CN117089595A - 一种亚细胞结构中rna的检测方法 - Google Patents
一种亚细胞结构中rna的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117089595A CN117089595A CN202311082918.0A CN202311082918A CN117089595A CN 117089595 A CN117089595 A CN 117089595A CN 202311082918 A CN202311082918 A CN 202311082918A CN 117089595 A CN117089595 A CN 117089595A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rna
- cells
- secondary antibody
- sequence
- promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 210000004895 subcellular structure Anatomy 0.000 title claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 42
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 28
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 16
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 8
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 3
- 101710106089 Protein cutoff Proteins 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000014632 RNA localization Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 101000893689 Homo sapiens Ras GTPase-activating protein-binding protein 1 Proteins 0.000 description 8
- 102100040854 Ras GTPase-activating protein-binding protein 1 Human genes 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种亚细胞结构中RNA的检测方法，包括如下步骤：S1、将细胞依次进行固定、透化、封闭；S2、将封闭好的细胞、靶向于蛋白质的一抗混合孵育；S3、将一抗洗涤缓冲液、链霉亲和素偶联的二抗与生物素化的T7‑N9启动子混合，得到二抗复合物；S4、将一抗孵育细胞与二抗复合物混合孵育；S5、将二抗孵育细胞进行洗涤、逆转录得到mRNA‑cDNA杂交体，并合成cDNA第二条链；S6、将cDNA第二条链进行体外转录，得到扩增的RNA，将RNA建库后进行测序，即可知细胞中与一抗靶向蛋白质相互作用的特异性RNA及分布。与现有技术相比，本发明无需高端仪器、昂贵试剂和高昂测序成本就能进行亚细胞的RNA定位。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种亚细胞结构中RNA的检测方法。
背景技术
RNA的亚细胞定位与其功能密切相关，不对称分布的RNA是生物发育、局部蛋白质翻译和染色质结构的基础，RNA在细胞内的位置可能决定其是否会被储存、加工、翻译和降解。因此，解析RNA的亚细胞定位对其功能研究至关重要。
目前已经开发了许多方法来研究RNA定位，但只有少数方法在转录组范围内得到了应用。其中最经典的方法是通过生化离心分层来获取各种细胞器，然后进行RNA测序(“fractionation-seq”)，然而fractionation-seq的主要限制是它不能应用于无法纯化的细胞器，例如很多重要的亚细胞区域核纤层和线粒体外膜等，而且这种方法也导致引入很多杂质分子。另外，近年来出现的新型RNA荧光原位杂交成像技术，虽然可以同时获取单细胞中上千种RNA的空间信息，但这种基于荧光探针杂交的方案需要设计靶向感兴趣的RNA的探针组，也并不能获得RNA的全部序列信息，并且此技术需要昂贵复杂的自动化仪器，无法适用于大部分实验室。
因此，亟需一种无需昂贵仪器、适用范围广的RNA定位检测方法。
发明内容
本发明的目的就是为了克服现有技术对检测对象要求高、检测结果受限、依赖高昂仪器等缺陷而提供一种亚细胞结构中RNA的检测方法。通过使用特异性抗体靶向与RNA相互作用的蛋白质和链霉亲和素偶联的二抗与生物素化的T7-N9启动子结合捕获亚细胞定位的RNA，以实现对亚细胞定位RNA种类和功能的研究。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的技术方案为提供一种亚细胞结构中RNA的检测方法，包括如下步骤：
