CN117165648A - 基于生物质废料生产目的产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于生物质废料生产目的产物的方法。一种基于生物质废料生产目的产物的方法，包括如下步骤：(A)将菌A投入由生物质废料制成的第一培养基中进行降解发酵，菌A为有机物降解菌，反应后的物料进行灭活，分离获得菌的细胞残骸；(B)将步骤(A)获得的细胞残骸作为第二培养基，将转基因的菌B投入所述第二培养基中进行异源基因表达，分离后获得目的产物。本发明采用菌A代谢生物质废料，代谢后的菌细胞残骸作为单一菌B的培养基生产目的产物，大幅代谢有机垃圾，同时表达异源基因，兼顾代谢有机固废以及表达异源基因生产目的产物。

Description

基于生物质废料生产目的产物的方法
技术领域
本发明涉及一种基于生物质废料生产目的产物的方法，特别涉及一种基于生物质废料生产乳酸的方法。
背景技术
生物质废料是固体废物的一大来源，其主要包括厨余垃圾、粪便、植物秸秆(林木修剪残余)等。鉴于生物质废料直接排放带来的诸多环境问题，目前已有对生物质废料进行回收利用的方法。如专利文献CN102794294A披露了一种生物垃圾的处理工艺，该工艺步骤为：居民生物垃圾进行干湿分离，得到干垃圾和湿垃圾；干垃圾用手工分拣，然后送去回收利用；湿垃圾处理，粉碎，湿垃圾送入粉碎机内粉碎；蒸煮，粉碎好的物料送入蒸煮机蒸煮，达到杀菌和油脂溶出效果；压榨，蒸煮处理后的物料，送入压榨机去压榨，得到渣和油水；然后分别进行油水和渣的处理。然而这些方法存在工艺繁琐、垃圾处理效率和目标产物的生产效率均较低的问题，不能兼顾生物质废料的高效代谢处理和目的产物的获取。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种基于生物质废料生产目的产物的方法，采用混合菌A代谢生物质废料，代谢后的菌细胞残骸作为单一菌B的培养基生产目的产物，大幅代谢有机垃圾，同时高效表达异源基因，将代谢生物质废料的降解发酵和利用宿主表达异源基因的生产反应环境分开，由不同的菌种发挥其特性，兼顾代谢有机固废以及表达异源基因生产目的产物两个目标。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于生物质废料生产目的产物的方法，包括如下步骤：
(A)将菌A投入由生物质废料制成的第一培养基中进行降解发酵，菌A为有机物降解菌，反应后的物料进行灭活，分离获得菌的细胞残骸；
(B)将步骤(A)获得的细胞残骸作为第二培养基，将转基因的菌B投入所述第二培养基中进行异源基因表达，分离后获得目的产物。
优选地，步骤(A)中，将反应后的物料灭活处理后，离心，弃上清液，取下层的浆状物质作为所述第二培养基。其中，第二培养基仅由上述浆状物质组成，不再添加其他物质，上述浆状物质为菌B生长提供必需的碳源、氮源，可选地还提供微量元素，包括但不限于钠、镁等金属阳离子。
优选地，菌A包括能够代谢所述生物质废料的真菌和/或细菌的一种或多种的组合。
更优选地，菌A包括集壶菌属、绵霉属、根霉属、木霉属、曲霉属及毛霉属中的一种或多种真菌的组合。
在一具体的实施例中，菌A为人工驯化后的真菌。
进一步地，菌A包括微小毛霉、少根根霉及黑曲霉中的一种或多种的组合。
优选地，所述生物质废料的来源包括厨余垃圾、粪便和植物秸秆中的一种或多种的组合。
优选地，所述生物质废料包括蛋白质、脂质、碳水化合物中的一种或多种的组合。
优选地，所述目的产物包括蛋白质、脂质或有机酸，菌B的转入至宿主细胞的异源基因选自表达蛋白质、脂质或有机酸的基因。
更优选地，所述目的产物包括乳酸、生物油或弹性胶原蛋白。
在一具体且优选的实施例中，目的产物为乳酸，菌B为转入乳酸脱氢酶基因的米根霉。该乳酸作为生产聚乳酸塑料母粒的原料。
优选地，步骤(A)中，将菌A和第一培养基在第一反应器中降解发酵，降解发酵后的物料灭活，离心分离；获得不溶于水的产物，将该不溶于水的产物作为所述第二培养基。
优选地，步骤(B)中，菌B和第二培养基在第二反应器中反应，反应后的混合物灭活，离心分离，分离后的溶于水的产物进行提纯。
在一具体且优选的实施例中，所述方法具体实施如下：
将生物质垃圾和氮源混合形成第一培养基；
将来自集壶菌属、绵霉属、根霉属、木霉属、曲霉属及毛霉属中的一种或多种菌投入到第一培养基中，降解发酵；
将上述降解发酵后的产物进行高温灭活处理，离心，弃上清液，取下层的浆状物质，即为前文所述的菌的细胞残骸；
向所述浆状物质中投入转基因的菌B，培养；
灭活，分离获得目标产物。
在一具体且优选的实施例中，一种基于生物质废料生产乳酸的方法，具体实施如下：
将生物质垃圾和氮源混合形成第一培养基，还可加入盐离子；该生物质垃圾包含或不包含淀粉；
将来自集壶菌属、绵霉属、根霉属、木霉属、曲霉属及毛霉属中的一种或多种菌投入到第一培养基中，降解发酵；
将上述降解发酵后的产物进行高温灭活处理，离心，弃上清液，取下层的浆状物质；
向所述浆状物质中投入转基因的菌B，发酵培养；
当pH值下降至设定值，添加中和剂进行反应，反应后离心，取上清液，对上清液加热并酯化水解，得到乳酸。
中和剂为(NH2)2CO-(NH4)HCO3-NH3·H2O或氢氧化钙。pH值的所述设定值小于6。
本发明采用以上方案，相比现有技术具有如下优点：
本发明的方法采用两段式发酵反应，在第一段发酵反应中，先利用菌A对生物质废料进行降解发酵，保证能够高效地降解处理生物质废料并获得较好的处理效果；然后，将第一段发酵反应后的物料灭活，将其中的真菌/细菌细胞残骸作为第二段发酵反应的培养基，投入菌B(针对目标产物设计，为转入表达目标产物的异源基因的单一菌)，进行异源基因的高效表达，获得目标产物，如乳酸等；菌A和菌B分别发挥其特性，兼顾代谢有机固废以及表达异源基因两个目标。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为模拟平板上的透明圈的示意图。
图2为经过微小毛霉降解蛋白质实验的平板照片。
图3为经过微小毛霉降解脂质实验的平板照片。
图4为经过少根根霉降解淀粉实验的平板照片。
图5为经过少根根霉降解纤维素实验的平板照片。
图6为经过黑曲霉降解淀粉实验的平板照片。
图7为经过黑曲霉降解纤维素实验的平板照片。
具体实施方式
下面结合对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域的技术人员理解。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。
为满足碧环计划的需求，达到高效代谢有机固废(厨余垃圾)，同时高效表达植入的异源基因。每个宿主细胞能有效承载的异源基因是有限的，过多异源基因植入不一定会杀死宿主，但是会影响宿主的生存能力。本发明采用2段式发酵模型，将代谢有机固废的降解发酵和利用宿主表达异源基因的生产反应环境分开，由不同的菌种发挥其特性，兼顾代谢有机固废以及表达异源基因两个目标，并将两个反应环境通过技术联合，形成一个生产闭合循环。
(A)第一段发酵反应包括如下步骤：向第一生物反应器A中投入浆状培养基和菌A，该浆状培养基的碳源由生物质废料(主要为厨余垃圾，还可能包括粪便、植物残余)粉碎形成，再加入氮源(如琼脂、明胶等)，或进一步加入无机盐(如钠盐等)。控制反应条件，使菌A代谢生物质废料。然后，收集第一生物反应器A中反应后的物料，对反应后的物料整体灭活(例如高温高压灭活)，离心分离(高速)；溶于水的产物(多为真菌蛋白残留等有机物)按照规定处理；不溶于水的产物中的真菌/细菌细胞残骸收集，作为第二段反应的培养基。
进一步地，菌A预先经过人工驯化或转基因处理。具体如下：
101、工程菌A的异源质粒构建：该异源质粒用于加强真菌/细菌的寄生性。
102、筛选工程菌A的宿主细胞：该宿主细胞选择具有强寄生性的真菌/细菌。真菌选自：集壶菌属(Synchytrium)、绵霉属(Achlya)、根霉属(Rhizopus)、木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、毛霉属(Mucor)；细菌选自肠道细菌，包括但不限于大肠杆菌、产甲烷菌。
103、构建工程菌A：将构建的异源质粒基因植入筛选出的混合菌中。具体通过CaCl2/PEG法植入。
104、对工程菌A培养，激发强寄生性的真菌/细菌的生长活性，扩大真菌/细菌基数后投入第一生物反应器A中。
其中，还可以连续向第一生物反应器A中投入菌A和浆状培养基，进行连续发酵。
(B)第二段发酵反应包括如下步骤：
201、工程菌B的异源端粒构建：异源端粒可以为ldhA-AmpRes端粒。
202、扩增端粒体量：通过PCR扩增ldhA-AmpRes端粒的体量，并通过Nanodrop超微量仪器检测。
203、构建工程菌B：将异源端粒基因植入宿主细胞内。宿主细胞可以为米根霉，通过CaCl2/PEG法将乳酸脱氢酶基因植入米根霉，获得转基因的米根霉。
204、对工程菌B培养，激发强寄生性的真菌/细菌的生长活性，扩大真菌/细菌基数后投入第二生物反应器B中。可以将转基因的米根霉投入第二生物反应器B中。
205、将第一段反应后的真菌/细菌细胞残骸作为第二培养基投入第二生物反应器B中，将工程菌B(转基因的米根霉)投入，发酵反应。
还可以连续向第二生物反应器B中投入工程菌B和浆状培养基，进行连续发酵。
206、收集第二生物反应器B中反应后的物料。
207、对反应后的物料整体高温高压灭活，离心分离(高速)；收集溶于水的产物(即离心后的上清液，其中无细胞)，酯化蒸馏提纯后获得目的产物。本实施例中的目的产物为乳酸，其作为聚乳酸的生产原料，可以进一步聚合生产聚乳酸塑料母粒。
步骤205中，当pH至下降至预定值后，向第二生物反应器B中加入氨(例如(NH2)2CO-(NH4)HCO3-NH3·H2O)或氢氧化钙作为中和剂，已生成的乳酸和中和剂反应。
步骤207中，上述的酯化蒸馏提纯具体包括：在上述溶于水的产物中加入正丁醇，乳酸铵与正丁醇进行酯化反应，生成的乳酸正丁酯通过水解释放出所需的乳酸。
还需要说明的是：工程菌B的异源基因表达范围非常广阔，比如蛋白质，脂质，有机酸等，可以作为生物基能源或者材料的原料。但是宿主细胞不一定是米根霉，主要根据目的产物来筛选宿主真菌细胞；工程菌B采用寄生性的菌种来代谢第一段反应中的真菌尸体。目的产物主要是生物能源和材料的原料，比如乳酸、生物油(生物柴油原料)和弹性胶原蛋白(类器官原料)等。
通常，生物质垃圾，如厨余垃圾，主要的成分包括蛋白质，脂质，碳水化合物(如淀粉)以及纤维素。因此通过培养基平板模拟垃圾源，配合透明圈实验，计算出降解效率，具体参见下述实施例1中的各个样本。
实施例1
1、生物垃圾平板制作
按照下表1配制培养基并制作垃圾源模拟平板，用以分别模拟蛋白质垃圾源、脂肪垃圾源、纤维素垃圾源及淀粉垃圾源。该实验皆使用直径为90mm的圆型塑料培养皿。
表1
2、垃圾分解运算
垃圾模拟平板整体呈单一颜色(如白色或红色)，菌A分解其中蛋白质、脂肪、淀粉或纤维素后，颜色会消退，形成一个或若干个接近琼脂颜色的圆圈，如图1所示。该实验皆使用直径为90mm的圆型塑料培养皿。每个垃圾模拟平板的体积为20ml。透明圈直径确定的时间为种菌后72h。该实验每个小点均使用10微升自制菌库的统一浓度标准菌株。所有菌株均经过自主驯化后投入实验。透明圈计算与平板成分消耗量的运算参见下式：
其中，M表示培养基的质量，m表示降解的培养基的质量，根据m和培养基中的浓度值可以获得目标物质的降解量。
3、实验
3.1微小毛霉
(a)微小毛霉降解蛋白质实验
