CN117043326A

CN117043326A - 包含变体多肽的组合物及其用途

Info

Publication number: CN117043326A
Application number: CN202280020166.2A
Authority: CN
Inventors: S·重; W-C·陆; B·J·希尔伯特; Q·N·韦斯塞尔; L·E·阿尔冯斯; A·J·加里蒂
Original assignee: Abbott Biotechnology
Current assignee: Abbott Biotechnology
Priority date: 2021-03-09
Filing date: 2022-03-09
Publication date: 2023-11-10

Abstract

本发明涉及变体多肽、制备这些变体多肽的方法、用于表征这些变体多肽的方法、包含这些变体多肽的组合物和细胞以及使用这些变体多肽的方法。本发明进一步涉及包含这些变体多肽的复合物、产生这些复合物的方法、用于表征这些复合物的方法、包含这些复合物的细胞以及使用这些复合物的方法。

Description

包含变体多肽的组合物及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年3月9日提交的美国临时申请63/158,738和2021年4月16日提交的美国临时申请63/176,021的优先权，将这些临时申请中的每一个的全部内容特此通过援引并入。

序列表

本申请含有已以ASCII格式以电子方式提交且特此通过援引以其全文并入的序列表。创建于2022年3月7日的所述ASCII副本被命名为A2186-7045WO_SL.txt，并且大小是291,503字节。

背景技术

成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)基因(统称为CRISPR-Cas或CRISPR/Cas系统)是古细菌和细菌中针对外来遗传元件而防御特定物种的适应性免疫系统。

发明内容

正是在上述背景下，本发明提供了优于现有技术的某些优点和进步。

尽管本文披露的本发明不限于特定的优点或功能，但在一些方面，本发明提供了变体多肽，该变体多肽包含与SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个中所示的序列具有至少95％同一性的序列。

在一些实施例中，变体多肽是SEQ ID NO:3的亲本多肽的变体。在一些实施例中，变体多肽包含表2的取代。

在一些实施例中，变体多肽包含以下取代中的一个或多个：E38R、T60R、D89R、S223R、E319R、P353G、L354G、Q355G、D356G、N357G、N358G、Q359G、L360G、K368G、Q421R、T480K、D482K、N501K、L523R、L523K、Q556R、Q556K、V557R、E566K、E566R、E571R、E571K、N579K、E586G、E589K、N620R、Q683K、S722K、和D730R。

在一些方面，本披露提供了变体多肽，该变体多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在以下位置中的一个或多个处的取代：E38、T60、D89、S223、E319、P353、L354、Q355、D356、N357、N358、Q359、L360、K368、Q421、T480、D482、N501、L523、Q556、V557、E566、E571、N579、E586、E589、N620、Q683、S722、和D730。

在一些方面，本披露提供了变体多肽，该变体多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列并且包含以下取代中的一个或多个：E38R、T60R、D89R、S223R、E319R、P353G、L354G、Q355G、D356G、N357G、N358G、Q359G、L360G、K368G、Q421R、T480K、D482K、N501K、L523R、L523K、Q556R、Q556K、V557R、E566K、E566R、E571R、E571K、N579K、E586G、E589K、N620R、Q683K、S722K、和D730R。

在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个中所示的序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:39中所示的序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:51中所示的序列。在一些实施例中，相对于亲本多肽，该变体多肽表现出增加的与RNA指导物的二元复合物形成。在一些实施例中，相对于亲本二元复合物，包含该变体多肽的二元复合物表现出增加的稳定性。在一些实施例中，相对于亲本多肽，该变体多肽表现出增加的核酸酶活性。

在一些方面，本披露提供了包含如本文所述的变体多肽的组合物，其中组合物进一步包含RNA指导物或编码RNA指导物的核酸，其中RNA指导物包含同向重复序列和间隔子序列。

在一些实施例中，同向重复序列与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有至少90％同一性或者包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，同向重复序列与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有至少95％同一性或者包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，同向重复序列是SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或者包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的序列。

在一些实施例中，间隔子序列的长度为约15个核苷酸至约35个核苷酸。在一些实施例中，该间隔子序列与靶核酸的靶链序列结合，并且其中该靶核酸序列的非靶链序列与原型间隔子相邻基序(PAM)序列相邻。在一些实施例中，PAM序列是5’-NNR-3’、5’-TNR-3’、5’-NTTN-3’、5’-NTTR-3’、或5’-TTTN-3’，其中N是任何核苷酸并且R是A或G。在一些实施例中，PAM序列是5’-TTG-3’、5’-TTTG-3’、5’-TTA-3’、5’-TTTA-3’、或5’-ATTG-3’。

在一些实施例中，变体多肽进一步包含核定位信号(NLS)。在一些实施例中，变体多肽进一步包含肽标签、荧光蛋白、碱基编辑结构域、DNA甲基化结构域、组蛋白残基修饰结构域、定位因子、转录修饰因子、光门控因子、化学诱导型因子或染色质可视化因子。

在一些方面，本披露提供了包含核酸的组合物，该核酸编码如本文所述的变体多肽和/或RNA指导物。

在一些实施例中，核酸经密码子优化以用于在细胞中表达。在一些实施例中，核酸可操作地连接至启动子。在一些实施例中，核酸位于载体中。在一些实施例中，该载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体、腺相关载体或单纯疱疹载体。在一些实施例中，变体多肽存在于包含纳米颗粒(例如，脂质纳米颗粒)、脂质体、外泌体、微泡、或基因枪的递送系统中。

在一些方面，本披露提供了细胞，其包含如本文所述的变体多肽或组合物。

在一些实施例中，细胞是真核细胞。在一些实施例中，细胞是哺乳动物细胞或植物细胞。在一些实施例中，细胞是人细胞。

在一些方面，本披露提供了组合物，其包含变体多肽或含有该变体多肽的复合物，其中该变体多肽包含与SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个中所示的序列具有至少95％同一性的序列，并且其中相对于亲本多肽或包含该亲本多肽的复合物，该变体多肽或该复合物表现出增强的酶活性、增强的结合活性、增强的结合特异性、和/或增强的稳定性。

在一些实施例中，变体多肽包含表2的取代。在一些实施例中，变体多肽包含以下取代中的一个或多个：E38R、T60R、D89R、S223R、E319R、P353G、L354G、Q355G、D356G、N357G、N358G、Q359G、L360G、K368G、Q421R、T480K、D482K、N501K、L523R、L523K、Q556R、Q556K、V557R、E566K、E566R、E571R、E571K、N579K、E586G、E589K、N620R、Q683K、S722K、和D730R。

在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个中所示的序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:39中所示的序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:51中所示的序列。

在一些实施例中，该增强的酶活性是增强的核酸酶活性。在一些实施例中，相对于该亲本多肽，该变体多肽表现出增强的与RNA指导物的结合活性。在一些实施例中，相对于该亲本多肽，该变体多肽表现出增强的与RNA指导物的结合特异性。在一些实施例中，该含有该变体多肽的复合物是进一步包含RNA指导物的变体二元复合物，并且相对于亲本二元复合物，该变体二元复合物表现出增强的与靶核酸的结合活性(例如，中靶结合活性)。在一些实施例中，该含有该变体多肽的复合物是进一步包含RNA指导物的变体二元复合物，并且相对于亲本二元复合物，该变体二元复合物表现出增强的与靶核酸的结合特异性(例如，中靶结合特异性)。在一些实施例中，该含有该变体多肽的复合物是进一步包含RNA指导物的变体二元复合物，并且相对于亲本二元复合物，该变体二元复合物表现出增强的稳定性。在一些实施例中，该变体二元复合物和靶核酸形成变体三元复合物，并且相对于亲本三元复合物，该变体三元复合物表现出增加的稳定性。在一些实施例中，相对于该亲本多肽，该变体多肽进一步表现出增强的二元复合物形成、增强的蛋白质-RNA相互作用、和/或降低的与RNA指导物的解离。在一些实施例中，相对于该亲本二元复合物，该变体二元复合物进一步表现出降低的与靶核酸的解离、和/或降低的与非靶核酸的脱靶结合。

在一些实施例中，该增强的酶活性、增强的结合活性、增强的结合特异性、和/或增强的稳定性发生在例如20℃至65℃的温度范围内。在一些实施例中，该增强的酶活性、增强的结合活性、增强的结合特异性、和/或增强的稳定性发生在一定孵育时间范围内。在一些实施例中，该增强的酶活性、增强的结合活性、增强的结合特异性、和/或增强的稳定性发生在具有约7.3至约8.6范围内的pH的缓冲液中。在一些实施例中，当该变体多肽、变体二元复合物、或变体三元复合物的T_m值比该亲本多肽、亲本二元复合物、或亲本三元复合物的T_m值大至少8℃时，该增强的酶活性、增强的结合活性、增强的结合特异性、和/或增强的稳定性发生。