S1、将培养好的细胞依次进行固定、透化、封闭；
S2、将S1步骤封闭好的细胞、靶向于与待扩增RNA相互作用的蛋白质的一抗进行混合孵育；
S3、将一抗洗涤缓冲液、链霉亲和素偶联的二抗与生物素化的T7-N9启动子混合，得到二抗复合物；
S4、将S2步骤孵育后的细胞与S3步骤得到的二抗复合物进行混合孵育；
S5、将S4孵育后的细胞进行洗涤、逆转录得到mRNA-cDNA杂交体，并合成cDNA第二条链；
S6、将S5得到的cDNA第二条链进行体外转录，即得到扩增后的RNA，将扩增得到的RNA建库后进行测序，即可知细胞中与一抗靶向蛋白质相互作用的特异性RNA及其分布。
在一些具体实施方式中，于S1步骤，培养好的细胞为细胞汇合度在70％～90％的细胞。
在一些具体实施方式中，于S2步骤，将靶向于与待扩增RNA相互作用的蛋白质的一抗与细胞的比例为(0.6-0.7)μL:1×105个细胞。
在一些具体实施方式中，于S2步骤，孵育的温度为25℃，孵育的时间为2h，孵育的转速为70rpm。
在一些具体实施方式中，于S3步骤，二抗复合物的制备工艺为：将体积比为98.3:1:0.7的一抗洗涤缓冲液、12.5μM生物素化的T7-N9启动子、链霉亲和素偶联的二抗混合，在4℃孵育20min，再加入4倍总体积的一抗洗涤缓冲液，用蛋白质截留分子量为100kD的超滤管过滤，得到浓缩10倍体积的浓缩液，再加入与浓缩液同等体积的一抗洗涤缓冲液，即为二抗复合物。
在一些具体实施方式中，于S3步骤，生物素化T7-N9启动子的序列从5’端至3’端依次包括生物素标记、连接臂序列、T7启动子序列、缓冲序列、cDNA接头的反向序列以及若干个随机碱基序列，所述连接臂序列用于增加生物素化T7-N9启动子的序列的灵活性，所述缓冲序列用于提高T7 RNA聚合酶的转录效率，所述若干个随机碱基序列用于与RNA随机配对。
优选的，于S3步骤，生物素化的T7-N9启动子中的序列如SEQ ID NO.1所示。
在一些具体实施方式中，于S4步骤，二抗复合物与细胞的比例为100μL:1×105个细胞。
在一些具体实施方式中，于S4步骤，孵育的温度为25℃，孵育的时间为大于等于45min，孵育的转速为70rpm。
在一些具体实施方式中，于S6步骤，利用T7 RNA聚合酶进行体外转录。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明为一种针对目标蛋白结合的转录本定点逆转录后进行扩增测序的技术(Target Transcript Amplification and Sequencing，TATA-Seq)，使用特异性抗体靶向与RNA相互作用的蛋白质，然后定位逆转录产生RNA/cDNA杂交体，随后通过T7 RNA聚合酶进行体外扩增后进行建库测序。抗体定位和T7 RNA聚合酶体外扩增的高效性使得本发明特别适用于亚细胞区域RNA定位的快速低成本研究，尤其是对揭示无膜细胞器中RNA的定性和定量检测，有利于更深入地了解RNA的生物功能。此外，本发明无需高端复杂仪器设备、昂贵实验试剂和高昂测序成本，本发明的成功研发，将为基础领域的科学家和临床领域的医生提供切实可用的先进工具。
附图说明
图1为本发明检测方法的流程示意图，图中的ROI为Amplified RNA Of Interest。
图2为Hela G3BP1抗体组、Hela IgG抗体组的分布图(A)和热图(B)。
图3为Hela G3BP1抗体组、Hela IgG抗体组的富集信号可视化图。
图4为Hela G3BP1抗体组(A)、Hela IgG抗体组(B)的文库质检图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下各实施例和对比例中，如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料产品或常规处理技术。
一抗：Hela G3BP1抗体(实验组，abcam，ab181150)、Hela IgG抗体(对照组，abclone，AC005)
链霉亲和素偶联的二抗：guinea pig anti-rabbit抗体(Antibodies Online,catalogno.ABIN101961)通过abcam公司的Streptavidin偶联试剂盒(ab102921)进行链霉亲和素偶联。
实施例1
一种亚细胞结构中RNA的检测方法，如图1所示的流程，包括如下步骤：
1、样本准备：将Hela细胞铺在48细胞孔板中，培养至细胞汇合度达到70％～90％，每孔约为1×105个细胞。
2、细胞固定：先用200μL PBS缓冲液洗涤细胞2次，加入100μL 4％多聚甲醛，25℃孵育15min，然后用200μL PBS缓冲液将细胞孔板洗两次。
3、细胞透化与封闭：
(1)向细胞孔板中每孔加入100μL透化缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5,10mMNaCl,0.5％ NP-40裂解液,0.3％ Triton X-100裂解液,0.1％ Tween 20,1×proteaseinhibitors，200U/mL RNase inhibitor)，在冰上孵育15min。
