CN117071033A - 开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置及方法，所述装置用于对核酸分子进行核酸电泳分离和检测；所述装置包括：成像检测器、镜头和滤光片、光源、开放式电泳槽、装载凝胶用玻璃。与现有技术相比，本发明的装置在PAGE分离核酸的基本原理上，将成像检测器、光源等凝胶成像组件与电泳组件集成在同一台装置中，实现了PAGE的在线成像、检测、从而实现了对电泳过程的监测、核酸分子的高分辨率分离、高灵敏度定量、结果分析等功能，各模块可通过软件单元控制，实现了自动化操作，节省人工成本，减少复杂处理过程中样品损耗，解决了传统聚丙烯酰胺凝胶核酸电泳无法精确定量、分辨率低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳技术领域，尤其是涉及一种开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置及其方法。
背景技术
核酸聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel,PAG)电泳(PAG electrophoresis,PAGE)是在电场作用下，带负电荷的核酸通过PAG凝胶网孔向阳极迁移，其迁移速率受凝胶浓度、所加电压、缓冲液、核酸分子片段大小、染剂用量等因素影响，在一定电泳时间后，达到分离不同片段大小、构象的核酸分子的效果。
目前核酸PAGE技术应用广泛，但这一传统技术仍存在一些如下问题。
第一、现有核酸PAGE无法实现在线成像检测，电泳结束后需将凝胶取下，经过后处理，通过凝胶成像仪等装置进行离线成像，这一过程自动化程度低、费工费时，较多手工操作接触危险试剂带来安全风险等。
第二、虽然现有核酸琼脂糖凝胶电泳(AGE)能够实现电泳观测(专利号：CN1766581A，CN211402238 U，CN 203249894U)，但PAGE电泳槽为水平结构，水平放置电泳槽的方案无法用于核酸PAGE的上下电极槽支撑、平衡机构及防漏液设计，因此，无法开展开放式PAGE电泳槽设计，进而无法实现开放电泳槽与在线成像检测技术的兼容，形成真正的在线成像检测。
第三、现有商品化的绝大多数核酸琼脂糖凝胶电泳(agarose gelelectrophoresis,AGE)凝胶成像仪观测仍为离线成像检测技术。如伯乐公司ChemDoc Go成像系统，赛默飞公司E-Gel Imager凝胶成像系统、iBright智能成像系统等产品，不能同时在一台仪器上实现核酸电泳分离和凝胶成像两个功能，仍需在电泳结束后取下凝胶，再放置于成像仪上进行成像分析。这种装置只能对电泳结果进行成像，无法监测电泳过程。
第四、现有琼脂糖凝胶电泳在线观测技术存在检测灵敏度低的问题。如赛默飞公司E-Gel Power Snap核酸电泳系统，使用蓝光透射仪对凝胶进行成像，光源放置于凝胶下方，由于光源光谱与核酸-染剂荧光光谱有重叠，这一结构会导致光学检测器接收到不必要的来自于光源的光信号，降低检测信噪比，使得小浓度核酸荧光信号被淹没在噪声中，无法实现高灵敏度检测。
第五、传统核酸PAGE的分辨率较低，无法实现精确定量。传统核酸PAGE仪没有将电泳组件和凝胶成像组件集成在一起，无法实时观察记录核酸电泳情况，电泳过程中出现问题难以及时发现。电泳结束后，凝胶后处理步骤多、耗时长，引起凝胶内分子扩散、条带展宽，导致分辨率降低，无法精确定量。
综上所述，现有核酸PAGE电泳存在不能在线检测，操作步骤繁杂，自动化程度低，检测灵敏度低和分辨率差、无法精确定量等问题。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置及其方法，设计一种开放式电泳槽，实现了对聚丙烯酰胺凝胶电泳中核酸分子条带的实时在线面成像，可对核酸分离情况、位置、片段大小、浓度进行实时监测和动态分析。该发明集成化程度高，将光学检测装置和电泳组件集成在同一台装置内，有效减少人工操作介入，降低样品被损耗、污染风险，降低了人工成本，保障了实验人员的安全。该发明可与计算机直接通信，数据获取、存储便捷，方便数据溯源。通过软件实现了对电源、光源、电泳组件、成像装置的自动控制，操作简捷。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明的第一个目的是提供一种开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置，所述装置用于对核酸分子进行核酸电泳分离和高灵敏检测；所述装置包括：成像检测器、镜头和滤光片、光源、开放式电泳槽、装载凝胶用玻璃；所述成像检测器与镜头通过螺纹结构连接；所述滤光片通过螺纹结构安装在镜头上；所述光源对称分布于开放式电泳槽中被检测面两侧；所述成像检测器设于开放式电泳槽一侧，用于对检测对象进行实时面成像；所述装载凝胶用玻璃通过楔子紧固安装在开放式电泳槽中。
其中，光源与成像检测器受软件单元控制，成像检测器可将实时采集图像输出至PC端软件单元进行在线分析。
进一步地，所述成像检测器接收染剂-核酸分子结合体被激发光照射后所发射的荧光信号，将信号传输至计算机(PC端)对核酸分子实时在线成像。
进一步地，所述装载凝胶用玻璃包括无色透明玻璃和黑色玻璃；所述无色透明玻璃和黑色玻璃之间形成夹缝；所述无色透明玻璃用于减少光源发射光穿过玻璃时的损耗，便于电泳情况观测；所述黑色玻璃用于为成像提供黑色背景，一方面防止发射光穿透凝胶后继续向后传播降低光源效率，另一方面提高条带与成像背景面对比度。
进一步地，所述透明玻璃对激发光透射率大于80％，所述黑色玻璃减少由于透射、反射和散射现象对激发光的消耗，提高发光条带与拍摄背景对比度；
进一步地，黑色玻璃包括但不限于使用铁铬黑、锰铁黑、铜铬黑、苯胺黑、钴黑等黑色颜料着色的玻璃。
进一步地，所述开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置对核酸分子定量时线性范围宽，覆盖两个数量级，检测灵敏度高，检测下限低至0.1ng/μL。
进一步地，所述开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置可对不同长度的核酸分子进行高分辨率分离，分辨率可达到2bp。
进一步地，所述开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置可对凝胶在线面成像，获取实时的条带位置和分离状况信息，无需取下凝胶进行复杂后处理，有效克服条带扩散降低分辨率的影响。
进一步地，所述镜头可能据检测需求调整焦距和光圈大小，滤光片通过螺纹结构装配在镜头前端，根据所用荧光染剂的不同，如EtBr、SYBR系列染料、GelRed、GelGreen和GoldView，包括但不限于各种峰值波长与染料检测波长相匹配的的滤光片。
进一步地，所述滤光片透过率大于80％；所选滤光片为包括但不限于适用于各种核酸染料，如EtBr、SYBR系列染料、GelRed、GelGreen和GoldView等的窄带滤光片。
进一步地，所述开放式电泳槽包括上电泳槽、下电泳槽；所述上电泳槽、下电泳槽相互配合，所述上电泳槽设有上、下电极、上缓冲液室，所述下电泳槽设有下缓冲液室。
进一步地，所述下电泳槽采用开放式结构，下电泳槽上端与被检测面下端平齐，防止开放式电泳槽外壁阻挡激发光，且除凝胶表面外，开放式电泳槽结构不会被光学检测器成像。
进一步地，所述光源包括但不限于LED光源、激光光源等；所述光源光源由两个相同发光件构成，光源前侧安装有匀光片形成面光源，光源与被检测面呈一定角度，激发光倾斜入射，避免光源对成像检测器影响，检测信噪比高，光源位置分布，如与被检测面距离，夹角等经过多次调整优化，经验证光源激发光在被检测面均匀分布。
进一步地，所述核酸分子包括但不限于双链DNA、单链DNA、环状DNA、双链RNA、单链RNA、环状RNA。
进一步地，所述开放式电泳槽前后结构对称，可同时对两块凝胶进行电泳，激发光在被检测面分布均匀；所述成像检测器与PC端通信，对检测对象进行实时面成像，获取的图像由PC端的软件单元实时显示并进行分析，拍摄图像位深16bit，图像灰度细节丰富，获取的图像可在软件单元界面实时显示并进行分析。
进一步地，所述软件单元包括：光源控制模块、成像检测器控制模块、电泳电源控制模块、成像显示分析模块；所述光源控制模块控制光源的亮灭，控制光源稳定输出激发光；所述成像检测器控制模块控制成像检测器的开关、结果图片存储格式、位深、曝光时间、增益和拍摄方式(即连续拍照或触发拍照)等；所述电泳电源控制模块与可调电压、电流的电源相连，控制该电源为电泳过程稳定供电，控制电泳时间、电压和上限电流；所述成像显示分析模块与成像检测器相连接，可将成像检测器拍摄到的图像传输至PC端软件界面实时显示，并对获取的图像根据条带位置进行分区域划分，获取目标条带后计算条带灰度值从而得到核酸浓度。
进一步地，所述成像检测器包括但不限于CMOS图像传感器、CCD图像传感器等。
本发明的第二个目的是提供一种上述开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置的方法，采用上述系统实现核酸电泳分离和高灵敏检测，该方法包括如下步骤：
步骤1)将配制好的凝胶注入夹紧的黑色玻璃与透明玻璃夹缝之间并插上用来形成上样孔的梳子，待凝胶充分凝固后，安装在上电泳槽上并使用楔子紧固，拔掉梳子，将配制好的电泳缓冲液分别倒入上电泳槽和下电泳槽内，使用移液枪分别在上样孔中加入配制好的样品溶液；
步骤2)打开电源，设置合适的电压和电泳时间，开始电泳，电压和电泳时长可根据检测需求调整，常用电压为60-200V，电泳时长20-180min；
步骤3)在电泳过程中的任意时间或电泳结束后，打开光源和成像检测器，对凝胶进行在实时在线成像，在成像显示检测模块显示记录、拍摄图像，并对核酸电泳的条带进行实时分析，获取核酸的分子量大小、浓度等信息。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几个方面：
1)本发明提出的一种开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置及其方法，将凝胶成像组件与电泳组件集成在同一系统中，结合开放式电泳槽，实现了对核酸PAGE的实时在线检测，省去了原有技术在电泳后取下凝胶并进行处理的流程，缩短实验时间，降低人工成本，减少人工参与，避免手工操作对样品和凝胶的污染与损耗，减少实验人员接触有毒试剂带来的安全隐患。
2)本发明提出的一种开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置及其方法，开放式电泳槽的上下电泳槽互相支撑配合、结构平衡，具有防漏液设计，适用于核酸PAGE，开放式的结构避免了电泳槽壁遮挡光源和被检测面。
3)本发明提出的一种开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置及其方法，光源布局采用倾斜入射而非透射的方式，减少光源对成像检测器影响，系统检测信噪比高，可实现核酸浓度的高灵敏度检测。
4)本发明提出的一种开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置及其方法，通过在线检测实现了对电泳过程的实时监测，过程中出现问题可及时发现并处理，提高实验效率。电泳结果可在电泳结束后立即获得，无需取出凝胶，防止条带在凝胶中的扩散，实现了核酸分子高分辨率分离和精确定量。
5)本发明提出的一种开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置及其方法，该装置中电泳模块、成像模块、光源模块等部分均可通过软件控制，操作简捷，易于使用。
附图说明
图1为实施例中的开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置的结构示意图。
图1中：1成像检测器、2镜头、3滤光片、4光源、5楔子、6上电泳槽、7下电泳槽、8装载凝胶用玻璃。
图2A为分离19bp、21bp、24bp、28bp四个片段的核酸电泳在线成像图及电泳图谱；图2B为分离19bp、21bp、24bp、28bp四个片段的核酸电泳离线成像图及电泳图谱。
图2中：上样孔中加入10μL DNA样品溶液，使用20％聚丙烯酰胺凝胶，施加200V恒压电压电泳70min得到如图结果。A图为电泳结束后立即使用成像检测器对凝胶成像，凝胶中条带清晰，不同长度条带完全分离。B图为电泳结束后等待40分钟成像结果，凝胶中条带扩散严重，亮度下降不利于观测，且19bp与21bp几乎不可分。
图3为DNA电泳在线成像图及160bp和100bp DNA分子浓度与灰度值线性关系图，其中160bp从左至右浓度分别为0.08、0.08、0.16、0.16、0.24、0.24、0.32、0.32ng/μL，100bp核酸分子从左之后浓度分别为0.2、0.2、0.4、0.4、0.6、0.6、0.8、0.8ng/μL，曝光时间0.6s。
图4为DNA电泳在线成像图及160bp和100bp DNA分子浓度与灰度值线性关系图，其中160bp核酸分子从左至右浓度分别为1.2、1.2、2.4、2.4、4、4、5、5ng/μL，100bp核酸分子从左之后浓度分别为3、3、6、6、8、8、12.5、12.5ng/μL,曝光时间0.1s。