在一些实施例中，该变体多肽包含RuvC结构域或拆分型RuvC结构域。在一些实施例中，该亲本多肽包含SEQ ID NO:3的序列。

在一些实施例中，该RNA指导物包含同向重复序列和间隔子序列。在一些实施例中，同向重复序列与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有至少90％同一性或者包含与SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:7具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，同向重复序列与SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5具有至少95％同一性或者包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，同向重复序列是SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或者包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的序列。在一些实施例中，该间隔子序列的长度为15至35个核苷酸。在一些实施例中，该间隔子序列包含与靶核酸的靶链序列的互补性。

在一些实施例中，该靶核酸包含与原型间隔子相邻基序(PAM)序列相邻的非靶链序列。在一些实施例中，PAM序列是5’-NNR-3’、5’-TNR-3’、5’-NTTN-3’、5’-NTTR-3’、或5’-TTTN-3’，其中N是任何核苷酸并且R是A或G。在一些实施例中，PAM序列是5’-TTG-3’、5’-TTTG-3’、5’-TTA-3’、5’-TTTA-3’、或5’-ATTG-3’。

在一些实施例中，变体多肽进一步包含肽标签、荧光蛋白、碱基编辑结构域、DNA甲基化结构域、组蛋白残基修饰结构域、定位因子、转录修饰因子、光门控因子、化学诱导型因子或染色质可视化因子。

在一些方面，本披露提供了包含核酸的组合物，该核酸编码如本文所述的变体多肽，其中任选地，该核酸经密码子优化以用于在细胞中表达。

在一些实施例中，该编码该变体多肽的核酸可操作地连接至启动子。在一些实施例中，该编码该变体多肽的核酸位于载体中。在一些实施例中，该载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体、腺相关载体或单纯疱疹载体。

在一些实施例中，该组合物存在于包含纳米颗粒(例如，脂质纳米颗粒)、脂质体、外泌体、微泡、或基因枪的递送组合物中。

在一些方面，本披露提供了用于编辑细胞中的基因的方法，该方法包括使该细胞与如本文所述的变体多肽或组合物接触。

在一些方面，本披露提供了编码如本文所述的变体多肽的核酸分子。

在一些实施例中，该核酸分子的序列与选自由SEQ ID NO:59-66组成的组的序列具有95％同一性。

在一些方面，本披露提供了编码SEQ ID NO:39的变体多肽的核酸分子，其中该核酸分子的序列与选自由SEQ ID NO:59-66组成的组的序列具有95％同一性。

在一些实施例中，该核酸分子的序列包含选自由SEQ ID NO:59-66组成的组的序列。

尽管本文披露的本发明不限于特定的优点或功能，但本发明提供了变体多肽和/或包含变体多肽的组合物，其中相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽，变体多肽包含改变，并且其中相对于亲本多肽或包含亲本多肽的复合物，变体多肽或包含变体多肽的复合物表现出增强的酶活性、增强的结合活性、增强的结合特异性、和/或增强的稳定性。

在一些方面，该增强的酶活性是增强的核酸酶活性。

在一些方面，相对于该亲本多肽，该变体多肽表现出增强的与RNA指导物的结合活性。

在一些方面，相对于该亲本多肽，该变体多肽表现出增强的与RNA指导物的结合特异性。

在一些方面，变体多肽和RNA指导物形成变体二元复合物，并且相对于亲本二元复合物，该变体二元复合物表现出增强的与靶核酸的结合活性(例如，中靶结合活性)。

在一些方面，变体多肽和RNA指导物形成变体二元复合物，并且相对于亲本二元复合物，该变体二元复合物表现出增强的与靶核酸的结合特异性(例如，中靶结合特异性)。

在一些方面，变体多肽和RNA指导物形成变体二元复合物，并且相对于亲本二元复合物，该变体二元复合物表现出增强的稳定性。

在一些方面，该变体二元复合物和靶核酸形成变体三元复合物，并且相对于亲本三元复合物，该变体三元复合物表现出增加的稳定性。

在一些方面，相对于该亲本多肽，该变体多肽进一步表现出增强的二元复合物形成、增强的蛋白质-RNA相互作用、和/或降低的与RNA指导物的解离。

在一些方面，相对于该亲本二元复合物，该变体二元复合物进一步表现出降低的与靶核酸的解离、和/或降低的与非靶核酸的脱靶结合。

在一些方面，该增强的酶活性、增强的结合活性、增强的结合特异性、和/或增强的稳定性发生在例如20℃至65℃的温度范围内。

在一些方面，该增强的酶活性、增强的结合活性、增强的结合特异性、和/或增强的稳定性发生在一定孵育时间范围内。

在一些方面，该增强的酶活性、增强的结合活性、增强的结合特异性、和/或增强的稳定性发生在具有约7.3至约8.6范围内的pH的缓冲液中。

在一些方面，当该变体多肽、变体二元复合物、或变体三元复合物的T_m值比该亲本多肽、亲本二元复合物、或亲本三元复合物的T_m值大至少8℃时，该增强的酶活性、增强的结合活性、增强的结合特异性、和/或增强的稳定性发生。

在其他方面，改变包含相对于具有SEQ ID NO:3中所示的序列的亲本多肽的氨基酸序列改变，其中改变包含与具有SEQ ID NO:3中所示的序列的亲本多肽相比的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或更多个)取代、插入、缺失、和/或添加。

在一些方面，改变包含相对于SEQ ID NO:3中所示的亲本多肽序列的氨基酸序列改变，其中改变包含表2中列出的一个或多个氨基酸取代。

在一些方面，改变包含精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、或甘氨酸取代。

在一些方面，改变包含E38R、T60R、D89R、S223R、P353G、L354G、L360G、K368G、E566R、和/或D730R取代。

在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:14-41中的任一个中具有至少90％同一性的氨基酸序列。

在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:14-41中的任一个中具有至少95％同一性的氨基酸序列。

在一些方面，变体多肽包含SEQ ID NO:14-41中的任一个的氨基酸序列。

在一些方面，变体多肽包含RuvC结构域或拆分型RuvC结构域。

在一些方面，变体多肽包含一个或多个催化残基(例如，天冬氨酸或谷氨酸)。在一些方面，一个或多个催化残基包含D336和E545。在一些方面，一个或多个催化残基包含D695、D661、或D636。

在一些方面，包含变体多肽的组合物或复合物进一步包含RNA指导物，并且RNA指导物包含同向重复序列和间隔子序列。

在一些方面，同向重复序列包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

在一些方面，同向重复序列包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的核苷酸序列。

在一些方面，间隔子序列的长度为15至35个核苷酸。

在一些方面，靶核酸包含与间隔子序列中的核苷酸序列互补的序列。

在一些方面，靶核酸与原型间隔子相邻基序(PAM)序列相邻，其中PAM序列包含核苷酸序列，其如5’-NNR-3’、5’-TNR-3’、5’-NTTN-3’、5’-NTTR-3’、或5’-TTTN-3’所示，其中N是任何核苷酸并且R是A或G。在一些方面，PAM序列包含如5’-TTTG-3’所示的核苷酸序列。

在一些方面，靶核酸是单链DNA或双链DNA。

在一些方面，变体多肽进一步包含肽标签、荧光蛋白、碱基编辑结构域、DNA甲基化结构域、组蛋白残基修饰结构域、定位因子、转录修饰因子、光门控因子、化学诱导型因子或染色质可视化因子。

