CN117120531A - 用纳米分散的酶解聚聚酯 - Google Patents

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Abstract

用于塑料的可编程降解的系统和方法采用包含酶的纳米级分散体的塑料，该塑料被配置成利用酶活性位点和酶‑保护剂相互作用来提供作为主要降解途径的持续解聚，其具有扩展的底物选择性以实现基本上完全的解聚，而没有伴随部分聚合物降解的大量微塑料形成。

Description

用纳米分散的酶解聚聚酯
本发明是在美国陆军研究办公室(the DA Army Research Office)合同号为W911NF-13-1-0232和能源部拨款号为DE-AC02-05-CH11231的政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。
引言
酶和生物机械与聚合物的成功界面连接提供了在制造、利用和处置期间的按需改性和/或可编程的塑料降解，但需要在具有大分子底物的固体基体中的受控生物催化。1-7嵌入的酶微粒加速了聚酯降解，但损害了主体性质，并无意中加速了伴随部分聚合物降解的微塑料形成。6,8,9
发明概述
我们公开了通过纳米级分散的具有深活性位点的酶，半结晶聚酯可以主要经由链末端介导的持续解聚降解，其具有可编程的潜伏期和材料完整性，类似于聚腺苷酸化诱导的mRNA衰变。10我们也公开了如何通过工程化酶/保护剂/聚合物复合物实现用具有表面暴露的活性位点的酶的持续性。例如，在标准土壤堆肥或家庭自来水中，包含少于2重量％酶的聚己内酯和聚(乳酸)在几天内以高达98％的聚合物至小分子转化率解聚，完全消除了目前在堆肥设施中分离和填埋其产物的需要。此外，嵌入聚烯烃中的氧化酶保留活性。然而，烃聚合物不像它们的聚酯对应物那样与酶紧密地缔合，并且产生的反应性自由基不能化学地改性大分子主体。所公开的分子指导提供酶/聚合物配对和酶保护剂的选择以调节底物选择性和优化生物催化途径。
本发明提供了用于用纳米分散的酶解聚聚酯的系统和方法。
一方面，本发明提供了用于塑料的可编程降解的系统，其包括包含酶的纳米级分散体的塑料，并且被配置成利用酶活性位点和酶-保护剂相互作用以提供作为主要降解途径的持续解聚，其具有扩展的底物选择性以实现基本上完全解聚，而没有伴随部分聚合物降解的大量微塑料形成。
一方面，本发明提供了塑料的可编程降解的方法，其包括提供一种塑料，其包含酶的纳米级分散体，并被配置成利用酶活性位点和酶-保护剂相互作用以提供作为主要降解途径的持续解聚，其具有扩展的底物选择性以实现基本上完全解聚，而没有伴随部分聚合物降解的大量微塑料形成。
在实施方案中：
a)酶为脂肪酶，底物为聚(己内酯)(PCL)，脂肪酶表面提供对底物的亲和力，结合位点具有相对窄的深入口；
b)酶底物为聚(乳酸)(PLA)，酶为蛋白酶K，proK结合位点相对浅且是暴露的；
c)系统包含无规杂聚物(RHP)，其被配置成纳米级分散酶和/或调节酶的活性或稳定性(如充当酶保护剂)。
d)酶表面、保护剂和聚合物底物形成复合物以将底物夹在中间；
e)塑料包含半结晶聚酯；
f)纳米级分散体占约0.001至5重量％或0.01至1.5重量％；
g)酶包含水解酶，如脂肪酶和/或蛋白酶；
h)解聚发生在水或堆肥中；
i)解聚在少于1、2、5或10天内发生，如在水中，或在少于30、60或90天内发生，如在堆肥中；
j)解聚在10-60℃、或30-60℃、或约37-40℃的温度下发生，其中通过调节材料性质，诸如降低结晶片层厚度，促进较低温度(如10-30℃)的解聚；
k)塑料包含聚酯，其中酶包括与聚酯骨架匹配的活性位点；
l)塑料包含在聚(己内酯)(PCL)中的脂肪酶；
m)塑料包含在聚(乳酸)(PLA)中的蛋白酶；
n)酶包含加工酶，其具有从其表面到催化位点的深(如约1-4nm，或约2nm)、窄(如在底部约或/>或约/>)疏水裂缝，以促进底物聚合物链滑动同时防止解离；
o)系统包含具有深活性位点的纳米级分散酶和主要经由链末端介导的持续解聚降解的半结晶聚酯，所述链末端介导的持续解聚具有可编程的催化潜伏期和材料完整性；
p)系统通过工程化酶/保护剂/聚合物复合物实现用具有表面暴露的活性位点的酶的持续性；和/或
q)在标准土壤堆肥或家庭自来水中，包含少于2重量％酶的聚己内酯和聚(乳酸)在几天内以高达98％的聚合物至小分子转化率解聚，消除了在堆肥设施中分离和填埋其产物的需要。
本发明涵盖本文所记载的具体实施方案的所有组合，就像每个组合都被费力地记载一样。
附图简述
主图图例
图1A-C。用于聚合物降解的嵌入的酶的生物催化。(A)图示说明两种降解途径的示意图：当酶被纳米级限制以与在无定形结构域中的聚合物链末端共定位时，具有无规断链和链末端结合介导的持续解聚的塑料表面侵蚀。酶保护剂(RHP)用于介导酶-聚合物相互作用用于分散，并呈现为多色珠链。(B)反应动力学变化，其中大分子底物结合变成被限制的酶的限速因素。所示变量代表聚合物链扩散进入(k进入)和离开(k离开)酶活性位点的速率常数，和催化反应速率常数(kr)。当k进入是限速因素时，酶降解速率降低(k进入<<kr)。(C)调节固态生物催化以及针对可编程聚合物降解的酶反应的另外的因素。左，表面暴露的活性位点可容易地结合链段，而深、窄的结合位点优选链末端。中间，酶保护剂(RHP)可以稳定酶，阻断活性位点或与表面暴露的结合位点的复合以实现持续性。右，半结晶聚合物链构象影响降解速率。
图2A-F。PCL-RHP-BC-脂肪酶的表征和降解。(A)具有均匀分布的荧光标记的BC-脂肪酶的膜的荧光显微镜图像。(B)叠加偏振光学显微镜图像。(C)显示RHP-脂肪酶在半结晶球晶中的掺入的透射电子显微镜(TEM)图像。(D)RHP-BC-脂肪酶掺入前和RHP-BC-脂肪酶掺入后PCL的应力-应变曲线。插图显示拉伸测试前(左)和拉伸测试后(右)的PCL-RHP-BC-脂肪酶狗骨样品。(E)重量损失为0、10、25重量％的PCL-RHP-BC-脂肪酶样品的SAXS图。插图显示来自50％重量损失的样品的横截面扫描电子显微镜(SEM)图像。(F)PCL-RHP-BC-脂肪酶在40℃缓冲液中降解后形成的微塑料颗粒的荧光显微镜图像。绿色荧光标记的BC-脂肪酶保持均匀地分布在PCL基体中。嵌入的酶继续降解PCL，以在一天内实现＞95％的PCL-小分子转化率。
