酸序列为RA)取代，SEQ IDNO：11为SEQ ID NO：34(氨基酸序列为GA)取代，SEQ ID NO：17为SEQ ID NO：39(氨基酸序列为YV)取代。
本发明中，所述重链可变区CDR1的氨基酸残基数量不超过10；和/或，所述重链可变区CDR2的氨基酸残基数量不超过22；和/或，所述重链可变区CDR3的氨基酸残基数量不超过17；和/或，所述轻链可变区CDR1的氨基酸残基数量不超过18；和/或，所述轻链可变区CDR2的氨基酸残基数量不超过10；和/或，所述轻链可变区CDR3的氨基酸残基数量不超过12。
本发明中，为了使得获得的抗体或其抗原结合片段可以更好的抑制IL-31，且具有高亲和力和高活性，从而抑制犬科皮肤瘙痒性疾病，所述重链可变区CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，重链可变区CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示，重链可变区CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示，轻链可变区CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示，轻链可变区CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示，轻链可变区CDR3的氨基酸序列为SEQ IDNO：6所示。
本发明的另一种实施方式，所述重链可变区CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示，重链可变区CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示，重链可变区CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：9所示，轻链可变区CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：10所示，轻链可变区CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：11所示，轻链可变区CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：12所示。
本发明的另一种实施方式，所述重链可变区CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：13所示，重链可变区CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：14所示，重链可变区CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：15所示，轻链可变区CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：16所示，轻链可变区CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：17所示，轻链可变区CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：18所示。
在一些方案中，本发明所述的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含与选自由SEQ ID NOs：40-43，48-51，56-59组成的组的氨基酸序列以及至少约80％、85％、90％、95％同一性；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含与选自由SEQ IDNOs：44-47，52-55，60-63组成的组的氨基酸序列以及至少约80％、85％、90％、95％同一性。
在一些方案中，本发明提供的抗体为嵌合抗体，进一步提供了嵌合抗IL31抗体，其包含重链可变区和/或轻链可变区。
优选的，所述抗体重链可变区选自SEQ ID NO：40、48、56，所述抗体轻链可变区选自SEQ ID NO：44、52、60。
优选的，所述嵌合抗IL31抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：40以及至少约80％、85％、90％、95％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO：44以及至少约80％、85％、90％、95％同一性的氨基酸序列。
优选的，所述嵌合抗IL31抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：48以及至少约80％、85％、90％、95％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO：52以及至少约80％、85％、90％、95％同一性的氨基酸序列。
优选的，所述嵌合抗IL31抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：56以及至少约80％、85％、90％、95％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO：60以及至少约80％、85％、90％、95％同一性的氨基酸序列。
优选的，所述重链氨基酸序列选自SEQ ID NO：66、74或82；所述轻链氨基酸序列选自SEQ ID NO：70、78或86。
更优选的，所述抗体可以为重链为SEQ ID NO：66所示、轻链为SEQ ID NO：70所示，或重链为SEQ ID NO：74所示、轻链为SEQ ID NO：78所示，或重链为SEQ ID NO：82所示、轻链为SEQ ID NO：86所示。
本发明中，为了使得获得的抗体或其抗原结合片段可以更好的抑制IL-31，且具有高亲和力和高活性，从而抑制犬科皮肤瘙痒性疾病，本发明提供犬源化抗体或其抗原结合片段。
在一些方案中，所述重链可变区框架FR氨基酸序列选自于犬种系重链序列，优选具有0-5个回复突变残基，可以为0、1、2、3、4或5个回复突变；在一些实施例中，优选为1个或多个选自49G、71V、73K、78A的氨基酸回复突变，另一优选为54A、55E、82D、87V的氨基酸回复突变。
在一些方案中，所述轻链可变区框架FR氨基酸序列选自于犬种系轻链序列，优选具有0-5个回复突变残基，可以为0、1、2、3、4或5个回复突变残基。在一些实施例中，优选为1个或多个选自2I、4L、36Y、46L、68R的氨基酸回复突变；另一优选为1个或多个选自68G、73F、78L的氨基酸回复突变；另另一优选为1个或多个选自2I、12S、37Q、46V、49K、59P、60S、69S、77S的氨基酸回复突变。“回复突变残基”指经过氨基酸残基第二次突变又完全地或部分地恢复为原来的基因型和表现型。
本发明中，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：41-43、49-51和57-59所示中的一种，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：45-47、53-55和61-63所示中的一种。
