CN117106771A - 一种从链霉亲和素磁珠上洗脱生物素标记核酸的方法 - Google Patents

一种从链霉亲和素磁珠上洗脱生物素标记核酸的方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供一种从链霉亲和素磁珠上洗脱生物素标记核酸的方法，属于生物技术领域。本申请通过优化链霉亲和素磁珠洗脱液的组分和浓度，并结合高温处理，可有效提高核酸的释放效率。

Description

一种从链霉亲和素磁珠上洗脱生物素标记核酸的方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种从链霉亲和素磁珠上洗脱生物素标记核酸的方法。
背景技术
染色质免疫沉淀(ChIP)是广泛用于研究蛋白质与DNA相互作用的方法，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与大规模平行DNA测序技术相结合，可以让研究者精确绘制感兴趣蛋白的全局DNA结合位点。若只想研究特定蛋白和特定位点的相互作用，则可将ChIP与qPCR检测方法相结合。ChIP的基本流程是：(1)交联：采用甲醛固定组织或细胞，使DNA与蛋白质紧密结合；(2)片段化：该过程破坏染色质，最终获得用于ChIP分析的DNA片段与蛋白复合物；(3)染色质免疫沉淀：通过加入针对目的蛋白的抗体，结合靶蛋白-DNA复合物；(4)DNA回收和纯化：回收纯化富集的DNA片段，通过下游检测技术(定量PCR、基因芯片、测序等)分析靶标蛋白特异结合的DNA序列信息(Park P.J.,etal.ChIP-seq:advantages and challenges of amaturing technology.Nat RevGenet.2009；10:669-680.)。然而，因ChIP技术需要对组织或细胞进行甲醛交联，然后再进行DNA片段化，这使得该技术需要极高的细胞起始投入量(百万级)，并且很可能因为甲醛过度交联使实验结果存在假阳性。
为了弥补ChIP的技术缺陷，研究者通过不断的更新与优化，开发了CUT&RUN(Cleavage Under Targets&Release Using Nuclease)技术和CUT&Tag(CleavageUnderTargets&Tagmentation)技术。CUT&Tag以及CUT&RUN是研究生物活体细胞中蛋白质与DNA相互作用的技术(Skene,P.J.&Henikoff,S.An efficient targeted nucleasestrategy for high-resolution mapping ofDNA binding sites.2017；eLife 6,e21856.；Kaya-Okur HS.,et al.CUT&Tag for efficient epigenomic profiling ofsmall samples and single cells.Nat Commun.2019；10(1):1930.)，其通过抗体富集TN5转座酶或Mnase核酸酶，特异切割目的蛋白附近的DNA，再通过对切割后标记的DNA进行文库构建和测序就可以绘制目的蛋白全局的DNA结合位点。该技术因为不需要交联和物理打断DNA，一定程度的缓解了ChIP技术假阳性和高细胞投入量的缺点。并且由于CUT&Tag不需要接头连接等建库操作，节省了大量的时间成本。
虽然CUT&Tag技术相较ChIP有明显提升，但是因为CUT&Tag技术基于TN5酶在目的片段插入扩增接头，其回收全基因组后，通过特殊扩增引物获得靶点DNA片段。CUT&Tag无法直接通过提取获得目的片段，导致CUT&Tag技术目前并不能兼容qPCR检测方式，这限制了CUT&Tag技术的广泛应用。
国际上虽然有通过将TN5接头进行Biotin修饰，再用SA磁珠特异回收TN5酶作用片段的方式，但是其是通过带SA磁珠进行文库扩增，并不兼容qPCR检测(Wei Y,etal.Optimization ofCUT&Tag product recovery and library construction method.YiChuan.2021Apr 20；43(4):362-374.)。
发明内容
本申请的目的在于提供一种从链霉亲和素磁珠上洗脱生物素标记核酸的方法。本申请的方法通过使用包含甲酰胺和SDS的洗脱液，能够提高链霉亲和素磁珠的核酸释放效率。进一步地，本申请还优化了CUT&Tag磁珠回收过程中的结合缓冲液，能够中和前端杂质对qPCR检测方法的抑制，使其能够充分兼容qPCR检测，进而大大提高研究效率和CUT&Tag技术的应用范围。
本申请的第一方面提供一种从链霉亲和素磁珠上洗脱生物素标记核酸的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)向结合有生物素标记核酸的链霉亲和素磁珠中加入洗脱液，所述洗脱液包含甲酰胺和十二烷基硫酸钠(SDS)；
(2)混匀，孵育；
(3)外加磁场，收集上清。
在一些实施方案中，所述孵育是室温孵育，例如室温孵育5-30min，例如室温孵育10-25min，包括所述范围内的10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min和25min。
在一些实施方案中，所述步骤(2)还包括在孵育后进行80-95℃热处理，优选85-95℃，包括所述范围内的85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃和95℃。
在一些实施方案中，所述热处理包括80-95℃处理1-10min，包括所述范围内的1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min和10min。
在一些实施方案中，所述热洗脱是通过水浴加热。
在一些实施方案中，所述甲酰胺的浓度是5-30mM，优选5-20mM，包括所述范围内的5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM和20mM。
在一些实施方案中，所述SDS的浓度(质量体积比，1％＝1g/100ml)是0.1％-10％，优选0.5％-10％，包括所述范围内的0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％和10％。
在一些实施方案中，所述洗脱液不包含柠檬酸盐缓冲液(SSC，salinesodiumcitrate)，或所述洗脱液不包含Denhardt's溶液，或所述洗脱液不包含SSC和Denhardt's溶液。
在一些实施方案中，所述生物素标记核酸是指核酸的一个或多个核苷酸上含有生物素标记，所述生物素与碱基共价连接。
在一些实施方案中，所述生物素标记核酸的3'末端和/或5'末端的核苷酸上含有生物素标记。
在一些实施方案中，所述生物素标记核酸是生物素标记的单链DNA、生物素标记的双链DNA、生物素标记的RNA或生物素标记的DNA-RNA杂合体。
本申请的第二方面提供一种蛋白质-DNA互作的片段捕获方法，所述方法包括如下步骤：
(1)收集细胞样本，透化，加入靶蛋白结合一抗和二抗进行孵育，所述靶蛋白结合一抗与靶蛋白结合，所述二抗与靶蛋白结合一抗结合；
(2)加入转座酶复合物，进行片段化反应从而获得片段化的DNA；其中所述转座酶复合物包含能够与二抗结合的基团或物质、转座酶、以及含有转座酶识别核心序列和标签序列的寡核苷酸；所述能够与二抗结合的物质例如是ProteinA、Protein G或ProteinAG，所述寡核苷酸上含有生物素标记；
(3)使用链霉亲和素磁珠结合片段化的DNA；
(4)使用第一方面所述的方法洗脱片段化的DNA。
在一些实施方案中，所述生物素标记在所述寡核苷酸上的一个或多个核苷酸，优选3'末端和/或5'末端的核苷酸。
在一些实施方案中，所述转座酶识别核心序列的3'末端和/或5'末端含有生物素标记，所述标签序列的3'末端和/或5'末端含有生物素标记。
在一些实施方案中，所述含有转座酶识别核心序列和标签序列的寡核苷酸包埋在转座酶上。
在一些实施方案中，所述转座酶复合物对靶基因进行切割，同时将其包埋的生物素标记的转座酶识别核心序列和标签序列插入到被切割的靶基因两端，获得生物素标记的片段化的DNA。
在一些实施方案中，所述透化包括加入细胞透化剂，例如洋地黄皂苷。
在一些实施方案中，所述方法还包括纯化片段化的DNA，所述纯化是例如磁珠法、离心柱法或离子交换树脂法，优选磁珠法。
在一些实施方案中，所述磁珠法纯化包括将磁珠和片段化的DNA在磁珠结合缓冲液中孵育。
在一些实施方案中，所述磁珠结合缓冲液包括Triton X-100、Tween-20和PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)。
在一些实施方案中，所述PBS缓冲液包含137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4和2mM KH2PO4。
在一些实施方案中，所述Triton X-100的浓度(体积分数)是0.01-10％，优选0.01-5％，包括所述范围内的0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、1.8％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％和5％。
在一些实施方案中，所述Tween-20的浓度(体积分数)是0.01-10％，优选0.01-5％，包括所述范围内的0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、1.8％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％和5％。
本申请的第三方面提供一种蛋白质-DNA互作的检测方法，所述方法包括如下步骤：
(1)使用第二方面所述的方法捕获DNA片段；
(2)以所述DNA片段为模板进行qPCR扩增。
在一些实施方案中，所述qPCR扩增在包含DNA聚合酶、dNTP、引物、缓冲液以及探针和/或荧光染料的体系中进行。
本申请的第四方面提供一种蛋白质-DNA互作基因文库的构建方法，所述方法包括如下步骤：
(1)使用第二方面所述的方法捕获DNA片段；
(2)对所述DNA片段连接测序接头；
(3)任选地，对接头连接后的产物进行纯化和/或扩增。
在一些实施方案中，所述连接测序接头包括加入与标签序列匹配并带有接头序列的引物，通过PCR扩增得到带有测序接头的DNA片段。
在一些实施方案中，所述引物包括带有第一接头序列的第一引物和带有第二接头序列的第二引物。
在一些实施方案中，所述接头序列是当前或将来测序平台(包括但不限于iontorrent平台、illumina平台和华大平台)使用的测序基质相关序列。
在一些实施方案中，所述第一接头序列是Illumina平台的P5接头序列，所述第二接头序列是Illumina平台的P7接头序列，反之亦然。
在一些实施方案中，所述第一接头序列是ion torrent平台的P1衔接头序列，所述第二接头序列是ion torrent平台的A衔接头，反之亦然。
在一些实施方案中，所述第一接头序列是MGI平台的单端标签建库上游夹板序列，所述第二接头序列是MGI平台的单端标签建库下游夹板序列，反之亦然。在一些实施方案中，所述第一接头序列是MGI平台的双端标签建库上游夹板序列，所述第二接头序列是MGI平台的双端标签建库下游夹板序列，反之亦然。
在一些实施方案中，所述引物还包括索引序列(index)。在一些实施方案中，所述索引序列为例如6-8个碱基，优选8个。
在一些实施方案中，所述第一引物是N5引物，所述第二引物是N7引物，反之亦然。
在一些实施方案中，所述纯化是例如磁珠法、离心柱法或离子交换树脂法，优选磁珠法。
本申请的第五方面提供一种蛋白质-DNA互作的检测方法，所述方法包括对第本申请第四方面构建的文库进行测序。
本申请的第六方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括生物素化的转座酶复合物、链霉亲和素磁珠和链霉亲和素磁珠洗脱液，所述链霉亲和素洗脱液包含甲酰胺和十二烷基硫酸钠(SDS)。
在一些实施方案中，所述生物素化的转座酶复合物包括转座酶和生物素标记的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括转座酶识别核心序列和标签序列。
在一些实施方案中，所述生物素标记在所述寡核苷酸上的一个或多个核苷酸，优选3'末端和/或5'末端的核苷酸。
在一些实施方案中，所述转座酶识别核心序列的3'末端和/或5'末端含有生物素标记，所述标签序列的3'末端和/或5'末端含有生物素标记。
在一些实施方案中，所述甲酰胺的浓度是5-30mM，优选5-20mM，包括所述范围内的5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM和20mM。
在一些实施方案中，所述SDS的浓度(质量体积比)是0.1％-10％，优选0.5％-10％，包括所述范围内的0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％和10％。
在一些实施方案中，所述洗脱液不包含柠檬酸盐缓冲液(SSC，salinesodiumcitrate)，或所述洗脱液不包含Denhardt's溶液，或所述洗脱液不包含SSC和Denhardt's溶液。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括磁珠结合缓冲液，所述磁珠结合缓冲液包括Triton X-100、Tween-20和PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)。
在一些实施方案中，所述PBS缓冲液包含137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4和2mM KH2PO4。
在一些实施方案中，所述Triton X-100的浓度(体积分数)是0.01-10％，优选0.01-5％，包括所述范围内的0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、1.8％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％和5％。
在一些实施方案中，所述Tween-20的浓度(体积分数)是0.01-10％，优选0.01-5％，包括所述范围内的0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、1.8％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％和5％。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括细胞透化剂、靶蛋白结合一抗、二抗、抗体孵育缓冲液、转座酶反应缓冲液、漂洗液、ConA磁珠、DNA纯化磁珠、聚合酶、扩增缓冲液、扩增引物以及无核酸酶水中的一种或多种。其中，磁珠、DNA纯化磁珠、扩增引物、一抗、二抗和无核酸酶水可以存在或者不存在于试剂盒中，即外部提供。
附图说明
图1：上清液、Control Stop buffer以及Stop buffer1-8对Bio-DNA-1的释放效率对比；
图2：Stop buffer3-1、Stop buffer4-1、Stop buffer5-1、Stop buffer6-1和Stopbuffer6的释放效率对比；
图3：Stop buffer6、Stop buffer11、Stop buffer12、Stop buffer13和Stopbuffer14的释放效率对比；
图4：上清液、Control Stop buffer以及Stop buffer1-8分别对Bio-DNA-1和Bio-DNA-2的释放效率对比；
图5：Control Stop buffer和Stop buffer6分别与不同的磁珠孵育缓冲液对CUT&Tag for qPCR的△△CT值影响。
具体实施方式(实施例)
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本申请的技术方案，但下述的实例仅仅是本申请的简易例子，并不代表或限制本申请的权利保护范围，本申请的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
实施例1
1.构建Biotin修饰的核酸片段：在生工生物合成带biotin修饰的核酸片段：长度为300bp-400bp，具体序列如下。在核酸的两端分别引入1个Biotin修饰，稀释至20ng/μl备用，记为Bio-DNA-1。
Bio-DNA-1序列(SEQ ID NO.1)：
5'-Bio-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGATAACTCAATGTTGGCCTGTATAGCTTCAGTGATTGCGATTCGCCTGTCTCTGCCTAATCCAAACTCTTTACCCGTCCTTGGGTCCCTGTAGCAGTAATATCCATTGTTTCTTATATAAAGGTTAGGGGGTAAATCCCGGCGCTCATGACTTCGCCTTCTTCCCATTTCTGATCCTCTTCAAAAGGCCACCTGTTACTGGTCGATTTAAGTCAACCTTTACCGCTGATTCGTGGAACAGATACTCTCTTCCATCCTTAACCGGAGGTGGGAATATCCTGCATTCCCGAACCCATCGACGAGACAGAGAATATGTGTAGAGGCTCGGGTGCTCTG-Bio-3'
2.配制不同的Stop buffer(洗脱缓冲液)，具体组分如下：
Control Stop buffer：10mM甲酰胺
Stop buffer 1：15mM甲酰胺
Stop buffer 2：20mM甲酰胺
Stop buffer 3：1％SDS，10mM甲酰胺
Stop buffer 3-1：1％SDS，15mM甲酰胺
Stop buffer4：2％SDS，10mM甲酰胺
Stop buffer4-1：2％SDS，15mM甲酰胺
Stop buffer 5：3％SDS，10mM甲酰胺
Stop buffer 5-1：3％SDS，15mM甲酰胺
Stop buffer 6：4％SDS，10mM甲酰胺
Stop buffer 6-1：4％SDS，15mM甲酰胺
Stop buffer 7：50mg/ml蛋白酶K
Stop buffer 8：100mg/ml蛋白酶K
Stop buffer 9：0.1％SDS
Stop buffer 10：0.5％SDS
Stop buffer 11：1％SDS
Stop buffer 12：2％SDS
Stop buffer 13：3％SDS
Stop buffer 14：4％SDS
2.取10μl的Bio-DNA-1加入10μl活化后的VAHTS CA-28Streptavidin Beads(Vazyme#N512)，充分涡旋混匀，室温孵育10min，其间颠倒混匀2-3次。
3.将样本置于磁力架上，静置约2-3min，小心移除上清。并加入20μl不同的前述Stop buffer进行目的片段释放。
其中具体方式如下：Control Stop buffer室温10分钟；Control Stop buffer室温10分钟后并进行95度5min热失活；Stop buffer 1室温10分钟；Stop buffer 1室温10分钟后并进行95度5min热失活；Stop buffer 2室温10分钟；Stop buffer2室温10分钟后并进行95度5min热失活……Stop buffer 14室温10分钟；Stop buffer 14室温10分钟后并进行95度5min热失活。并以不添加任何Buffer的上清作核酸量作为本底背景。
4.转移上清至新的离心管中，加入80μl DNA提取磁珠(Vazyme#N411)进行释放片段回收，并进行Qubit浓度测定，根据回收的产物的浓度计算不同Stop buffer的释放效率，其中释放效率＝回收量/投入量，结果如图1-图3所示。
结果分析：如图1所示，相对于Control Stop buffer，不同的Stop buffer 3-8均能有效提升释放效率，其中Stop buffer6+95℃释放效率最优，高达96.1％，相较于ControlStop buffer提升了134％。如图2所示，Stop buffer3-1、Stop buffer4-1、Stop buffer5-1、Stop buffer5-1与Stop buffer6在释放效率上无明显差异，在室温下均能够达到80％以上的释放效率，在室温+95℃下均能够达到90％以上的释放效率。如图3所示，Stop buffer11-14在释放效率上均明显低于Stop buffer6，二者释放效率均相差50％以上。
实施例2
在生工生物合成与实施例1中序列相同的核酸片段，将两端均引入biotin修饰的记为Bio-DNA-1，仅在5'端进行biotin的记为Bio-DNA-2，比较biotin修饰数量对洗脱效果的影响，其中Bio-DNA-2和Bio-DNA-1的具体序列相同，将Bio-DNA-1和Bio-DNA-2分别稀释至20ng/μl备用。
Bio-DNA-2序列(SEQ ID NO.1)：
5'-Bio-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGATAACTCAATGTTGGCCTGTATAGCTTCAGTGATTGCGATTCGCCTGTCTCTGCCTAATCCAAACTCTTTACCCGTCCTTGGGTCCCTGTAGCAGTAATATCCATTGTTTCTTATATAAAGGTTAGGGGGTAAATCCCGGCGCTCATGACTTCGCCTTCTTCCCATTTCTGATCCTCTTCAAAAGGCCACCTGTTACTGGTCGATTTAAGTCAACCTTTACCGCTGATTCGTGGAACAGATACTCTCTTCCATCCTTAACCGGAGGTGGGAATATCCTGCATTCCCGAACCCATCGACGAGACAGAGAATATGTGTAGAGGCTCGGGTGCTCTG-3'
2.配制不同的Stop buffer(洗脱缓冲液)，具体组分如下：
Control Stop buffer：10mM甲酰胺
Stop buffer 1：15mM甲酰胺
Stop buffer 2：20mM甲酰胺
Stop buffer 3：1％SDS，10mM甲酰胺
Stop buffer4：2％SDS，10mM甲酰胺
Stop buffer 5：3％SDS，10mM甲酰胺
Stop buffer 6：4％SDS，10mM甲酰胺
Stop buffer 7：50mg/ml蛋白酶K
Stop buffer 8：100mg/ml蛋白酶K
4.后续磁珠结合、目的片段释放、释放片段回收和释放效率计算的具体步骤同实施例1，其中目的片段释放的具体方式均为室温10分钟，结果如图4所示。
结果分析：如图4所示，单侧Biotin修饰和双侧Biotin修饰对于本申请中各Stopbuffer的释放效率影响不大，二者均有较好的目的片段回收效果。
实施例3
1.Biotin-TN5转座子复合物构建
在生工生物合成带biotin修饰的引物：primerA，primerB，primer C，使用PBS缓冲液溶解PrimerA、Primer B、Primer C至10μM。具体序列以及Biotin修饰如下：
Primer A(SEQ ID NO.2)：5'-phos-CTGTCTCTTATACACATCT-Bio-3'
Primer B*(SEQ ID NO.3)：5′-Bio-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-Bio-3′
Primer C*(SEQ ID NO.4)：5′-Bio-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-Bio-3′
分别配制如下反应体系：
分别将反应1和反应2涡旋震荡充分混匀，并短暂离心使溶液回到管底。置于PCR仪内，进行如下反应程序：
热盖 On，105℃
75℃ 15min
60℃ 10min
50℃ 10min
40℃ 10min
25℃ 30min
反应结束后，将反应1和反应2等体积混合，混匀。命名为Adapter Mix。
随后在灭菌PCR管中依次添加各反应组分：
使用移液器轻轻吹打20次充分混匀，并置于30℃反应1h，反应产物命名为Biotin-TN5，-30～-15℃保存。在Biotin-TN5上进行修饰获得Biotin-pA/G-TN5，30～-15℃保存备用。
2.CUT&Tag for qPCR实验，具体流程按照Vazyme#TD903说明书进行，其中以H3K4me3为靶点，样本投入量为100000个K562细胞。
用1μl Biotin-pA/G-TN5代替Vazyme#TD903中的pA/G-Tnp(2μM)，按说明书正常操作进行到“08-8/片段化”，设置实验组和非特异性IgG的对照组，使用spike in组分(Vazyme#TD904)进行组间系统误差矫正，具体投入量参考TD904说明书。
向片段化后的样本中加入25μl VAHTS CA-28Streptavidin Beads(Vazyme#N512)，充分涡旋混匀，室温孵育10min，其间颠倒混匀2-3次。
3.配制不同的Stop buffer，选择前述释放效率最高的Stop buffer 6作为实验组。具体组分如下：
Control Stop buffer：10mM甲酰胺；
Stop buffer 6：4％SDS，10mM甲酰胺；
4.将样本置于磁力架上，静置约2-3min，小心移除上清。并分别加入200μlControlStop buffer和Stop buffer 6进行目的片段释放。具体实施方式为：Control Stop buffer室温10分钟后并进行95度热失活；Stop buffer 6室温10分钟后并进行95度热失活。
5.加入100μl(2X)DNA提取磁珠(Vazyme#N411)进行目的片段回收，配制如下四组磁珠孵育缓冲液：
5a：100μl Vazyme#N411磁珠+100μl无核酸酶水
5b：100μl Vzyme#N411磁珠+100μl PBSTTA(0.1％Triton X-100；0.1％Tween20in PBS)
5c：100μl Vzyme#N411磁珠+100μl PBSTTB(0.5％Triton X-100；0.5％Tween20in PBS)
5d：100μl Vzyme#N411磁珠+100μl PBSTTC(1％TritonX-100；1％Tween20in PBS)
室温孵育10min，其间颠倒混匀2-3次
将样本置于磁力架上，静置约2-3min，小心移除上清，用80％乙醇漂洗两次，干燥后加入40μl无核酸酶水洗脱进行qPCR检测。
以H3K4me3为靶点，基因DGCR8、DDX56、ACRBP和IGFL2的TSS上游2K为不同待测区域，并进行引物设计。其中引物序列如下：
DGCR8：
F(SEQ ID NO.5)：CGAAGACCCACTGCCCTTTTG
R(SEQ ID NO.6)：AAGAATGTCAACTACCACGAATGC
ACRBP：
F(SEQ ID NO.7)：ATAGGAGTAGACTCTACTTCT
R(SEQ ID NO.8)：CCCAAGTTTCACTCTGAATCTCT
DDX56：
F(SEQ ID NO.9)：GTTCCTGAGGCCAAAGTTCTAGC
R(SEQ ID NO.10)：GAGACCCCAGTCCAGGTCCT
IGFL2：
F(SEQ ID NO.11)：ACACAACTGTCTATGTAAAC
R(SEQ ID NO.12)：TACATGTTTTGTTAGATTTAC
DNA Spike-in：
F(SEQ ID NO.13)：GCCTTCTTCCCATTTCTGATCC
R(SEQ ID NO.14)：CACGAATCAGCGGTAAAGGT
使用Vazyme#Q711产品进行qPCR检测，其中△CT(Targer)＝CT(Target)-CT(spikein)，△CT(IgG)＝CT(IgG)-CT(spike in)，△△CT(Target)＝△CT(Target)-△CT(IgG)，得到结果如图5所示。
结果分析：如图5所示，PBSTTA-C与改进的Stop buffer6能够显著提升CUT&Tagfor qPCR的性能，其中△△CT值越大，表明靶点相对于背景的富集程度越大。如图5，Stopbuffer6相较于Control Stop buffer提升了3个CT值，对靶点的检出提升了2^3＝8倍，加入PBSTTA-C后，△△CT值进一步提升，其对靶点的检测提升了至少2^4＝16倍。

Claims (19)

1.一种从链霉亲和素磁珠上洗脱生物素标记核酸的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)向结合有生物素标记核酸的链霉亲和素磁珠中加入洗脱液，所述洗脱液包含甲酰胺和SDS；
(2)混匀，孵育；
(3)外加磁场，收集上清。
2.权利要求1所述的方法，所述甲酰胺的浓度是5-30mM，优选5-20mM。
3.权利要求1所述的方法，所述SDS的质量体积比是0.1％-10％，优选0.5％-10％。
4.权利要求1所述的方法，所述孵育是室温孵育5-30min。
5.权利要求4所述的方法，所述步骤(2)还包括在孵育后进行80-95℃热处理，优选80-95℃热处理1-10min。
6.一种蛋白质-DNA互作的片段捕获方法，所述方法包括如下步骤：
(1)收集细胞样本，透化，加入靶蛋白结合一抗和二抗进行孵育，所述靶蛋白结合一抗与靶蛋白结合，所述二抗与靶蛋白结合一抗结合；
(2)加入转座酶复合物，进行片段化反应从而获得片段化的DNA；其中所述转座酶复合物包含能够与二抗结合的基团或物质、转座酶、以及含有转座酶识别核心序列和标签序列的寡核苷酸；所述能够与二抗结合的物质例如是Protein A、Protein G或ProteinAG，所述寡核苷酸上含有生物素标记；
(3)使用链霉亲和素磁珠结合片段化的DNA；
(4)使用权利要求1-5任一项所述的方法洗脱片段化的DNA。
7.权利要求6所述的方法，所述生物素标记在所述寡核苷酸上的一个或多个核苷酸，优选3'末端和/或5'末端的核苷酸。
8.权利要求7所述的方法，所述转座酶识别核心序列的3'末端和/或5'末端含有生物素标记，所述标签序列的3'末端和/或5'末端含有生物素标记。
9.权利要求6所述的方法，所述方法还包括纯化片段化的DNA，所述纯化是例如磁珠法、离心柱法或离子交换树脂法，优选磁珠法。
10.权利要求9所述的方法，所述磁珠法纯化包括将磁珠和片段化的DNA在磁珠结合缓冲液中孵育，所述磁珠结合缓冲液包括Triton X-100、Tween-20和PBS缓冲液。
11.权利要求10所述的方法，所述Triton X-100的体积分数是0.01-10％，优选0.01-5％；所述Tween-20的体积分数是0.01-10％，优选0.01-5％。
12.一种蛋白质-DNA互作的检测方法，所述方法包括如下步骤：
(1)使用权利要求6-11任一项所述的方法捕获DNA片段；
(2)以所述DNA片段为模板进行qPCR扩增。
13.权利要求12所述的方法，所述qPCR扩增在包含DNA聚合酶、dNTP、引物、缓冲液以及探针和/或荧光染料的体系中进行。
14.一种蛋白质-DNA互作基因文库的构建方法，所述方法包括如下步骤：
(1)使用权利要求6-11任一项所述的方法捕获DNA片段；
(2)对所述DNA片段连接测序接头；
(3)任选地，对接头连接后的产物进行纯化和/或扩增。
15.一种蛋白质-DNA互作的检测方法，所述方法包括对权利要求14构建的文库进行测序。
16.一种试剂盒，所述试剂盒包括生物素化的转座酶复合物、链霉亲和素磁珠和链霉亲和素磁珠洗脱液，所述链霉亲和素洗脱液包含甲酰胺和SDS。
17.权利要求16所述的试剂盒，所述甲酰胺的浓度是5-30mM，优选5-20mM；所述SDS的质量体积比是0.1％-10％，优选0.5％-10％。
18.权利要求17所述的试剂盒，所述试剂盒还包括磁珠结合缓冲液，所述磁珠结合缓冲液包括Triton X-100、Tween-20和PBS缓冲液。
19.权利要求18所述的试剂盒，所述TritonX-100的体积分数是0.01-10％，优选0.01-5％；所述Tween-20的体积分数是0.01-10％，优选0.01-5％。
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