在一些方面，编码变体多肽的核酸经密码子优化以用于在细胞中表达。

在一些方面，编码变体多肽的核酸可操作地连接至启动子。

在一些方面，编码变体多肽的核酸位于载体中。

在一些方面，载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体、腺相关载体或单纯疱疹载体。

在一些方面，组合物存在于递送组合物中，该递送组合物包含纳米颗粒、脂质体、外来体、微泡或基因枪。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含E38R取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含E38R取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置E38处的取代(例如，E38R取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置E38处的取代(例如，E38R取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含T60R取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含T60R取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置T60处的取代(例如，T60R取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置T60处的取代(例如，T60R取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含D89R取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含D89R取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置D89处的取代(例如，D89R取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置D89处的取代(例如，D89R取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含S223R取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含S223R取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置S223处的取代(例如，S223R取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置S223处的取代(例如，S223R取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含P353G取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含P353G取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置P353处的取代(例如，P353G取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置P353处的取代(例如，P353G取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含L354G取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含L354G取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置L354处的取代(例如，L354G取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置L354处的取代(例如，L354G取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含L360G取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含L360G取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置L360处的取代(例如，L360G取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置L360处的取代(例如，L360G取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含K368G取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含K368G取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置K368处的取代(例如，K368G取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置K368处的取代(例如，K368G取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含E566R取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含E566R取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置E566处的取代(例如，E566R取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置E566处的取代(例如，E566R取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含E566K取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含E566K取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置E566处的取代(例如，E566K取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置E566处的取代(例如，E566K取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含D730R取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含D730R取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置D730处的取代(例如，D730R取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置D730处的取代(例如，D730R取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含E319R取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含E319R取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置E319处的取代(例如，E319R取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置E319处的取代(例如，E319R取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含Q355G取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含Q355G取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置Q355处的取代(例如，Q355G取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置Q355处的取代(例如，Q355G取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含D356G取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含D356G取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置D356处的取代(例如，D356G取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置D356处的取代(例如，D356G取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含N357G取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含N357G取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置N357处的取代(例如，N357G取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置N357处的取代(例如，N357G取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含N358G取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含N358G取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置N358处的取代(例如，N358G取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置N358处的取代(例如，N358G取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含Q359G取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含Q359G取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置Q359处的取代(例如，Q359G取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置Q359处的取代(例如，Q359G取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含Q421R取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含Q421R取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置Q421处的取代(例如，Q421R取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置Q421处的取代(例如，Q421R取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含T480K取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含T480K取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置T480处的取代(例如，T480K取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置T480处的取代(例如，T480K取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含D482K取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含D482K取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置D482处的取代(例如，D482K取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置D482处的取代(例如，D482K取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含N501K取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含N501K取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置N501处的取代(例如，N501K取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置N501处的取代(例如，N501K取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含L523R取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含L523R取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置L523处的取代(例如，L523R取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置L523处的取代(例如，L523R取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含L523K取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含L523K取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置L523处的取代(例如，L523K取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置L523处的取代(例如，L523K取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含Q556R取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含Q556R取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置Q556处的取代(例如，Q556R取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置Q556处的取代(例如，Q556R取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含Q556K取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含Q556K取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置Q556处的取代(例如，Q556K取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置Q556处的取代(例如，Q556K取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含V557R取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含V557R取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置V557处的取代(例如，V557R取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置V557处的取代(例如，V557R取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含E571R取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含E571R取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置E571处的取代(例如，E571R取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置E571处的取代(例如，E571R取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含E571K取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含E571K取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置E571处的取代(例如，E571K取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置E571处的取代(例如，E571K取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含N579K取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含N579K取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置N579处的取代(例如，N579K取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置N579处的取代(例如，N579K取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含E586G取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含E586G取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置E586处的取代(例如，E586G取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置E586处的取代(例如，E586G取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含E589K取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含E589K取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置E589处的取代(例如，E589K取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置E589处的取代(例如，E589K取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含N620R取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含N620R取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置N620处的取代(例如，N620R取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置N620处的取代(例如，N620R取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含Q683K取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含Q683K取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置Q683处的取代(例如，Q683K取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置Q683处的取代(例如，Q683K取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含S722K取代。在一些方面，变体多肽包含与SEQ ID NO:3的至少95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3，进一步包含S722K取代。

在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3，包含在位置S722处的取代(例如，S722K取代)。在一些方面，本披露提供了多肽，该多肽包含在SEQ ID NO:3的至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、或35个氨基酸位置处具有一个或多个序列改变(例如，取代、插入、或缺失、或其任何组合)的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:3，这些序列改变中的一个包含在位置S722处的取代(例如，S722K取代)。

本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ IDNO:21的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。本发明还进一步提供了变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。

本发明进一步提供了细胞，其包含本文披露的变体多肽和/或组合物。在一些方面，细胞是真核细胞或原核细胞。在一些方面，细胞是哺乳动物细胞或植物细胞。在一些方面，细胞是人细胞。

本发明进一步提供了制备本文披露的变体多肽和/或组合物的方法。

本发明进一步提供了使变体多肽与本文披露的RNA指导物复合的方法。

本发明进一步提供了使变体二元复合物与本文披露的靶核酸复合的方法。

本发明进一步提供了递送本文披露的变体多肽和/或组合物的方法。

本发明还进一步提供了组合物，组合物包含变体多肽、或含有变体多肽和RNA指导物的复合物，其中相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽，变体多肽包含改变，并且其中相对于亲本多肽或包含亲本多肽和RNA指导物的复合物，变体多肽或复合物表现出增强的酶活性、增强的结合活性、增强的结合特异性、和/或增强的稳定性。

在一些方面，该增强的酶活性是增强的核酸酶活性。

在一些方面，变体多肽包含RuvC结构域或拆分型RuvC结构域。

在一些方面，RNA指导物包含同向重复序列和间隔子序列。

在一些方面，间隔子序列的长度为15至35个核苷酸。

在一些方面，靶核酸与PAM序列相邻，其中PAM序列包含核苷酸序列，其如5’-NNR-3’、5’-TNR-3’、5’-NTTN-3’、5’-NTTR-3’、或5’-TTTN-3’所示，其中N是任何核苷酸并且R是A或G。在一些方面，PAM序列包含如5’-TTTG-3’所示的核苷酸序列。

在一些方面，靶核酸是单链DNA或双链DNA。

在一些方面，编码变体多肽的核酸可操作地连接至启动子。

在一些方面，编码变体多肽的核酸位于载体中。

在一些方面，组合物或复合物存在于递送组合物中，该递送组合物包含纳米颗粒、脂质体、外来体、微泡或基因枪。

本发明进一步提供了细胞，其包含本文披露的变体多肽和/或复合物。在一些方面，细胞是真核细胞或原核细胞。在一些方面，细胞是哺乳动物细胞或植物细胞。在一些方面，细胞是人细胞。

本发明进一步提供了制备本文披露的变体多肽和/或复合物的方法。

本发明进一步提供了递送本文披露的变体多肽和/或复合物的方法。

定义

本发明将相对于特定实施例并参考某些附图进行描述，但本发明不限于此，而仅由权利要求来限定。除非另有说明，否则下文阐述的术语通常应以其常见意义来理解。

除非另外定义，本文所用的科学术语和技术术语具有本领域普通技术人员普遍理解的含义。在任何潜在的歧义情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外部定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数形式，并且复数术语应包括单数形式。除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括(including)”以及其他形式(如“包括(includes和included)”)的使用没有限制性。

通常，本文所述的结合细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的命名是本领域中熟知并且普遍使用的那些。除非另外指明，否则本文提供的方法及技术可根据本领域中熟知的常规方法且如贯穿本说明书所引用及论述的各种通用及更特定参考文献中所描述来进行。酶促反应和纯化方法是根据制造商说明书来进行，如本领域中普遍完成的或如本文所述。结合本文所述的分析化学、合成有机化学、以及医学和药物化学使用的命名，它们的实验室程序和技术是本领域中熟知并且普遍使用的那些。使用标准技术进行化学合成、化学分析、药物制备、配制、递送以及患者的治疗。

为了使本披露可以容易地理解，下面定义了选定的术语。

本文中使用的冠词“一个/种(a/an)”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)该冠词的语法宾语。举例来说，“一个元素”意指一个元素或多于一个元素。

当指可测量的值如量、时距等时，如本文所用的“约”意指涵盖自指定值±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，以及还更优选±0.1％的变化，因为这样的变化适于进行所披露的方法。

如本文所用，术语“活性”是指生物活性。在一些实施例中，核酸酶活性包括核酸酶的酶活性，例如催化能力。例如，核酸酶活性可以包括核酸酶活性。在一些实施例中，核酸酶活性包括结合活性，例如核酸酶与RNA指导物和/或靶核酸的结合活性。

如本文所用，术语“复合物”是指两个或更多个分子的群化。在一些实施例中，复合物包含彼此相互作用(例如，结合、接触、粘附)的多肽和核酸分子。

如本文所用，术语“二元复合物”是指两个分子(例如，多肽和核酸分子)的群化。在一些实施例中，二元复合物是指多肽和靶向部分(例如，RNA指导物)的群化。在一些实施例中，二元复合物是指核糖核蛋白(RNP)。如本文所用，术语“变体二元复合物”是指变体多肽和RNA指导物的群化。如本文所用，术语“亲本二元复合物”是指亲本多肽和RNA指导物或参考多肽和RNA指导物的群化。

如本文所用，术语“三元复合物”是指三个分子(例如，一个多肽和两个核酸分子)的群化。在一些实施例中，“三元复合物”是指多肽、RNA分子和DNA分子的群化。在一些实施例中，三元复合物是指多肽、靶向部分(例如，RNA指导物)和靶核酸(例如，靶DNA分子)的群化。在一些实施例中，“三元复合物”是指二元复合物(例如，核糖核蛋白)和第三分子(例如，靶核酸)的群化。