(2)用100μL封闭液(5％ BSA牛血清白蛋白,10％normal guinea pig serum豚鼠血清,2μg yeast tRNA,1μg white egg avidin protein白蛋亲和素蛋白,1×PBST缓冲液(PBS+0.1％ Tween 20))，25℃，封闭细胞1h后，吸掉封闭液(不要清洗)。
4、一抗孵育：将一抗与Antibody Buffer(抗体缓冲液)中按1:150的体积比例进行稀释，每孔加入100μL抗体稀释液，将细胞孔板置于旋转摇床上，在70rpm、25℃下孵育2h。
Antibody Buffer抗体缓冲液按表1进行配置：
表1Antibody Buffer抗体缓冲液的组分组成
5、二抗复合物：
(1)在1.5mL EP管中加入98.3μL Primary antibody wash Buffer(一抗洗涤缓冲液)，1μL浓度为12.5μM的生物素化T7-N9启动子和0.7μL链霉亲和素偶联的二抗，将EP管放在旋转摇床上，4℃孵育20min。
Primary antibody wash Buffer一抗洗涤缓冲液按表2进行配置：
表2 Primary antibody wash Buffer一抗洗涤缓冲液的组分组成
(2)孵育结束后加入400μL Primary antibody wash Buffer，使最终体积为500μL。用超滤管(Millipore，cutoff＝100kD)纯化，去除过量的生物素化T7-N9启动子，即将500μL混合物浓缩为50μL，再加入50μL Primary antibody wash Buffer，将体积补充至100μL，得到二抗复合体，即可用于后续的孵育。
其中，生物素化的T7-N9启动子从5’端至3’端依次包括生物素标记(/Biotin-T/)和如SEQ ID NO.1所示的序列，
SEQ ID NO.1：
CACTGTAGTTGTACAGACTCCATAATACGACTCACTATAGGGATAATGAGCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNN。
6、二抗结合：将上述100μL的二抗复合物加入到细胞孔板中，置于摇床上，在70rpm、25℃下至少孵育45min。
7、洗涤：
(1)二抗孵育结束后，吸掉液体，首先加入100μL的Primary antibody WashBuffer洗孔板3次，每次需置于摇床上，在70rpm、25℃下孵育5min，吸掉液体。
(2)然后用100μL Wash BufferII(0.5×SSC/15％甲酰胺)洗涤孔板3次，每次需置于摇床上，在70rpm、25℃下孵育5min，吸掉液体。
(3)再次用100μL 1×PBST缓冲液(PBS+0.1％ Tween 20)洗涤孔板3次，每次需置于摇床上，在70rpm、25℃下孵育5min，吸掉液体。
(4)最后用100μL 1×PBS缓冲液洗涤细胞孔板2次后，吸掉液体，再加入100μL 1×PBS缓冲液，在37℃孵育2min，转至25℃孵育5min，吸掉液体。
8、逆转录：
按照下表3配置逆转录反应液：
表3逆转录反应液
(1)将表3的逆转录反应液加入细胞孔板中，37℃孵育1h后，吸掉上清。
(2)用100μL 10mM Tris HCl pH 7.5缓冲液将孔板清洗一次后，加入下表4反应液。
9、cDNA第二条链的合成：
按照下表4配置合成cDNA第二条链的反应液
表4合成cDNA第二条链的反应液
(1)将上述混合液加入细胞孔板中，置于16℃孵育2h后，加入1μL的T4 DNA聚合酶，再次置于16℃孵育5min。
(2)加入5μL of蛋白酶K，22μL of 5×蛋白酶K buffer，55℃孵育45min。
(3)将上清转移到新的1.5mL EP管，用86μL的1×PBS清洗孔板两次，并将洗涤液转移到同一管中，采用Zymo Research的DNA clean&concentrator kit进行DNA纯化。
10、T7 RNA Polymerase体外转录：
按照下表5配置T7 RNA Polymerase体外转录反应液
表5T7 RNA Polymerase体外转录反应液
将上述配置好的反应液轻轻混匀，37℃孵育3h左右，且将PCR管置于磁力架中离心，保留上清，上清中即为扩增后的RNA，之后用silane beads(购买于Thermo FisherScientific货号37002D)进行纯化。
11、文库构建：
(1)RT primer的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
ACACGACGCTCTTCCGATCT。
(2)逆转录：
按照下表6配置RNA逆转录反应液
表6 RNA逆转录的反应液
将上述反应液轻轻混匀后，置于42℃孵育1h后，加入1μL RNase H除去原始RNA，之后用1.2×Ampure beads(Beckman A63881)进行纯化，最后采用UltraTMIIDNALibrary Prep Kit for Illumina试剂盒进行建库。
12、测序
