CN117157084A

CN117157084A - 病毒感染的治疗

Info

Publication number: CN117157084A
Application number: CN202280028277.8A
Authority: CN
Inventors: L·布鲁斯
Original assignee: TX Medic AB
Current assignee: TX Medic AB
Priority date: 2021-10-14
Filing date: 2022-06-10
Publication date: 2023-12-01

Abstract

本发明涉及用于预防、抑制和/或治疗黄病毒感染或感染性疾病的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐。所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有等于或低于10000Da的平均分子量和等于或高于15％的平均硫含量。

Description

病毒感染的治疗

技术领域

本发明一般涉及病毒感染和感染性疾病的治疗，并且具体涉及硫酸葡聚糖在治疗黄病毒感染和由黄病毒感染引起的感染性疾病中的用途。

背景技术

黄病毒是黄病毒科的一个正链核糖核酸(RNA)病毒属。该属包括西尼罗河病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、黄热病病毒、寨卡病毒和其它若干可能引起脑炎的病毒。

黄病毒通常具有若干共同特征，包括大小(40-65nm)、对称性(有包膜、二十面体核衣壳)、核酸(正链、约10,000-11,000个碱基的单链RNA)以及电子显微镜下的外观。

大多数这些病毒主要通过受感染的节肢动物(蚊子或蜱)的叮咬传播，并且因此被归类为虫媒病毒。大多数虫媒病毒的人类感染都是偶然的，因为人类无法将病毒复制到足够高的滴度以重新感染继续病毒生命周期所需的节肢动物—那么人类就是死胡同的宿主。黄热病病毒、登革热病毒和寨卡病毒除外。这三种病毒仍然需要蚊媒，但对人类的适应能力足够强，不一定依赖于动物宿主。

取决于感染人类宿主的特定病毒种类，黄病毒可引起各种感染性疾病。登革热病毒引起登革热，严重时可能发展为登革出血热或登革休克综合征，通常称为严重登革热，可能致命。寨卡病毒引起寨卡热，也称为寨卡病毒病，其症状与登革热相似。然而，怀孕期间的母婴传播可能会导致婴儿出现小头畸形和其它麸皮畸形。此外，寨卡病毒感染与成人格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome，GBS)有关。黄热病是由黄热病病毒引起的，并且症状包括发烧、发冷、食欲不振、恶心、肌肉疼痛，所述症状通常在五天内消失。然而，大约15％的感染者会出现肝损伤，导致皮肤发黄和肾脏问题。

U.S.2004/0009953和WO 2005/004882研究了高分子量(40kDa、500kDa)和低硫酸化(6-13％)硫酸葡聚糖针对HIV-1病毒的抗病毒作用的影响。Antiviral Research 2017,143:186-194研究了高硫酸化肝素、高分子量和低硫酸化硫酸葡聚糖(每个二糖2.3个硫，40kDa)和苏拉明(suramin)针对寨卡病毒感染的作用。

一旦受试者感染黄病毒，就普遍需要降低病毒感染和传播风险的治疗。

发明内容

总体目标是提供黄病毒感染或感染性疾病的治疗。

此目标和其它目标通过如本文所公开的实施方案来满足。

本发明的一个方面涉及用于预防、抑制和/或治疗黄病毒感染或感染性疾病的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐。所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有等于或低于10 000Da的平均分子量和等于或高于15％的平均硫含量。

本文提供的实验数据表明硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐可用于治疗黄病毒感染和黄病毒感染性疾病。更详细地说，硫酸葡聚糖在临床相关浓度下对人类细胞的寨卡病毒、登革热病毒和黄热病病毒感染产生显著且剂量依赖性的抑制。

附图说明

参考以下描述连同附图可最好地理解实施方案以及其另外的目标和优点，在附图中：

图1说明硫酸葡聚糖在MOI 0.5(1A)、3(1B)和5(1C)时以浓度依赖性方式抑制人HeLa细胞中的寨卡病毒感染。数据代表平均值+SEM。

图2说明硫酸葡聚糖在MOI 0.05(2A)和0.01(2B)时以浓度依赖性方式抑制Vero细胞中的寨卡病毒感染。数据代表平均值+SEM。

图3说明对照莫能菌素对人HeLa细胞中的寨卡病毒感染的抑制。

图4A-4H说明硫酸葡聚糖和阳性对照病毒感染性抑制剂莫能菌素在体外预防指定黄病毒感染哺乳动物细胞的能力。根据四参数Logistic方程通过迭代曲线拟合来分析浓度-效应数据。x轴上的μM分别针对硫酸葡聚糖和莫能菌素。数据代表来自单个实验的各个数据点。

图5说明硫酸葡聚糖以浓度依赖性方式抑制>90％的登革热病毒、寨卡病毒和黄热病病毒感染人类细胞。数据代表平均值+SD。

具体实施方式

硫酸葡聚糖能够在临床相关浓度下预防人类细胞中的黄病毒感染，例如寨卡病毒(ZIKV)、登革热病毒(DENV)和黄热病病毒(YFV)感染。更详细地说，与对照相比，硫酸葡聚糖处理显著减少了感染细胞的数量，这提供了硫酸葡聚糖能够显著预防或至少抑制人类细胞中黄病毒感染的证据。

黄病毒颗粒或病毒体有包膜，并且呈球形，直径约为50nm。表面蛋白质呈二十面体对称排列。成熟的病毒体主要含有两种病毒编码的膜蛋白，表示为蛋白M和蛋白E，而未成熟的病毒体则含有膜蛋白前体。