如本文所用，术语“结构域”是指多肽的不同功能和/或结构单元。在一些实施例中，结构域可包含保守氨基酸序列。

如本文所用，术语“亲本”、“亲本多肽”和“亲本序列”是指对其进行改变以产生本发明的变体多肽的原始多肽(例如，参考多肽或起始多肽)。

如本文所用，术语“原型间隔子相邻基序”或“PAM”是指与包含效应子(例如，核酸酶)和RNA指导物的复合物所结合的靶序列相邻的DNA序列。在一些实施例中，PAM是酶活性所需的。该“靶核酸”是双链分子：一条链包含与PAM相邻的靶序列并且被称为“PAM链”(例如，非靶链或非间隔子互补链)，而另一条互补链被称为“非-PAM链”(例如，靶链或间隔子互补链)。如本文所用，术语“相邻”包括复合物的RNA指导物与紧邻PAM的靶序列特异性结合、相互作用或缔合的情况。在此类情况下，在靶序列与PAM之间没有核苷酸。术语“相邻”还包括在与靶向部分结合的靶序列与PAM之间存在少数(例如，1、2、3、4或5个)核苷酸的情况。

如本文所用，术语“参考组合物”、“参考分子”、“参考序列”和“参考”是指对照，例如阴性对照或亲本(例如，亲本序列、亲本蛋白质或野生型蛋白质)。例如，参考分子是指与变体多肽进行比较的多肽。同样，参考RNA指导物是指与经修饰的RNA指导物进行比较的靶向部分。变体或经修饰的分子可基于序列(例如，变体或经修饰的分子可与参考分子具有X％序列同一性或同源性)、热稳定性或活性(例如，变体或经修饰的分子可具有参考分子的X％的活性)与参考分子进行比较。例如，变体或经修饰的分子可表征为具有参考多肽的不超过10％的活性，或可表征为具有比参考多肽高至少10％的活性。参考多肽的实例包括天然存在的未经修饰的多肽，例如来自古细菌或细菌物种的天然存在的多肽。在某些实施例中，参考多肽是天然存在的多肽，该多肽与所比较的变体多肽具有最接近的序列同一性或同源性。在某些实施例中，参考多肽是具有天然存在或已知序列的亲本分子，已经在该序列上进行突变以获得变体多肽。

如本文所用，术语“RNA指导物”或“RNA指导物序列”是指促进本文所述的多肽靶向靶核酸的任何RNA分子。例如，RNA指导物可以是识别靶核酸(例如，与其结合)的分子。RNA指导物可以被设计为与靶核酸序列的靶链(例如，非PAM链)互补。RNA指导物包含DNA靶向序列和同向重复(DR)序列。术语CRISPR RNA(crRNA)、前crRNA、成熟crRNA和gRNA在本文中也用于指RNA指导物。如本文所用，术语“前crRNA”是指包含DR-间隔子-DR序列的未加工RNA分子。如本文所用，术语“成熟crRNA”是指前crRNA的加工形式；成熟crRNA可以包含DR-间隔子序列，其中DR是前crRNA的DR的截短形式和/或间隔子是前crRNA的间隔子的截短形式。

如本文所用，术语“基本上相同”是指与参考序列具有一定程度同一性的序列、多核苷酸或多肽。

如本文所用，术语“靶核酸”、“靶序列”和“靶底物”是指与RNA指导物特异性结合的核酸。在一些实施例中，RNA指导物的DNA靶向序列与靶核酸结合。

如本文所用，术语“变体多肽”和“变体核酸酶多肽”是指与亲本多肽相比在一个或多个残基位置处包含改变(例如但不限于，取代、插入、缺失、添加和/或融合)的多肽。如本文所用，术语“变体多肽”和“变体核酸酶多肽”是指与SEQ ID NO:3的多肽相比包含改变的多肽。

附图说明

图1示出通过具有相对于SEQ ID NO:3的取代的变体多肽诱导的AAVS1靶(SEQ IDNO:13)、EMX1靶(SEQ ID NO:9)、和VEGFA靶(SEQ ID NO:11)中的插入缺失(indel)％，如实例7中所述。图1中的变体多肽具有SEQ ID NO:14-17和19-41中所示的氨基酸序列。对应于AAVS1靶的条柱是最左侧两部分针对每个变体的条柱，对应于EMX1靶的条柱是中间两部分针对每个变体的条柱，并且对应于VEGFA靶的条柱是最右侧两部分针对每个变体的条柱。

图2A和图2B示出通过具有相对于SEQ ID NO:3的点取代的变体多肽诱导的AAVS1靶(SEQ ID NO:42)、EMX1靶(SEQ ID NO:46)、和VEGFA靶(SEQ ID NO:44)中的插入缺失％。虚线描绘了SEQ ID NO:3的亲本多肽在三个靶的每一个处的平均插入缺失活性。示出的数据是两个技术重复中每一个的两个生物重复的平均值。

图3示出通过具有相对于SEQ ID NO:3的组合取代的变体多肽诱导的AAVS1靶(SEQID NO:42)、EMX1靶(SEQ ID NO:46)、和VEGFA靶(SEQ ID NO:44)中的插入缺失％。示出的数据是两个技术重复中每一个的两个生物重复的平均值。

具体实施方式

在一些方面，本发明提供了SEQ ID NO:3的多肽的新颖的变体、包含这些变体的组合物、及其制备方法和用途。在其他方面，本发明进一步提供了包含SEQ ID NO:3的多肽的变体的复合物、和组合物、及其制备方法和用途。在一些方面，本文描述了包含具有一个或多个特性的复合物的组合物。在一些方面，描述了递送包含复合物的组合物的方法。

组合物

在一些实施例中，本发明的组合物包括相对于亲本多肽，表现出增强的酶活性、增强的结合活性、增强的结合特异性、和/或增强的稳定性的变体多肽。在一些实施例中，本发明的组合物包括复合物，其包含相对于亲本复合物，表现出增强的酶活性、增强的结合活性、增强的结合特异性、和/或增强的稳定性的变体多肽。

在一些实施例中，本发明的组合物包括变体多肽和RNA指导物。在一些实施例中，本发明的组合物包括包含变体多肽和RNA指导物的变体二元复合物。

在组合物的一些方面，与亲本多肽相比，变体多肽具有增加的与RNA指导物的复合物形成(例如，增加的二元复合物形成)。在组合物的一些方面，与亲本多肽和RNA指导物相比，变体多肽和RNA指导物具有更大的结合亲和力。在组合物的一些方面，与亲本多肽和RNA指导物相比，变体多肽和RNA指导物具有更强的蛋白质-RNA相互作用(例如离子相互作用)。在组合物的一些方面，变体二元复合物比亲本二元复合物更稳定。

在一些实施例中，本发明的组合物包括变体多肽、RNA指导物和靶核酸。在一些实施例中，本发明的组合物包括变体三元复合物，其包含变体多肽、RNA指导物和靶核酸。

在组合物的一些方面，与亲本多肽相比，变体多肽具有增加的与RNA指导物和靶核酸的复合物形成(例如，增加的三元复合物形成)。在组合物的一些方面，与亲本多肽和RNA指导物(例如，亲本二元复合物)相比，变体多肽和RNA指导物(例如，变体二元复合物)具有更大的对靶核酸的结合亲和力。在组合物的一些方面，变体三元复合物比亲本三元复合物更稳定。

在一些实施例中，本发明的组合物包括本文所述的变体多肽。

变体多肽

在一个实施例中，变体多肽是分离的或纯化的多肽。

在一些实施例中，本发明的变体多肽是亲本多肽的变体，其中亲本由包含核苷酸序列例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多核苷酸编码，或者包含氨基酸序列例如SEQ IDNO:3。参见表1。

表1.对应于SEQ ID NO:1-3的序列。

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编码本文所述的亲本多肽的核酸序列可与参考核酸序列(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)基本上相同。在一些实施例中，变体多肽由包含以下序列的核酸编码：该序列与参考核酸序列(例如，编码亲本多肽的核酸序列，例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％序列同一性。可以通过检查两个最佳比对的核酸序列或通过使用软件程序或算法(例如，BLAST、ALIGN、CLUSTAL)使用标准参数人工确定两个此类核酸之间的同一性百分比。两个核酸序列基本上相同的一个指示是核酸分子在严格条件下(例如，在中等至高度严格的范围内)与另一个核酸分子的互补序列杂交。

在一些实施例中，变体多肽由以下核酸序列编码：该核酸序列与参考核酸序列(例如，编码亲本多肽的核酸序列，例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高序列同一性，但非100％序列同一性。

在一些实施例中，本发明的变体多肽包含与SEQ ID NO:3具有50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％但非100％同一性的多肽序列。在一些实施例中，本发明的变体多肽包含与SEQ ID NO:3具有大于50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％但非100％同一性的多肽序列。