图3A-E。嵌入的BC-脂肪酶经由链末端介导的持续降解解聚聚酯。(A)在37℃缓冲液中作为降解时间的函数的PCL-RHP-BC-脂肪酶样品的剩余质量(实心蓝色圆圈)和结晶度百分比(空心黑色圆圈)(误差线代表一个标准偏差；对于剩余质量n≥3，对于结晶度n≥2)。(b)在表面侵蚀和通过BC-脂肪酶限制降解后的PCL样品的GPC，包括剩余的膜和降解的副产物的GPC。(C)通过表面侵蚀或通过被限制的BC-脂肪酶降解的PCL的质谱，包括剩余的膜和降解的副产物的质谱。x轴(m/z)显示质量除以电荷。(D)当PCL-b-PLA二嵌段共聚物与RHP/BC脂肪酶共混时PCL-b-PLA二嵌段共聚物的降解副产物的核磁共振(NMR)谱。在包含BC脂肪酶的二嵌段基体中观察到PCL和PLA的小分子副产物两者，而对于PCL-PLA共混物基体观察到仅PCL降解。x轴(δ)显示化学峰位移。(E)BC-脂肪酶和CA-脂肪酶的表面表示，突出显示疏水(白色)底物结合结构域和结合结构域对面的极性(紫色)片段；催化丝氨酸残基显示为绿色，而阴性和阳性残基分别显示为红色和蓝色。a.u.，任意单位。
图4A-E。酶保护剂(RHP)与嵌入的酶缔合，以在熔融加工和热处理期间保持活性以编程降解。(A)包含约0.1重量％脂肪酶的熔融挤出的PCL-RHP-BC-脂肪酶细丝，其在40℃缓冲液中在36小时内降解成小分子，几乎完全转化。(B)通过热处理对PCL-RHP-BC-脂肪酶降解的编程。偏振光学成像证实，在37℃缓冲液中24小时后，只有具有低结晶温度的区域降解。(C)通过降解温度对PCL-RHP-BC-脂肪酶降解的编程。PCL-RHP-BC-脂肪酶的降解速率在低于PCL熔融温度的起点时或在无定形PCL熔体中被基本抑制。这确保在储存和熔融加工期间的PCL完整性。(D)在PCL-BC-脂肪酶和PLA-蛋白酶K中RHP可以调节解聚。显示的PCL-BC-脂肪酶的剩余质量是在缓冲液中浸泡1天后，对于具有20:50MMA:EHMA RHP组成的PLA-蛋白酶K在7天后，并且对于具有50:20和60:10MMA:EHMA RHP组成的PLA-蛋白酶K在1个月后(n≥3)。(E)包含酶的PCL(左)和PLA(右)在ASTM标准堆肥中容易分解。
图5A-C。酶嵌入的PCL的表征。(A)对于RHP和纯化的BC-脂肪酶在甲苯(用于浇铸PCL的溶剂)中的DLS结果，其平均流体动力学直径为285nm±35nm(n＝5)(误差表示标准偏差)。(B)对于PCL和PCL-RHP-BC-脂肪酶铸态膜的DSC结果。(C)PCL和PCL-RHP-BC-脂肪酶铸态膜的SAXS曲线。
图6。PCL-RHP-BC-脂肪酶副产物分析。对于通过被限制的和溶解的(表面侵蚀)BC-脂肪酶降解的降解副产物的液相色谱图。
图7A-B。通过具有浅活性位点的被限制的CA-脂肪酶的降解。(A)PCL-RHP-CA-脂肪酶降解的GPC曲线，显示主峰的移动和加宽，表明无规断链。(B)图示说明峰移动和加宽的a的放大版本。
图8A-B。酶环境决定生物催化反应动力学。(A)通过溶解在溶液(表面)中的BC-脂肪酶、纳米级嵌入具有RHP的PCL中的BC-脂肪酶以及嵌入作为微粒的吐温80，一种小分子表面活性剂的BC-脂肪酶的PCL降解(误差线代表一个标准偏差；n≥3)。(B)通过在溶液中或被限制在PCL中的BC-脂肪酶水解对硝基苯丁酸酯，一种小分子酯。
图9A-C。模拟界面张力实验以解释酶、保护剂和基体之间的分子间相互作用。当所有三种组分最初在甲苯中混合(A，左)然后引入水界面(A，右)时，RHP-脂肪酶复合物立即在界面处与PCL相互作用，如在摇动小瓶以产生乳液后约20秒拍摄的荧光显微镜图像(B)和仅对PCL-RHP-脂肪酶可见的界面张力降低的长延迟时间(C)所示。
图10A-B。熔融加工的PCL-RHP-BC-脂肪酶的半结晶性质的表征(49℃，蓝色；铸态，黑色)。(A)PCL-RHP-BC-脂肪酶在不同重结晶条件下的DSC曲线(重结晶温度Tc＝49℃的膜的结晶度为41％±1.2％，相比铸态膜的结晶度为39％±1.8％)。热流量，-0.6至0.0W/g v。温度40-7049℃。熔融温度从约58℃增加到约64℃表示Tc＝49℃的膜的结晶片层明显增厚，这通过SAXS证实。(B)PCL-RHP-BC-脂肪酶的铸态和Tc＝49℃的膜的SAXS曲线。强度a.u.相对于根据DSC数据，长时间段时的增加(向较低q移动)与整体百分比结晶度的可忽略差异结合，证实在Tc＝49℃下结晶后结晶片层的增厚。
图11。证实酶在高温下不变性。通过作为温度的函数的嵌入的BC-脂肪酶的小分子酯水解(红色)，叠加PCL-RHP-BC-脂肪酶降解速率。小分子活性在60℃保持高的，但没有定量，因为膜由于熔融而皱缩，因此比在较低温度的膜厚得多，使得定量对于所有其它温度是不可比较的。
图12-A-D。定量不同RHP的链段疏水性。(A)对于具有60:10MMA:EHMA组成的RHP的亲水性图。(B)对于具有50:20MMA:EHMA组成的RHP的亲水性图。(C)对于具有20:50MMA:EHMA组成的RHP的亲水性图。(D)对于每种RHP组成的平均链段HLB值。误差线表示标准偏差，n≥3。
图13-A-E。表征用于更商业相关的塑料的嵌入的酶。(A)蛋白酶K的结晶结构，其颜色编码方案与正文中用于脂肪酶的颜色编码方案相同(图3A-E)。(B)铸态和在缓冲液中解聚后PLA-RHP-蛋白酶K(“ProK”)的GPC曲线；(C)在DCM相中对于具有PLA、RHP和蛋白酶K的DCM-水界面的界面张力测定实验结果。(D)在约10分钟后，在丙二酸盐缓冲液中ABTS小分子测定的照片，证明嵌入聚苯乙烯(PS)中的漆酶保留氧化小分子的能力。对于锰过氧化物酶和对于嵌入聚乙烯中的两种酶，发现了类似的结果。(E)在甲苯相中具有PS、RHP和漆酶或锰过氧化物酶(“MnP”)的甲苯-水界面的界面张力测定实验结果。
本发明的具体实施方案的描述
除非另有相反指示或说明，否则在这些描述和整个该说明书中，术语“一(a)”和“一个(an)”是指一个或多个，术语“或”是指和/或。应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且本领域技术人员将提出根据其的各种修改或变化，并且这些修改或变化将包括在该申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请，包括其中的引用，均出于所有目的通过引用以其整体结合于此。
我们羡慕大自然对复杂过程进行编程以实现系统范围的、长期可持续性的能力。11-14关键瓶颈是生物元素与合成对应物的分子界面连接，对于基于酶的塑料改性/降解，如何用既是反应底物又是主体基体的大分子操纵生物催化。2,3,8,15酶活性取决于蛋白质结构、底物结合和活性位点的反应性16-18。在代表大多数塑料的半结晶聚合物中，13由于被限制的酶3,4,7和聚合物基体19的降低的流动性，底物可及性可能是限速的(图1A和图1B)。当聚合物具有化学上不稳定的骨架时，酶可以无规地结合到长链并使其断裂，或者选择性地结合到链末端并催化解聚。20,21无规断链是更普遍的途径，6,14但是链末端持续解聚是更期望的，因为它直接和几乎完全将聚合物转化为增值的单体，同时几乎完全降解。16,22选择性链末端结合在溶液生物催化中是具有挑战性的，23但是当酶被纳米限制以与聚合物链末端共存时，其可能变得可行。固态生物催化需要另外的考虑，如果适当选择，这些考虑是有益的(图1C)。热力学上，聚合物链构象有助于熵增益，并因此有助于解聚的整体驱动力。动力学上，局部聚合物链堆积影响链段的流动性和底物结合，以引发和继续持续解聚。24,25用于分散酶的保护剂可竞争底物结合和/或瞬时改性活性位点，提供调节催化潜伏期的机会。5,26最后，必须考虑目标塑料的生物催化机制和类型。20,21,27缩合聚合物如聚酯的降解可能仅需要底物结合。鉴于它们快速的市场增长，理解固态酶学可以导致针对一次性使用塑料的即时技术影响。28-30然而，化学休眠分子诸如烃和/或聚烯烃的酶改性需要多个生物催化过程的同步，并且即使在生物优化条件下也是缓慢的。31在不知道微生物如何改性和降解聚烯烃的情况下，15,21,32,33理解嵌入的酶如何表现将指导用于塑料的升级回收的蛋白质工程化和混合生物/非生物催化剂设计，而不产生二次环境污染。
通过纳米级地将酶限制在半结晶聚酯中并利用酶活性位点特征和酶-保护剂相互作用，我们表明，使持续解聚作为具有扩展的底物选择性的主要降解途径成为可能。微量酶的纳米级分散，如在聚(己内酯)PCL中的约0.02重量％脂肪酶(总添加剂＜2重量％)，或在聚(乳酸)PLA中的约1.5重量％蛋白酶K(总添加剂＜5重量％)，导致几乎完全转化为小分子，使用家用自来水和标准土壤堆肥在几天内消除微塑料。可编程的降解克服了它们与工业堆肥操作的不相容性，使它们成为可行的聚烯烃替代品。28-30对聚合物构象和链段协同性的影响的分析指导聚酯的热处理以在空间和时间上编程降解，同时在加工和储存期间保持潜伏期。保护剂被设计为在普通塑料加工期间调节生物催化和稳定酶。此外，用嵌入的氧化酶诸如漆酶和锰过氧化物酶，酶促产生的反应性自由基不能氧化主体聚烯烃。需要了解生物催化级联以设计酶/主体相互作用并且增强反应性物质的反应性、扩散和寿命而不产生生物危害。
随着生产的增加和成本的降低，可生物降解塑料PCL和PLA是许多商品塑料的市场现成的替代品。34然而，它们在垃圾填埋中是无差别的。14即使在48-60℃下操作的嗜热消化器中，一般的停留时间不足以允许完全分解，28,29导致操作挑战和财务负担，以使有机废物中的污染最小化。30考虑到洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶(BC-脂肪酶)、南极假丝酵母(Candida Antarctica)脂肪酶(CA-脂肪酶)和蛋白酶K在溶液中已知的水解能力，将洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶和南极假丝酵母(Candida Antarctica)脂肪酶嵌入PCL中，将蛋白酶K嵌入PLA中。15添加先前开发的四单体无规杂聚物(RHP)以纳米级分散酶。5,7RHP调节链段构象以介导酶和局部微环境之间的相互作用。5扩展的数据表1详细描述了所有共混物的组成。
纳米分散的脂肪酶加速PCL降解
在0.02-2重量％的酶负载量下，RHP-脂肪酶纳米簇均匀地分布在整个半结晶球晶中(图2A，图5A)并掺入半结晶球晶内(图2B)。RHP-BC-脂肪酶簇，尺寸为约50nm至约500nm，位于PCL片层的束之间(图2C)。具有最少量添加剂的纳米级分散体是保持主体性质的关键。小角度x射线散射(SAXS)和差示扫描量热法(DSC)显示在脂肪酶掺入后类似的PCL结晶(图5B、5C)。当脂肪酶-RHP的负载量高达2重量％时，PCL的机械性质变化小于10％(图2D)。PCL-RHP-BC-脂肪酶的弹性模量和拉伸强度类似于低密度聚乙烯(LDPE)的弹性模量和拉伸强度。包含0.02重量％BC-脂肪酶的PCL一旦浸入40℃的缓冲液中就会内部降解。在横截面扫描电子显微镜图像中可以清楚地看到内部降解期间纳米多孔结构的形成，并且当散射矢量时，由于PCL与空气之间增强的对比度，导致散射强度增加(图2E)。在分解成微塑料颗粒后(图2F)，荧光标记的BC-脂肪酶保持被包封并继续降解微塑料材料，以在24小时内达到约98％的转化率。
当降解重量损失从20％增加到80％时，在PCL-RHP-BC-脂肪酶中总PCL结晶度不变(图3A)。因此，与主要是无定形链段相反，在无定形相和结晶相两者中的PCL链段都降解。这与图2E中的SAXS结果一致，其中与片层周期性相关的峰位置不变。尽管重量损失显著，PCL分子量保持相同(图3B)。主要降解副产物是尺寸小于500Da的可再聚合小分子(图3C，图6)。经由无规断链进行PCL降解的对照实验显示宽范围的高分子量低聚物。因此，PCL-RHP-BC-脂肪酶的降解应经由持续解聚来进行。
设计酶/聚合物共混物以实现持续解聚
当BC-脂肪酶纳米簇嵌入纯PLA或PCL/PLA共混物中时，即使脂肪酶催化广泛的水解反应，也没有观察到PLA水解。35然而，当主体基体是PCL-b-PLA二嵌段共聚物(40-b-20kDa)时，PCL嵌段和PLA嵌段两者均以与母体共聚物相似的摩尔比解聚成小分子(图3D)。因此，一旦PCL链末端结合到活性位点并被BC-脂肪酶解聚，PLA嵌段就可穿梭到活性位点并随后解聚。这类似于聚腺苷酸化诱导的持续mRNA降解，10为扩展底物选择打开了有用途径。
BC-脂肪酶与加工酶共享共同的特征。23,24从其表面到催化三联体其具有深(高达2nm)、窄(在底部)的疏水裂缝，17这可促进底物聚合物链滑动，同时防止解离。与疏水结合片段相对的是六个极性残基，提供潜在的驱动力以在水解后向前拉动剩余的链(图3E，左)。一旦链末端被结合，BC脂肪酶就持续催化解聚而不释放它。23CA-脂肪酶具有表面暴露的、浅的活性位点(距离表面约1nm)，没有提供持续性的明显残基(图3E，右)。由于无规断裂是主要途径(图7A-B)，PCL-RHP-CA脂肪酶降解在约12％质量损失后停止，并且整体PCL结晶度随着降解的进行而增加。因此，酶的表面化学和活性位点的形状对调节聚合物底物结合到优先持续解聚起着重要作用。
在没有纳米级限制的情况下，BC-脂肪酶经由在溶液中的无规断链降解PCL。当BC-脂肪酶作为微米尺寸的聚集体被嵌入时，在约40％的质量损失后主体降解停止，并导致高度结晶的、持久的微塑料(图8A)。6,8,9此外，PCL-RHP-BC-脂肪酶在室温下在缓冲溶液中经历可忽略的降解，持续＞3个月，而在溶液中的BC-脂肪酶在2天内降解约30％的纯PCL。嵌入的酶和PCL链段的受阻流动性限制了初始底物的结合和解聚。
对于嵌入的BC-脂肪酶周转率为在0-3小时内约30s-1，在3小时后为约12s-1。BC-脂肪酶的周转率在具有小分子底物的溶液中为约200s-1，在具有作为底物的PCL膜的溶液中为约19s-1，在具有小分子底物的PCL-RHP-BC-脂肪酶中为约120s-1(图8B)。与溶液中的脂肪酶相比，嵌入的脂肪酶对PCL显示出相似或更高的表观活性，其中脂肪酶具有高的旋转和平移自由度以及更高的底物可用性(即与链末端相反的聚合物链段)。因此，解聚动力学主要由嵌入的酶的底物结合控制，并显著受益于链末端介导的持续解聚途径。
因此，为了实现链末端介导的持续解聚，酶应当被纳米级地限制为与聚合物链末端共存在，排除中间链段到达催化位点，并且与剩余的链末端具有吸引性相互作用以滑动聚合物链而不解离。随着持续解聚，主体以接近完全的聚合物至小分子转化降解，最终消除高度结晶的微塑料颗粒。动力学上，通过热处理和/或操作温度可以调节受益于底物穿梭和催化潜伏期的表观降解速率。
酶保护剂(RHP)调节酶稳定性
RHP有助于酶的纳米级分散，并影响局部微环境、底物可及性和可能的降解途径。设计了在溶剂/水界面的模型实验，其中界面张力用于监测酶、RHP和聚合物的分子缔合(图9A-B)。使用悬滴张力测定法，当PCL在甲苯中时，甲苯/水界面张力(γ)从36mN/m降低到27mN/m，在水中用脂肪酶时降低到约10mN/m，以及在甲苯中仅用RHP时降低到小于5mN/m。当所有三种组分都在甲苯中时，界面张力初始为27mN/m，在一段时间内保持不变，然后在平稳在约7mN/m之前迅速下降，并保持恒定。荧光标记的脂肪酶立即浓缩在甲苯/水界面(图9C)。结合张力测定数据(图9D)，RHP-脂肪酶复合物浓缩在与包裹复合物的PCL链缔合的甲苯/水界面处。随着脂肪酶降解PCL，较短的链解吸并暴露RHP-脂肪酶复合物，导致张力降低。因此，在界面处存在协同的相互作用：PCL与脂肪酶结合，RHP促进PCL导入脂肪酶，于是PCL降解并在界面处留下仅RHP/脂肪酶复合物。由于PCL在稀溶液中从脂肪酶/RHP复合物上解离的驱动力高于在熔体中的驱动力，RHP仍与PCL中的脂肪酶缔合。
RHP调节酶的微环境并提供熵稳定，使得使用熔融挤出进行酶嵌入的塑料的可规模化加工成为可能。在85℃下挤出包含约0.1重量％脂肪酶的PCL-RHP-BC-脂肪酶，以产生约1.5mm直径的细丝，该细丝在缓冲液中通过相同的持续解聚机制在36小时内完全降解(图4A)。
编程催化潜伏期
聚合物降解可以通过热处理进行编程。由于BC-脂肪酶拉动跨越结晶片层的PCL主干中的链段时，竞争力由链之间的多个成对相互作用控制，并且在临界片层厚度以上不应发生降解。事实上，具有较厚结晶片层(在49℃结晶)的PCL-RHP-BC-脂肪酶膜在37℃缓冲液中在3个月内经历可忽略的降解，而具有较薄结晶片层(在20℃结晶)的膜在24小时内的降解超过95％(图10A-B)。利用该薄层厚度依赖性在同一膜内空间上改变降解(图4B)。使用CA-脂肪酶的对照实验显示正如无规断裂途径所预期的，对热处理或片层厚度没有依赖性。
操作温度是对降解潜伏期进行编程的另一处理。结晶的链段与酶结合的构象熵损失比完全无定形的链低得多。36酶结合的高熵损失超过了链流动性增加的影响，导致在较高温度(＞43℃)下降解速率大幅降低(图4C)和最终在熔融状态(＞60℃)的PCL降解最小，尽管针对小分子底物的酶活性较高(图11)。这些结果反驳了长期以来的观点，即结晶度减缓合成聚合物18,20和天然24,37聚合物两者的酶降解，并且使得利用链末端介导的持续解聚以确保熔融加工和长期储存期间的催化潜伏期和聚合物完整性成为可能。
酶保护剂(RHP)调节催化动力学和途径
蛋白酶K容易降解PLA，但活性位点是高度表面暴露的，使得部分PLA降解伴随无规断链发生，留下高度结晶的微塑料。我们假设调节蛋白酶K结合位点和RHP之间的相互作用可以产生RHP覆盖的活性位点，以实现加工酶的特征而无需蛋白质工程化。我们实验筛选RHP，这是通过分析RHP链段疏水性38(图12A-D)和蛋白酶K活性位点的表面化学(图13A)来指导的。两种亲水单体，25％的低聚(乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯)(OEGMA)和5％的甲基丙烯酸磺丙酯钾盐(SPMA)的组成保持不变，两种疏水单体，甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸乙基己酯(EHMA)的组成变化。当使用具有20:50MMA0:EHMA组成的RHP时，PLA容易解聚成小分子副产物，而没有任何可观察到的分子量变化或中等分子量副产物的形成(图4D，红色，图13B)。在DCM/水界面处的张力测定研究证实了蛋白酶K/RHP复合和在复合早期阶段的PLA结合(图13C)。这表明RHP与酶表面结合，以通过与蛋白酶K形成杂化“结合袋”来促进持续性并在PLA链中穿梭。然而，当使用具有50:20和60:10MMA:EHMA组成的RHP时，尽管针对小分子酯具有高活性，但在缓冲液中1个月后观察到具有仅约10％的质量损失的最小的PLA解聚。类似地，RHP组成也影响PCL的解聚速率(图4D，蓝色)。因此，除了作为酶保护剂，RHP可被设计为调节底物结合和活性位点的可用性，这是指导酶活性位点工程的有用处理。39实验上，当具有3重量％的RHP的1.5重量％的蛋白酶K被嵌入时，约80重量％的PLA在37℃的缓冲液中在1周内解聚。包含酶的PCL和PLA两者在工业土壤堆肥中均显示加速的解聚(图4E)，并且在工业堆肥设施的操作温度范围内，膜在几天内明显分解(PCL在40℃下2天，PLA在50℃下6天)。
嵌入的氧化酶不能达到烃底物
除了合成催化剂之外，22烃的生物催化由于其已知的效率、选择性和可编程性是高度期望的。31然而，与酶相比，主要报道了使用微生物的聚烯烃降解。21聚烯烃降解经常由侧链改性诸如氧化引发。为了探究瓶颈，将来自白腐真菌的锰过氧化物酶和来自变色栓菌的漆酶嵌入具有介体和不具有介体的聚乙烯或聚苯乙烯中(吐温80用于锰过氧化物酶，羟基苯并三唑用于漆酶)。在30℃或60℃的丙二酸盐缓冲液中两周后，通过红外光谱和凝胶渗透色谱没有观察到任何酶-聚烯烃共混物的变化。为了生物安全，这些结果是可靠的并且是塑料废物已知寿命的预期结果。然而，基于比色测定，两种酶在塑料内部都保持高度活性，证实了扩散反应性自由基的形成(图13D)。张力测定研究证实了RHP与两种酶之间的复合，但没有证实酶与聚烯烃之间的复合(图13E)。结果表明，产生的自由基不能到达聚烯烃底物，最可能是由于有限的扩散、反应性自由基寿命不足以及穿过酶和烃链之间的界面层的能量势垒。
我们的技术使得制造具有与塑料熔融加工相容的可编程寿命周期的功能塑料成为可能。考虑到合成生物学和可生物降解塑料生产的最新进展，14,34,39调节嵌入的酶的生物催化可提供对反应途径、动力学、潜伏期和高价值副产物的产生的分子控制。
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部分M1.在聚酯中嵌入无规杂聚物-酶
来自洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)的Amano PS脂肪酶(BC-脂肪酶)、南极假丝酵母(Candida Antarctica)脂肪酶B(CA-脂肪酶)和来自Tritirachiumalbum的蛋白酶K购自Sigma Aldrich。按照已建立的程序纯化BC-酶溶液。40蛋白酶K通过使用10000克/摩尔分子量截留过滤器在离心机中以6000rcf旋转3个总循环来纯化。使用在280nm处的紫外-可见吸光度确定纯化的脂肪酶和蛋白酶K原液的浓度。所有样品的详细信息列于表S1中。
合成了无规杂聚物(RHP)(70KDa，PDI＝1.55)。5除非另有说明，否则所用的单体摩尔组成为50％甲基丙烯酸甲酯(MMA)，20％甲基丙烯酸2-乙基己酯(EHMA)，25％低聚(乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯)(OEGMA；Mn＝500克/摩尔)和5％甲基丙烯酸3-磺丙酯钾盐(SPMA)。RHP被称为MMA:EHMA:OEGMA:SPMA＝0.5:0.2:0.25:0.5。使用两种RHP变体进行图4E中所述的实验，其组成分别为MMA:EHMA:OEGMA:SPMA＝0.6:0.1:0.25:0.05和MMA:EHMA:OEGMA:SPMA＝0.2:0.5:0.25:0.05。
将RHP和酶在水溶液中混合，在液氮中快速冷冻，并冻干过夜。将干燥的RHP-酶混合物直接重新悬浮于指定的聚合物溶液或熔体中。将RHP与纯化的BC-脂肪酶以80:1的质量比混合(总聚合物基体质量＝98.4％)。对于商业BC-脂肪酶和CA-脂肪酶共混物，RHP与共混物的重量比保持在2:1(总聚合物基体质量＝95.5％)。对于PLA中的蛋白酶K，使用2:1的RHP:酶比例(总聚合物基体质量＝95.5％)。
PCL(80KDa)和PLA(85-160KDa)购自Sigma Aldrich，无需进一步纯化即可使用。为了制备溶液浇铸膜，将PCL(或PLA)以4重量％的浓度溶解在甲苯(或二氯甲烷)中，并搅拌至少4小时以确保完全溶解。将干燥的RHP-酶复合物在室温下以指定的酶浓度直接重新悬浮于聚合物溶液中。在直接浇铸到玻璃板上之前，将混合物涡旋约5分钟。将PCL膜风干，将PLA膜在玻璃皿下干燥，以防止因二氯甲烷的挥发性而导致的快速溶剂蒸发。
为了探究酶分布，对脂肪酶进行荧光标记。按照制造商的程序，使用NHS-荧光素(5/6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)标记脂肪酶并除去过量的染料。使用具有460-490nm激发波长的A U-MWBS3反射镜单元拍摄荧光显微图像。在JEOL 1200显微镜上以120kV加速电压拍摄TEM图像。使用来自0.5重量％四氧化钌溶液的蒸汽对RHP-脂肪酶和无定形PCL结构域进行染色。
部分M2.铸态塑料的表征
使用动态光散射(DLS)获得在甲苯中的复合物的粒度。分别经由差示扫描量热法(DSC)和拉伸测试来探究酶嵌入的聚酯的结晶度和机械性质。对于DSC，将约5mg PCL膜压入铝盘中并以2℃/min的扫描速率从25℃加热至70℃。为了定量结晶度百分比，将样品的熔融焓标准化为151.7J/g，即100％结晶PCL的熔融焓。41对于单轴拉伸测试，将PCL溶液直接浇铸在具有标准狗骨形状的定制设计的特氟隆模具中。对于小角度x射线散射(SAXS)研究，将约300μm厚的膜浇铸在特氟隆烧杯中。样品在降解后真空干燥16小时，然后在高级光源(ALS)下在光束线7.3.3处运行SAXS。使用具有波长和2s暴露时间的X射线。使用高速Pilatus 2M检测器检测散射的X射线强度分布。图像被绘制为强度(I)相对于q，其中q＝(4π/λ)sin(θ)，λ是入射X射线束的波长，2θ是散射角。使用具有Nika程序包的Igor Pro提取SAXS图的扇区平均轮廓。使用相同的SAXS方法分析降解过程不同时间点的样品的纳米多孔结构，如图2E所示。为了获得图2E插图所示的横截面SEM图像，在液氮中冲洗和破碎降解的膜。然后将该膜安装在SEM短柱上，并在成像之前用铂溅射涂覆。
部分M3.酶嵌入的PCL降解的表征
在指定温度下，在磷酸钠缓冲液(25mM，pH 7.2)中进行降解。通过干燥剩余的膜并在天平上测量质量来确定质量损失。在24小时后，通过积分凝胶渗透色谱(GPC)峰估计质量损失。图2F所示的微塑料实验在40℃下用在3mL缓冲液中的约5mg PCL-RHP-BC-脂肪酶膜(0.02重量％酶)进行。用荧光标记的酶进行相同的实验。
在0-5小时的每个时间点，干燥PCL-RHP-BC-脂肪酶剩余膜，并经由DSC分析以确定结晶度。为了分析降解副产物，将小瓶冻干过夜，然后重新悬浮于用于GPC或LCMS的适当溶剂中。使用在THF中的总浓度为2mg/mL的剩余膜和副产物进行GPC测量。将20μL溶液注入Agilent PolyPore 7.5×300mm柱中；将溶液中BC-脂肪酶的GPC谱标准化到溶剂前沿。使用Agilent InfinityLab EC-C18，2.7μm柱，通过将降解上清液重新悬浮于乙腈/水(67/33体积％)中，获得液相色谱-质谱(LC-MS)测量。用约0.15mg/mL总BC-脂肪酶共混物浓度进行表面侵蚀的对照实验。图3C所示的质谱是色谱图(图6)中看到的主峰的组合。在经由相萃取和过滤从酶和缓冲盐中回收降解的PCL副产物后，使用先前报道的方法42将副产物重新聚合作为概念验证。
部分M4.酶活性位点影响通过被限制的酶的降解
将RHP-BC-脂肪酶嵌入与纯PLA共混的PCL-b-PLA去嵌段共聚物中用于测试，因为二嵌段本身太脆而不能在干燥后形成独立的膜。该膜由9重量％PCL-b-PLA(购自PolymerSource)+4重量％纯PLA在二氯甲烷中的溶液浇铸而成。允许膜在40℃缓冲液中降解24小时，并使用NMR分析副产物。对于没有任何共混的纯PLA均聚物的自制PCL-b-PLA二嵌段共聚物(基于NMR分析的10k-b-8k)获得了类似的结果。
BC-脂肪酶和CA-脂肪酶的结晶结构分别取自蛋白质数据库中的条目3LIP和1TCA。使用条目3PRK进行蛋白酶K活性位点的分析。疏水残基(灰色)定义为下列氨基酸：丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸。天冬氨酸和谷氨酸被定义为阴性残基(红色)，而赖氨酸、精氨酸和组氨酸被定义为阳性残基(蓝色)。剩余的残基被认为是极性不带电荷的残基(紫色)。按照与用于BC-脂肪酶-嵌入的膜相同的程序进行PCL-RHP-CA-脂肪酶膜(在37℃缓冲液中降解)上的GPC。
部分M5.限制影响降解途径：纳米级相对于微观相对于表面侵蚀
在1mL和1L容器中进行降解，同时每几小时摇动容器以证明酶浸出和扩散的效果。PCL-RHP-BC-脂肪酶在两种体积中都类似地降解(24小时内≥95％降解)，这与内部降解和有限的酶浸出一致。
将纯PCL膜置于1L缓冲液中，该缓冲液中总脂肪酶的质量与PCL-RHP-脂肪酶膜中存在的总脂肪酶的质量相等。纯PCL膜在1L缓冲液中一周内表现出可忽略的降解，而在具有相同酶质量的1mL缓冲液中纯PCL膜在1天内损失约80％的质量。该缓冲液体积依赖性是预期的，因为酶必须扩散到塑料表面以水解塑料。
为了模拟在先前的文献中详细描述的实验用于比较，6,8将吐温80与纯化的脂肪酶以1:1的质量比混合，冻干，并重新悬浮于PCL/甲苯中以浇铸膜。在1L缓冲液中，具有吐温80嵌入的酶的膜在与PCL-RHP-BC-脂肪酶相同的酶负载量下在1天内降解约40％，然后停止降解(监测超过1周)，而在1mL缓冲液中，小分子嵌入的膜与RHP嵌入的膜类似地降解(在24小时内≥95％)。这种对缓冲液体积的依赖性表明，先前文献中报道的小分子表面活性剂嵌入的酶实验表现出显著的浸出，并且在大体积中，这种酶浸出阻止了完全的聚合物降解。
部分M6.BC-脂肪酶在具有不同底物的不同环境中的动力学分析
M6.1被限制的BC-脂肪酶与PCL底物：使用图2A中所示的降解图的斜率来估计在37℃下被限制的脂肪酶的降解速率。获得两个不同的斜率(0-3小时和3-5小时)并且速率在3小时左右变化。周转率通过用每秒断裂的PCL键的数量除以膜中脂肪酶分子的总数来确定，假设基于LC-MS副产物分析的平均三聚体PCL副产物。