G3BP1抗体(实验组)为感兴趣抗体靶向定位人HEK293T细胞的应激颗粒(StressGranule)，通过本发明方法可以富集到应激颗粒中的特异性RNA，Hela IgG为阴性对照组，两组进行对比，可以比对出存在于应激小体中的特异性RNA。
利用Deeptools软件，以差异的Peak的中心计算reads的富集程度，可以明显看到在这些区域有差异性富集，揭示了应激颗粒中RNA的特异性分布。
(1)图2为Hela G3BP1抗体组(实验组)、Hela IgG抗体组(对照组)的分布图和热图，从图中可以看出，与Hela IgG抗体组(对照组)相比，Hela G3BP1抗体组(实验组)有明显的富集峰，P＜0.05。
(2)图3为Hela G3BP1抗体组(实验组)、Hela IgG抗体组(对照组)的富集信号可视化图，从该图中可以看出，实验组相对于对照组的多个基因在基因组不同处有特异性的富集峰。
(3)使用Agilent 2100/4200Bioanalyzer/Qseq400对文库进行质控，获得文库质检图谱，如图4所示，说明建库效果良好。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种亚细胞结构中RNA的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将培养好的细胞依次进行固定、透化、封闭；
S2、将S1步骤封闭好的细胞、靶向于与待扩增RNA相互作用的蛋白质的一抗进行混合孵育；
S3、将一抗洗涤缓冲液、链霉亲和素偶联的二抗与生物素化的T7-N9启动子混合，得到二抗复合物；
S4、将S2步骤孵育后的细胞与S3步骤得到的二抗复合物进行混合孵育；
S5、将S4孵育后的细胞进行洗涤、逆转录得到mRNA-cDNA杂交体，并合成cDNA第二条链；
S6、将S5得到的cDNA第二条链进行体外转录，即得到扩增后的RNA，将扩增得到的RNA建库后进行测序，即可知细胞中与一抗靶向蛋白质相互作用的特异性RNA及其分布。
2.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中RNA的检测方法，其特征在于，于S1步骤，培养好的细胞为细胞汇合度在70％～90％的细胞。
3.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中RNA的检测方法，其特征在于，于S2步骤，将靶向于与待扩增RNA相互作用的蛋白质的一抗与细胞的比例为(0.6-0.7)μL：1×105个细胞。
4.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中RNA的检测方法，其特征在于，于S2步骤，孵育的温度为25℃，孵育的时间为2h，孵育的转速为70rpm。
5.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中RNA的检测方法，其特征在于，于S3步骤，二抗复合物的制备工艺为：将体积比为98.3:1:0.7的一抗洗涤缓冲液、12.5μM生物素化的T7-N9启动子、链霉亲和素偶联的二抗混合，在4℃孵育20min，再加入4倍总体积的一抗洗涤缓冲液，用蛋白质截留分子量为100kD的超滤管过滤，得到浓缩10倍体积的浓缩液，再加入与浓缩液同等体积的一抗洗涤缓冲液，即为二抗复合物。
6.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中RNA的检测方法，其特征在于，于S3步骤，生物素化T7-N9启动子的序列从5’端至3’端依次包括生物素标记、连接臂序列、T7启动子序列、缓冲序列、cDNA接头的反向序列以及若干个随机碱基序列，所述连接臂序列用于增加生物素化T7-N9启动子的序列的灵活性，所述缓冲序列用于提高T7 RNA聚合酶的转录效率，所述若干个随机碱基序列用于与RNA随机配对。
7.根据权利要求6所述的一种亚细胞结构中RNA的检测方法，其特征在于，于S3步骤，生物素化的T7-N9启动子中的序列如SEQ ID NO.1所示。
8.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中RNA的检测方法，其特征在于，于S4步骤，二抗复合物与细胞的比例为100μL:1×105个细胞。
9.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中RNA的检测方法，其特征在于，于S4步骤，孵育的温度为25℃，孵育的时间为大于等于45min，孵育的转速为70rpm。
10.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中RNA的检测方法，其特征在于，于S6步骤，利用T7 RNA聚合酶进行体外转录。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311082918.0A CN117089595A (zh) | 2023-08-28 | 2023-08-28 | 一种亚细胞结构中rna的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311082918.0A CN117089595A (zh) | 2023-08-28 | 2023-08-28 | 一种亚细胞结构中rna的检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117089595A true CN117089595A (zh) | 2023-11-21 |