在一些实施例中，本发明描述了变体多肽，该多肽与一个或多个参考多肽(例如，亲本多肽)具有指定程度的氨基酸序列同一性，例如与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％但非100％序列同一性。同源性或同一性可以例如使用如本文所述的程序(诸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL)通过氨基酸序列比对来确定。在一些实施例中，变体多肽保持将该多肽与其相应的亲本/参考序列区分开的氨基酸变化(或这些变化中的至少1、2、3、4、5个等)。

在一些实施例中，变体多肽包含在亲本多肽的一个或多个(例如，几个)氨基酸处的改变，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、162、164、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、193、194、195、196、197、198、199、200个或更多个氨基酸被改变。

在一些实施例中，变体多肽包含表2中列出的氨基酸取代中的一个或多个。

表2.SEQ ID NO:3的变体中的单个氨基酸取代。

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在一些实施例中，变体多肽包含增加变体多肽与RNA指导物的相互作用的改变。在一些实施例中，增加与RNA指导物的相互作用的改变是精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、或组氨酸取代。在一些实施例中，变体多肽包含增加变体多肽与靶核酸的相互作用的改变。在一些实施例中，增加与靶核酸的相互作用的改变是精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、或组氨酸取代。在一些实施例中，变体多肽包含丙氨酸取代。在一些实施例中，变体多肽包含甘氨酸取代。

在一些实施例中，变体多肽包含从P353到L360的一个或多个取代。例如，在一些实施例中，变体多肽包含以下取代中的一个或多个：P353G、L354G、Q355G、D356G、N357G、N358G、Q359G、和L360G。在一些实施例中，变体包含一个或多个N-末端精氨酸取代。

在一些实施例中，变体多肽包含：在E38处的取代、在T60处的取代、在D89处的取代、在S223处的取代、在P353处的取代、在L354处的取代、在L360处的取代、在K368处的取代、在E566处的取代、和/或在D730处的取代。在一些实施例中，在E38处的取代是E38R取代，在T60处的取代是T60R取代，在D89处的取代是D89R取代，在S223处的取代是S223R取代，在P353处的取代是P353G取代，在L354处的取代是L354G取代，在L360处的取代是L360G取代，在K368处的取代是K368G取代，在E566处的取代是E566R取代，和/或在D730处的取代是D730R取代。在一些实施例中，变体多肽是包含以下的双突变体、三重突变体、四重突变体、或五重突变体：在E38处的取代、在T60处的取代、在D89处的取代、在S223处的取代、在P353处的取代、在L354处的取代、在L360处的取代、在K368处的取代、在E566处的取代、和/或在D730处的取代。在一些实施例中，变体多肽是包含以下的双突变体、三重突变体、四重突变体、或五重突变体：E38R取代、T60R取代、D89R取代、S223R取代、P353G取代、L354G取代、L360G取代、K368G取代、E566R取代、和/或D730R取代。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:14具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:14具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含L354G取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:15具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:15具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含K368G取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含E566R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:17具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:17具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D730R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:18具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:18具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代和L354G取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:19具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:19具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代和D730R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:20具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:20具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含L354G取代和K386G取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:21具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:21具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含L345G取代和D730R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:22具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:22具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含K368G取代和E566R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含K368G取代和D730R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:24具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:24具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含E566R取代和D730R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:25具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:25具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、L354G取代、和K368G取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:26具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:26具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、L354G取代、和E566R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:27具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:27具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、L354G取代、和D730R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:28具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:28具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、K368G取代、和E566R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:29具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:29具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、K368G取代、和D730R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:30具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:30具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:30中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、E566R取代、和D730R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:31具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:31具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含L354G取代、K368G取代、和E566R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:32具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:32具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含L354G取代、K368G取代、和D730R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:33具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:33具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:33中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含L354G取代、E566R取代、和D730R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:34具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:34具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含L354G取代、E566R取代、和D730R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:35具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:35具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、L354G取代、K368G取代、和E566R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:36具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:36具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、L354G取代、K368G取代、和D730R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:37具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:37具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、L354G取代、E566R取代、和D730R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:38具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:38具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、K368G取代、E566R取代、和D730R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:39具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:39具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:39中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含L354G取代、K368G取代、E566R取代、和D730R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:40具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:40具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ IDNO:40中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、L354G取代、K368G取代、E566R取代、和D730R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:41具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:41具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQID NO:41中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、K368G取代、E566R取代、D730R取代、T60R取代、和D356G取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:49具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:49具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:49中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、K368G取代、E566R取代、D730R取代、T60R取代、D356G取代、和P353G取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:50具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:50具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:50中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、K368G取代、E566R取代、D730R取代、T60R取代、D356G取代、和E571R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:51中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、K368G取代、E566R取代、D730R取代、T60R取代、D356G取代、P353G取代、和E571R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:52具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ IDNO:52具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、L354G、E566R取代、D730R取代、和T60R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:53具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:53具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ IDNO:53中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、L354G、E566R取代、D730R取代、和D356G取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:54具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:54具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQID NO:54中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、L354G、E566R取代、D730R取代、T60R取代、和D356G取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:55具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:55具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:55中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、L354G、E566R取代、D730R取代、T60R取代、和P353G取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:56具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:56具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:56中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、L354G、E566R取代、D730R取代、T60R取代、和E571R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:57具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:57具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:57中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含D89R取代、L354G、E566R取代、D730R取代、T60R取代、P353G取代、D356G取代、和E571R取代。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:58具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含与SEQ ID NO:58具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体多肽包含SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:3，变体多肽包含以下突变中的一个或多个：Q683K、E586G、Q556R、D356G、Q421R、Q556K、N579K、N501K、D482K、S722K、Q359G、V557R、N620R、E589K、T480K、L523K、E571R、E571K、E566K、L523R、和E319R。在一些实施例中，SEQ IDNO:14-41或49-48中的任一个的变体多肽进一步包含以下突变中的一个或多个：Q683K、E586G、Q556R、D356G、Q421R、Q556K、N579K、N501K、D482K、S722K、Q359G、V557R、N620R、E589K、T480K、L523K、E571R、E571K、E566K、L523R、和E319R。

在一些实施例中，变体多肽包含至少一个RuvC基序或RuvC结构域。

尽管本文所述的变化可以是一个或多个氨基酸的变化，但变体多肽的变化也可以是实质性的，例如作为氨基和/或羧基末端延伸的多肽融合。例如，变体多肽可含有另外的肽，例如一种或多种肽。另外的肽的实例可包括用于标记的表位肽，诸如多组氨酸标签(His标签)、Myc和FLAG。在一些实施例中，本文所述的变体多肽可以融合到可检测部分，诸如荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(GFP)或黄色荧光蛋白(YFP))。

在一些实施例中，变体多肽包含至少一个(例如，两个、三个、四个、五个、六个或更多个)核定位信号(NLS)。在一些实施例中，变体多肽包含至少一个(例如，两个、三个、四个、五个、六个或更多个)核输出信号(NES)。在一些实施例中，变体多肽包含至少一个(例如，两个、三个、四个、五个、六个或更多个)NLS和至少一个(例如，两个、三个、四个、五个、六个或更多个)NES。

在一些实施例中，本文所述的变体多肽可以是自灭活的。参见Epstein等人,“Engineering a Self-Inactivating CRISPR System for AAV Vectors[工程化用于AAV载体的自灭活的CRISPR系统],”Mol.Ther.[分子疗法],24(2016):S50，将该文献通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，编码本文所述的变体多肽的核苷酸序列可以经密码子优化以用于特定的宿主细胞或生物体。例如，核酸可以经密码子优化以用于任何非人真核生物，包括小鼠、大鼠、兔、狗、家畜或非人灵长类动物。密码子使用表是易于获得的，例如在www.kazusa.orjp/codon/上可获得的“密码子使用数据库(Codon Usage Database)”中，并且这些表可以按多种方式进行改编。参见Nakamura等人Nucl.Acids Res.[核酸研究]28:292(2000)，将其通过援引以其全文并入本文。用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可获得的，诸如基因制造(Gene Forge)(Aptagen公司；宾夕法尼亚州雅各布斯(Jacobus,PA))。

编码SEQ ID NO:39的变体多肽的核苷酸序列在表3中示出。在一些实施例中，SEQID NO:59-66中的任一个的核苷酸序列可以经修饰以编码变体多肽，相对于SEQ ID NO:3，该变体多肽包含D89R取代、K368G取代、E566R取代、D730R取代、和本文所述的一个或多个另外的取代。

表3.对应于SEQ ID NO:59-66的序列。

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变体多肽的功能性

如本文所用，“生物活性部分”是保留亲本多肽(例如，“最小”或“核心”结构域)的至少一种功能(例如，完全地、部分地、最低限度地)的部分。在一些实施例中，变体多肽保留至少与亲本多肽一样活性的酶活性。因此，在一些实施例中，变体多肽具有比亲本多肽更大的酶活性。