一般的黄病毒感染，特别是寨卡病毒、登革热病毒和黄热病病毒感染可被视为一个两步过程：病毒与细胞的初始附着，然后是内化至宿主细胞中。病毒与细胞的初始附着是通过病毒包膜蛋白E与细胞表面带负电荷的糖胺聚糖(GAG)之间的相互作用介导(Infection,Genetics and Evolution 2019 69:22-29)，并在细胞表面上富集病毒颗粒。宿主细胞的实际内化是由宿主细胞的细胞表面受体介导。神经细胞粘附分子(NCAM1)最近被鉴定为细胞内化的潜在黄病毒受体，特别是寨卡病毒受体(Nature Communications2020 11:3896)，硫酸乙酰肝素也是如此(Virology 2002,292:162-168)。然而，在肝素结合分析中没有观察到寨卡病毒与肝素之间的直接相互作用，并且细胞硫酸乙酰肝素的下调或去除并不能抑制寨卡病毒感染(Antiviral Research 2017,143:186-194)。这表明寨卡病毒不利用细胞表面硫酸乙酰肝素作为附着受体。

硫酸葡聚糖对黄病毒感染的抑制作用的可能机制可能是干扰病毒与细胞的初始附着和/或与细胞表面受体的结合。实施方案的硫酸葡聚糖呈现负电荷并且可模拟硫酸乙酰肝素和细胞表面上的其它带负电的GAG。因此，实施方案的硫酸葡聚糖可阻断或至少干扰病毒包膜蛋白E与硫酸乙酰肝素和宿主细胞表面上的其它带负电的GAG之间的结合。另外，NCAM1和其它细胞表面受体包括肝素结合域(HBD)(Journal of Neuroscience Research1992 33(4):538-548)。实施方案的硫酸葡聚糖能够结合此类HBD或充当竞争性拮抗剂，并且因此可干扰黄病毒颗粒与NCAM1和包含此类HBD或硫酸乙酰肝素的其它细胞表面受体的结合。

因此，可通过干扰病毒与细胞的初始附着以及干扰病毒蛋白与细胞表面受体(例如NCAM1和硫酸乙酰肝素)之间的相互作用来获得如在实施方案的硫酸葡聚糖的情况下所见的实验结果。

本发明的一个方面涉及用于预防、抑制或治疗黄病毒感染或感染性疾病的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，黄病毒感染选自由黄病毒引起的黄病毒感染组成的组，所述黄病毒选自由以下组成的组：登革热病毒(DENV)、日本脑炎病毒(JEV)、昆津病毒(Kunjinvirus，KUNV)、兰加特病毒(Langat virus，LGTV)、卢平病病毒(Louping ill virus，LIV)、墨累谷脑炎病毒(Murray valley encephalitis virus，MVEV)、圣路易斯脑炎病毒(St.louis encephalitis virus，SLEV)、波瓦桑病毒(powassan virus，POWV)、西尼罗河病毒(West Nile virus，WNV)、黄热病病毒(YFV)和寨卡病毒(ZIKAV)。在另一实施方案中，黄病毒感染选自由黄病毒引起的黄病毒感染组成的组，所述黄病毒选自由以下组成的组：DENV、JEV、KUNV、LIV、MVEV、SLEV、POWV、WNV、YFV和ZIKV。

在特定实施方案中，黄病毒感染选自由黄病毒引起的黄病毒感染组成的组，所述黄病毒选自由以下组成的组：DENV、YFV和ZIKV。

在一个优选的实施方案中，黄病毒感染是由ZIKV引起的黄病毒感染。

在另一优选的实施方案中，黄病毒感染是由DENV引起的黄病毒感染。

在进一步的实施方案中，黄病毒感染是由YFV引起的黄病毒感染。

在一个实施方案中，黄病毒感染由除日本脑炎病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒和黄热病病毒之外的黄病毒引起。

本文所用的黄病毒感染性疾病包括由DENV引起的登革热、登革出血热和登革休克综合征；由JEV引起的日本脑炎；由KUNV引起的非脑炎性昆津病毒病和脑炎性昆津病毒病；由LIV引起的卢平病；由MVEV引起的墨累谷；由SLEV引起的圣路易斯脑炎；由POWV引起的脑炎；由WNV引起的西尼罗河热；由YFV引起的黄热病；以及由ZIKAV引起的寨卡热或寨卡病毒病。

在一个优选的实施方案中，黄病毒感染性疾病选自由以下组成的组：由DENV引起的登革热、登革出血热和登革休克综合征；由YFV引起的黄热病；以及由ZIKAV引起的寨卡热或寨卡病毒病。在一个具体实施方案中，黄病毒感染性疾病是寨卡热或由ZIKAV引起的寨卡病毒病。在另一具体实施方案中，所述黄病毒感染性疾病是由DENV引起的登革热、登革出血热或登革休克综合征。在进一步的具体实施方案中，黄病毒感染性疾病是由YFV引起的黄热病。

在一个实施方案中，黄病毒感染性疾病是除以下之外的黄病毒感染性疾病：由JEV引起的日本脑炎；由WNV引起的西尼罗河热；由DENV引起的登革热、登革出血热和登革休克综合征；以及由YFV引起的黄热病。

本发明还涉及硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐用于制造供预防、抑制和/或治疗黄病毒感染或感染性疾病的药物的用途。

本发明还涉及预防、抑制和/或治疗黄病毒感染或感染性疾病的方法。所述方法包括向罹患黄病毒感染或感染性疾病或有罹患黄病毒感染或感染性疾病风险的受试者施用有效量的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐。

本文所用的黄病毒感染或感染性疾病的治疗不一定意味着黄病毒感染或感染性疾病的治愈性治疗，而是还包括黄病毒感染或感染性疾病的短期和长期症状的抑制或减少。因此，治疗还涵盖延迟黄病毒感染或感染性疾病的发作，包括延迟、预防症状的发作或解决与黄病毒感染或感染性疾病相关的已确定的病理。