M6.2溶解的BC-脂肪酶与PCL底物：将纯PCL膜(每个约5mg)置于包含约1μg脂肪酶的1mL缓冲液(37℃)中，以模拟来自被限制的脂肪酶的降解实验的浓度。本文提供的周转率也通过假设三聚体副产物来确定，这可以代表上限，因为表面侵蚀可以通过无规断裂发生(由于每次键断裂损失更多的质量，所以每次键断裂产生的更大的低聚物将起到降低表观周转率的作用)。
M6.3溶解并被限制的BC-脂肪酶与小分子底物：使用相同的小分子测定来定量溶解的并被限制的BC-脂肪酶的活性。在进行测定之前，将4-硝基苯基丁酸酯溶解于在每种底物浓度下的缓冲液中以排除可溶性脂肪酶的界面效应。经由紫外-可见光定量活性以监测水解的副产物在410nm处在10分钟内的吸光度。副产物的消光系数估计为16500M-1cm-1。使用PRISM软件拟合作为底物浓度的函数的活性，以获得Vmax，即在饱和底物浓度下的理论最大反应速率。通过将每质量转化为每脂肪酶分子，将Vmax转化为周转率。使用相同的小分子测定来定量PCL中被限制的脂肪酶的活性。
部分M7.动态界面张力实验以探究PCL-RHP-脂肪酶相互作用
使用甲苯和水相之间的界面张力来探究共混物。用1mL注射器通过1.27mm直径的针头分配MilliQ水小滴，并将其浸入甲苯中。每秒用CCD照相机捕获小滴形状，并用杨氏-拉普拉斯方程拟合，以获得界面张力。对于每个样品，测量重复三次，并且显示出良好的一致性和再现性。
将RHP-脂肪酶以10-1质量比混合，并冻干以除去水性溶剂。与实际降解研究相比，这里使用不同的比例，因为80-1RHP-脂肪酶由于高的RHP界面活性导致不稳定的小滴，妨碍了精确的测量。首先将PCL以0.5mg/mL的浓度溶解在甲苯中。然后使用PCL/甲苯溶液直接分散RHP-脂肪酶，使在甲苯中RHP的最终浓度为0.005mg/mL，脂肪酶的最终浓度为0.0005mg/mL。在所有组中各组分的浓度是固定的。在所有三种组分(PCL、RHP和脂肪酶)分散在甲苯中之后，将水小滴浸入甲苯中。
为了确定单独的PCL是否能将脂肪酶分散在甲苯中，将荧光标记的脂肪酶溶解在水相中(0.75mg/mL浓度)，同时将PCL溶解在甲苯相中(0.5mg/mL)。两个相的荧光强度在3小时内没有变化(数据未显示)，表明单独PCL不能经由水/甲苯界面将脂肪酶分散在甲苯中。
部分M8.熔融加工、热处理和操作温度以编程降解
首先使用商业研磨机将PCL(10000克/摩尔)研磨成细粉。将RHP-脂肪酶干燥粉末(1-1质量比)与PCL粉末混合，所有三种组分再次通过商业研磨机。然后将PCL-RHP-脂肪酶粉末置于单螺杆台式挤出机中，转速为20RPM，挤出温度为85℃。熔融挤出的PCL-RHP-脂肪酶细丝以相同的加工机制降解，如GPC和LCMS所证实的。
对于热处理，将PCL-RHP-脂肪酶膜浇铸在显微镜载玻片上，置于80℃的热板上5分钟以确保完全熔融，并在指定温度下结晶高达3天以确保完全重结晶。
为了确定降解对操作温度的依赖性，将PCL-RHP-BC-脂肪酶溶液浇铸膜置于在指定温度下的缓冲液中。对于铸态膜，从20℃至约43℃的升温导致降解速率增加。然而，温度的进一步增加导致降解速率降低。为了排除酶变性，在给定温度下利用部分M5中描述的相同小分子测定。在每个温度下运行仅0.5mM酯溶液的对照，以确保酯在给定的测量时间内不会自水解。对小分子的活性在43℃以上显著增加，排除了变性作为高温下PCL降解减少的原因。
部分M9.具有不同组成的RHP使PLA解聚并调节嵌入的酶活性成为可能
筛选RHP的组成以确定RHP-酶相互作用对通过嵌入的酶解聚的影响。基于通过模拟RHP序列确定的链段疏水性选择三种组成。简言之，RHP序列是用组分漂移(Compositional Drift)产生的。43使用亲水-亲油平衡(HLB)值通过基团贡献理论来评价单体侧链的溶解度。使用等式HLB＝7+∑i ni HLBi，其中ni是具有相应值HLBi的分子中第i个化学基团的数目。每个单体侧链的HLB值估计为：HLB(MMA)＝8.45，HLB(EHMA)＝5.12，HLB(OEGMA)＝11.4以及HLB(SPMA)＝18.5。较低的HLB值表示较高的疏水性，较高的HLB值是指较大的亲水性。创建Python编程以连续计算从模拟的RHP链的α末端到ω末端滑动的窗口的平均链段HLB值。窗口每次前进一个单体。我们使用包含奇数单体的跨度，并将该跨度的平均HLB值分配给其中间单体。窗口尺寸9用作中间链段区域尺寸。产生亲水性图以使对于每种RHP组成和窗口尺寸的无规取样序列可视化。设定HLB-阈值＝9以区分疏水链段和亲水链段。然后，对沿着链的位置的序列以及模拟批次中所有15000个序列两者进行平均，以对平均链段(窗口)疏水性进行批次间比较。
使用RHP(0.005mg/mL)-蛋白酶K(0.0025mg/mL)、PLA和二氯甲烷进行与部分M7中概述的那些类似的张力测量实验。PLA显示出很小的界面活性。对于20:50MMA:EHMA RHP，PLA的添加可测量地降低RHP的界面活性。50:20MMA:EHMA RHP在有PLA或没有PLA的情况下具有类似的界面活性。
部分M10.在ASTM堆肥或自来水中的解聚
将PCL-RHP-BC-脂肪酶膜置于自来水中或家用堆肥装置中。对于水，将膜浸入在来自水槽的100mL自来水中，并且在指定温度下在24小时(＜95％)内同样地进行降解。土壤购自当地堆肥设施。通过将已知的土壤质量在设定为110℃的烘箱中过夜，然后称重剩余的物质质量，来确定土壤的总的干燥有机重量。向土壤中添加水以达到50或60％的总水分含量，与ASTM标准一致。对于PCL-RHP-BC-脂肪酶，在40℃的堆肥装置中，分别在2天和4天后观察到高达40％的质量损失和70％的质量损失。对于PLA-RHP-蛋白酶K，在50℃土壤堆肥中，在5天后，对于40KDa PLA发生约34％的质量损失，对于85-160KDa PLA发生约8％的质量损失。
部分S11.嵌入聚烯烃中的氧化酶