按照表1制作蛋白质垃圾源模拟平板，将脱脂奶粉加水后整体呈白色，向盛有该模拟的蛋白质垃圾的整体呈白色的平板中接种微小毛霉(10微升，浓度1×107CFU)，35℃下培养72h。由于微小毛霉分解蛋白质后，白色消退，在平板上形成一个接近琼脂颜色的圆圈。经测量，3个平行实验的平均圆圈直径为：(3.32cm+3.36cm+3.12cm)/3＝3.27cm。根据上述公式计算消耗蛋白质132mg。
(b)微小毛霉降解脂质实验
按照表1制作脂肪垃圾源模拟平板，将猪油加水后整体呈乳白色，向盛有该模拟的脂肪垃圾的整体呈乳白色的平板中接种微小毛霉(10微升，浓度1×107CFU)，35℃下培养72h。由于微小毛霉分解脂肪后，乳白色消退，在平板上形成一个接近琼脂颜色的圆圈。经测量，3个平行实验的平均圆圈直径为：(5.01cm+4.91cm+5.11cm)/3＝5.01cm。根据上述公式计算消耗猪油0.124ml。
3.2少根根霉
(a)少根根霉降解淀粉实验
按照表1制作淀粉垃圾源模拟平板，可溶性淀粉加水后整体呈白色，向盛有该模拟的淀粉垃圾的整体呈白色的平板中接种少根根霉(10微升，浓度1×107CFU)，35℃下培养72h。由于少根根霉分解淀粉后，白色消退，在平板上形成一个接近琼脂颜色的圆圈。3个平行实验中，培养72小时后平板完全透明，淀粉全部被消耗，至少消耗蛋白质400mg。
(b)少根根霉降解纤维素实验
按照表1制作纤维素垃圾源模拟平板，将纤维素、刚果红加水后整体呈深红色，向盛有该模拟的纤维素垃圾的整体呈深红色的平板中接种少根根霉(10微升，浓度1×107CFU)，35℃下培养72h。由于少根根霉分解脂肪后，深红色消退为浅红色，在平板上形成一个浅红色的圆圈。经测量，3个平行实验的平均圆圈直径为：(3.32cm+3.35cm+3.09cm)/3＝3.25cm。根据上述公式计算消耗纤维素19mg。
3.3黑曲霉
(a)黑曲霉降解淀粉实验
按照表1制作淀粉垃圾源模拟平板，可溶性淀粉加水后整体呈白色，向盛有该模拟的淀粉垃圾的整体呈白色的平板中接种黑曲霉(10微升，浓度1×107CFU)，35℃下培养72h。由于黑曲霉分解淀粉后，白色消退，在平板上形成一个接近琼脂颜色的圆圈。经测量，3个平行实验的平均圆圈直径为：(2.81cm+2.62cm+2.23cm)/3＝2.55cm。根据上述公式计算消耗纤维素12mg。
(b)黑曲霉降解纤维素实验
按照表1制作纤维素垃圾源模拟平板，将纤维素、刚果红加水后整体呈深红色，向盛有该模拟的纤维素垃圾的整体呈深红色的平板中接种黑曲霉(10微升，浓度1×107CFU)，35℃下培养72h。由于黑曲霉分解脂肪后，深红色消退为浅红色，在平板上形成一个浅红色的圆圈。经测量，3个平行实验的平均圆圈直径为：(0.25cm+0.32cm+0.20cm)/3＝0.26cm。根据上述公式计算消耗纤维素0.0016g。
实施例2
步骤(1)：将实施例1中的各实验后的平板中的体系进行高温高压灭活，温度为121℃，压力的0.12MPa。离心分离，弃上层水，取下层的浆状物质，各实验后的收集的浆状物质混合，接种转入ldhA-AmpRes端粒的米根霉，不再混合其他物质。
步骤(2)：32℃下，培养72h，培养规模为100mL；当体系pH值下降至5.5，添加(NH2)2CO-(NH4)HCO3-NH3·H2O中和剂；离心，过滤，取上清液；对上清液加热处理并加入正丁醇，进行酯化反应，温度为120℃，压力为270mmHg，时间为1h，产出乳酸。3个平行实验的最终乳酸产量为(1.680+1.600+1.427)/3＝1.569g。
对比例
按照表1配制含蛋白质、脂肪及纤维素的培养基，向培养基中接种转入ldhA-AmpRes端粒的米根霉，按照实施例2的步骤(2)培养，无乳酸产生，且蛋白质、脂肪及纤维素的含量未明显减少。
实施例2采用多种能够代谢生物质废料的菌可将多种来源和成分的生物质废料转换为转基因米根霉的培养基，用以生产乳酸，本实施例的方法可直接用于处理成分复杂的生物质废料(典型地如厨余垃圾)且能够产出乳酸。对于不含淀粉的生物质肥料来说，转基因的米根霉极少分解，也极少产出乳酸。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
除非特别定义，否则所有于此所用的技术及科学名词均与本领域技术人员所通常理解的意义相同。若于本文中所用定义与其他公开文献中所载定义有所矛盾或不一致，则应以此处所用的定义为准。
除非上下文明确说明，否则位于本文的元素或成份之前的不定冠词“一”、“一个”及“一种”旨在非限制性地说明所述元素或成份的实例数目(即出现数)。因此，“一”、“一个”及“一种”应理解为包括一个或至少一个，且所述元素或成分的单数词形也包括复数形式。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，是一种优选的实施例，其目的在于熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限定本发明的保护范围。凡根据本发明的原理所作的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于生物质废料生产目的产物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(A)将菌A投入由生物质废料制成的第一培养基中进行降解发酵，菌A为有机物降解菌，反应后的物料进行灭活，分离获得菌的细胞残骸；
(B)将步骤(A)获得的细胞残骸作为第二培养基，将转基因的菌B投入所述第二培养基中进行异源基因表达，分离后获得目的产物。
2.根据权利要求1所述的基于生物质废料生产目的产物的方法，其特征在于，步骤(A)中，将反应后的物料灭活处理后，离心，弃上清液，取下层的浆状物质作为所述第二培养基。
3.根据权利要求1所述的基于生物质废料生产目的产物的方法，其特征在于，菌A包括能够代谢所述生物质废料的真菌和/或细菌的一种或多种的组合。
4.根据权利要求3所述的基于生物质废料生产目的产物的方法，其特征在于，菌A包括集壶菌属、绵霉属、根霉属、木霉属、曲霉属及毛霉属中的一种或多种的组合。
5.根据权利要求3或4所述的基于生物质废料生产目的产物的方法，其特征在于，菌A包括微小毛霉、少根根霉及黑曲霉中的一种或多种的组合。
6.根据权利要求1所述的基于生物质废料生产目的产物的方法，其特征在于，所述生物质废料的来源包括厨余垃圾、粪便和植物秸秆中的一种或多种的组合，所述生物质废料包括蛋白质、脂质、碳水化合物中的一种或多种的组合；所述目的产物包括蛋白质、脂质或有机酸，菌B的转入至宿主细胞的异源基因选自表达蛋白质、脂质或有机酸的基因。
7.根据权利要求6所述的基于生物质废料生产目的产物的方法，其特征在于，所述目的产物包括乳酸、生物油或弹性胶原蛋白。
8.根据权利要求7所述的生物质废料生产目的产物的方法，其特征在于，所述目的产物为乳酸，菌B为转入乳酸脱氢酶基因的米根霉。
9.根据权利要求1所述的基于生物质废料生产目的产物的方法，其特征在于，步骤(A)中，将菌A和第一培养基在第一反应器中降解发酵，降解发酵后的物料灭活，离心分离；获得不溶于水的产物，将该不溶于水的产物作为所述第二培养基；步骤(B)中，菌B和第二培养基在第二反应器中反应，反应后的混合物整体经过灭活，离心分离，分离后的溶于水的产物进行提纯。
10.根据权利要求1或9所述的基于生物质废料生产目的产物的方法，其特征在于，所述方法具体实施如下：
将生物质垃圾和氮源混合形成第一培养基；
将来自集壶菌属、绵霉属、根霉属、木霉属、曲霉属及毛霉属中的一种或多种菌投入到第一培养基中，降解发酵；
将上述降解发酵后的产物进行高温灭活处理，离心，弃上清液，取下层的浆状物质；
向所述浆状物质中投入转基因的菌B，培养；
分离获得目标产物。
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