在一些实施例中，变体多肽具有降低的核酸酶活性，或者是核酸酶死亡型(nuclease dead)多肽。如本文所用，本文披露的多肽的催化残基包含D336和E545。在一些实施例中，相对于亲本多肽，包含在D336和E545处的取代(例如，D336A和E545A)的变体多肽表现出降低的核酸酶活性或没有表现出核酸酶活性。在一些实施例中，相对于亲本多肽，包含在D695、D661、或D636处的取代(例如，D695A、D661A、或D636A)的变体多肽表现出降低的核酸酶活性或没有表现出核酸酶活性。

在一个方面，本发明提供了用于将改变或突变导入亲本多肽序列中以增强二元复合物形成、RNA指导物结合活性和/或RNA指导物结合特异性的方法。

在一个方面，本发明还提供了用于将改变或突变导入亲本多肽序列中以增强三元复合物形成、中靶结合亲和力、中靶结合活性、中靶结合和/或中靶结合特异性的方法。在一个方面，本发明还提供了用于将改变或突变引入亲本多肽序列中以增强二元复合物(例如，核糖核蛋白)的中靶结合亲和力(例如，与靶相互作用的亲和力或时间)、中靶结合活性、中靶结合(例如，与靶相互作用的强度)和/或中靶结合特异性(例如，对特定靶的偏好)的方法。在一些实施例中，将改变或突变引入亲本多肽序列中以产生具有增加的中靶结合和/或活性的变体多肽。而且，在这样的实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽中的脱靶结合和/或活性可以降低。此外，有关中靶结合与脱靶结合的特异性可以增加或降低。在一些实施例中，将改变或突变引入亲本多肽序列以产生变体多肽，该变体多肽在与RNA指导物复合时具有增加的中靶结合。而且，在这样的实施例中，包含变体多肽和RNA指导物的复合物中的脱靶结合可以降低。此外，有关中靶结合/活性与脱靶结合/活性的特异性可以增加或降低。在某些实施例中，将改变或突变引入亲本多肽序列以产生增强稳定性和/或蛋白质-RNA相互作用的变体多肽。在某些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽包括促进变体多肽的稳定性和/或RNA相互作用以及酶活性的至少一种改变。

在一些实施例中，本发明的变体多肽具有相当于或大于亲本多肽的酶活性。在一些实施例中，本发明的变体多肽在从约20℃至约90℃的温度范围下具有酶活性。在一些实施例中，本发明的变体多肽在约20℃至约25℃的温度下或在约37℃的温度下具有酶活性。

在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽包含增强对RNA的亲和力(例如RNA亲和力)的至少一个改变。在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽在比20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中约任一个低的温度下表现出增强的RNA亲和力。在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽在具有约7.3至约8.6范围内的pH的缓冲液中表现出增强的RNA亲和力。在一些实施例中，当变体多肽的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、或20℃时，与亲本多肽相比，变体多肽表现出增强的RNA亲和力。在一个实施例中，当变体多肽的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少8℃时，变体多肽表现出增强的RNA亲和力。

在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽包含增强与RNA指导物的复合物形成(例如，二元复合物形成)的至少一个改变。在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽在比20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中约任一个低的温度下表现出增强的二元复合物形成。在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽在具有约7.3至约8.6范围内的pH的缓冲液中表现出增强的二元复合物形成。在一些实施例中，当变体多肽的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、或20℃时，与亲本多肽相比，变体多肽表现出增强的二元复合物形成。在一个实施例中，当变体多肽的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少8℃时，变体多肽表现出增强的二元复合物形成。

在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽包含增强与RNA指导物的结合活性的至少一个改变。在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽在比20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中约任一个低的温度下表现出增强的RNA指导物结合活性。在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽在具有约7.3至约8.6范围内的pH的缓冲液中表现出增强的RNA指导物结合活性。在一些实施例中，当变体多肽的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、或20℃时，与亲本多肽相比，变体多肽表现出增强的RNA指导物结合活性。在一个实施例中，当变体多肽的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少8℃时，变体多肽表现出增强的RNA指导物结合活性。

在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽包含增强与RNA指导物的结合特异性的至少一个改变。在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽在比20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中约任一个低的温度下表现出增强的RNA指导物结合特异性。在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽在具有约7.3至约8.6范围内的pH的缓冲液中表现出增强的RNA指导物结合特异性。在一些实施例中，当变体多肽的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、或20℃时，与亲本多肽相比，变体多肽表现出增强的RNA指导物结合特异性。在一个实施例中，当变体多肽的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少8℃时，变体多肽表现出增强的RNA指导物结合特异性。

在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽包含增强蛋白质-RNA相互作用的至少一个改变。在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽在比20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中约任一个低的温度下表现出增强的蛋白质-RNA相互作用。在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽在具有约7.3至约8.6范围内的pH的缓冲液中表现出增强的蛋白质-RNA相互作用。在一些实施例中，当变体多肽的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、或20℃时，与亲本多肽相比，变体多肽表现出增强的蛋白质-RNA相互作用。在一个实施例中，当变体多肽的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少8℃时，变体多肽表现出增强的蛋白质-RNA相互作用。

在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽包含增强蛋白质稳定性的至少一个改变。在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽在比20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中约任一个低的温度下表现出增强的蛋白质稳定性。在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽在具有约7.3至约8.6范围内的pH的缓冲液中表现出增强的蛋白质稳定性。在一些实施例中，当变体多肽的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、或20℃时，与亲本多肽相比，变体多肽表现出增强的蛋白质稳定性。在一个实施例中，当变体多肽的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少8℃时，变体多肽表现出增强的蛋白质稳定性。

在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽包含降低与RNA指导物的解离(例如，二元复合物解离)的至少一个改变。在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽在比20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中约任一个低的温度下表现出降低的与RNA指导物的解离。在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽在具有约7.3至约8.6范围内的pH的缓冲液中表现出降低的与RNA指导物的解离。在一些实施例中，当变体多肽的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、或20℃时，与亲本多肽相比，变体多肽表现出降低的与RNA指导物的解离。在一个实施例中，当变体多肽的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少8℃时，变体多肽表现出降低的与RNA指导物的解离。在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽在10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时或更长时间中的至少任一个的孵育期内表现出降低的与RNA指导物的解离。在一些实施例中，变体核糖核蛋白(RNP)复合物不与不同的RNA交换RNA指导物。

在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽包含增强与RNA指导物和靶核酸的三元复合物形成的至少一个改变。在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽在比20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中约任一个低的温度下表现出增强的三元复合物形成。在一些实施例中，与亲本多肽相比，变体多肽在具有约7.3至约8.6范围内的pH的缓冲液中表现出增强的三元复合物形成。在一些实施例中，当变体多肽的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、或20℃时，与亲本多肽相比，变体多肽表现出增强的三元复合物形成。在一个实施例中，当变体多肽的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少8℃时，变体多肽表现出增强的三元复合物形成。

在一些实施例中，变体多肽包含至少一个改变，使得与亲本二元复合物相比，包含变体多肽的二元复合物(例如，变体二元复合物)表现出增强的对靶核酸的结合亲和力。在一些实施例中，与亲本二元复合物相比，变体二元复合物在比20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中约任一个低的温度下表现出增强的对靶核酸的结合亲和力。在一些实施例中，与亲本二元复合物相比，变体二元复合物在具有约7.3至约8.6范围内的pH的缓冲液中表现出增强的对靶核酸的结合亲和力。在一些实施例中，当变体二元复合物的T_m值比亲本二元复合物的T_m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、或20℃时，与亲本二元复合物相比，变体二元复合物表现出增强的对靶核酸的结合亲和力。在一个实施例中，当变体二元复合物的T_m值比亲本二元复合物的T_m值大至少8℃时，变体二元复合物表现出增强的对靶核酸的结合亲和力。

在一些实施例中，变体多肽包含至少一个改变，使得与亲本二元复合物相比，包含变体多肽的二元复合物(例如，变体二元复合物)表现出增强的中靶结合活性。在一些实施例中，与亲本二元复合物相比，变体二元复合物在比20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中约任一个低的温度下表现出增强的中靶结合活性。在一些实施例中，与亲本二元复合物相比，变体二元复合物在具有约7.3至约8.6范围内的pH的缓冲液中表现出增强的中靶结合活性。在一些实施例中，当变体二元复合物的T_m值比亲本二元复合物的T_m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、或20℃时，与亲本二元复合物相比，变体二元复合物表现出增强的中靶结合活性。在一个实施例中，当变体二元复合物的T_m值比亲本二元复合物的T_m值大至少8℃时，变体二元复合物表现出增强的中靶结合活性。