其它病毒也使用与黄病毒类似的机制来附着和内化细胞。例如，狂犬病病毒也利用细胞表面受体NCAM1进行内化(Philosophical Transactions Royal Society B 2015,370:2014035)。更详细地说，狂犬病病毒和其它狂犬病毒病毒属病毒包含参与与宿主细胞相互作用和内化的糖蛋白G。因此，实施方案的硫酸葡聚糖还可用于预防、抑制或治疗狂犬病病毒属病毒感染或感染性疾病。

在一个实施方案中，狂犬病病毒属病毒感染选自由狂犬病病毒属病毒引起的狂犬病病毒属病毒感染组成的组，所述狂犬病病毒属病毒选自由以下组成的组：澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒属病毒(Australian bat lyssavirus，ABLV)、杜文哈基狂犬病病毒属病毒(Duvenhage lyssavirus，DUVV)、欧洲蝙蝠狂犬病病毒属病毒(European bat lyssavirus，EBLV)、拉各斯蝙蝠病毒(Lagos bat virus，LBV)、莫科拉病毒(Mokola virus，MOKV)和狂犬病病毒。在一个具体实施方案中，狂犬病病毒属感染由狂犬病病毒引起。

在一个实施方案中，狂犬病病毒属感染性疾病是狂犬病、脑炎或狂犬病样脑炎疾患。在一个具体实施方案中，狂犬病病毒属感染性疾病是狂犬病。

在一个实施方案中，狂犬病病毒属感染由狂犬病病毒以外的狂犬病病毒属引起。

在下文中，对硫酸葡聚糖的(平均)分子量和硫含量的提及也适用于硫酸葡聚糖的任何药学上可接受的盐。因此，硫酸葡聚糖的药学上可接受的盐优选具有如以下实施方案中论述的平均分子量和硫含量。

据信在实施方案的优选范围之外的硫酸葡聚糖具有较差的效果和/或对细胞或受试者造成负面副作用。

例如，与具有较低平均分子量的硫酸葡聚糖相比，分子量超过10,000Da(10kDa)的硫酸葡聚糖通常具有较低的效果与副作用曲线。这意味着与平均分子量在优选范围内的硫酸葡聚糖分子相比，对于较大的硫酸葡聚糖分子(>10,000Da)，可安全地施用于受试者的硫酸葡聚糖的最大剂量较低。因此，当将硫酸葡聚糖施用至受试者体内时，这种较大的硫酸葡聚糖分子不太适合临床应用。例如，US 2004/0009953公开了平均分子量为40kDa或500kDa且平均硫含量为17％的硫酸葡聚糖对大鼠具有剧毒。

根据本发明的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐没有毒性，如所提供的实施例中所示。因此，与U.S.2004/0009953中公开的高分子量硫酸葡聚糖相比，本发明的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐不具有毒性问题。

硫酸葡聚糖是硫酸化多糖，并且特别是硫酸化葡聚糖，即由许多葡萄糖分子组成的多糖。本文定义的平均分子量表示各个硫酸化多糖可具有与此平均分子量不同的分子量，但平均分子量代表硫酸化多糖的平均分子量。这进一步意味着硫酸葡聚糖样品的此平均分子量周围将存在分子量的自然分布。

硫酸葡聚糖的平均分子量，或更准确地重均分子量(M_w)典型地使用间接方法，例如凝胶排阻/渗透色谱法、光散射或粘度来确定。使用此类间接方法确定平均分子量将取决于许多因素，包括柱和洗脱液的选择、流速、校准程序等。

重均分子量(M_w)：典型地用于对分子大小而不是数值敏感的方法，例如光散射和尺寸排阻色谱法(SEC)方法。如果假设呈正态分布，则M_w两侧的重量相同，即样品中分子量低于M_w的硫酸葡聚糖分子的总重量等于样品中分子量高于M_w的硫酸葡聚糖分子的总重量。参数N_i表示样品或批次中分子量为M_i的硫酸葡聚糖分子的数量。

在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有等于或低于10,000Da的M_w。在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有在2,000Da至10,000Da的区间内的M_w。

在另一实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有在2,500Da至10,000Da的区间内、优选在3,000Da至10,000Da的区间内的M_w。在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有在3,500Da至9,500Da的区间内、例如在3,500Da至8,000Da的区间内的M_w。

在另一具体实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有在4,500Da至7,500Da的区间内、例如在4,500Da至6,500Da的区间内或在4,500Da至5,500Da的区间内的M_w。

因此，在一些实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有等于或低于10,000Da、等于或低于9,500Da、等于或低于9,000Da、等于或低于8,500Da、等于或低于8,000Da、等于或低于7,500Da、等于或低于7,000Da、等于或低于6,500Da、等于或低于6,000Da、或等于或低于5,500Da的M_w。

在一些实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有等于或高于1,000Da、等于或高于1,500Da、等于或高于2,000Da、等于或高于2,500Da、等于或高于3,000Da、等于或高于3,500Da、等于或高于4,000Da、或等于或高于4,500Da的M_w。这些实施方案中的任一者可与限定M_w的上限的上述实施方案中的任一者组合，例如与等于或低于10,000Da的上限组合。

在一个具体实施方案中，如上所述的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的M_w是平均M_w，并且优选通过凝胶排阻/渗透色谱法、尺寸排阻色谱法、光散射或基于粘度的方法确定。

数均分子量(M_n)：典型地通过端基测定，例如核磁共振(NMR)光谱法或色谱法得出。如果假设正态分布，则在M_n的每一侧都可以找到相同数量的硫酸葡聚糖分子，即样品中分子量低于M_n的硫酸葡聚糖分子的数量等于样品中分子量高于M_n的硫酸葡聚糖分子的数量。

在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有通过NMR光谱法测量的在1,850至3,500Da的区间内的M_n。

在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有通过NMR光谱法测量的在1,850Da至2,500Da的区间内、优选在1,850Da至2,300Da的区间内、例如在1,850Da至2,000Da的区间内的M_n。

因此，在一些实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有等于或低于3,500Da、等于或低于3,250Da、等于或低于3,000Da、等于或低于2,750Da、等于至或低于2,500Da、等于或低于2,250Da、或等于或低于2,000Da的M_n。另外，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有等于或高于1,850Da的M_n。

在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有在2.5至3.0的区间内的每葡萄糖单位的平均硫酸根数。

在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有在2.5至2.8的区间内、优选在2.6至2.7的区间内的每葡萄糖单位的平均硫酸根数。

在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有在4.0至6.0的区间内的平均葡萄糖单位数。

在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有在4.5至5.5的区间内、优选在5.0至5.2的区间内的平均葡萄糖单位数。

在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有通过NMR光谱法测量的在1,850至3,500Da区间内的M_n、在2.5至3.0的区间内的每葡萄糖单位的平均硫酸根数并且硫酸葡聚糖的葡萄糖单位中C2位的平均硫酸化率为至少90％。

在一个实施方案中，硫酸葡聚糖具有约5.1的平均葡萄糖单位数、在2.6至2.7的区间内的每葡萄糖单位的平均硫酸根数以及在1,850Da至2,000Da的区间内的M_n。

在一个实施方案中，硫酸葡聚糖的药学上可接受的盐是硫酸葡聚糖的钠盐。在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖的钠盐具有约5.1的平均葡萄糖单位数、在2.6至2.7的区间内的每葡萄糖单位的平均硫酸根数以及在2,100Da至2,300Da的区间内的包括Na+抗衡离子的M_n。

在一个实施方案中，硫酸葡聚糖具有5.1的平均葡萄糖单位数、2.7的每葡萄糖单位的平均硫酸根数、通过NMR光谱法测量的约1,900-1,950Da的不含Na+的平均M_n和通过NMR光谱法测量的约2,200-2,250Da的含有Na+的平均M_n。

硫酸葡聚糖是葡聚糖的聚阴离子衍生物并且含有硫。实施方案的硫酸葡聚糖的平均硫含量等于或大于15％。在一个实施方案中，实施方案的硫酸葡聚糖的平均硫含量优选为15至20％，并且更优选为大约17％，通常对应于每个葡糖基残基约或至少两个硫酸基团。在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖的硫含量优选等于或至少接近相应葡聚糖分子的最大可能的硫含量程度。

根据实施方案的硫酸葡聚糖可作为硫酸葡聚糖的药学上可接受的盐，例如钠盐或钾盐提供。

根据实施方案的当前优选的硫酸葡聚糖公开于WO 2016/076780中。

受试者优选是哺乳动物受试者，更优选是灵长类动物并且特别是人类受试者。然而，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐也可用于兽医应用。动物受试者的非限制性实例包括灵长类动物、猫、狗、猪、马、小鼠、大鼠。

硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐优选通过注射施用于受试者，并且特别是通过静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射或腹膜内(i.p.)注射，优选i.v.或s.c.注射。可使用的其它肠胃外施用途径包括肌内注射和关节内注射。硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物的注射可替代地或另外直接在例如受试者体内将发生目标效应的组织或器官或其它部位进行。

实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐优选与选择的溶剂或赋形剂一起配制为水性注射溶液。溶剂有利地是水性溶剂并且特别是缓冲溶液。此类缓冲溶液的非限制性实例是柠檬酸缓冲液，例如一水柠檬酸(CAM)缓冲液，或磷酸盐缓冲液。例如，实施方案的硫酸葡聚糖可溶解在盐水，例如0.9％ NaCl盐水中，且接着任选地用75mM CAM缓冲并使用氢氧化钠将pH调节至约5.9。非缓冲溶液也是可能的，包括水性注射溶液，例如盐水，即NaCl(aq)。此外，如果需要缓冲溶液，则可使用除CAM之外的其它缓冲系统。

这些实施方案不限于注射，并且可替代地使用其它施用途径，包括经口、经鼻、经颊、经直肠、经皮、经气管、经支气管或局部。接着将活性化合物硫酸葡聚糖与根据具体施用途径选择的合适赋形剂或载体一起配制。

硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的合适剂量范围可根据应用而变化，例如体外与体内、受试者的体型和体重、所治疗的受试者的病况以及其它考虑因素。特别是对于人类受试者，可能的剂量范围可为1μg/kg至100mg/kg体重，优选10μg/kg至50mg/kg体重。

在优选的实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐被配制为以如下范围内的剂量施用：0.05至50mg/kg受试者体重，优选0.05或0.1至40mg/kg受试者体重，并且更优选0.05或0.1至30mg/kg，或0.1至25mg/kg、或0.1至15mg/kg、或0.1至10mg/kg受试者体重。优选的剂量在0.25至5mg/kg、优选0.5至2.5mg/kg并且更优选0.75至2mg/kg受试者体重的范围内选择。

硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物可在单次施用场合施用，例如以单次推注的形式。此推注剂量可相当快地注射至受试者，但有利地随时间输注，使得硫酸葡聚糖溶液在几分钟时间内，例如在5至10分钟内输注至患者。

或者，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐可在治疗期间多次(即至少两次)施用。

硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐可与其它活性剂一起顺序地、同时地或以包含硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐和至少一种其它活性剂的组合物的形式施用。至少一种活性剂可选自可用于任何上述疾病、病症或病况的任何药剂。

实施例

实施例1-针对ZIKV的抗病毒活性

本研究的目的是研究硫酸葡聚糖针对寨卡病毒(ZIKV)的抗病毒活性。

材料和方法

在此实施例中，使用硫酸葡聚糖的钠盐(Tikomed AB,Viken,Sweden，WO2016/076780)。硫酸葡聚糖以0.9％ NaCl中的100mg/ml储备溶液的形式提供。

使用寨卡病毒PF13在两种细胞系统中研究了病毒感染：人HeLa Kyoto细胞和非洲绿猴肾细胞(Vero AD细胞)。测试了以下条件：0.5、3和5的感染复数(MOI)，即感染开始时每个细胞的病毒体数量下的HeLa Kyoto，以及0.05和0.01的MOI下的Vero AD。使用MTT测定来确定对用相同浓度的硫酸葡聚糖处理的未感染细胞的细胞毒性。

试剂

完全培养基：对于Vero AD是5％ M199；对于HeLa Kyoto是补充有10％ FBS(Gibco)和1X p/s(Gibco)的10％ DMEM(Gibco)。

补充培养基：与上述Vera AD相同，并且与上述HeLa Kyoto相同，但含有2％ FBS。

实验程序

通过在感染寨卡病毒之前将药物与测定细胞一起预培育1小时来探索硫酸葡聚糖的三种稀释液的抗病毒活性。在整个实验的48小时内，病毒和配制物都留在细胞上。通过MTT测定来确定相同浓度范围的硫酸葡聚糖在相同细胞系中的细胞毒性。为了确保达到正确的感染性范围，针对寨卡病毒，并行测试了三个MOI。

细胞平板接种

将细胞分离并计数。每种细胞类型接种两个96孔板，一个用于抗病毒测定，并且一个用于细胞毒性测定。将细胞以8,000个细胞/孔的密度接种在100μl/孔的完全培养基中。接种后，将板在室温下培育5分钟以均匀分布，且接着在37℃、5％ CO₂下培育直至第二天。

所述板含有每个硫酸葡聚糖浓度(600μg/ml、200μg/ml、60μg/ml)和MOI 3个孔、每个MOI 9个感染对照孔、每个MOI 18个未感染对照孔和8个莫能菌素对照孔，参见下表，其中粗体代表第一MOI，斜体代表第二MOI，并且下划线代表第三MOI。

600：600μg/ml硫酸葡聚糖；200：200μg/ml硫酸葡聚糖；60：60μg/ml硫酸葡聚糖

M：莫能菌素(莫能菌素钠盐，Sigma)；I：经感染；U：未感染

化合物预处理

从储备溶液(100mg/ml)中制备出三种不同浓度的硫酸葡聚糖：

600μg/ml：将6μl硫酸葡聚糖储备液加入994μl补充培养基中；

200μg/ml：将2μl硫酸葡聚糖储备液加入998μl补充培养基中；以及

60μg/ml：将100μl 600μg/ml加入900μl补充培养基中。

将2.4μl 10mM莫能菌素储备液添加至1200μl补充培养基中，然后涡旋混合。将240μl补充培养基添加至圆底96孔板(上面标有M)每行的三个孔中。将360μl稀释的莫能菌素添加至顶部三个孔中。将顶部三个孔中的孔中120μl体积向下移动至下一行的三个孔中，依此类推，以在每行获得莫能菌素的三倍稀释液。

从细胞中去除培养基，并用100μl制备的化合物(硫酸葡聚糖或莫能菌素)或培养基(未感染和未处理对照)替换后维持1小时。

在培育结束时，将新鲜的硫酸葡聚糖和莫能菌素制备成最终浓度的两倍，体积为50μl，因为它们将被等体积的病毒或培养基稀释至最终浓度。

1,200μg/ml：将7.2μl硫酸葡聚糖储备液加入592.8μl补充培养基中

400μg/ml：将2.4μl硫酸葡聚糖储备液加入597.6μl补充培养基中

120μg/ml：将60μl 1,200μg/ml稀释液加入540μl补充培养基中

将2.4μl 10mM莫能菌素储备液添加至600μl补充培养基中，然后涡旋混合。将120μl补充培养基添加至圆底96孔板(上面标有M)每行的三个孔中。将180μl稀释的莫能菌素添加至顶部三个孔中。将顶部三个孔中的孔中60μl体积向下移动至下一行的三个孔中，依此类推，以在每行获得莫能菌素的三倍稀释液。

细胞毒性

硫酸葡聚糖和莫能菌素与预培育药物同时添加，并在实验期间保留。8小时后去除莫能菌素并用补充培养基替换以降低细胞毒性。

病毒制备和感染

按根据以下的MOI添加病毒：

Zika MOI 0.5(HeLa Kyoto)：27μl未稀释病毒(1.5×10⁷PFU/ml)+2,473μl补充培养基；

Zika MOI 3(HeLa Kyoto)：160μl未稀释病毒+2,340μl补充培养基；

Zika MOI 5(HeLa Kyoto)：270μl未稀释病毒+2,230μl补充培养基

Zika MOI 0.5(Vero AD)：27μl未稀释病毒(1.5×10⁷PFU/ml)+2,473μl补充培养基

Zika MOI 0.05(Vero AD)：2.7μl未稀释病毒+2,500μl补充培养基

Zika MOI 0.01(Vero AD)：0.6μl未稀释病毒+2,500μl补充培养基

在化合物预培育结束时，从细胞中去除培养基，并用50μl稀释的化合物(硫酸葡聚糖或莫能菌素)或培养基(未处理和未感染的对照)替换。立即添加50μl稀释的病毒或培养基(未感染的对照)。将板在37℃和5％ CO₂下培育48小时，并且在整个实验期间配制物+病毒留在细胞上。

固定与显色

48小时后，用PBS洗涤板，用4％甲醛固定30分钟，再次用PBS洗涤，并在4℃下保存在PBS中直至染色。

用MTT处理细胞毒性板以确定细胞活力。

感染性读数

用免疫荧光染色对细胞进行免疫染色。简而言之，用50mM氯化铵淬灭任何残留的甲醛，然后对细胞进行透化(0.1％ Triton X100)并用识别黄病毒包膜蛋白的抗体(Millipore，MAB10216)染色。使用Alexa-488偶联二抗(Life Technologies，A11001)检测一抗，并使用Hoechst染色细胞核。使用10倍物镜在CellInsight CX5高内涵平台(ThermoScientific)上采集图像，并使用CellInsight CX5软件计算感染百分比(感染细胞/总细胞×100)。

细胞毒性读数

通过MTT测定来检测细胞毒性。简而言之，将MTT试剂(Sigma)在37℃、5％ CO₂下添加至细胞后维持2小时，之后去除培养基并用1:1异丙醇:DMSO的混合物溶解沉淀物20分钟。将上清液转移至干净的板中并在570nm处读取信号。

抑制％的确定

使用以下公式计算标准化抑制百分比：

对于对照药物，使用GraphPad Prism(第9版)从表示化合物浓度对数与标准化抑制百分比的最佳拟合(非线性回归分析，可变斜率)的曲线外推EC₅₀值。

细胞毒性的确定

使用以下公式计算细胞毒性％：

使用GraphPad Prism(第9版)从表示化合物浓度对数与标准化细胞毒性百分比的最佳拟合(非线性回归分析，可变斜率)的曲线外推对照药物的TC₅₀值。

结果

图1A-1C、2A-2B中的条形图显示了硫酸葡聚糖在针对指定病毒测试的三个浓度下的感染抑制％(条)和细胞毒性％(点)。硫酸葡聚糖在两种细胞类型中均对寨卡病毒产生显著且剂量依赖性的抑制作用。

在任何测试浓度下均未观察到显著的细胞毒性。

鉴于针对寨卡病毒和其它黄病毒的有效抗病毒药物的临床需求未得到满足，本文呈现的结果表明所述实施方案的硫酸葡聚糖具有针对黄病毒家族的治疗潜力。

硫酸葡聚糖针对寨卡病毒的有效性非常令人惊讶，因为Antiviral Research2017,143:186-194显示硫酸葡聚糖在Vero细胞中在200μg/ml处具有约60％的感染抑制％，相比之下，根据本发明的硫酸葡聚糖在200μg/ml处的感染抑制％超过80％(图2A)。Antiviral Research2017,143:186-194中使用的硫酸葡聚糖是来自Sigma的低硫酸盐硫酸葡聚糖(每个二糖有2.3个硫酸化)。此外，硫酸葡聚糖具有明显更高的平均分子量(40kDa)。本发明的硫酸葡聚糖与Antiviral Research2017,143:186-194中的硫酸葡聚糖之间的硫酸化数和平均分子量的这些差异被认为是针对寨卡病毒的抗病毒活性显著差异的基础。

实施例2-针对DENV、ZIKV和YFV的抗病毒活性

本研究的目的是研究硫酸葡聚糖针对登革热病毒(DENV)、寨卡病毒(ZIKV)和黄热病病毒(YFV)的抗病毒活性。

材料和方法

在两种细胞系统中研究了病毒感染：使用登革热病毒(DENV)的一组(四种)血清型和黄热病17D(YF17D)疫苗株的人Huh-7细胞(VRS库存P1)和使用寨卡病毒(ZIKV)的两个谱系的人HeLa Kyoto细胞(VRS储备P1)。

病毒：DENV1(夏威夷株，GenBankTM代码EU848545)；

DENV2(新几内亚C株，GenBankTM代码AF038403)；

DENV3(H87株，GenBankTM代码M93130)；

DENV4(H241株；GenBankTM代码AY947539)；

ZIKV非洲谱系(MP1751株)；

ZIKV亚洲谱系(PF/13)；以及

YF17D(VRS储备)

试剂

完全培养基：补充有10％ FBS(Gibco)和1X p/s(Gibco)的DMEM(Gibco)

补充培养基：补充有2％ FBS(Gibco)和1X p/s(Gibco)的DMEM(Gibco)

实验程序

通过在添加病毒之前将药物与测定细胞一起预培育1小时来探索硫酸葡聚糖的八种稀释液的抗病毒活性。在整个实验的48小时内，病毒和配制物都留在细胞上。通过MTT测定来确定相同浓度范围的硫酸葡聚糖的细胞毒性。

细胞平板接种

将细胞分离并计数。每种细胞类型接种两个96孔板，一个用于抗病毒测定，并且一个用于细胞毒性测定。将Huh-7和HeLa细胞以8,000个细胞/孔的密度接种在100μl/孔的完全培养基中。接种后，将板在室温下培育5分钟以均匀分布，且接着在37℃、5％ CO₂下培育直至第二天。

病毒制备和感染

将病毒储备液稀释至补充培养基中，以达到以下MOI：

DENV1-3：0.3

DENV4：1

ZENV：5

YF17D：0.1

配制物稀释液

将硫酸葡聚糖配制物制备成最终浓度的两倍，因为它们被等体积的病毒或培养基稀释至最终浓度。

对于每种病毒，通过将150μl 100mg/ml储备液添加至600μl补充培养基(20mg/ml)中来制备硫酸葡聚糖测试溶液。

对于每种相关病毒，通过将3μl 10mM储备液添加至747μl补充培养基(40μM)中来制备莫能菌素作为对照抑制剂。

在圆底96孔板的A行中，一式三份地添加上述制备的稀释液(180μl/孔)。在B至H行中，添加了120μl补充培养基。在3倍系列稀释中，将60μl从上一行转移至下一行，中间混合15次。

细胞处理

从细胞中去除培养基并加入50μl补充培养基，然后立即加入50μl稀释的配制物。将仅培养基添加至第11列和第12列(未处理对照)。混合后，将板在37℃、5％ CO₂下培育1小时。

细胞毒性测试

从细胞中除去培养基并替换为50μl补充培养基，然后替换为50μl稀释的配制物或培养基。混合后，将板在37℃和5％ CO₂下培育48小时。

细胞感染

1小时后，从细胞中去除培养基，并用50μl病毒或培养基(未感染的未处理对照)替换，然后立即加入50μl先前制备的配制物稀释液。将板在37℃和5％ CO₂下培育48小时，并且在整个实验期间配制物+病毒留在细胞上。

固定与显色

用MTT处理细胞毒性板以确定细胞活力。

感染性读数

用免疫荧光染色对细胞进行免疫染色。简而言之，用50mM氯化铵淬灭任何残留甲醛，然后对细胞进行透化(0.1％ Triton X100)并用识别登革热病毒包膜蛋白的抗体(Invitrogen MA1-27093，用于DENV 1-3)、泛黄病毒包膜(Millipore MAB10216，用于DENV4和ZIKV)和黄热病E抗体3576(Santa Cruz，sc-58083，用于YF17D)进行染色。使用Alexa-488偶联二抗(Life Technologies，A11001)检测一抗，并使用Hoechst染色细胞核。使用4倍物镜在CellInsight CX5高内涵平台(Thermo Scientific)上采集图像，并使用CellInsightCX5软件计算感染百分比(感染细胞/总细胞×100)。

细胞毒性读数

EC₅₀浓度的确定

根据四参数Logistic方程，使用KaleidaGraph(v5；Synergy Software)，使用迭代曲线拟合来分析浓度-效应数据(m1＝感染性的最大抑制，m2＝EC₅₀浓度，m3＝Hill系数并且m4＝最大感染性；分析后，如果m1>m4，则重复分析，强制m1等于原始m4，并且与相关图表关联的表中缺少m1；分析后，如果m4比媒剂数据的最高重复值高出>10％，则强制m4为媒剂数据的平均值，并且是显而易见的，因为与相关图表关联的表中缺少m4)。在不存在(媒剂)或存在指定浓度的指定药物的情况下的感染％的所有重复均包含在分析中。

TC₅₀浓度的确定

使用以下公式计算细胞毒性％：

当最大细胞毒性未能达到TC₅₀值时，报告>最大测试浓度的TC₅₀值。

结果

表1显示了硫酸葡聚糖的EC₅₀、TC₅₀和选择性指数(SI(＝TC₅₀/EC₅₀)，以及阳性对照抑制剂莫能菌素的EC₅₀值。

硫酸葡聚糖和阳性对照药物对所有黄病毒(即四种登革热病毒株、两种寨卡病毒株和黄热病病毒株)的抑制作用都很明显，硫酸葡聚糖的EC₅₀范围为～0.03至0.6mg/ml(30-600μg/ml)。

除了最高测试浓度(10mg/ml)下的低sub-TC₅₀水平外，在任何测试的硫酸葡聚糖浓度下均未观察到细胞毒性；最大16％的细胞毒性。

表1.每种所测试病毒的EC₅₀、TC₅₀和SI值

登革热病毒

登革热是一种由蚊子(通常是埃及伊蚊和白纹伊蚊)传播的病毒感染，并且在世界许多地区(亚洲、非洲、美洲、澳大利亚和加勒比地区)广泛传播。登革热感染由四种抗原性不同的登革热病毒类型，即DENV1、DENV2、DENV3和DENV4引起。它们属于黄病毒属，从地理分布、发病率和死亡率来看，黄病毒属是人类最丰富的虫媒病毒疾病；据估计，至少有25亿人面临感染登革热的风险，每年有1亿-4亿人感染登革热。症状通常很轻微(轻度发热性疾患，称为‘登革热’)，但估计每年有500,000例需要住院治疗的非常严重且危及生命的病例(‘严重登革热’，又名登革出血热)，其中约2.5％的患者死亡。据WHO称，严重登革热是亚洲和拉丁美洲国家儿童和成人住院和死亡的主要原因。

目前尚无针对登革热的药物治疗或任何广泛使用的安全疫苗，并且登革热的预防依赖于有效的病媒控制。

所述测定评估了四种登革热病毒类型(1至4)中的每一者感染Huh-7细胞(人上皮肿瘤细胞系)的能力以及硫酸葡聚糖预防感染的能力。硫酸葡聚糖显示出对所有四种登革热类型的感染的有效抑制，IC₅₀值为0.6mg/ml或更低(图4A-4D)。通过莫能菌素(一种具有抗病毒活性的离子载体)对四种登革热变体中的每一者的感染性的抑制验证了所述测定。

硫酸葡聚糖的数据支持此药物具有减少人类登革热病毒感染的潜力。

黄热病病毒

黄热病是另一种严重的虫媒病毒性疾病，黄病毒感染通过蚊子(主要是埃及伊蚊和其它伊蚊物种)传播，发生在非洲、南美洲、中美洲和加勒比地区。黄热病是一种急性出血性疾病；“黄”描述了影响一些患者的黄疸。其它症状包括发烧、头痛、肌肉疼痛、恶心、呕吐和疲劳，严重时可能导致死亡。

所述测定评估了黄热病病毒感染Huh-7细胞(人上皮肿瘤细胞系)的能力以及硫酸葡聚糖预防感染的能力。硫酸葡聚糖显示出有效的感染抑制作用，IC₅₀值小于0.05mg/ml(图4E)。通过莫能菌素(一种具有抗病毒活性的离子载体)对感染性的抑制验证了所述测定。

硫酸葡聚糖的数据支持此药物具有减少人类黄热病病毒感染的潜力。

寨卡病毒

与登革热病毒一样，寨卡黄病毒也通过蚊子(同样通常是埃及伊蚊和白纹伊蚊物种)传播，并在世界热带和亚热带疟疾带(例如非洲、南美洲和中美洲以及东南亚)爆发。寨卡病毒有两个主要谱系，称为非洲谱系和亚洲谱系。

虽然寨卡病毒病对大多数人来说是轻微且短暂的，但所述疾病可能会给孕妇带来灾难性后果，将病毒传播给胎儿。这可能会促进流产或出生缺陷，包括可能致命的异常小头畸形(小头畸形)以及先天性寨卡综合征；功能失调性大脑发育障碍。2015-2016年，巴西爆发了一次超过20万例的大规模疫情，导致8000名婴儿出生时患有先天缺陷。目前估计，确诊寨卡病毒感染的孕妇中有5-10％会导致出生缺陷，当确诊感染仅限于妊娠前三个月时，这一比例会增加至8-15％。另外，人们越来越认识到，很少有患者出现神经系统问题，例如格林-巴利综合征、神经病或脊髓炎。

目前没有药物可以减少寨卡病毒感染，并且预防措施遵循减少蚊子接触的预防措施。根据症状怀疑感染，并经实验室检测确认。

所述测定评估了寨卡病毒谱系(亚洲和非洲)感染HeLa细胞(人类上皮肿瘤细胞系)的能力以及硫酸葡聚糖预防感染的能力。硫酸葡聚糖对两种寨卡病毒谱系的感染表现出有效的抑制作用，IC₅₀值小于0.140mg/ml(图4G-4H)。通过莫能菌素(一种具有抗病毒活性的离子载体)对两种变体的感染性的抑制验证了所述测定。

硫酸葡聚糖的数据支持此药物具有减少人类寨卡病毒感染的潜力。

结论

评估了硫酸葡聚糖抑制黄病毒登革热(四种主要类型)、寨卡病毒(两种主要类型)和黄热病病毒感染性的能力，参见图5中的寨卡亚洲株(ZIKV)、登革热夏威夷株(DENV)和YF17D的结果概述。

硫酸葡聚糖显示出抑制所有测试黄病毒的感染性的强大能力。另外，还在相同的测定中评估了硫酸葡聚糖的一般细胞毒性，但在任何测定中均未明显达到任何相关水平。这些数据支持硫酸葡聚糖作为预防人类黄病毒感染的治疗方法的潜力，黄病毒可导致毁灭性疾病，而目前尚无治疗所述疾病的药物。

上述实施方案被理解为本发明的几个说明性示例。本领域技术人员将理解，可对实施方案做出各种修改、组合和改变，而此并不背离本发明的范围。具体地讲，在技术上可行的情况下，不同实施方案中的不同的部分解决方案可组合在其它配置中。

Claims

1.一种用于预防、抑制或治疗黄病毒感染或感染性疾病的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有等于或低于10 000Da的平均分子量和等于或高于15％的平均硫含量。

2.根据权利要求1所述使用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述黄病毒感染选自由黄病毒引起的黄病毒感染组成的组，所述黄病毒选自由以下组成的组：登革热病毒、日本脑炎病毒、昆津病毒、兰加特病毒、卢平病病毒、墨累谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、波瓦桑病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒和寨卡病毒，优选地选自由以下组成的组：登革热病毒、日本脑炎病毒、昆津病毒、卢平病病毒、墨累谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、波瓦桑病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒和寨卡病毒。

3.根据权利要求2所述使用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述黄病毒感染选自由黄病毒引起的黄病毒感染组成的组，所述黄病毒选自由以下组成的组：登革热病毒、黄热病病毒和寨卡病毒。

4.根据权利要求3所述使用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述黄病毒感染是由寨卡病毒引起的黄病毒感染。

5.根据权利要求3所述使用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述黄病毒感染是由登革热病毒引起的黄病毒感染。

6.根据权利要求3所述使用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述黄病毒感染是由黄热病病毒引起的黄病毒感染。

7.根据权利要求1所述使用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述黄病毒感染由除日本脑炎病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒和黄热病病毒之外的黄病毒引起。

8.根据权利要求1至7中任一项所述使用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐被配制用于向所述受试者全身施用。

9.根据权利要求8所述使用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐被配制用于向所述受试者静脉内或皮下施用，优选被配制用于向所述受试者皮下施用。

10.根据权利要求1至9中任一项所述使用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有15至20％范围内的平均硫含量。

11.根据权利要求1至10中任一项所述使用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述平均分子量在2 000至10 000Da的范围内，优选在3 000至10 000Da的范围内，并且更优选在3 500至9500Da的范围内。

12.根据权利要求11所述使用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述平均分子量在4 500至7 500Da的范围内，优选在4500至5 500Da的范围内。

13.根据权利要求1至10中任一项所述使用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有通过核磁共振(NMR)光谱法测量的在1850至3500Da的范围内、优选在1850至2500Da的范围内并且更优选在1850至2300Da的范围内的数均分子量(Mn)。

14.根据权利要求13所述使用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有通过NMR光谱法测量的在1850至2000Da的范围内的Mn。

15.根据权利要求1至14中任一项所述使用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有在2.5至3.0的范围内、优选在2.5至2.8的范围内并且更优选在2.6至2.7的范围内的每葡萄糖单位的平均硫酸根数。

16.根据权利要求1至15中任一项所述使用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐具有平均5.1个葡萄糖单位和2.6至2.7的每葡萄糖单位的平均硫酸根数。

17.根据权利要求1至16中任一项所述使用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐被配制为注射水溶液。

18.根据权利要求1至17中任一项所述使用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述其药学上可接受的盐是硫酸葡聚糖的钠盐。