在一些实施例中，本发明提供了犬源化抗IL31抗体，含有SEQ ID NOs：41-43氨基酸序列的重链可变区具有至少80％、85％、90％、95％同一性的氨基酸序列，以及含有SEQID NOs：45-47的氨基酸序列的轻链可变区具有至少80％、85％、90％、95％同一性的氨基酸序列。优选的，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：41-43所示中的一种，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：45-47所示中的一种，更优选的，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：42和43所示中的一种，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：45和47所示中的一种。
在一些实施例方案中，本发明提供了犬源化抗IL31抗体，含有SEQ ID NOs：49-51氨基酸序列的重链可变区具有至少80％、85％、90％、95％同一性的氨基酸序列，以及含有SEQ ID NOs：53-55的氨基酸序列的轻链可变区具有至少80％、85％、90％、95％同一性的氨基酸序列。优选的，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：49-51所示中的一种，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：53-55所示中的一种；更优选的，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：49和50所示中的一种，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：54和55所示中的一种。
在一些方案中，本发明提供了犬源化抗IL31抗体，含有SEQ ID NOs：57-59氨基酸序列的重链可变区具有至少80％、85％、90％、95％同一性的氨基酸序列，以及含有SEQ IDNOs：61-63的氨基酸序列的轻链可变区具有至少80％、85％、90％、95％同一性的氨基酸序列。优选的，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：57-59所示中的一种，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：61-63所示中的一种；更优选的，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：58和59所示中的一种，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：61和62所示中的一种。
在一些方案中，本发明提供了所述的嵌合和/或犬源化抗体或抗原结合片段，含有IgG A,IgG B,IgG C，IgG D重链恒定区或其变体，优选SEQ ID NO：64组成的IgG B突变体重链恒定区氨基酸序列；以及含有犬κ或λ链轻链恒定区或其变体，优选SEQ ID NO:65组成的κ轻链恒定区氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明提供了抗IL31嵌合抗体，其中所述抗体含有完整重链，所述重链选自SEQ ID NO：66、74或82组成的氨基酸至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；所述轻链氨基酸序列选自SEQ ID NO：70、78或86组成的氨基酸至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
所述嵌合抗体可以为SEQ ID NO：66所示的重链和SEQ ID NO：70所示的轻链构成；或SEQ ID NO：74所示的重链和SEQ ID NO：78所示的轻链构成；或SEQ ID NO：82所示的重链和SEQ ID NO：86所示的轻链构成。
在一些实施例中，本发明提供了抗IL31犬源化抗体，其中所述抗体含有完整重链，所述重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：67-69、75-77和83-85中的一种以及至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；以及完整轻链，所述轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：71-73、79-81和87-89中的一种以及至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
所述犬源化抗体的可变区由同一抗体的犬源化可变区重链和犬源化可变区轻链自由组合。例如：重链6465-H1(SEQ ID NO:41)可与轻链6465-K1、6465-K2或6465-K3组合，分别标记为6465-H1K1，6465-H1K2和6465-H1K3，以此类推。例如6465-H1K1-canIgGB具有犬源化可变区重链H1、犬源化可变区轻链K1和犬IgGB恒定区，以此类推，具体组合详见表1。
在一些实施例中，所述抗体可以为SEQ ID NO：67所示的重链和SEQ ID NO：71所示的轻链构成，或SEQ ID NO：68所示的重链和SEQ ID NO：71所示的轻链构成，或SEQ ID NO：69所示的重链和SEQ ID NO：71所示的轻链构成，或SEQ ID NO：67所示的重链和SEQ ID NO：72所示的轻链构成，或SEQ ID NO：68所示的重链和SEQ ID NO：72所示的轻链构成，或SEQID NO：69所示的重链和SEQ ID NO：72所示的轻链构成，或SEQ ID NO：67所示的重链和SEQID NO：73所示的轻链构成，或SEQ ID NO：68所示的重链和SEQ ID NO：73所示的轻链构成，或SEQ ID NO：69所示的重链和SEQ ID NO：73所示的轻链构成，或SEQ ID NO：75所示的重链和SEQ ID NO:79所示的轻链构成，或SEQ ID NO：76所示的重链和SEQ ID NO:79所示的轻链构成，或SEQ ID NO：77所示的重链和SEQ ID NO:79所示的轻链构成，或SEQ ID NO:75所示的重链和SEQ ID NO:80所示的轻链构成，或SEQ ID NO：76所示的重链和SEQ ID NO:80所示的轻链构成，或SEQ ID NO：77所示的重链和SEQ ID NO:80所示的轻链构成，或SEQ ID NO:75所示的重链和SEQ ID NO:81所示的轻链构成，或SEQ ID NO：76所示的重链和SEQ ID NO:81所示的轻链构成，或SEQ ID NO：77所示的重链和SEQ ID NO:81所示的轻链构成，或SEQID NO:83所示的重链和SEQ ID NO:87所示的轻链构成，或SEQ ID NO:84所示的重链和SEQID NO:87所示的轻链构成，或SEQ ID NO:85所示的重链和SEQ ID NO:87所示的轻链，或SEQID NO:83所示的重链和SEQ ID NO:88所示的轻链构成，或SEQ ID NO:84所示的重链和SEQID NO:88所示的轻链构成，或SEQ ID NO:85所示的重链和SEQ ID NO:88所示的轻链，或SEQID NO:83所示的重链和SEQ ID NO:89所示的轻链构成，或SEQ ID NO:84所示的重链和SEQID NO:89所示的轻链构成，或SEQ ID NO:85所示的重链和SEQ IDNO:89所示的轻链构成。
本发明中，优选的，所述抗体或其抗原结合片段包括单抗、多抗、多聚体抗体和CDR移植抗体中的至少一种；优选的，所述抗体或其抗原结合片段包括单链抗体、Fab抗体、Fv抗体、单域抗体、(Fab)2片段、scFv-Fc融合蛋白、scFv-Fv融合蛋白、Fv片段和抗原最小识别单位中的一种。
本发明在第二方面本发明提供了编码上述IL31抗体或其抗原结合片段的核苷酸分子。
本发明并不限于具体的核苷酸序列，只要符合密码子编码规则能够翻译得到上述蛋白序列的均在本发明保护范围内。如需特别限定，优选的，编码所述重链的DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO：90-93、98-101和106-109中的一种以及与之具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的其基本相似序列；另优选的，编码所述轻链的DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO：94-97、102-105和110-113中的一种以及与之具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的其基本相似序列。
更优选的，编码抗体的DNA可以为，重链为SEQ ID NO：90、轻链为SEQ ID NO：94所示；重链为SEQ ID NO：91，轻链为SEQ ID NO：95所示；重链为SEQ ID NO：92，轻链为SEQ IDNO：95所示；重链为SEQ ID NO：93，轻链为SEQ ID NO：95所示；重链为SEQ ID NO：91，轻链为SEQ ID NO：96所示；重链为SEQ ID NO：92，轻链为SEQ ID NO：96所示；重链为SEQ ID NO：93，轻链为SEQ ID NO：96所示；重链为SEQ ID NO：91，轻链为SEQ ID NO：97所示；重链为SEQID NO：92，轻链为SEQ ID NO：97所示；重链为SEQ ID NO：93，轻链为SEQ ID NO：97所示；重链为SEQ ID NO：98，轻链为SEQ ID NO：102所示；重链为SEQ ID NO：99，轻链为SEQ ID NO：103所示；重链为SEQ ID NO：100，轻链为SEQ ID NO：103所示；重链为SEQ ID NO：101，轻链为SEQ ID NO：103所示；重链为SEQ ID NO：99，轻链为SEQ ID NO：104所示；重链为SEQ IDNO：100，轻链为SEQ ID NO：104所示；重链为SEQ ID NO：101，轻链为SEQ ID NO：104所示；重链为SEQ ID NO：99，轻链为SEQ ID NO：105所示；重链为SEQ ID NO：100，轻链为SEQ ID NO：105所示；重链为SEQ ID NO：101，轻链为SEQ ID NO：105所示；重链为SEQ ID NO：106，轻链为SEQ ID NO：110所示；重链为SEQ ID NO：107，轻链为SEQ ID NO：111所示；重链为SEQ IDNO：108，轻链为SEQ ID NO：111所示；重链为SEQ ID NO：109，轻链为SEQ ID NO：111所示；重链为SEQ ID NO：107，轻链为SEQ ID NO：112所示；重链为SEQ ID NO：108，轻链为SEQ IDNO：112所示；重链为SEQ ID NO：109，轻链为SEQ ID NO：112所示；重链为SEQ ID NO：107，轻链为SEQ ID NO：113；重链为SEQ ID NO：108，轻链为SEQ ID NO：113；重链为SEQ ID NO：109，轻链为SEQ ID NO：113所示。
本发明第三方面提供了一种表达载体，该表达载体表达上述的核苷酸分子。
本发明中，所述表达载体是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体，在本发明中，为在核苷酸上增加表达元件，使得表达载体可以顺利表达出本发明的DNA分子，如在包含本发明核苷酸的质粒。优选地，所述表达载体为真核表达载体，例如pCDNA3.1、pcDNA3.4。
本发明第四方面提供了一种生产抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括：用上述的表达载体转化宿主细胞。
本发明中，所述转化的方法没有限制，为本领域常见的将表达载体导入宿主细胞使其表达的方法。
本发明中，所述宿主细胞没有限制，可以顺利表达出本发明的核苷酸分子，优选所述宿主细胞为真核细胞，更优选哺乳动物细胞，包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、NS0、NP2/0、Hela细胞、293T细胞、HEK293和其它细胞系。
本发明第五方面提供了一种药物组合物，该药物组合物包括辅料以及上述的抗体或其抗原结合片段或上述的核苷酸分子或表达载体。优选的，所述辅料选自药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明中，所述药物载体和赋形剂没有限制，药学上可接受即可，包括但不限于盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇或其组合。
本发明第六方面提供了一种治疗哺乳动物皮肤瘙痒性疾病的方法，该方法包括：向哺乳动物施用上述的抗体或其抗原结合片段或核酸分子或表达载体或药物组合物。
所述的抗体或其抗原结合片段的施用量为1-5mg/kg，可以为1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg或以上任意两数值形成的范围及范围内的值。
所述施用的方式包含但不限于静脉注射、肌内注射、皮下注射、舌下给药、直肠灌注、吸入给药、喷雾给药等，更优选皮下注射给药。
所述皮肤瘙痒性疾病包括但不限于特应性皮炎、接触性皮炎、结节性瘙痒和湿疹中等，优选特应性皮炎。
所述哺乳动物为猫科、犬科、猪科、牛科、羊科、猴科、鼠科和马科动物中的至少一种。优选的，所述哺乳动物为犬、狼、豺和狐狸中的至少一种，更优选为犬。
本发明第七方面提供了一种上述的抗体或其抗原结合片段或核酸分子或载体在制备用于治疗哺乳动物皮肤瘙痒性疾病的药物中的用途。
本发明中提供了一种上述的抗体或其抗原结合片段或核酸分子或载体在治疗哺乳动物皮肤瘙痒性疾病中的用途。
关于皮肤瘙痒疾病、药物的施用量与施用方式、以及哺乳动物的前面已经说明，此处不再赘述。
通过上述技术方案，本发明提供的可结合白介素31的抗体或其抗原结合片段高亲和力和高活性，通过阻断IL-31及其受体结合，尤其是犬IL-31，从而抑制哺乳动物皮肤瘙痒性疾病。
附图说明
图1是在抗体6465、7475或B2的存在下APC阳性细胞率；
图2是3个嵌合抗体和Lokivetmab对犬IL-31瘙痒攻击的抑制效果；
图3是4种基于6465抗体构建的犬源化抗体对犬IL-31瘙痒攻击的抑制效果；
图4是4种基于7475抗体构建的犬源化抗体对犬IL-31瘙痒攻击的抑制效果；
图5是4种基于B2抗体构建的犬源化抗体对犬IL-31瘙痒攻击的抑制效果。
具体实施方式
实施例1、小鼠抗犬白介素31(IL-31)抗体的产生与鉴定
(1)抗原制备
使用HEK293细胞瞬转表达His标记犬IL-31(白细胞介素31)重组蛋白，收集瞬转细胞的培养上清并使用Ni柱对上清进行亲和层析，洗脱液为纯化的犬IL-31重组蛋白。
(2)小鼠免疫
以犬IL-31重组蛋白作为抗原，分别对Balb/c小鼠和C57小鼠进行免疫。首次免疫用弗氏完全佐剂乳化抗原，每只小鼠给予100μg抗原，后续免疫用弗氏不完全佐剂乳化抗原，每只小鼠给予50μg抗原。间隔时间为两周，注射方式为腹腔加皮下多点注射。第四次免疫后，收集血清并使用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析抗体效价，选择血清免疫效价超过36万的小鼠进行抗体库构建。
(3)脾脏RNA提取与反转录
采用TRIzol法提取小鼠脾脏组织的RNA，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，使用超微量分光光度计测定RNA的浓度及OD260/OD280。选择质量合格的RNA按照反转录酶Superscript II reverse transcriptase(Thermo Scientific)的说明书进行RNA反转录，获得cDNA。
(4)抗体库构建与噬菌体展示
从cDNA中扩增抗体重链和轻链，分别构建scFv抗体库和Fab抗体库，库容均达到1E8 cfu。将抗体库电转至TG1大肠杆菌中，再用加入辅助噬菌体M13KO7侵染TG1大肠杆菌，经过夜培养后，使用PEG/NaCl沉析噬菌体，制备噬菌体展示抗体库。
(5)噬菌体展示抗体库筛选
采用免疫管和磁珠筛选仪，分别对噬菌体展示抗体库进行固相筛选、固相与液相交叉筛选。其中固相筛选使用犬IL-31重组蛋白包被免疫管，液相筛选使用生物素化的犬IL-31重组蛋白包被Dynabeads磁珠。经过三轮筛选后，使用Phage ELISA鉴定富集的噬菌体集合以及从集合中分离的单克隆。
(6)抗体的构建与表达纯化
对Phage ELISA阳性单克隆的噬菌粒进行DNA测序，从测序结果中选取具有正确读码框的鼠源抗体可变区进行基因合成，然后将鼠源抗体可变区与人IgG1恒定区融合后插入pcDNA3.4载体，构建全长抗体表达质粒。在HEK293细胞中瞬时转染表达全长抗体，培养上清经Protein A亲和层析，获得纯化的全长抗体。
(7)阻断犬IL-31与其受体结合的抗体筛选
将生物素标记的犬IL-31重组蛋白与不同浓度的抗体孵育5分钟，然后加入具有膜表达犬IL-31受体(犬IL-31RA和犬OSMR)的HEK293细胞中，冰上孵育30分钟，PBS漂洗三次后，加入链霉亲和素-APC荧光二抗，利用流式细胞仪分析被APC标记的细胞比例。APC阳性细胞率反映生物素标记犬IL-31重组蛋白与具有膜表达犬IL-31受体细胞的结合能力，APC阳性细胞率越低，说明抗体阻断生物素标记犬IL-31重组蛋白与其受体结合的能力越强。
结果：测试抗体6465、7475和B2抗体随抗体浓度增加，均可导致APC阳性细胞下降，表明抗体均具有阻断效果。具体结果见图1。使用Kabat编码得到抗体6465重链可变区互补决定区(CDR)1、2、3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：1-3，轻链可变区CDR1、2、3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：4-6；抗体7475重链可变区CDR1、2、3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：7-9，轻链可变区CDR1、2、3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：10-12；抗体B2重链可变区CDR1、2、3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：13-15，轻链可变区CDR1、2、3的氨基酸序列依次为SEQID NO：16-18。使用Chothia编码得到抗体6465重链可变区CDR1、2、3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：19、20、3，轻链可变区CDR1、2、3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：4-6；抗体7475重链可变区CDR1、2、3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：21、22、9，轻链可变区CDR1、2、3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：10-12；抗体B2重链可变区CDR1、2、3的氨基酸序列依次为SEQID NO：23、24、15，轻链可变区CDR1、2、3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：16-18。使用IMGT编码得到抗体6465重链可变区CDR1、2、3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：25-27，轻链可变区CDR1、2、3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：28、29、6；抗体7475重链可变区CDR1、2、3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：30-32，轻链可变区CDR1、2、3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：33、34、12；抗体B2重链可变区CDR1、2、3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：35-37，轻链可变区CDR1、2、3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：38、39、18。
实施例2、构建鼠抗犬IL-31抗体的嵌合抗体和犬源化抗体
(1)嵌合抗体
对6465、7475和B2进行犬嵌合抗体克隆构建，这些嵌合抗体具有来自小鼠重链可变区和小鼠轻链可变区，基于6465的嵌合抗体(6465-mHvKv-canIgG B)，构建重链可变区变体(SEQ ID NO:40)，轻链可变区变体(SEQ ID NO:44)；基于7475的嵌合抗体(7475-mHvKv-canIgG B)，构建重链可变区变体(SEQ ID NO:48)和轻链可变区变体(SEQ ID NO:52)；基于B2的嵌合抗体(B2-mHvKv-canIgG B)，构建重链可变区变体(SEQ ID NO:56)和轻链可变区变体(SEQ ID NO:60)。以及来自犬IgG B抗体的恒定区(包括CL、CH1、CH2、CH3)。犬IgG B重链的恒定区结构域氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示。犬IgG B轻链的恒定区结构域氨基酸序列如SEQ ID NO:65所示。具体组合详见表1。
(2)犬源化抗体
1)构建6465的三个犬源化重链可变区变体(SEQ ID NO:41-43)和三个犬源化轻链可变区变体(SEQ ID NO:45-47)，其含有不同的修饰或取代。其中6465-H1的犬源化策略为CDR移植和回复突变49G，71V及73K，6465-H2为CDR移植和回复突变49G，71V，73K及78A，6465-H3仅CDR移植。6465-K1的犬源化策略为CDR移植和回复突变2I，4L，46L及68R，6465-K2的犬源化策略为CDR移植和回复突变4L，36Y，46L及68R，6465-K3的犬源化策略为CDR移植和回复突变36Y。
2)构建7475的三个犬源化重链可变区变体(SEQ ID NO:49-51)和三个犬源化轻链可变区变体(SEQ ID NO:53-55)，其含有不同的修饰或取代。其中7475-H1、7475-H2和7475-H3的犬源化策略均为仅CDR移植。7475-K1和7475-K3的犬源化策略为仅CDR移植，而7475-K2的犬源化策略为CDR移植和回复突变68G，73F及78L。
3)构建B2的三个犬源化重链可变区变体(SEQ ID NO:57-59)和三个犬源化轻链可变区变体(SEQ ID NO:61-63)，其含有不同的修饰或取代。其中B2-H1的犬源化策略为CDR移植和回复突变54A，82D及87V，B2-H2的犬源化策略为CDR移植和回复突变55E，82D及87V，B2-H3的犬源化策略为CDR移植和回复突变55E，82D及87V。B2-K1的犬源化策略为CDR移植和回复突变2I，46V，49K和69S，B2-K2的犬源化策略为CDR移植和回复突变46V，49K和69S，B2-K3的犬源化策略为CDR移植和回复突变2I，12S，37Q，46V，49K，59P，60S，69S及77S。
犬源化抗体的可变区由同一抗体的犬源化可变区重链和犬源化可变区轻链自由组合，例如：重链6465-H1(SEQ ID NO:41)可与轻链6465-K1、6465-K2或6465-K3组合，分别标记为6465-H1K1，6465-H1K2和6465-H1K3，以此类推。犬源化抗体的恒定区由犬IgG B重链的恒定结构域和犬Kappa轻链恒定结构域组成(犬IgG B重链的恒定区结构域氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示。犬Kappa轻链的恒定区结构域氨基酸序列如SEQ ID NO:65所示)，例如6465-H1K1-canIgG B具有犬源化可变区重链H1、犬源化可变区轻链K1和犬IgG B恒定区，以此类推，具体组合详见表1。
犬IgG B重链恒定区包含3个氨基酸突变，分别是M234A，L235A和G237A，目的是降低犬IgG B与犬FcγRI和C1q的亲和力，从而避免犬IgG B的效应功能。
表1嵌合抗体和犬源化抗体序列表
实施例3、嵌合抗体和犬源化抗体的体外评价
(1)基于6465、7475和B2抗体所构建的新抗体体外活性评价
新抗体对犬IL-31诱导的STAT(信号传导及转录激活因子)磷酸化的抑制测定：
IL-31通过与其细胞表面共受体IL-31RA和OSMR结合，从而激活下游JAK/STAT信号通路，导致STAT3磷酸化程度增加。当IL-31中和抗体阻断IL-31与其受体结合时，其下游信号通路的STAT3磷酸化也被抑制。使用不同浓度梯度的抗犬IL-31嵌合抗体和犬源化抗体，在DH82细胞试验中评价抗体抑制STAT磷酸化的IC50值。具体过程为，每孔铺50000个DH82细胞，加10ng/mL IFN-γ，37℃刺激24小时，再血清饥饿2小时。将2.86μg/mL犬IL-31重组蛋白与不同浓度的犬IL-31抗体孵育1小时后，加入上述DH82细胞，37℃刺激5分钟。然后参考STAT3p-Y705试剂盒说明书检测DH82细胞的STAT3磷酸化水平，根据抗体浓度计算IC50值。结果如表2所示，3个嵌合抗体和27个犬源化抗体均能抑制pSTAT的活性，IC50在6.7-9.4μg/mL。
表2犬源化抗体诱导pSTAT的活性
(2)基于6465、7475和B2抗体所构建新抗体的亲和力测定
使用基于生物膜干涉(BLI)技术的Gator仪器测定抗体的结合亲和力。当生物传感器上的固化物与溶液中分析物发生相互作用时，传感器上的生物膜层厚度增加，干涉光谱曲线向波长增加的方向移动，相位移动由工作站探测并分析，可定量得出传感器表面分子数量变化及相关浓度与动力学数据，如解离速率Koff、结合速率Kon和亲和力KD，其中KD＝Koff/Kon。
分别对3个嵌合抗体、27个犬源化抗体和阳性对照Lokivetmab的结合亲和力进行检测。具体过程为，首先对抗体进行生物素标记，然后将生物素标记的抗体作为固化物与生物传感器使用链霉亲和素探针(GatorTM Streptavidin Probes)固化生物素标记的抗体结合。再用不同浓度梯度的犬IL-31重组蛋白作为分析物，测定其与生物素标记抗体的结合动力学数据，计算亲和力。结果如表3所示，3个嵌合抗体和27个犬源化抗体的结合亲和力KD达10-9M，是阳性对照Lokivetmab亲和力的10倍左右。
表3 IL31抗体的亲和力数据
注：E为科学计数法，为×10，E后面的数值为10的幂
实施例4、基于6465、7475和B2的嵌合抗体和犬源化抗体的体内药效评价
使用犬IL-31瘙痒攻击模型对抗犬IL-31嵌合抗体和犬源化抗体进行体内药效评估。
首先对比格犬(体重约10kg)造模并筛选出合适的试验犬。静脉注射2.5μg/kg犬IL-31重组蛋白，使用视频监控给药前半小时与给药后四小时内比格犬的瘙痒行为(如咀嚼、抓挠、咬、舔、滚动和摩擦等)，若在1分钟内观察到瘙痒行为则计1分，没有则计0分。每间隔1分钟进行一次评分。以给药前半小时的累计瘙痒评分为基线值，给药后四个小时的累计瘙痒评分为测量值。测量值扣除其基线值得到最终瘙痒评分。由于个体差异，每只比格犬造模后的瘙痒评分波动较大，为了模型的均一性，筛选瘙痒分数在100-150分之间的比格犬并分组。
筛选出造模成功的比格犬，选择25只犬，随机分为5组，3个给药组(6465、7475和B2嵌合抗体)、PBS对照组和阳性对照组(Lokivetmab)，每组5只。适应7天后，对给药组比格犬分别皮下注射2mg/kg6465、7475和B2嵌合抗体，阳性对照组比格犬皮下注射2mg/kgLokivetmab，阴性对照PBS组皮下注射等体积的PBS。次日对所有比格犬静脉注射2.5μg/kg犬IL-31重组蛋白。依上述评分标准，记录每组比格犬的瘙痒评分，以评价给药抗体是否抑制IL-31介导的瘙痒。结果见图2，对比格犬给予PBS，不能减少IL31引起的瘙痒症状，瘙痒评分仍在100-150内，而给予3个嵌合抗体和Lokivetmab，均可明显减少IL31引起的犬瘙痒，具有明显的抑制效果。
以相同试验方法，分别评估6465、7475和B2犬源化抗体(6465-H2K1-canIgGB、6465-H3K1-canIgGB、6465-H2K3-canIgGB、6465-H3K3-canIgGB、7475-H1K2-canIgGB、7475-H2K2-canIgGB、7475-H1K3-canIgGB、7475-H2K3-canIgGB、B2-H2K1-canIgGB、B2-H3K1-canIgGB、B2-H2K2-canIgGB、B2-H3K2-canIgGB)的药效，结果分别见图3、4和5。显示，与嵌合抗体相似，12个犬源化抗体具有明显的抑制效果，造模后四小时观察期内的瘙痒分数下降超过75％，表1所示的其它犬源化抗体的与这12个犬源化抗体表现相似。
此外，使用跳蚤诱导过敏性皮炎模型评估抗犬IL-31犬源化抗体的药效，初步结果显示，犬源化抗体亦能明显抑制跳蚤诱导的瘙痒行为。对特应性皮炎患犬的疗效结果也显示，犬源化抗体可减少特应性皮炎患犬的瘙痒症状。
上述试验期间及后续1个月，未发现试验犬出现不良反应。
以上结果表明，采用本发明构建的抗体具有高亲和力和高活性，通过阻断犬IL-31及其受体结合，可抑制由犬IL-31和跳蚤引起的犬类皮肤瘙痒性疾病，可减少特应性皮炎患犬的瘙痒症状。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
本发明中，SEQ ID NO：1-39的序列如下，其中SEQ ID NO：29、34和39由于序列过短，导致WIPO Sequence不识别，因此在软件中做了“故意跳过的处理”，但并不影响检索，SEQ ID NO：1-39原始序列以此为准作为原始公开。
SEQ ID NO：1为：NYYLY
SEQ ID NO：2为：ELNPRNGGTNLNAKFKT
SEQ ID NO：3为：GGTTVVVRDVMDF
SEQ ID NO：4为：RASESVDSYGNSFMH
SEQ ID NO：5为：RASNLES
SEQ ID NO：6为：QQSNEDPYT
SEQ ID NO：7为：SYAMS
SEQ ID NO：8为：YISNGGDYIFYADTVKG
SEQ ID NO：9为：RGHYNTSSYWYFDV
SEQ ID NO：10为：KASENVGTYVS
SEQ ID NO：11为：GASNRYT
SEQ ID NO：12为：GQSYSYPPT
SEQ ID NO：13为：DAWMD
SEQ ID NO：14为：EIRSRAESHATYYAESVKG
SEQ ID NO：15为：ASTMITTGWFAY
SEQ ID NO：16为：RASQNISVYLH
SEQ ID NO：17为：YVSQSIS
SEQ ID NO：18为：QNGHSFPYT
SEQ ID NO：19为：GYSFTNY
SEQ ID NO：20为：NPRNGG
SEQ ID NO：21为：GFTFSSY
SEQ ID NO：22为：SNGGDY
SEQ ID NO：23为：GFTFSDA
SEQ ID NO：24为：RSRAESHA
SEQ ID NO：25为：GYSFTNYY
SEQ ID NO：26为：LNPRNGGT
SEQ ID NO：27为：TRGGTTVVVRDVMDF
SEQ ID NO：28为：ESVDSYGNSF
SEQ ID NO：29为：RA
SEQ ID NO：30为：GFTFSSYA
SEQ ID NO：31为：ISNGGDYI
SEQ ID NO：32为：TRRGHYNTSSYWYFDV
SEQ ID NO：33为：ENVGTY
SEQ ID NO：34为：GA
SEQ ID NO：35为：GFTFSDAW
SEQ ID NO：36为：IRSRAESHAT
SEQ ID NO：37为：TPASTMITTGWFAY
SEQ ID NO：38为：QNISVY
SEQ ID NO：39为：YV。
Claims (11)
1.一种可结合白介素31的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，该抗体或其抗原结合片段的重链可变区CDR1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1、7或13所示的氨基酸序列具有不低于80％的同一性，重链可变区CDR2的氨基酸序列与SEQ ID NO：2、8和14所示的氨基酸序列具有不低于80％的同一性，重链可变区CDR3的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、9和15所示的氨基酸序列具有不低于80％的同一性，轻链可变区CDR1的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、10和16所示的氨基酸序列具有不低于80％的同一性，轻链可变区CDR2的氨基酸序列与SEQ ID NO：5、11和17所示的氨基酸序列具有不低于80％的同一性，轻链可变区CDR3的氨基酸序列与SEQID NO：6、12和18所示的氨基酸序列具有不低于80％的同一性。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区CDR1的氨基酸残基数量不超过10；
和/或，所述重链可变区CDR2的氨基酸残基数量不超过22；
和/或，所述重链可变区CDR3的氨基酸残基数量不超过17；
和/或，所述轻链可变区CDR1的氨基酸残基数量不超过18；
和/或，所述轻链可变区CDR2的氨基酸残基数量不超过10；
和/或，所述轻链可变区CDR3的氨基酸残基数量不超过12。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，重链可变区CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示，重链可变区CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示，轻链可变区CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示，轻链可变区CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示，轻链可变区CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示；
或，所述重链可变区CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示，重链可变区CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示，重链可变区CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：9所示，轻链可变区CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：10所示，轻链可变区CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：11所示，轻链可变区CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：12所示；
或，所述重链可变区CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：13所示，重链可变区CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：14所示，重链可变区CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：15所示，轻链可变区CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：16所示，轻链可变区CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：17所示，轻链可变区CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：18所示；
或，SEQ ID NO：1为SEQ ID NO：19或25取代；SEQ ID NO：7为SEQ ID NO：21或30取代，SEQ ID NO：13为SEQ ID NO：23或35取代，SEQ ID NO：2为SEQ ID NO：20或26取代，SEQ IDNO：8为SEQ ID NO：22或31取代，SEQ ID NO：14为SEQ ID NO：24或36取代，SEQ ID NO：3为SEQ ID NO：27取代，SEQ ID NO：9为SEQ ID NO：32取代，SEQ ID NO：15为SEQ ID NO：37取代，SEQ ID NO：4为SEQ ID NO：28取代，SEQ ID NO：10为SEQ ID NO：33取代，SEQ ID NO：16为SEQ ID NO：38取代，SEQ ID NO：5为SEQ ID NO：29(氨基酸序列为RA)取代，SEQ ID NO：11为SEQ ID NO：34(氨基酸序列为GA)取代，SEQ ID NO：17为SEQ ID NO：39(氨基酸序列为YV)取代。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体为嵌合抗体；
优选的，所述抗体重链可变区选自SEQ ID NO：40、48、56，所述抗体轻链可变区选自SEQID NO：44、52、60；
优选的，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：40，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：44；
或，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：48，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：52；
或，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：56，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：60；
优选的，所述重链氨基酸序列选自SEQ ID NO：66、74或82；所述轻链氨基酸序列选自SEQ ID NO：70、78或86；
更优选的，所述抗体可以为重链为SEQ ID NO：66所示、轻链为SEQ ID NO：70所示，或重链为SEQ ID NO：74所示、轻链为SEQ ID NO：78所示，或重链为SEQ ID NO：82所示、轻链为SEQ ID NO：86所示。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体为犬源化抗体；
优选的，所述重链可变区框架FR氨基酸序列选自于犬种系重链序列，优选具有0-5个回复突变残基；
优选的，所述轻链可变区框架FR氨基酸序列选自于犬种系轻链序列，优选具有0-5个回复突变残基；
优选的，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：41-43、49-51和57-59所示中的一种，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：45-47、53-55和61-63所示中的一种；
优选的，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：41-43所示中的一种，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：45-47所示中的一种，更优选的，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：42和43所示中的一种，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：45和47所示中的一种；
优选的，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：49-51所示中的一种，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：53-55所示中的一种；更优选的，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：49和50所示中的一种，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：54和55所示中的一种；
优选的，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：57-59所示中的一种，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：61-63所示中的一种；更优选的，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：58和59所示中的一种，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：61和62所示中的一种；
优选的，所述重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：67-69、75-77和83-85中的一种；
优选的，所述轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：71-73、79-81和87-89中的一种；
更优选的，所述抗体可以为SEQ ID NO：67所示的重链和SEQ ID NO：71所示的轻链构成，或SEQ ID NO：68所示的重链和SEQ ID NO：71所示的轻链构成，或SEQ ID NO：69所示的重链和SEQ ID NO：71所示的轻链构成，或SEQ ID NO：67所示的重链和SEQ ID NO：72所示的轻链构成，或SEQ ID NO：68所示的重链和SEQ ID NO：72所示的轻链构成，或SEQ ID NO：69所示的重链和SEQ ID NO：72所示的轻链构成，或SEQ ID NO：67所示的重链和SEQ ID NO：73所示的轻链构成，或SEQ ID NO：68所示的重链和SEQ ID NO：73所示的轻链构成，或SEQ IDNO：69所示的重链和SEQ ID NO：73所示的轻链构成，或SEQ ID NO：75所示的重链和SEQ IDNO:79所示的轻链构成，或SEQ ID NO：76所示的重链和SEQ ID NO:79所示的轻链构成，或SEQ ID NO：77所示的重链和SEQ ID NO:79所示的轻链构成，或SEQ ID NO:75所示的重链和SEQ ID NO:80所示的轻链构成，或SEQ ID NO：76所示的重链和SEQ ID NO:80所示的轻链构成，或SEQ ID NO：77所示的重链和SEQ ID NO:80所示的轻链构成，或SEQ ID NO:75所示的重链和SEQ ID NO:81所示的轻链构成，或SEQ ID NO：76所示的重链和SEQ ID NO:81所示的轻链构成，或SEQ ID NO：77所示的重链和SEQ ID NO:81所示的轻链构成，或SEQ ID NO:83所示的重链和SEQ ID NO:87所示的轻链构成，或SEQ ID NO:84所示的重链和SEQ ID NO:87所示的轻链构成，或SEQ ID NO:85所示的重链和SEQ ID NO:87所示的轻链，或SEQ ID NO:83所示的重链和SEQ ID NO:88所示的轻链构成，或SEQ ID NO:84所示的重链和SEQ ID NO:88所示的轻链构成，或SEQ ID NO:85所示的重链和SEQ ID NO:88所示的轻链，或SEQ IDNO:83所示的重链和SEQ ID NO:89所示的轻链构成，或SEQ ID NO:84所示的重链和SEQ IDNO:89所示的轻链构成，或SEQ ID NO:85所示的重链和SEQ ID NO:89所示的轻链构成。
优选的，所述抗体或其抗原结合片段为单抗、多抗、多聚体抗体和CDR移植抗体中的至少一种；
优选的，所述抗体或其抗原结合片段为单链抗体、Fab抗体、Fv抗体、单域抗体、(Fab)2片段、scFv-Fc融合蛋白、scFv-Fv融合蛋白、Fv片段和抗原最小识别单位中的一种。
6.一种核苷酸分子，其特征在于，该核苷酸分子编码权利要求1-5中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段；
优选的，编码所述重链的DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO：90-93、98-101和106-109中的一种；
优选的，编码所述轻链的DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO：94-97、102-105和110-113中的一种。
更优选的，编码抗体的DNA为：重链为SEQ ID NO：90、轻链为SEQ ID NO：94所示；重链为SEQ ID NO：91，轻链为SEQ ID NO：95所示；重链为SEQ ID NO：92，轻链为SEQ ID NO：95所示；重链为SEQ ID NO：93，轻链为SEQ ID NO：95所示；重链为SEQ ID NO：91，轻链为SEQ IDNO：96所示；重链为SEQ ID NO：92，轻链为SEQ ID NO：96所示；重链为SEQ ID NO：93，轻链为SEQ ID NO：96所示；重链为SEQ ID NO：91，轻链为SEQ ID NO：97所示；重链为SEQ ID NO：92，轻链为SEQ ID NO：97所示；重链为SEQ ID NO：93，轻链为SEQ ID NO：97所示；重链为SEQID NO：98，轻链为SEQ ID NO：102所示；重链为SEQ ID NO：99，轻链为SEQ ID NO：103所示；重链为SEQ ID NO：100，轻链为SEQ ID NO：103所示；重链为SEQ ID NO：101，轻链为SEQ IDNO：103所示；重链为SEQ ID NO：99，轻链为SEQ ID NO：104所示；重链为SEQ ID NO：100，轻链为SEQ ID NO：104所示；重链为SEQ ID NO：101，轻链为SEQ ID NO：104所示；重链为SEQID NO：99，轻链为SEQ ID NO：105所示；重链为SEQ ID NO：100，轻链为SEQ ID NO：105所示；重链为SEQ ID NO：101，轻链为SEQ ID NO：105所示；重链为SEQ ID NO：106，轻链为SEQ IDNO：110所示；重链为SEQ ID NO：107，轻链为SEQ ID NO：111所示；重链为SEQ ID NO：108，轻链为SEQ ID NO：111所示；重链为SEQ ID NO：109，轻链为SEQ ID NO：111所示；重链为SEQID NO：107，轻链为SEQ ID NO：112所示；重链为SEQ ID NO：108，轻链为SEQ ID NO：112所示；重链为SEQ ID NO：109，轻链为SEQ ID NO：112所示；重链为SEQ ID NO：107，轻链为SEQID NO：113；重链为SEQ ID NO：108，轻链为SEQ ID NO：113；重链为SEQ ID NO：109，轻链为SEQ ID NO：113所示。
7.一种表达载体，其特征在于，该表达载体表达权利要求6所述的核苷酸分子。
8.一种生产抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，该方法包括：用权利要求7所述的表达载体转化宿主细胞；
优选的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，更优选为CHOK1细胞或HEK293细胞。
9.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物包括辅料以及权利要求1-5中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的核苷酸分子或权利要求7所述的表达载体；
优选的，所述辅料选自药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂和佐剂中的至少一种。
10.一种治疗哺乳动物皮肤瘙痒性疾病的方法，其特征在于，该方法包括：向哺乳动物施用权利要求1-5中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的核酸分子或权利要求7所述的表达载体或权利要求9所述的药物组合物；
优选的，所述抗体或其抗原结合片段的施用量为1-5mg/kg；
更优选的，所述施用的方式为静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下给药、直肠灌注、吸入给药、喷雾给药中的至少一种，更优选为皮下注射给药；
进一步优选的，所述皮肤瘙痒性疾病为与IL-31异常表达相关的疾病；
进一步优选的，所述皮肤瘙痒性疾病为特应性皮炎、接触性皮炎、结节性瘙痒和湿疹中的至少一种；
更优选的，所述哺乳动物为猫科、犬科、猪科、牛科、羊科、猴科、鼠科和马科动物中的至少一种；
优选的，所述哺乳动物为犬、狼、豺和狐狸中的至少一种，更优选为犬。
11.权利要求1-5中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的核酸分子或权利要求7所述的表达载体在制备用于治疗哺乳动物皮肤瘙痒性疾病的药物中的用途；
优选的，所述皮肤瘙痒性疾病为与IL-31异常表达相关的病灶；
进一步优选的，所述皮肤瘙痒性疾病为特应性皮炎、接触性皮炎、结节性瘙痒、和湿疹中的至少一种；
更优选的，所述哺乳动物为猫科、犬科、猪科、牛科、羊科、猴科、鼠科和马科动物中的至少一种；
优选的，所述哺乳动物为犬、狼、豺和狐狸中的至少一种，更优选为犬。
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