CN117120833A - 用于在液体样品中的分析物的高通量分析的工作流程 - Google Patents
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Abstract
本文描述检测在至少一种液体样品中的至少一种分析物的方法。方法包括下述步骤：使液体样品脱盐，将脱盐样品声学喷射入开放端口接口，稀释脱盐样品，和将稀释样品转移至离子化源，使稀释样品离子化，和通过离子迁移率选择有关离子。
Description
与相关申请的交叉引用
本申请涉及并且要求2021年3月25日提交的U.S.临时专利申请序号63/165,854的优先权益处，并且通过援引将其全部并入本文。
背景
用于分析生物学流体或液体样品的当前途径一般使用液相色谱法(LC)/质谱法(MS)途径。然而，这些方法一般需要大取样容积以及长运行时间来确保充分的分离。额外地，在能够快速获取数据的工作流程中，分析时间仍受到柱平衡和样品加载顾虑的限制。
概要
发明人已认识到需要用于分析生物学流体或液体样品的高通量工作流程。尤其是需要允许分析小体积脱盐的和稀释的样品的快速途径。
本公开的一方面涉及检测在至少一种液体样品中的至少一种分析物的方法，所述方法包括下述步骤：使液体样品脱盐，将脱盐样品声学喷射入开放端口接口，稀释脱盐样品，和将稀释样品转移至离子化源，使稀释样品离子化，和通过离子迁移率选择有关离子。在某些方面，液体样品选自尿、血液、口腔液和血浆。在一个方面，以低倍数比率稀释脱盐样品。在又一方面，低倍数比率是10倍稀释或更少。在一方面，以高倍数比率稀释脱盐样品。在又一方面，高倍数比率是大于10倍稀释。
在一个方面，选择有关离子是用差分迁移率谱仪进行的。在又一方面，差分迁移率谱仪包括平坦或弯曲的电极。在又一方面，差分迁移率谱仪将共洗脱的化合物、同量异序的(isobaric)化合物、异构化合物、构造异构体或非对映体与有关离子分离。在又一方面，脱盐步骤是通过使用反相或阴离子交换相或尺寸排阻、分子筛、移液管尖端和/或凝胶过滤进行的。
在又一方面，脱盐步骤是用线上脱盐装置进行的。在又一方面，线上脱盐装置是柱或筒。在还又一方面，液体处理器容纳线上脱盐装置。在又一方面，液体处理器也容纳声学微滴喷射转换器。
在又一方面，方法还包括水解脱盐样品以产生水解产物，并且喷射脱盐样品包括将水解产物喷射入开放端口接口。在还又一方面，在选择有关离子之后，方法还包括质量分析有关离子。在又一方面，有关离子是用质谱仪质量分析的。在又一方面，方法包括定量分析物在液体样品中的量的步骤。
在某些方面，定量限在低ng/mL范围。在其它方面，定量限在亚ng/mL范围。在某些方面，方法还使用多路测试来分析多个液体样品。在又一方面，每秒分析约3个样品或更多。在一方面，方法用于高通量筛选应用或快速筛选工作流程中。在还又一方面，分析物是至少一种滥用药物。在某些方面，滥用药物选自安非他明类，甲基苯丙胺类，苯并二氮杂类，巴比妥酸盐类，大麻，可卡因，PCP，美沙酮，和阿片类物质(麻醉药)。
在参考本公开具体实施方式的下述说明和附图之后，本公开的其它方面和特征对本领域普通技术人员将变得明显。
附图描述
本公开的目的和特征用所附权利要求的细节来描述。关于本发明的组织和操作方式以及其他目的和优势，可以通过参照下文描述并结合附图进行最佳理解。
图1A-1D展示流动注射分析(FIA)数据，其来自对于(图1A)标准品、(图1B)在尿基质中制备的样品和(图1C)在脱盐尿基质中制备的样品的去甲多塞平和米氮平混合物的5uL注射。图1D描述来自图1A-1C的相同米氮平样品的分析实例，其使用具有声学注射的开放端口装置。
图2说明校准曲线数据，其来自使用50nL注射体积的米氮平。
图3A-3C说明校准曲线和定量限(LOQ)，其对应在脱盐尿基质中的2.5nL(图3A)、10nL(图3B)和50nL(图3C)米氮平样品。