在一些实施例中，变体多肽包含至少一个改变，使得与亲本二元复合物相比，包含变体多肽的二元复合物(例如，变体二元复合物)表现出增强的中靶结合特异性。在一些实施例中，与亲本二元复合物相比，变体二元复合物在比20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中约任一个低的温度下表现出增强的中靶结合特异性。在一些实施例中，与亲本二元复合物相比，变体二元复合物在具有约7.3至约8.6范围内的pH的缓冲液中表现出增强的中靶结合特异性。在一些实施例中，当变体二元复合物的T_m值比亲本二元复合物的T_m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、或20℃时，与亲本二元复合物相比，变体二元复合物表现出增强的中靶结合特异性。在一个实施例中，当变体二元复合物的T_m值比亲本二元复合物的T_m值大至少8℃时，变体二元复合物表现出增强的中靶结合特异性。

在一些实施例中，变体多肽包含至少一个改变，使得与亲本二元复合物相比，包含变体多肽的二元复合物(例如，变体二元复合物)表现出降低的与非靶核酸的脱靶结合。在一些实施例中，与亲本二元复合物相比，变体二元复合物在比20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中约任一个低的温度下表现出降低的与非靶核酸的脱靶结合。在一些实施例中，与亲本二元复合物相比，变体二元复合物在具有约7.3至约8.6范围内的pH的缓冲液中表现出降低的与非靶核酸的脱靶结合。在一些实施例中，当变体多肽的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、或20℃时，与亲本二元复合物相比，变体二元复合物表现出降低的与非靶核酸的脱靶结合。在一个实施例中，当变体二元复合物的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少8℃时，变体二元复合物表现出降低的与非靶核酸的脱靶结合。

在一些实施例中，变体多肽包含至少一个改变，使得与亲本二元复合物相比，包含变体多肽的二元复合物(例如，变体二元复合物)表现出降低的与靶核酸的解离。在一些实施例中，与亲本二元复合物相比，变体二元复合物在比20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中约任一个低的温度下表现出降低的与靶核酸的解离。在一些实施例中，与亲本二元复合物相比，变体二元复合物在具有约7.3至约8.6范围内的pH的缓冲液中表现出降低的与靶核酸的解离。在一些实施例中，当变体多肽的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、或20℃时，与亲本二元复合物相比，变体二元复合物表现出降低的与靶核酸的解离。在一个实施例中，当变体二元复合物的T_m值比亲本多肽的T_m值大至少8℃时，变体二元复合物表现出降低的与靶核酸的解离。

在一些实施例中，变体多肽包含至少一个改变，使得与亲本三元复合物相比，包含变体多肽的三元复合物(例如，变体三元复合物)表现出增强的稳定性。在一些实施例中，与亲本三元复合物相比，变体三元复合物在比20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中约任一个低的温度下表现出增强的稳定性。在一些实施例中，与亲本三元复合物相比，变体三元复合物在具有约7.3至约8.6范围内的pH的缓冲液中表现出增强的稳定性。在一些实施例中，当变体三元复合物的T_m值比亲本三元复合物的T_m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、或20℃时，与亲本三元复合物相比，变体三元复合物表现出增强的稳定性。在一个实施例中，当变体三元复合物的T_m值比亲本三元复合物的T_m值大至少8℃时，变体三元复合物表现出增强的稳定性。

在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽表现出(a)降低的酶活性和(b)增强的RNA亲和力的变体多肽。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽表现出(a)增加的酶活性和(b)增强的RNA亲和力的变体多肽。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽表现出(a)保留的酶活性和(b)增强的RNA亲和力的变体多肽。在一些实施例中，具有如本文所述的特征的变体多肽包含与SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽表现出(a)降低的酶活性和(b)增强的二元复合物形成的变体多肽。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ IDNO:3的亲本多肽表现出(a)增加的酶活性和(b)增强的二元复合物形成的变体多肽。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽表现出(a)保留的酶活性和(b)增强的二元复合物形成的变体多肽。在一些实施例中，具有如本文所述的特征的变体多肽包含与SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽表现出(a)降低的酶活性和(b)增强的RNA指导物结合活性的变体多肽。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQID NO:3的亲本多肽表现出(a)增加的酶活性和(b)增强的RNA指导物结合活性的变体多肽。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ IDNO:3的亲本多肽表现出(a)保留的酶活性和(b)增强的RNA指导物结合活性的变体多肽。在一些实施例中，具有如本文所述的特征的变体多肽包含与SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽表现出(a)降低的酶活性和(b)增强的RNA指导物结合特异性的变体多肽。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽表现出(a)增加的酶活性和(b)增强的RNA指导物结合特异性的变体多肽。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽表现出(a)保留的酶活性和(b)增强的RNA指导物结合特异性的变体多肽。在一些实施例中，具有如本文所述的特征的变体多肽包含与SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽表现出(a)降低的酶活性和(b)增强的蛋白质-RNA相互作用的变体多肽。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQID NO:3的亲本多肽表现出(a)增加的酶活性和(b)增强的蛋白质-RNA相互作用的变体多肽。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ IDNO:3的亲本多肽表现出(a)保留的酶活性和(b)增强的蛋白质-RNA相互作用的变体多肽。在一些实施例中，具有如本文所述的特征的变体多肽包含与SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽表现出(a)降低的酶活性和(b)增强的蛋白质稳定性的变体多肽。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ IDNO:3的亲本多肽表现出(a)增加的酶活性和(b)增强的蛋白质稳定性的变体多肽。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽表现出(a)保留的酶活性和(b)增强的蛋白质稳定性的变体多肽。在一些实施例中，具有如本文所述的特征的变体多肽包含与SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽表现出(a)降低的酶活性和(b)降低的与RNA指导物的解离的变体多肽。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQID NO:3的亲本多肽表现出(a)增加的酶活性和(b)降低的与RNA指导物的解离的变体多肽。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ IDNO:3的亲本多肽表现出(a)保留的酶活性和(b)降低的与RNA指导物的解离的变体多肽。在一些实施例中，具有如本文所述的特征的变体多肽包含与SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽表现出(a)降低的酶活性和(b)增强的三元复合物形成的变体多肽。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ IDNO:3的亲本多肽表现出(a)增加的酶活性和(b)增强的三元复合物形成的变体多肽。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽表现出(a)保留的酶活性和(b)增强的三元复合物形成的变体多肽。在一些实施例中，具有如本文所述的特征的变体多肽包含与SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生形成变体二元复合物的变体多肽，该变体二元复合物相对于包含SEQ ID NO:3的多肽的亲本二元复合物表现出(a)降低的酶活性和(b)增强的对靶核酸的结合亲和力。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生形成变体二元复合物的变体多肽，该变体二元复合物相对于包含SEQ ID NO:3的多肽的亲本二元复合物表现出(a)增加的酶活性和(b)增强的对靶核酸的结合亲和力。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生形成变体二元复合物的变体多肽，该变体二元复合物相对于包含SEQID NO:3的多肽的亲本二元复合物表现出(a)保留的酶活性和(b)增强的对靶核酸的结合亲和力。在一些实施例中，具有如本文所述的特征的变体多肽包含与SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生形成变体二元复合物的变体多肽，该变体二元复合物相对于包含SEQ ID NO:3的多肽的亲本二元复合物表现出(a)降低的酶活性和(b)增强的中靶结合活性。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生形成变体二元复合物的变体多肽，该变体二元复合物相对于包含SEQ ID NO:3的多肽的亲本二元复合物表现出(a)增加的酶活性和(b)增强的中靶结合活性。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生形成变体二元复合物的变体多肽，该变体二元复合物相对于包含SEQ ID NO:3的多肽的亲本二元复合物表现出(a)保留的酶活性和(b)增强的中靶结合活性。在一些实施例中，具有如本文所述的特征的变体多肽包含与SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生形成变体二元复合物的变体多肽，该变体二元复合物相对于包含SEQ ID NO:3的多肽的亲本二元复合物表现出(a)降低的酶活性和(b)增强的中靶结合特异性。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生形成变体二元复合物的变体多肽，该变体二元复合物相对于包含SEQ ID NO:3的多肽的亲本二元复合物表现出(a)增加的酶活性和(b)增强的中靶结合特异性。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生形成变体二元复合物的变体多肽，该变体二元复合物相对于包含SEQ ID NO:3的多肽的亲本二元复合物表现出(a)保留的酶活性和(b)增强的中靶结合特异性。在一些实施例中，具有如本文所述的特征的变体多肽包含与SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生形成变体二元复合物的变体多肽，该变体二元复合物相对于包含SEQ ID NO:3的多肽的亲本二元复合物表现出(a)降低的酶活性和(b)降低的与非靶核酸的脱靶结合。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生形成变体二元复合物的变体多肽，该变体二元复合物相对于包含SEQ ID NO:3的多肽的亲本二元复合物表现出(a)增加的酶活性和(b)降低的与非靶核酸的脱靶结合。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生形成变体二元复合物的变体多肽，该变体二元复合物相对于包含SEQID NO:3的多肽的亲本二元复合物表现出(a)保留的酶活性和(b)降低的与非靶核酸的脱靶结合。在一些实施例中，具有如本文所述的特征的变体多肽包含与SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生形成变体二元复合物的变体多肽，该变体二元复合物相对于包含SEQ ID NO:3的多肽的亲本二元复合物表现出(a)降低的酶活性和(b)降低的与靶核酸的解离。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生形成变体二元复合物的变体多肽，该变体二元复合物相对于包含SEQ ID NO:3的多肽的亲本二元复合物表现出(a)增加的酶活性和(b)降低的与靶核酸的解离。在一些实施例中，将至少一种改变引入SEQ ID NO:3的亲本多肽中以产生形成变体二元复合物的变体多肽，该变体二元复合物相对于包含SEQ ID NO:3的多肽的亲本二元复合物表现出(a)保留的酶活性和(b)降低的与靶核酸的解离。在一些实施例中，具有如本文所述的特征的变体多肽包含与SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