图5为在0.1s和0.6s曝光下分别获取浓度与灰度值的线性关系后，以0.6s曝光条件下的线性关系作为基准，对不同曝光条件下线性关系进行拟合，获得完整线性曲线，最终线性范围可覆盖两个数量级。
图5中：每个上样孔加入5μL DNA Marker溶液，施加160V恒压电压，电泳20min得到如图结果。
图6为对同一DNA样品，在电泳过程中不同时间拍照的在线成像图，分别在电泳开始后15分钟、30分钟、45分钟、60分钟和70分钟成像，成像时无需取出凝胶，可直接使用软件控制成像检测器及光源，对电泳过程实时在线成像。
图6中：上样量5μL，施加200V恒压电压得到如图结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但绝不是对本发明的限制。本技术方案中如未明确说明的制备手段、材料、结构或组成配比等特征，均视为现有技术中公开的常见技术特征。
实施例
如图1所示，本实施例一种开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置，包括成像检测器1(CMOS图像传感器)、镜头2、滤光片3、光源4(LED光源)、楔子5、上电泳槽6、下电泳槽7、装载凝胶用玻璃8，其中装载凝胶用玻璃8通过楔子5紧固安装在上电泳槽6的卡槽中。上电泳槽6、下电泳槽7共同配合构成开放式电泳槽。
所述成像检测器1与PC端通信，对检测对象进行实时面成像，获取的图像由PC端的软件单元实时显示并进行分析，拍摄图像位深16bit，图像灰度细节丰富，获取的图像可在软件单元界面实时显示并进行分析。所述软件单元包括：光源控制模块、成像检测器控制模块、电泳电源控制模块、成像显示分析模块；所述光源控制模块控制光源的亮灭，控制光源稳定输出激发光；所述成像检测器控制模块控制成像检测器1的开关、结果图片存储格式、位深、曝光时间、增益和拍摄方式(即连续拍照或触发拍照)等；所述电泳电源控制模块与可调电压、电流的电源相连，控制该电源为电泳过程稳定供电，控制电泳时间、电压和上限电流；所述成像显示分析模块与成像检测器1相连接，可将成像检测器1拍摄到的图像传输至PC端软件界面实时显示，并对获取的图像根据条带位置进行分区域划分，获取目标条带后计算条带灰度值从而得到核酸浓度。
所述成像检测器1与镜头2通过螺纹结构连接，成像检测器1的靶面尺寸小于等于镜头2的像面尺寸，防止成像时出现边缘暗角。
所述滤光片3通过螺纹结构安装在镜头2上。其根据使用荧光染剂的不同而改变，该实例中使用SYBR GreenⅠ染料，故选用中心波长530nm，带宽10nm的窄带滤光片。
所述装载凝胶用玻璃8由两块玻璃构成，其中一块为无色透光玻璃，减少光源发射光穿过玻璃时的损耗，便于电泳情况观测。另一块为使用黑色染料涂黑的玻璃(黑色玻璃)，为成像提供黑色背景，一方面防止发射光穿透凝胶后继续向后传播降低光源效率，另一方面提高条带与成像背景面对比度。
将配置好的聚丙烯酰胺凝胶注入所述装载凝胶用玻璃8夹缝之间，插入梳子形成上样孔。
所述凝胶尺寸为长75mm×宽55mm×厚0.8mm。
所述凝胶有10个上样孔，上样孔尺寸为长8mm×宽5mm×厚0.8mm。
所述镜头2距离检测面距离为250mm，两个光源4与检测面水平夹角约为30°。
待凝胶充分凝固后，拔掉梳子，将所述无色透明玻璃，黑色玻璃，放入上电泳槽6的卡槽内，使用40mL的10×TBE缓冲液，加水稀释至400mL，稀释成1×TBE缓冲液，配置电泳缓冲液，分别将电泳缓冲液倒入下电泳槽7和上电泳槽6的缓冲液室中。所述下电泳槽7中的电极丝充分接触位于下电泳槽7中的电泳缓冲液。上电泳槽6内的电泳缓冲液应能没过凝胶上样孔。
使用移液枪在每个上样孔中加入配制好的样品溶液，将开放式电泳槽放在合适位置。打开电泳电源，电压设置为160V，电泳总时长20min，开始电泳。在电泳的任意时间段，均可打开光源与成像系统，对电泳情况进行成像分析。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置，其特征在于，所述装置用于对核酸分子进行核酸电泳分离和检测；
所述装置包括：成像检测器(1)、镜头(2)和滤光片(3)、光源(4)、开放式电泳槽、装载凝胶用玻璃(8)；
所述成像检测器(1)与镜头(2)连接；
所述滤光片(3)安装在镜头(2)上；
所述光源(4)对称分布于开放式电泳槽中被检测面两侧；
所述成像检测器(1)设于开放式电泳槽一侧，用于对检测对象进行实时面成像；
所述装载凝胶用玻璃(8)通过楔子(5)紧固安装在开放式电泳槽中。
2.根据权利要求1所述一种开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置，其特征在于，所述装载凝胶用玻璃(8)包括无色透明玻璃和黑色玻璃；
所述无色透明玻璃和黑色玻璃之间形成夹缝；
所述无色透明玻璃用于减少光源发射光穿过玻璃时的损耗，便于电泳情况观测；
所述黑色玻璃用于为成像提供黑色背景。
3.根据权利要求1所述一种开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置，其特征在于，所述核酸分子包括双链DNA、单链DNA、环状DNA、双链RNA、单链RNA、环状RNA。
4.根据权利要求1所述一种开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置，其特征在于，所述开放式电泳槽前后结构对称；
所述成像检测器(1)与PC端通信，对检测对象进行实时面成像，获取的图像由PC端的软件单元实时显示并进行分析，拍摄图像位深16bit。
5.根据权利要求4所述一种开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置，其特征在于，所述软件单元包括：光源控制模块、成像检测器控制模块、电泳电源控制模块、成像显示分析模块；
所述光源控制模块控制光源的亮灭，控制光源稳定输出激发光；
所述成像检测器控制模块控制成像检测器(1)的开关、结果图片存储格式、位深、曝光时间、增益和拍摄方式(即连续拍照或触发拍照)等；
所述电泳电源控制模块与可调电压、电流的电源相连，控制该电源为电泳过程稳定供电，控制电泳时间、电压和上限电流；
所述成像显示分析模块与成像检测器(1)相连接，可将成像检测器(1)拍摄到的图像传输至PC端软件界面实时显示，并对获取的图像根据条带位置进行分区域划分，获取目标条带后计算条带灰度值从而得到核酸浓度。
6.根据权利要求1所述一种开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置，其特征在于，所述成像检测器(1)选自CMOS图像传感器、CCD图像传感器。
7.根据权利要求1所述一种开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置，其特征在于，所述滤光片(3)透过率大于80％；
所选滤光片(3)为窄带滤光片。
8.根据权利要求1所述一种开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置，其特征在于，所述光源(4)选自LED光源、激光光源。
9.根据权利要求1所述一种开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置，其特征在于，所述开放式电泳槽包括上电泳槽(6)、下电泳槽(7)；
所述上电泳槽(6)、下电泳槽(7)相互配合，所述上电泳槽(6)设有上、下电极、上缓冲液室，所述下电泳槽(7)设有下缓冲液室。
10.一种采用如权利要求1-9中任一项所述的开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置的核酸电泳分离和检测的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
步骤1)在装载凝胶用玻璃(8)中注入凝胶，插上用来形成上样孔的梳子，并待凝胶充分凝固，将电泳缓冲液倒入开放式电泳槽内，在上样孔中加入配置好的核酸分子样品溶液；
步骤2)打开电源，设置电压和电泳时间，开始电泳；
步骤3)在电泳过程中的任意时间或电泳结束后，打开光源和成像检测器，对凝胶进行在实时在线成像，在成像显示检测模块显示记录、拍摄图像，并对核酸电泳的条带进行实时分析，获取核酸的分子量大小、浓度。
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| CN202310785318.4A CN117071033A (zh) | 2023-06-29 | 2023-06-29 | 开放式核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳在线成像分析装置及方法 |
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