Family
ID=88778809
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311082918.0A Pending CN117089595A (zh) | 2023-08-28 | 2023-08-28 | 一种亚细胞结构中rna的检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117089595A (zh) |
-
2023
- 2023-08-28 CN CN202311082918.0A patent/CN117089595A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1161561B1 (en) | One step sample preparation and detection of nucleic acids in complex biological samples | |
| US20100112548A1 (en) | Kit for detecting non-pathogenic or pathogenic influenza a subtype h5 virus | |
| JP2015528305A (ja) | 標的ｒｎａ枯渇化組成物を調製するための方法およびキット | |
| JPH10508741A (ja) | 核酸−プローブ標的ハイブリッド検出の感度上昇のための増幅方法 | |
| JP2003505041A (ja) | 固体支持体担体を用いる試験管内選択及びポリペプチドの任意の同定 | |
| Tacheny et al. | Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids | |
| CN107760686B (zh) | Dkk-1蛋白的核酸适配体及其应用 | |
| KR102113078B1 (ko) | 압타머의 선별 방법 | |
| KR20190135456A (ko) | 차세대서열결정법을 이용한 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 그 용도 | |
| CN111122847B (zh) | 一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素b1的方法 | |
| CN103695419B (zh) | 一种病毒核酸提取试剂 | |
| US10590451B2 (en) | Methods of constructing a circular template and detecting DNA molecules | |
| CN111500583B (zh) | 特异性识别牛妊娠相关糖蛋白4的核酸适配体及其应用 | |
| WO2021249816A1 (en) | Method of single-cell analysis of multiple samples | |
| CN117089595A (zh) | 一种亚细胞结构中rna的检测方法 | |
| CN116218971A (zh) | 一种高效染色质dna结合图谱测序方法 | |
| WO2020118543A1 (zh) | 分离和/或富集宿主源核酸和病原核酸的方法和试剂及其制备方法 | |
| CN113025690B (zh) | 一种核酸探针组及其应用 | |
| US20170022545A1 (en) | Rna microarray for detecting interaction between protein and rna containing a higher-order structure | |
| WO2021112559A1 (ko) | 시료의 표적분자 집단에 대한 프로파일을 얻는 방법 | |
| CN111454956B (zh) | 一种针对中华鳖虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用 | |
| CN114107446A (zh) | 一种核酸的检测试剂盒及其检测方法 | |
| WO2019200580A1 (zh) | 一种同时捕获基因组目标区域正反义双链的平行液相杂交捕获方法 | |
| CN114410637B (zh) | 一种特异性结合氯丙嗪的核酸适配体的筛选及应用 | |
| CN107083388B (zh) | 一种特异结合膜联蛋白A2的核酸适体wh3及用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |