CN117159584A - 一种液态金属纳米药物及其应用 - Google Patents
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本申请涉及一种液态金属纳米药物，所述液态金属纳米药物用DOX·HCl的降解产物多元醇作为配体螯合到液态金属纳米液滴(LMND)表面而成，所述液态金属为镓或镓基合金。液态金属纳米药物的平均粒径为20nm，具有优异的肿瘤穿透性和生物相容性，并进行肿瘤选择性载体‑药物转化，通过金属置换反应同步消耗Cu2+离子并产生Ga3+离子，这种双重抗癌途径，加上活性氧的大量产生，使得乳腺癌细胞选择性Cu依赖性凋亡和抗血管生成，可以有效抑制癌细胞的生长，而对正常细胞没有明显的细胞毒性。
Description
技术领域
本申请属于液态金属技术领域，尤其涉及一种液态金属纳米药物及其应用。
背景技术
为了优化肿瘤的疗效，人们一直在努力获得具有更好药理特性、增强选择性和较少副作用的药物。通常，许多药物设计的理论依赖于活性剂的保护(如药物载体、结构修饰)，后通过生理参数选择(如pH、氧化还原环境、缺氧和酶)或外部能量输入(超声、光/电化学)激活从而选择性释放药物。
前药策略极大推进了肿瘤的选择性治疗，但由于前药存在筛选精细、合成和纯化过程繁琐、无机成分不可降解、与生物相容性低、反应活性不理想等问题，使其治疗效果充满不确定性。
纳米药物进一步推进了肿瘤选择性治疗，其中，液态金属纳米液滴(LMND)作为一种新兴的药物递送体系，在各种生物医学应用中已经引起了广泛的兴趣，LMND具有良好的生物相容性、可变形性、弹性、无交叉耐药性，能够增强穿越血管、穿透肿瘤实质的能力，并提供额外的小毛细血管运输途径，这种新型的药物输送技术可以提高所输送药物的有效性，可以帮助医生定位肿瘤，并且理论上生物毒性极低。此外，基于Ga基LMND在正常细胞中没有明显的细胞毒性，其在肿瘤微环境(TME)中经历了一系列降解过程，成为游离的抗癌Ga离子，这种通过内源性生物刺激触发的选择性载体-药物转换可以解决诸如低载药率、药物爆发性释放、多系统毒性和载体免疫反应等问题。尽管有这些独特的优点，然而目前LMND在肿瘤治疗中的应用仅限于被动药物载体或介质，在用于化疗的液态金属基纳米平台的合理设计和构建中，诸如药物装载效率低、水相稳定性差、表面配体可修饰性弱、形貌控制难等局限性使其治疗效果不显著，并且大块LM很难被设计成小尺寸水相LMND(<40nm，这是完全从肝脏和脾脏移除的阈值尺寸)，而小尺寸LMND在克服肿瘤细胞密度、血管和肿瘤细胞外基质(ECM)造成的扩散阻力方面优于大尺寸LMND，基于以往的研究报道，调节配体结构(官能团、表面电位、分子量、尺寸和拓扑结构)和优化超声参数(配体/LM投料比、配体浓度、超声时间和温度)不能显著降低水相LMNDs的总体尺寸至100nm以下。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：为解决现有液态金属纳米液滴(LMND)存在的药物装载效率低、水相稳定性差、表面配体可修饰性弱、形貌控制难、很难被设计成小尺寸水相LMND等的不足，从而提供一种液态金属纳米药物及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种液态金属纳米药物，所述液态金属纳米药物用DOX·HCl的降解产物多元醇作为配体螯合到液态金属纳米液滴(LMND)表面而成，所述液态金属为镓或镓基合金。
优选地，所述镓基合金为镓铟共晶合金EGaIn或镓铟锡合金GaInSn。
优选地，所述液态金属纳米药物的平均粒径为20nm。
一种上述液态金属纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
S1：制备包含液态金属和DOX·HCl的混合溶液，并进行超声处理；
S2：超声处理后，将混合物离心，去除沉淀，得到液态金属纳米药物。
优选地，将液态金属和DOX·HCl混合在去离子水中，得到包含液态金属和DOX·HCl的混合溶液。
优选地，所述超声处理的时间为12min以上。
优选地，所述超声处理在冰浴中进行。
优选地，S1步骤中所述DOX·HCl、液态金属的质量体积比不高于0.06g/mL。
优选地，S1步骤中所述液态金属占去离子水的体积比为0.6％-1％。
优选地，所述离心处理的条件为800-1200rpm，离心时间优选为3-8min。
本发明还提供一种上述液态金属纳米药物在制备治疗乳腺癌的试剂中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的LMND纳米药物不引入额外的佐剂或药物，即可增强肿瘤的穿透性，并通过肿瘤微环境中的电置换反应(GRR)获得双互补抗癌途径，即以不可逆的方式同时消耗Cu2+离子等金属离子和释放Ga3+离子，结合原位生成的大量活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)，在体外和体内选择性触发乳腺癌细胞凋亡和抗血管生成，可以有效抑制癌细胞的生长，而对正常细胞没有细胞毒性，与临床前/临床抗癌药物四硫钼酸盐(TM)和硝酸镓Ga(NO3)3相比，本发明制备的Ga基LMND给药可显著提高BCap-37异种移植小鼠模型的治疗效果和生存率，且无明显副作用；LMND20不仅通过凋亡和抗血管生成对BCap-37乳腺癌细胞的IC50值(30.4μg/mL)低于TM(91.1μg/mL)，而且还增强了BCap-37荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用。这是首次报道的具有内在抗肿瘤活性的Ga基LMND纳米药物，这种GRR策略是对现有癌症治疗模式的补充。
(2)本发明通过简单的声化学方法，首次利用可降解配体实现了20nm水相Ga基LMND的简便合成，不需要繁琐的合成/纯化过程或特定的储存条件，同时配体能够稳定新形成的小尺寸LMNDs。
附图说明
下面结合附图和实施例对本申请的技术方案进一步说明。
图1a、1b是本申请实施例1制备的液态金属纳米药物的高分辨率透射电镜(HRTEM)和扫描电镜(SEM)图；
图2a是基于场发射透射电子显微镜(FE-TEM)对本申请实施例1制备的液态金属纳米药物尺寸的统计分析结果图，图2b是基于DLS法对本申请实施例1制备的液态金属纳米药物ζ和PDI的分析结果图；
图3是本申请实施例1制备的液态金属纳米药物的小角XRD谱图；
图4a是本申请实施例1制备的液态金属纳米药物和DOX的FTIR光谱，图4b是本申请实施例制备的液态金属纳米药物的Ga 3d高分辨率XPS光谱；
图5是本申请实施例1制备的液态金属纳米药物的O1s高分辨XPS光谱；
图6是本申请实施例1对超声前后溶液进行液相色谱分析的谱图；
图7a-7k是本申请实施例1制备的液态金属纳米药物水溶液的LC-MS谱正模式分析谱图；
图8a-8d是本申请实施例1制备的液态金属纳米药物水溶液的LC-MS谱负模式分析谱图；
图9是由不同EGaIn/DOX·HCl投料比合成的LMND的吸光度光谱分析、荧光光谱分析图；
图10是本申请实施例1及对比例1-3制备的液态金属纳米药物的尺寸、表面ζ电位、多分散性指数(PDI)的对比图；
图11是本申请实施例1及对比例4-7制备的液态金属纳米药物的尺寸、表面ζ电位、多分散性指数(PDI)的对比图；
图12是本申请实施例1制备的液态金属纳米药物在去离子水中储存1个月粒径和PDI的分析图；
图13a是动态小动物microPET成像(0-60min)和定量ROI分析LMND20生物分布统计(n＝4)分析图；图13b、13c分别是通过microPET和ICP-MS方法计算LMND20的等离子体半衰期(T1/2)(n＝4)；
图14是对携带BCap-37的BALB/c裸鼠(n＝5)注射Cy5.5标记的LMND20(10mg/kg)后，通过IVIS成像捕获的荧光信号分析图；
图15a是LMND20治疗组与对照组(生理盐水)涉及肝肾功能的血清生化指标(ALT为丙氨酸转氨酶，AST为天冬氨酸转氨酶，BUN为血尿素氮，CRE为血肌酐，LDH为乳酸脱氢酶，CK为肌酸激酶，CK-MB为肌酸激酶同工酶)的对比分析图；图15b是苏木精和伊红染色主对照与LMND20处理的BCap-37荷瘤BALB/c裸鼠各器官(心、肝、脾、肺和肾)切片图；
图16为LMNDs和Cu2+离子在不同LMNDs/CuCl2投料比和反应时间下的GRR混合物的日光图像；
图17a为LMND20(3mg/mL)与不同浓度CuCl2(0.8、1.6、3.2、6.4、8、16mM)孵育30min后LMND20水溶液的紫外可见光谱图；图17b为LMND20水溶液与8mM CuCl2孵育后的动态紫外可见光谱；图17c为LMND20水溶液与8mM其他金属离子(Ca2+，Mg2+，Zn2+，Fe3+)孵育6h的紫外可见光谱；
图18a为LMND20及LMND20与CuCl2(8mM)孵育6h后纳米液滴(NDs)的FTIR光谱；图18b为LMND20及LMND20与CuCl2(8mM)孵育6h后纳米液滴(NDs)的高分辨率Ga 3d XPS光谱；图18c为LMND20及LMND20与CuCl2(8mM)孵育6h后ND的高分辨率Cu2p XPS光谱；
图19为CuCl2与LMND20进行GRR前后CuCl2的Cu-LMM俄歇XPS光谱图；
图20a为BCS检测LMND20与CuCl2(8mM)取代反应中的Cu+所对应不同物质的吸光度光谱图；图20b为LMND20及LMND20与CuCl2(8mM)孵育6h后纳米液滴(NDs)的XRD谱图；
图21为不同LMND/CuCl2投料比和反应时间制备的NDs的HRTEM和SAED光谱，插入比例尺5nm；
图22a、22b为1.5mg和3.0mg LMND20分别与8mM CuCl2孵育12h后得到的ND的STEM图像和EDS图谱,比例尺，图22a为90nm，图22b为500nm。
图23为实施例1制备的LMND20在体外和体内的渗透情况。图23a，用LMND20和LMND100孵育BCap-37肿瘤球体的Z-stack CLSM图像，LMNDs用FITC预标记，图像以10μm的间隔从肿瘤球体顶部的赤道面采集，标尺，250μm；图23b-e,LMNDs中BCap-37肿瘤球体横切面荧光强度，标尺，250μm；图23f,g,LMNDs的三维荧光强度图；图23h,i,LMND20、LM/S、LMND100和生理盐水处理BCap-37细胞的细胞ROS测定和细胞流式细胞仪分析，标尺，200μm；图23j,BCap-37荷瘤BALB/c裸鼠BCap-37肿瘤中LMNDs分布的TEM图像，以相同浓度5mg kg-1给药LMND20和LMND100对小鼠进行多点瘤内处理，小鼠在注射后48h死亡，比例尺，2μm；图23k，从BCap-37荷瘤BALB/c裸鼠切除的BCap-37肿瘤中分布的LMNDs的CLSM图像，用FITC预标记LMNDs，并用CD31和DAPI分别对10μm冷冻切片的血管和细胞核进行染色，标尺，100μm；
图24a-24c,LMND20、LM/S、TM和Ga(NO3)3对不同癌细胞系(BCap-37、MDA-MB-231、MCF-7)的细胞毒性；图24d为LMND20对不同癌细胞系(SKOV-3和PC-9细胞)和正常细胞(293T细胞)的细胞毒性；所有数据均以mean±s.d表示，n＝4；图24e，流式细胞术分析LMND20、LM/S、TM、Ga(NO3)3在相同浓度50μg/mL作用24h对BCap-37细胞的凋亡作用；Q4，活细胞；Q3，早期凋亡细胞；Q2，晚期凋亡细胞；Q1,坏死细胞,每个区域的细胞百分比用具体数字表示；图24f，LMND20、LM/S、TM、Ga(NO3)3在相同浓度50μg/mL下作用24h后BCap-37细胞周期分布直方图；图24g，Western blot检测相同浓度50μg/mL的LMND20、LM/S、TM和Ga(NO3)3诱导BCap-37细胞24h caspase-3的表达水平，生理盐水处理细胞设为对照，内参蛋白为肌动蛋白；图24h-j，游离Cu2+(0.5mM、1mM)加入LMND20使其对BCap-37、MDA-MB-231、MCF-7细胞毒性的影响，所有数据均以mean±s.d表示，n＝4；
图25a，将1×106个BCap-37细胞皮下接种于BALB/c小鼠的臀部，从第7天(D0)开始的处理方法图；图25b-25e，不同处理(LMND20(5mg/kg)、TM(5mg/kg)、Ga(NO3)3(40mg/kg)和生理盐水)对小鼠肿瘤体积、体重、存活率和肿瘤重量的作用对比图；图25f，不同处理(LMND20(5mg/kg)、TM(5mg/kg)、Ga(NO3)3(40mg/kg)和生理盐水)后的小鼠被处死后切除肿瘤的明场图像；图25g，生理盐水、TM、Ga(NO3)3和LMND20不同处理BCap-37肿瘤组织不同组中差异表达基因(DEGs)的分布谱；图25h，生理盐水、TM、Ga(NO3)3和LMND20不同处理BCap-37肿瘤组织中DEG(差异表达基因)的RNA-seq分级聚类；图25i，通过GO分析得出DEGs显著富集途径的气泡图(P<0.05)；图25j，小鼠处死后BCap-37肿瘤切片的代表性IHC染色和TUNEL实验图，标尺，50μm；图25k，免疫组化参数(Ki-67、caspase-3、VEGF、CD31)及TUNEL法平均荧光强度统计分析图，n＝3，所有数据均以mean±s.d表示；
图26a-26j是本申请实施例2制备的液态金属纳米药物水溶液的LC-MS谱正模式分析谱图；
图27a-27d是本申请实施例2制备的液态金属纳米药物水溶液的LC-MS谱负模式分析谱图；
图28a-28d是本申请实施例2制备的液态金属纳米药物的C-1s,O-1s,N-1s和Ga-3d的高分辨率XPS光谱。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请的技术方案。
下述实施例中使用的实验试剂如下：镓铟共晶(EGaIn,Alfa Aesar,99.99％，Ga:In；75.5：24.5wt％)，镓铟锡共晶(Alfa Aesar,99.99％，Ga:In:Sn；62:22:16wt％)，盐酸阿霉素(Ark Pharmacies，>98％)，四硫钼酸铵(Acros，99.95％，金属级)、硝酸镓(Acros,99.9998％，金属级)，二水合氯化铜(Acros,99.999％，金属级)，海根素磺酸二钠盐水合物(Alfa Aesar,97％)，花青素-5.5(Cy5.5)，NHS酯(95％，Lumiprobe Corporation)，异硫氰酸荧光素异构体I(FITC)(Sigma-Aldrich，≥90％)，葡聚糖(Acros,MW:100-300kDa)，无水乙醇(Aladdin，>99.5％，无水)，其他金属盐(CuCl,CaCl2,FeCl3,MgCl2,ZnCl2)均购自国药化学试剂；68GaCl3由同位素技术Garching GmbH(ITG)68Ge/68Ga发生器(1110MBq)通过0.1MHCl洗脱柱生成；89Zr(ox)2购自安迪科制药集团有限公司；超纯水由净化系统生成，水的电阻率为18.2MΩ·cm(25℃)。
下述实施例中使用的实验仪器如下：在JEOL 2000FX或Tecnai G2 F20(FEI)分析电子显微镜上，在200kV加速电压下获得了LMNDs的TEM图像；利用Malvern Zetasizer NanoZS进行动态光散射(DLS)，测量了水动力直径和表面电位；扫描电镜(SEM)记录在蔡司Supra55电子显微镜上，ETH＝5kV；在配备chemstem系统的FEI Titan 80-300探针像差校正扫描电镜(STEM)上获得了单粒子的能谱(EDS)元素图；x射线光电子能谱(XPS)测量采用Thermo ESCALAB 250XI多功能成像电子能谱仪；在Bruker D8 ADVANCE粉末x射线衍射仪上进行x射线粉末衍射(XRD)分析；超声波是在fishbrandTM505型超声波分离器上进行的(功率:500瓦；频率:2万赫兹)；在Perkin Elmer LS55荧光光谱仪上记录荧光；紫外在Lambda25紫外/可见分光光度计上测量。
实施例1
本实施例提供一种液态金属纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
将80μLEGaIn(镓铟共晶)和5mg DOX·HCl混合在12mL去离子水中，在冰浴中进行超声处理12min；
超声处理后，将混合物以1000rpm离心5分钟，丢弃沉淀的大颗粒，得到液态金属纳米药物(LMND)。
高分辨率透射电镜(HRTEM)和扫描电镜(SEM)(图1a,1b)显示，小尺寸LMND具有不规则的形貌，根据FE-TEM图像(图2a,2b)的统计结果，小尺寸LMND的平均尺寸为20.3±4.3nm(这种尺寸的LMND被称为LMND20，并在后续实验中使用)，DLS分析显示ζ为36.5±2.0mV，PDI为0.064±0.013。在小角XRD谱图中，0.85°处的一个峰显示了本实施例制备LMND20的纳米孔结构(图3)，它可以分别作为药物装载和催化的附加空间和空位。
利用傅里叶变换红外(FTIR)和X射线光电子能谱(XPS)研究了DOX·HCl的降解产物多元醇与LMND表面的相互作用。在FTIR光谱中(图4a)，DOX在1731cm-1处的C＝O信号消失，在LMND20中在1017和1260cm-1处产生两个新峰，分别属于Ga-OH的弯曲带和C-OH的拉伸带。在XPS测量中，Ga0和Ga3+都在Ga 3d高分辨率光谱中被检测到(图4b)。此外，在O1s光谱中，531.5eV处的一次峰证实了O-Ga键的产生(图5)。这些数据结果表明多元醇被成功地螯合到LMND20表面。
此外，经过对超声前后溶液进行液相色谱分析，去离子水中的DOX在超声12min后完全降解为多元醇(图6)。进一步分析高分辨率质谱(HRMS)正负模式的结果(图7、8)，证实了一系列含有多羟基(多元醇)的DOX片段的存在。
实施例2
本实施例提供一种小尺寸水相液态金属纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
将120μL液态金属镓和5mg DOX·HCl混合在12mL去离子水中，在冰浴中进行超声处理12min；
超声处理后，将混合物以1200rpm离心3分钟，丢弃沉淀的大颗粒，得到小尺寸水相液态金属纳米材料(LMND20)，平均粒径约20nm。
通过高分辨率质谱(HRMS)正负模式对尺寸水相液态金属纳米材料进行分析，结果(图26a-26j、27a-27d)，证实了一系列含有多羟基(多元醇)的DOX片段的存在。此外，通过对液态金属纳米药物的C-1s,O-1s,N-1s和Ga-3d的高分辨率XPS光谱(图28a-28d)可知，多元醇与小尺寸水相液态金属纳米材料成功结合，并且小尺寸水相液态金属纳米材料保留了部分镓单质(Ga0)，有利于后期与铜离子进行金属置换反应。
实施例3
本实施例提供一种小尺寸水相液态金属纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
将100μL液态金属镓铟锡合金GaInSn和5mg DOX·HCl混合在12mL去离子水中，在冰浴中进行超声处理12min；
超声处理后，将混合物以800rpm离心8分钟，丢弃沉淀的大颗粒，得到小尺寸水相液态金属纳米材料(LMND)，平均粒径约20nm。
对比例1
对比例1与实施例1的区别仅在于：对比例1使用20μLEGaIn(镓铟共晶)。
对比例2
对比例2与实施例1的区别仅在于：对比例2使用40μL EGaIn(镓铟共晶)。
对比例3
对比例3与实施例1的区别仅在于：对比例3使用60μL EGaIn(镓铟共晶)。
对比例4
对比例4与实施例1相比仅在于：对比例4在冰浴中进行超声处理4min。
对比例5
对比例5与实施例1相比仅在于：对比例5在冰浴中进行超声处理6min。
对比例6
对比例6与实施例1相比仅在于：对比例6在冰浴中进行超声处理8min。
对比例7
对比例7与实施例1相比仅在于：对比例7分别在冰浴中进行超声处理10min。
测试例1
本测试例对实施例1及对比例1-3制备的LMND进行了吸光度光谱分析、荧光光谱分析，随着EGaIn/DOX·HCl投料比的增加，所得LMND的特征吸收峰变宽，而典型发射波长Em485没有变化(图9)；此外，随着EGaIn/DOX·HCl投料比的增加，LMND的尺寸稳步减小，表面ζ电位逐渐增加，并稳定在+40mV以内，PDI稳定在0.15以内。(图10)。
测试例2
本测试例对实施例1及对比例4-7制备的LMND进行了分析，随着超声时间的增长，LMND的表面ζ电位从6.5±0.6mV(超声时间4min)上升到35mV(超声时间12min)以上，多分散性指数(PDI)一直在0.1以下，表明动态DOX片段是稳定LMNDs的良好配体(见图11)；多元醇介导的LMNDs在动态超声作用下，大块LM转化为LMND，超声作用4min、6-10min和12min后，得到的LMND尺寸分别为100nm、60-90nm和20nm左右。
测试例3
本测试例测试实施例1制备的LMND20的稳定性，具体是：观察30天后，LMND20的大小略有增加，为26.3±5.7nm，PDI仍为0.075±0.021，可见其粒径和PDI变化不明显(图12)。
测试例4
采用放射性标记法，68GaCl3(～100μCi)与实施例1制备的LMND20(100μL,2.0mg/mL在水中)在30℃下反应15min，通过3次超滤-再分散循环(4000rpm,5min)和水洗去除游离68GaCl3，得到68Ga-LMND20。68Ga-LMND20的鉴定采用radio-iTLC，采用柠檬酸缓冲液(50mM，pH＝5)作为流动相，在Varian iTLC-SA条带上，游离68GaCl3以溶剂前洗脱(Rf＝0.8)，而68Ga-LMND20从起点移动了一点(Rf＝0.2)，这在BIOSCAN Mini-Scan TLC上记录，表明68GaCl3(～100μCi)与LMND20(100μL,2.0mg/mL)完全结合。
将BCap-37荷瘤BALB/c裸鼠(n＝4)静脉注射68Ga-LMND20(100μL，～100μCi)，进行动态小动物pet成像(0～60min)，通过定量ROI分析获得实施例1制备的LMND20的生物分布统计数据，并通过DAS2.1软件计算基于动态小动物pet成像数据的衰减校正半衰期(T1/2)。动态小动物PET成像和感兴趣区域(ROI)分析显示，LMND20显著增强了68GaCl3的血液循环，并获得了较高的肝脏摄取(静脉注射后40分钟，>20％ ID g-1)(图13a)。在microPET方法中，T1/2基于动态microPET成像数据，通过DAS2.1软件进行衰减校正和计算，得到实施例1制备的LMND20的衰变校正半衰期(t1/2)为315min(图13b)，而采用ICP-MS法，于静脉注射后2、5、10、30、60、120、240、480、1440min等不同时间点采集50μL血，用ICP-MS法定量分析Ga排泄情况，电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测量显示其更长的等离子体半衰期为468min(图13c)。
测试例5
采用Cy5.5标记法对实施例1制备的LMND20进行长期代谢跟踪。荧光标记时，将Cy5.5 NHS酯(50μg)与LMND20(1mL,1.0mg/mL水中)在30℃下孵卵过夜，通过3次超滤-再分散循环(4000转/分，5分钟)和水洗去除游离染料，得到Cy5.5标记的LMND20，荧光测量合格，暗存备用。
对携带BCap-37的BALB/c裸鼠(n＝5)注射Cy5.5标记的LMND20(10mg/kg)后，通过IVIS成像捕获荧光信号，图14显示，在静脉注射后第3天，LMND20在肾脏和肝脏中仍有明显的蓄积，在第7天肾脏和肝脏分别保留了超过80％和55％的原始荧光信号强度(第3天)，在第14天逐渐下降到10-20％。
此外，本测试例尝试多次给药(每隔一天给药一次，剂量为5mg/kg，共5次)对小鼠模型进行毒性评估，最终治疗后24小时采集血样，数据用mean±s.d表示(n＝5)。LMND20治疗组与对照组(生理盐水)血清生化指标中涉及肝肾功能的差异无统计学意义(补充图15a)。此外，LMND20处理小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)的H&E染色未见明显损伤或病变(补充图15b)。
测试例6
本测试例用实施例1制备的LMND20与Cu2+进行GRR(金属置换反应)。最初，将3.0mgLMNDs加入不同浓度(2,4,8mM)的CuCl2水溶液中，结果见图16。对于2mM CuCl2投料情况，LMND20悬浮液的黄绿色在5min内迅速变暗，6h后变为浅酒红色，12小时后，得海根素磺酸二钠到酒红色的清液，表明LMND20与CuCl2之间持续GRR。当CuCl2浓度增加到4mM和8mM时，LMND20也经历了类似的过程，只是溶液的颜色变浅了。
为了从LMND20和Cu2+之间的GRR中收集更详细的信息，将1mL LMND20(3mg/mL)与不同浓度的CuCl2(0.8、1.6、3.2、6.4、8、16mM)混合30分钟。随着Cu2+浓度的增加，LMND20的典型紫外吸特征峰(272，295-470nm)下降幅度更大，并在Cu2+浓度为8mM时达到平台(图17a)，该浓度被设置为进一步动态监测GRR的标准金属浓度。如图17b所示，在8mM Cu2+的作用下，LMND20在272nm处的典型吸光度在2min内迅速消失，在373nm处的吸光度在随后的300min内继续下降。此外，还测试了LMND20对不同金属离子(Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+和Cu2+)的反应性，将LMND20水溶液与8mM其他金属离子(Ca2+，Mg2+，Zn2+，Fe3+)孵育6h，在此时间尺度内，Cu2+在所有金属离子中降低LMND20Abs272的能力最好(图17c)，这种选择性可能有助于体内金属稳态。
接下来，本测试例对CuCl2与LMND20进行GRR后的纳米粒子进行了表征。FTIR光谱(图18a)显示，在GRR后，来自LMND20(1,023、1,260和2,930cm-1)的信号显著减少，表明多元醇与生成的纳米液滴(NDs)之间的相互作用发生了变化。在XPS分析中，Ga光谱显示Ga0金属完全转化为Ga3+离子(图18b)。Cu 2p谱图显示，963.1eV和942.5eV的Cu2+卫星强峰完全消失(图18c)，952.0eV和932.1eV产生两个新的信号，945eV附近没有Cu+的弱卫星峰。同时，CuLMM峰在916.2～920.7eV范围内展宽与强化(图19)。为了进一步确认LMND20在GRR过程中是否产生Cu+离子，本测试例使用了Cu+螯合剂浴铜灵(BCS)，Cu+-BCS配合物在483nm处有典型信号，在572nm处有肩峰(图20a)，对于LMND20+CuCl2+BCS组中，LMND20(400～525nm)的本征吸光度与Cu+-BCS配合物的特征峰重合，但与肩膀峰不重合，说明LMND20与Cu2+离子GRR时，主要产物是Cu0金属。此外，XRD测量也证实了Cu0金属的存在(图20b)，没有无定形Ga、CuCl和CuCl2的特征峰。
将实施例1制备的LMND20(1.5mg)与CuCl2(8mM)孵育6小时后，所得ND的总体尺寸(21.9±7.5nm)没有明显变化，但从HRTEM图像和SAED图像中分别产生了晶格结构和Cu和In的尖锐斑点。将反应时间延长至12h，纳米颗粒的尺寸进一步增大至46.4±9.8nm。当LMND20/CuCl2添加量增加到3.0mg/8mM时，ND的尺寸显著增加至1,157.1±359.7nm，在SAED部分中出现GaOOH新的尖锐斑点。这些结果表明，较高的初始LMND20浓度、较高的LMND20/CuCl2投料比和较长的反应时间会导致更多的ND聚集(图21)。相应的EDS元素映射证实了GRR后最终ND中Ga氧化物和Cu的存在(图22a,22b)。
测试例7
本测试例主要测试实施例1制备的LMNDs的尺寸依赖性穿透能力。
在BCap-37三维多细胞肿瘤球体模型中，从肿瘤球体的外壳到核心，LMND20比葡聚糖稳定的LMND(>100nm，我们在此命名为LMND100)表现出更强的荧光素异硫氰酸酯(FITC)荧光(图23a)。BCap-37肿瘤球体的定量荧光强度和3D荧光强度图证实了尺寸大小对BCap-37肿瘤球体中LMNDs的穿透能力和分布的重要性(图23b-g)。有趣的是，通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和流式细胞术，用2'-7'-二氯荧光素(DCFH-DA)检测到LMND20处理的BCap-37细胞中ROS浓度最高(图23h,i)。虽然LMND20的上清液(LM/S)主要由小分子(多元醇)组成，但产生的ROS水平甚至低于LMND100。因此，我们推断，在LMND处理的肿瘤细胞中，ROS的生成可能与Ga3+离子参与和细胞内扩散有关，这可以协同抑制肿瘤细胞的分裂和增殖。
本测试例进一步收集了LMND治疗小鼠的肿瘤组织切片，并进行了生物TEM分析。虽然通过瘤内给药，LMND20和LMND100呈现出不同的生物分布和积累。LMND20在肿瘤组织中分布均匀，LMND100在特定区域聚集(图23j)。荧光免疫组化(IHC)染色显示，FITC标记的LMND20广泛分布在肿瘤组织中，CD31染色的血管中有丰富的集群分化(红色荧光)(图23k)，但在LMND100处理的肿瘤组织中几乎没有观察到绿色荧光。这些结果表明，与LMND100相比，LMND20在肿瘤组织中的渗透、扩散和积累都有所改善。
测试例8
本测试例主要进行实施例1制备的LMND20体外抗肿瘤活性研究。
通过MTT实验评估LMND20对乳腺癌细胞的增殖作用，并与四硫钼酸盐(TM)、Ga(NO3)3和LM/S(LMND20的上清液)进行比较。结果如图24a所示，LMND20对BCap-37乳腺癌细胞的细胞毒性最高，其半数抑制浓度(IC50)值为30.4μg mL-1，远低于TM(IC50:91.1μg/mL)，而当Ga(NO3)3和LM/S浓度超过250μg mL-1时，BCap-37细胞仍有75％以上的细胞存活。在涉及MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞的其他乳腺癌细胞系中也证实了LMND20的抗癌活性(图24b,c)。不过，LMND20对其他低铜水平的肿瘤细胞系(如SKOV-3、PC-9细胞)和正常细胞的细胞毒性未表现出明显的细胞毒性(图24d)，这种选择性可以减轻对健康组织和器官的副作用。
然后，采用FITC-Annexin V/PI法验证LMND20是否通过凋亡激活细胞死亡，这是许多Ga类抗癌药物的杀伤机制。如图24e所示，流式细胞术结果显示，TM、Ga(NO3)3和LM/S激活的凋亡细胞比例分别为30.96％、19.95％和9.98％，而LMND20的孵育使这一比例显著提高至63.01％。同时，同等浓度的LMND20处理后，BCap-37细胞的细胞周期发生了显著变化，G0/G1最大下降至31.7％，出现明显的sub-G1期凋亡，比例为16.6％(图24f)。caspase-3蛋白作为细胞凋亡的重要效应因子，其活化作用进一步得到证实。Western blot结果显示，与其他组相比，LMND20处理的细胞中cleaved caspase-3的表达显著升高(图24g)。这些结果证实了LMND20通过触发细胞凋亡而具有抗癌活性。
为了确定LMND20的抗癌活性是否也与通过GRR的Cu耗尽有关，本实施例研究了Cu状态对LMND20细胞毒性的影响。与LMND20对BCap-37细胞的严重细胞毒性相比，与0.5mMCuCl2共孵育显著降低了细胞毒性，超过68％的BCap-37细胞存活(图24h)。这可能是由于细胞外大量消耗LMND20，导致NDs尺寸大，细胞摄取差，因此很少有Ga0金属可用于消耗细胞内的Cu2+离子。然而，较高浓度(1.0mM)的CuCl2在与LMND20进行GRR后仍能保留部分Cu2+离子，从而发挥CuCl2固有的细胞毒性。在MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞中也观察到类似的细胞活力趋势(图24i,j)。
测试例9
本测试例主要进行实施例1制备的LMND20对乳腺癌异种移植模型的治疗效果。
本测试例用生理盐水saline(0.9％)、TM(5mg/kg)和Ga(NO3)3(40mg/kg)处理的小鼠作为阳性对照(图25a)，以5mg/kg剂量评估LMND20对BCap-37荷瘤小鼠的抗癌活性。除了严重的毒副作用外，纳米材料全身给药还可诱导乳腺癌细胞内/外渗，促进新的转移，因此所有配方均采用肿瘤内多部位给药。为了优化给药频率，本测试例采用ICP-MS法测定单次给药后铜的排泄量。由于Cu2+离子变为金属Cu0后的溶解度降低，治疗后第一天粪便和尿液中代谢的Cu浓度显著降低(D1)。然而，在治疗后第4天，BCap-37荷瘤小鼠的排泄铜浓度会恢复到正常水平(D4)。因此，后续每3天给药1次，共4次，评估疗效。在BCap-37荷瘤小鼠的治疗过程中，Ga(NO3)3(40mg/kg)显示出有限的抗癌特性，这与乳腺癌患者的临床数据一致。LMND20(5mg/kg)比相同浓度的TM更有效地抑制肿瘤生长(图25b,25e,25f)。在整个治疗过程中，所有组均未观察到明显的体重减轻(图25c)，表明没有严重的全身毒性。在为期40天的生存研究中，saline和Ga(NO3)3处理组小鼠全部死亡，而TM处理组的存活率为2/6，显示出有限的抗癌作用，LMND20治疗组小鼠全部存活(图25d)，无异常行为，表明LMND20抗癌效果的改进。
为了进一步探讨LMND20的抗癌机制，我们对BCap-37肿瘤组织进行了单独生理盐水、Ga(NO3)3、TM和LMND20处理后的RNA测序(RNA-seq)。差异表达基因(DEGs)的分布谱(图25g)中纵坐标表示基因的上下调结果，横坐标表示组间差异(P<0.05为前提)，以L vs C为例，上下调基因越多，则说明L(LMND20组)相对于C(对照组)来说治疗差异越明显，同理，Gvs C上下调基因数少，则说明G组(硝酸镓)相对于对照组来说差异不大，即治疗效果不显著，图25g表明，与其他处理相比，LMND20处理对转录组的影响更为显著，其中分别有568个和327个基因上调和下调。图25h和表1显示了具有代表性的表达改变的关键基因，包括参与凋亡过程、血管生成、细胞群体增殖和对ROS的反应的基因。此外，基因本体(GeneOntology,GO)富集分析也证实，除了凋亡外，血管生成途径也可能对LMND20的抗癌特性起作用(图25i，表2)，这在乳腺癌的治疗中具有重要意义。
治疗后，切除异种移植BCap-37肿瘤组织进行H&E和IHC分析。在这些小鼠中，通过活化的caspase-3蛋白酶免疫染色，LMND20处理组显示出最高的凋亡活性(图25j)。同时，通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)荧光实验证实了其凋亡作用，再次验证了LMND20的抗癌机制。H&E染色显示LMND20治疗后大部分肿瘤细胞被正常组织所取代。此外，抗原Ki-67染色显示，LMND20处理显著降低了BCap-37肿瘤细胞的增殖(图25j,k)。由于细胞中Cu2+的缺失，肿瘤血管生成、肿瘤生长和转移受到极大抑制，可能导致血管内皮生长因子(VEGF)表达下调，微血管形成减少。图25j,k显示，小鼠接受LMND20治疗后切除的肿瘤中，VEGF表达和微血管数量明显下降，优于II期抗癌药物TM的抗肿瘤活性。
表1具有代表性的DEGs列表
表2具有代表性的GO列表
以上述依据本申请的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项申请技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项申请的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (10)
1.一种液态金属纳米药物，其特征在于，所述液态金属纳米药物用DOX·HCl的降解产物多元醇作为配体螯合到液态金属纳米液滴(LMND)表面而成，所述液态金属为镓或镓基合金。
2.根据权利要求1所述的液态金属纳米药物，其特征在于，所述液态金属为镓铟共晶合金EGaIn。
3.根据权利要求1或2所述的液态金属纳米药物，其特征在于，所述液态金属纳米药物的平均粒径为20nm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的液态金属纳米药物，其特征在于，所述液态金属纳米药物由以下方法制备而成，S1：制备包含液态金属和DOX·HCl的混合溶液，并进行超声处理；S2：超声处理后，将混合物离心，去除沉淀，得到液态金属纳米药物。
5.根据权利要求4所述的液态金属纳米药物，其特征在于，将液态金属和DOX·HCl混合在去离子水中，得到包含液态金属和DOX·HCl的混合溶液。
6.根据权利要求4或5所述的液态金属纳米药物，其特征在于，所述超声处理的时间为12min以上，所述超声处理优选在冰浴中进行。
7.根据权利要求4-6任一项所述的液态金属纳米药物，其特征在于，S1步骤中所述DOX·HCl、液态金属的质量体积比不高于0.06g/mL。
8.根据权利要求4-7任一项所述的液态金属纳米药物，其特征在于，S1步骤中所述液态金属占去离子水的体积比为0.6％-1％。
9.根据权利要求1-8任一项所述的液态金属纳米药物，其特征在于，所述离心处理的条件为800-1200rpm，离心时间优选为3-8min。
10.一种权利要求1-9任一项所述的液态金属纳米药物在制备治疗乳腺癌的试剂中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310942560.8A CN117159584A (zh) | 2023-07-28 | 2023-07-28 | 一种液态金属纳米药物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310942560.8A CN117159584A (zh) | 2023-07-28 | 2023-07-28 | 一种液态金属纳米药物及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117159584A true CN117159584A (zh) | 2023-12-05 |
Family
ID=88942050
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310942560.8A Pending CN117159584A (zh) | 2023-07-28 | 2023-07-28 | 一种液态金属纳米药物及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117159584A (zh) |
-
2023
- 2023-07-28 CN CN202310942560.8A patent/CN117159584A/zh active Pending
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Legal Events
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