来自白腐真菌的锰过氧化物酶和来自变色栓菌的漆酶购自Sigma，并如购买的那样使用。将RHP(50:20MMA:EHMA)与任一种酶以4:1的比例混合。两种酶都嵌入聚乙烯(Mw＝35KDa)或聚苯乙烯(Mn＝260KDa)中。对于聚乙烯，通过由5重量％的甲苯溶液的溶液浇铸或在95℃下由聚乙烯粉末的熔融压制来嵌入酶。对于聚苯乙烯，通过直接重新悬浮在10重量％聚苯乙烯的二氯甲烷溶液中来嵌入酶。酶用和不用介体嵌入(对于锰过氧化物酶是吐温80，对于漆酶是羟基苯并三唑)。然后将膜置于30℃或60℃丙二酸盐缓冲液(pH 4.5)中长达两周。在干燥膜之后，使用红外光谱法和GPC，并且对于任何酶-聚烯烃系统，没有观察到变化。
为了证实酶在嵌入聚烯烃中后仍然是活性的，将膜浸入小分子2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)在丙二酸盐缓冲液中的1mM溶液中。对于锰过氧化物酶和漆酶两者，溶液都变成深蓝色，证明嵌入的酶保留了大部分的活性。在与PCL/脂肪酶概述的相同装置和浓度下，使用RHP-锰过氧化物酶或RHP-漆酶与或与PS在甲苯中进行张力测定测试。具有两种酶的RHP-酶簇在存在PS或不存在PS的情况下达到相同的最终界面张力，并且最终界面张力没有滞后期或变化，这表明PS链不与酶强烈相互作用。
在方法部分中使用的另外的参考文献：
40.Bornscheuer,U.et al.Lipase of Pseudomonas-Cepacia forBiotechnological Purposes-Purification,Crystallization andCharacterization.Bba-Gen Subjects 1201,55-60,doi:10.1016/0304-4165(94)90151-1(1994).
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43.Smith,A.A.A.,Hall,A.,Wu,V.&Xu,T.Practical Prediction ofHeteropolymer Composition and Drift.Acs Macro Lett 8,36-40,doi:10.1021/acsmacrolett.8b00813(2019).
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Claims (19)

1.一种塑料的可编程降解的方法，所述方法包括提供包含聚合物、包含位点的酶的纳米级分散体和酶保护剂的塑料，其中活性位点和酶-保护剂相互作用被配置成提供作为主要降解途径的聚合物的持续解聚，其具有扩展的底物选择性，并在一定条件下孵育塑料以实现聚合物的基本完全解聚，而没有伴随部分聚合物降解的大量微塑料形成。
2.权利要求1所述的方法，其中：(a)所述酶为脂肪酶，所述聚合物/底物为聚(己内酯)(PCL)，脂肪酶表面提供对聚合物/底物的亲和力，并且活性位点具有相对窄的深入口。
3.权利要求1所述的方法，其中：(b)所述酶为蛋白酶K，所述聚合物/底物为聚(乳酸)(PLA)，并且活性位点相对较浅并且是暴露的。
4.权利要求1所述的方法，其中：(c)所述保护剂包含无规杂聚物(RHP)，其被配置成纳米级分散酶和/或调节酶的活性或稳定性。
5.权利要求1所述的方法，其中：(d)酶表面、保护剂和聚合物/底物形成复合物，以将底物夹在酶和保护剂之间。
6.权利要求1所述的方法，其中：(e)所述聚合物是半结晶聚酯。
7.权利要求1所述的方法，其中：(f)所述纳米级分散体占约0.001至5重量％或0.01至1.5重量％。
8.权利要求1所述的方法，其中：(g)所述酶为水解酶，诸如脂肪酶或蛋白酶。
9.权利要求1所述的方法，其中：(h)所述解聚发生在水或堆肥中。
10.权利要求1所述的方法，其中：(i)所述解聚在少于1、2、5或10天内发生，如在水中，或在少于30、60或90天内发生，如在堆肥中。
11.权利要求1所述的方法，其中：(j)所述解聚在10-60℃，或30-60℃，或约37-40℃的温度下发生，其中通过调节材料性质，诸如降低结晶片层厚度，促进较低温度(如10-30℃)解聚。
12.权利要求1所述的方法，其中：(k)所述聚合物为聚酯，所述酶包含与聚酯骨架匹配的活性位点。
13.权利要求1所述的方法，其中：(l)所述塑料包含在聚(己内酯)(PCL)中的脂肪酶。
14.权利要求1所述的方法，其中：(m)所述塑料包含在聚(乳酸)(PLA)中的蛋白酶。
15.权利要求1所述的方法，其中：(n)所述酶是加工酶，其具有从其表面到催化位点的深(如约1-4nm，或约2nm)、窄(如在底部约或/>或约/>)的疏水裂缝，以促进底物聚合物链滑动，同时防止解离。
16.权利要求1所述的方法，其中：(o)所述纳米级分散的酶具有深活性位点，并且所述聚合物是主要经由链末端介导的持续解聚降解的半结晶聚酯，所述链末端介导的持续解聚具有可编程的催化潜伏期和材料完整性。
17.权利要求1所述的方法，其中：(p)所述酶具有表面暴露的活性位点，并且所述方法通过工程化酶、保护剂和聚合物的复合物实现持续解聚(持续性)。
18.权利要求1所述的方法，其中：(q)在标准土壤堆肥或家庭自来水中，包含少于2重量％酶的聚己内酯和聚(乳酸)在几天内以高达98％的聚合物至小分子转化率解聚，消除了在堆肥设施中分离和填埋其产物的需要，例如在水中少于1、2、5或10天，或例如在堆肥中少于30、60或90天。
19.一种用于塑料的可编程降解的系统，其包含含有聚合物、含有位点的酶的纳米级分散体和酶保护剂的塑料，其中活性位点和酶-保护剂相互作用被配置成提供作为主要降解途径的聚合物的持续解聚，其具有扩展的底物选择性以实现聚合物的基本上完全解聚，而没有伴随部分聚合物降解的大量微塑料形成。
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