图4A-4C说明校准曲线和定量限(LOQ)，其对应在脱盐尿基质中的2.5nL(图4A)、10nL(图4B)和50nL(图4C)去甲多塞平样品。
FIGs 5A-5C说明米氮平校准曲线和LOQ，其对应在脱盐且水解的尿中制备的样品；2.5nL(图5A)，10nL(图5B)，和50nL(图5C)。
图6A-6C说明去甲多塞平校准曲线和LOQ，其对应在脱盐且水解的尿中制备的样品；2.5nL(图6A)，10nL(图6B)，和50nL(图6C)。
详述
应理解本公开并不局限于本文描述的具体方法、方案和试剂而是本身可以变化。还应理解本文所用的术语仅是用于描述具体实施方式的意图并且不期望限制本公开或所附权利要求的范围。
如本文和所附权利要求中所用，单数形式"一"、"一个"和"一种"包括其复数指称，除非上下文清楚地另有明确指示。
在说明书和权利要求通篇用于数值的术语"约"表示本领域技术人员熟悉和可接受的精确度范围。通常，所述精确度范围是+/-10％。
除非另有定义，本文所用的全部技术和科学术语具有本公开所属领域普通技术人员一般理解的相同含义。
分析生物学或液体样品常常具有挑战性，原因在于样品基质的复杂性。直接的样品引入方法(包括但不限于声学注射、直接流动注射、固相微萃取、开放端口接口或差分迁移率谱测定法)提供数种优势，包括在分析之前有效率且有效地清洁(例如使脱盐)和浓缩样品的能力。例如，声学开放端口接口将声学能量施加至样品储库从而将很小的取样容积喷射入流动流中。这允许样品稀释，其能够降低离子抑制效果。在分析工作流程中包括差分迁移率谱测定法(DMS)允许分辨潜在的同量异序干扰物，其是通过基于在高场和低场中的离子迁移率差来选择有关离子。
本公开的实施方式包括用于检测液体样品中的至少一种分析物的方法。在实施方式中，方法包括使液体样品脱盐，将脱盐样品声学喷射入开放端口接口，稀释脱盐样品，和将稀释样品转移至离子化源，使稀释样品离子化，和通过离子迁移率选择有关离子。液体样品可以是生物学样品。非限制性实例包括尿、血液、口腔液和血浆。
对于某些液体样品，盐和其它干扰物质的存在阻碍分析。使这些样品脱盐能够进一步降低离子抑制效果。在某些实施方式中，脱盐步骤是用反相或阴离子交换相或尺寸排阻、分子筛、移液管尖端和/或凝胶过滤进行的。脱盐可以用移液管尖端、柱或筒进行，其含有极性物质，比如十八烷基碳链(C18)-键合的二氧化硅、C8-键合的二氧化硅、纯二氧化硅、氰基-键合的二氧化硅、或苯基-键合的二氧化硅。在实施方式中，脱盐步骤是用线上脱盐装置比如柱或筒进行的。
在实施方式中，线上脱盐装置可以封装在液体处理器中，其是允许试剂、样品或其它液体的自动式转移的自动化设备。在一种实施方式中，液体处理器也容纳声学微滴喷射转换器。
采用开放端口接口，脱盐样品以恒定速率连续流动，其允许对脱盐样品进行线上稀释。在某些实施方式中，以低倍数比率比如10倍稀释或更少来稀释脱盐样品。在其它实施方式中，以更高比率比如大于10倍稀释来稀释脱盐样品。
在实施方式中，有关离子的选择是用差分迁移率谱仪进行的。使用差分迁移率谱仪允许将共洗脱的化合物、同量异序化合物、异构化合物、构造异构体或非对映体与有关离子分离。
在实施方式中，方法还包括水解脱盐样品以产生水解产物并且将水解产物喷射入开放端口接口。在某些实施方式中，在水解之前加入内标，但本领域普通技术人员能够认识到可以在水解完成之后加入内标。
水解能够是化学法或酶法。酶水解是用酶比如蛋白酶、肽酶或肽水解酶来水解蛋白质肽键的方法。蛋白酶能够是外肽酶，其在多肽链末段附近起作用和包括例如氨基肽酶和二肽基肽酶，或者是内肽酶，其在非末端肽键上起作用和包括例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属内肽酶。
适宜的水解酶包括但不限于β-葡糖醛酸糖苷酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶，蛋白酶，LysC，LysN，AspN，GluC，ArgC，链霉蛋白酶，胃蛋白酶和脯肽酶。适宜的水解酶也包括能够水解糖苷连接的那些，比如在代谢过程期间形成的那些。这些连接的非限制性实例包括可待因-6-葡糖苷酸和吗啡-6-葡糖苷酸连接。
在本公开的实施方式中，分析仪可以用来分析有关离子。术语"分析仪"可以包括能够分析样品比如生物学或液体样品的任何适宜设备。分析仪的实例包括色谱法设备，质谱仪，免疫分析仪，血液学分析仪，微生物学分析仪，和/或分子生物学分析仪。
在实施方式中，对有关离子进行质量分析，例如使用质谱仪。有关离子可以被引入质谱仪，使用额外分离或不使用额外分离。可以需要额外分离的样品引入方法可以包括捕集器和洗脱方法模块。方法可以还包括定量分析物在液体样品中的量的步骤。在分析生物学样品例如滥用药物的情况下，希望的定量限(LOQ)在低ng/mL或亚ng/mL范围。在实施方式中，滥用药物包括但不限于安非他明类、甲基苯丙胺类、苯并二氮杂类、巴比妥酸盐类、LSD、迷幻药、大麻、可卡因、PCP、美沙酮、兴奋剂和阿片类物质(麻醉药)。尿是在滥用药物测试中使用的常见生物学样品。尿分析或临床尿试验能够在药物效果已消退后之后检测滥用药物的存在。
所公开的方法允许这些方法在高通量筛选应用或快速筛选工作流程中的自动化或使用。在一种实施方式中，方法还应用多路测试来分析多个液体样品。在该实施方式中每秒分析约3个或更多样品。
在示范性实施方式中，所公开的方法能够用作常规尿毒理学筛选的一部分。在该实例中，能够从不同(>100个)尿样本同时定量至少5种、至少10种、至少15种或至少20种分析物(也即滥用药物或药物代谢物)。所评价的分析物可以包括但不限于2-氧代-LSD(LSD代谢物)，6-MAM(海洛因代谢物)，阿普唑仑，a-羟基阿普唑仑，异戊巴比妥/戊巴比妥，苯丙胺，甲酰芽子碱(BE)，丁丙诺啡，去甲丁丙诺啡，布他比妥，卡立普多，氯硝西泮，7-氨基氯硝西泮(aminoclonazepam)，可待因，环苯扎林，N-去甲环苯扎林，去甲多塞平，地西泮，去甲地西泮，苯海拉明，芬太尼，去甲芬太尼，氟硝西泮，7-氨基氟硝西泮(aminoflunitrazepam)，氟西泮，脱-烷基-氟西泮，加巴喷丁，氢可酮，去甲氢可酮，氢吗啡酮，劳拉西泮，氯胺酮，MDA，MDEA，MDMA，麦啶，去甲麦啶，甲丙氨酯，美沙酮，EDDP，甲基苯丙胺，哌甲酯，利太林酸(ritalinic acid)，咪达唑仑，米氮平，吗啡，纳洛酮，纳曲酮，奥沙西泮，羟考酮，去甲羟可酮，羟吗啡酮，苯环利定(PCP)，苯巴比妥，芬特明，普瑞巴林，伪麻黄碱，司可巴比妥，他喷他多，N-去甲基他喷他多，替马西泮，thc-cooh，曲马多，O-去甲基曲马多，a-羟基三唑仑，唑吡坦，唑吡坦-COOH。
取决于分析物，检测的截断值为2.5-50ng/mL的范围。如果鉴定出有关分析物，则用LC-MS(液相色谱法-质谱法)或LC-MS/MS(液相色谱法-串联质谱法)对样本进行第二次证实性定量程序。所公开的方法增加下游分析的特异性，原因在于使样品脱盐降低基质相关性干扰物并且在质量分析之前用差分迁移率谱测定法选择有关离子分离可以共洗脱的难以分辨的离子。可以应用其它优化策略(比如增加样本的处理和分析或增加灵敏度)来调整所公开的方法用于高通量临床环境。
实施例
分析去甲多塞平和米氮平的混合物
样品制备
尿样品能够根据SAMHSA指南(Substance Abuse and Mental Health ServicesAdministration Center for Substance Abuse Prevention)收集，其可在https://www.samhsa.gov/sites/default/files/specimen-collection-handboo k-2014.pdf获得。尿样本一般在收集之后24小时内提交至合格实验室。
分析
作为标准品(图1A)、在尿基质中(图1B)和在脱盐尿基质中(图1C)制备100ng/mL去甲多塞平和米氮平的混合物的五微升注射剂。用离线式分散移液管萃取尖端使脱盐的混合物脱盐，随后在SCIEX Triple Quad 6500+设备上用SelexION+差分迁移率分离装置(SCIEX)进行流动注射分析注射。在运行标准品(图1A)的情况下，实现典型的流动注射峰，对于米氮平和去甲多塞平其信号强度分别为60,000,000和10,000,000cps量级。在注射于尿基质中制备的相同浓度药物(图1B)的情况下，观察到典型抑制峰。信号掉队至图中部，展示严重抑制效果。图1C显示在使尿基质脱盐之后的流动注射分析(FIA)数据。用固相微萃取(SPME)C18纤维使样品脱盐。将SPME纤维在200μL的50％甲醇/水中调理20分钟。在调理之后，将SPME纤维加至200μL尿样品并且激烈混合30分钟。然后从样品小瓶除去SPME纤维并且置入含有100μL的100％甲醇的小瓶中并且激烈混合5分钟。然后将小瓶封盖，并且小瓶的内容物已准备好用于分析。抑制效果被显著降低，得到典型的FIA峰形。信号强度为低于对标准品的观察值10-20X的量级。
声学开放端口接口装置提供样品基质的稀释，并且这能够帮助降低离子抑制效果。然而，对于具有很高的盐含量的基质比如尿来说，单独的稀释可以不足以完全消除抑制效果和/或稀释可以将分析物浓度降到足够低从而不可能实现所希望的LOQ。图1D显示分析实施例，其用具有声学注射的开放端口装置分析来自图1A-C相同米氮平样品。在该情况下，分析50nL样品基质并且所述样品基质包括尿(红线)和脱盐的尿(黑线)。在用ADE/OPP装置分析尿样品的情况下测得具有正面积的峰，然而峰形显示明显的抑制迹象，其中边缘信号增加且峰中心凹陷。虽然这代表相对图1B的显著改善，但是不利的抑制效果仍然明显。黑线显示具有相同注射体积的脱盐样品的ADE/OPP分析。在该情况下产生非抑制峰形，与在尿基质中制备的样品的测量结果相比，具有显著更佳的峰面积。
样品的进一步稀释(通过注射更少的体积)能够以更高程度降低抑制，然而在降低抑制与降低分析物浓度之间存在平衡(trade off)。
在尿中制备一系列药物样品组，所述尿是用分散移液管萃取移液管尖端脱盐的和用声学开放端口接口装置分析的。最初，用30％甲醇/水调理分散移液管萃取尖端。然后将200μL等分试样的尿样品移取入经调理的尖端。然后从尖端喷射尿样品，并且然后用200μL水洗涤尖端。将总共100μL甲醇、0.1％甲酸移取入尖端，并且然后喷射入小瓶中以洗脱有关分析物。然后用含已溶解内标的水稀释洗脱物。然后小瓶已准备好用于分析。图2显示对于米氮平获得的校准曲线数据实例，使用50nL注射体积。图2显示空白和加料样品的10次注射，所述样品含有7.81、15.6、31.3、62.5和125ng/mL的药物。最低浓度样品(7.81ng/mL米氮平)可以容易地区别于空白。
图3A-3C和4A-4C描述校准曲线和计算LOQ，分别对应在脱盐尿中的米氮平和去甲多塞平。在分析脱盐尿样品中的米氮平和去甲多塞平两者时，可能实现类似预先用标准品所产生的那些的LOQ值；这指出，与在尿中制备的样品相比，脱盐步骤将LOQ改善大约1个数量级。这些结果表明还可以不存在对进一步处理步骤的需要。牵涉尿样品的离线脱盐并随后用声学OPP/SelexION+/6500+直接分析的简单工作流程显得足以降低离子抑制。还分析一系列的QC并且显示产生可接受的结果。
将药物代谢物转化为单纯药物分子的额外水解步骤可以帮助分析真实样品(与药物加料样品相反)。在脱盐尿中制备额外的样品系列来确保在水解期间发生的额外10倍稀释并不会不利于实现所需的20ng/mL LOQ。对于米氮平和去甲多塞平的数据分别示于图5A-5C和6A-6C，其中清楚的是能够通过注射更大体积样品对抗来自水解步骤的额外稀释。对于非脱盐样品，这会引起增加的抑制、随注射体积的非线性信号增加、和因此无法实现所需的检测限。然而，对于脱盐样品，增加的注射体积随灵敏度线性增加，如图5A-C和6A-C数据的校准曲线斜率所明示。
虽然本公开已参照某些实施方式进行描述，本领域技术人员将理解可以进行各种变化和可以替代等价方式而不背离本公开或所附权利要求的范围。此外，可以进行许多修饰以按照本公开的教导调整特定的情况或物质而不背离其范围。因此，本公开期望并不局限于所公开的具体实施方式，而是本公开将包括属于所附权利要求范围内的全部方面。
Claims (25)
1.检测在至少一种液体样品中的至少一种分析物的方法，所述方法包括下述步骤：
使液体样品脱盐,
将脱盐样品声学喷射入开放端口接口，稀释脱盐样品，和将稀释样品转移至离子化源,
使稀释样品离子化，和
通过离子迁移率选择有关离子。
2.权利要求1的方法，其中所述液体样品选自尿，血液，口腔液和血浆。
3.权利要求1或2的方法，其中以低倍数比率稀释脱盐样品。
4.权利要求3的方法，其中低倍数比率是10倍稀释或更少。
5.权利要求1或2的方法，其中以高倍数比率稀释脱盐样品。
6.权利要求5的方法，其中高倍数比率大于10倍稀释。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中选择有关离子是用差分迁移率谱仪进行的。
8.权利要求7的方法，其中差分迁移率谱仪包括平坦或弯曲的电极。
9.权利要求7或8的方法，其中差分迁移率谱仪将共洗脱的化合物、同量异序的化合物、异构化合物、构造异构体或非对映体与有关离子分离。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中脱盐步骤是用反相或阴离子交换相或尺寸排阻、分子筛、移液管尖端和/或凝胶过滤进行的。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中脱盐步骤是用线上脱盐装置进行的。
12.权利要求11的方法，其中线上脱盐装置是柱或筒。
13.权利要求11或12的方法，其中液体处理器容纳线上脱盐装置。
14.权利要求13的方法，其中液体处理器也容纳声学微滴喷射转换器。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法还包括水解脱盐样品以产生水解产物，并且声学喷射脱盐样品的步骤包括将水解产物声学喷射入开放端口接口。
16.前述权利要求中任一项的方法，其中在选择有关离子之后，所述方法还包括质量分析有关离子。
17.权利要求16的方法，其中有关离子是用质谱仪质量分析的。
18.权利要求16或17的方法，还包括定量分析物在液体样品中的量的步骤。
19.权利要求18的方法，其中定量限在低ng/mL范围。
20.权利要求18的方法，其中定量限在亚ng/mL范围。
21.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法还使用多路测试来分析多个液体样品。
22.权利要求21的方法，其中每秒分析约3个样品。
23.权利要求16-22中任一项的方法，其中所述方法用于高通量筛选应用或快速筛选工作流程中。
24.前述权利要求中任一项的方法，其中分析物是至少一种滥用药物。
25.权利要求24的方法，其中所述滥用药物选自安非他明类、甲基苯丙胺类、苯并二氮杂类、巴比妥酸盐类、LSD、迷幻药、大麻、可卡因、PCP、美沙酮、兴奋剂和阿片类物质(麻醉药)。
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