RNA指导物

在一些实施例中，如本文所述的组合物或复合物包含结合靶核酸并且与变体多肽相互作用的靶向部分(例如，RNA指导物、反义寡核苷酸、肽寡核苷酸缀合物)。靶向部分可结合靶核酸(例如，利用对靶核酸的特异性结合亲和力)。

在一些实施例中，靶向部分包含或是RNA指导物。在一些实施例中，RNA指导物将本文所述的变体多肽导向特定核酸序列。阅读特定种类的RNA指导物的以下实例的本领域技术人员将理解，在一些实施例中，RNA指导物具有位点特异性。即，在一些实施例中，RNA指导物与一个或多个靶核酸序列(例如，特异性DNA或基因组DNA序列)特异性缔合，而不与非靶核酸序列(例如，非特异性DNA或随机序列)特异性缔合。

在一些实施例中，如本文所述的组合物包含与本文所述的变体多肽缔合并且将变体多肽导向靶核酸序列(例如，DNA)的RNA指导物。

RNA指导物可靶向(例如，缔合、导向、接触或结合)靶序列(例如，位点特异性序列或位点特异性靶)的一个或多个核苷酸。在一些实施例中，变体核蛋白(例如，变体多肽加RNA指导物)在结合到与RNA指导物中的DNA靶向序列互补的靶核酸(例如，序列特异性底物或靶核酸)时被活化。

在一些实施例中，RNA指导物包含具有约11个核苷酸至约100个核苷酸的长度的间隔子。例如，DNA靶向区段可以具有约11个核苷酸至约80个核苷酸、约11个核苷酸至约50个核苷酸、约11个核苷酸至约40个核苷酸、约11个核苷酸至约30个核苷酸、约11个核苷酸至约25个核苷酸、约11个核苷酸至约20个核苷酸或约11个核苷酸至约19个核苷酸的长度。例如，间隔子可以具有约19个核苷酸至约20个核苷酸、约19个核苷酸至约25个核苷酸、约19个核苷酸至约30个核苷酸、约19个核苷酸至约35个核苷酸、约19个核苷酸至约40个核苷酸、约19个核苷酸至约45个核苷酸、约19个核苷酸至约50个核苷酸、约19个核苷酸至约60个核苷酸、约19个核苷酸至约70个核苷酸、约19个核苷酸至约80个核苷酸、约19个核苷酸至约90个核苷酸、约19个核苷酸至约100个核苷酸、约20个核苷酸至约25个核苷酸、约20个核苷酸至约30个核苷酸、约20个核苷酸至约35个核苷酸、约20个核苷酸至约40个核苷酸、约20个核苷酸至约45个核苷酸、约20个核苷酸至约50个核苷酸、约20个核苷酸至约60个核苷酸、约20个核苷酸至约70个核苷酸、约20个核苷酸至约80个核苷酸、约20个核苷酸至约90个核苷酸或约20个核苷酸至约100个核苷酸的长度。

在一些实施例中，RNA指导物的间隔子通常可被设计成具有介于11个与50个核苷酸之间(例如，11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸)的长度并且与特定靶核酸序列互补。在一些特定的实施例中，RNA指导物可被设计成与例如基因组基因座的特定DNA链互补。在一些实施例中，DNA靶向序列被设计成与例如基因组基因座的特定DNA链互补。

RNA指导物可与参考核酸序列的互补链基本上相同。在一些实施例中，RNA指导物包含与参考核酸序列(例如，靶核酸)的互补链具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％序列同一性的序列。可以通过检查两个最佳比对的核酸序列或通过使用软件程序或算法(例如，BLAST、ALIGN、CLUSTAL)使用标准参数人工确定两个此类核酸之间的同一性百分比。

在一些实施例中，RNA指导物与靶核酸的互补链具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％序列同一性。

在一些实施例中，RNA指导物包含长度介于11个与50个核苷酸(例如，11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸)之间并且与靶核酸至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％互补的间隔子。在一些实施例中，RNA指导物包含与靶DNA序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％互补的序列。在一些实施例中，RNA指导物包含与靶基因组序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％互补的序列。在一些实施例中，RNA指导物包含长度为至多50并且与靶核酸至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％互补的序列(例如，RNA序列)。在一些实施例中，RNA指导物包含与靶DNA序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％互补的序列。在一些实施例中，RNA指导物包含与靶基因组序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％互补的序列。

在某些实施例中，RNA指导物包括与DNA靶向序列连接的同向重复序列、基本上由该序列组成或包含该序列。在一些实施例中，RNA指导物包括同向重复序列和DNA靶向序列或同向重复-DNA靶向序列-同向重复序列。在一些实施例中，RNA指导物包括截短的同向重复序列和DNA靶向序列，这些序列是加工的或成熟的crRNA的典型特征。在一些实施例中，本文所述的变体多肽与RNA指导物形成复合物，并且RNA指导物指导复合物与和RNA指导物的至少一部分互补的位点特异性靶核酸缔合。

在一些实施例中，同向重复序列与表4中所示的序列或表4中所示的序列的一部分具有至少90％同一性。在一些实施例中，同向重复序列与表4中所示的序列或表4中所示的序列的一部分具有至少95％同一性。在一些实施例中，同向重复序列与表4中所示的序列或表4中所示的序列的一部分是相同的。

表4.同向重复序列。

序列标识符	同向重复序列
		SEQ ID NO:4	CCUGUUGUGAAUACUCUUUUAUAGGUAUCAAACAAC
SEQ ID NO:5	CCUGUUGUGAAUACUCUUUAUAGGUAUCAAACAAC

在一些实施例中，同向重复包含如CCUGUUGUGAAUACUC所示的序列(SEQ ID NO:6)。在一些实施例中，同向重复包含如UUAUAGGUAUCAAACAAC所示的序列(SEQ ID NO:7)。

在一些实施例中，本文所述的组合物或复合物包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个)RNA指导物，例如多个RNA指导物。

在一些实施例中，RNA指导物具有类似于例如国际公布号WO 2014/093622和WO2015/070083的结构，将每篇文献的全部内容通过援引并入本文。

除非另有说明，否则本文提供的所有组合物和复合物和多肽都是参考该组合物或复合物或多肽的活性水平而制成的，并且不包括杂质，例如可能存在于市售来源中的残留溶剂或副产物。酶组分重量基于总活性蛋白质。除非另外指明，否则所有百分比和比率均按重量进行计算。除非另外指明，否则所有百分比和比率均基于总组合物计算。在示例性组合物中，酶水平以总组合物的重量计按纯酶表示，除非另有说明，否则成分以总组合物的重量表示。

修饰

RNA指导物或编码变体多肽的任何核酸序列可包括关于参考序列、特别是亲本多核糖核苷酸的一个或多个共价修饰，这些共价修饰包括在本发明的范围内。

示例性修饰可以包括对糖、核碱基、核苷间键(例如，对连接性磷酸盐/磷酸二酯键/磷酸二酯主链)以及任何组合的任何修饰。下面详细描述了本文提供的一些示例性修饰。

RNA指导物或编码变体多肽的组分的任何核酸序列可包括任何有用的修饰，诸如对糖、核碱基或核苷间键(例如，对连接性磷酸盐/磷酸二酯键/磷酸二酯主链)的修饰。嘧啶核碱基的一个或多个原子可被任选取代的氨基、任选取代的硫醇、任选取代的烷基(例如，甲基或乙基)或卤基(例如，氯或氟)替代或取代。在某些实施例中，修饰(例如，一个或多个修饰)存在于糖和核苷间键的每一者中。修饰可以是对核糖核酸(RNA)到脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或它们的杂交体的修饰。本文描述了另外的修饰。

在一些实施例中，修饰可包括化学或细胞诱导的修饰。例如，细胞内RNA修饰的一些非限制性实例由Lewis和Pan在“RNA modifications and structures cooperate toguide RNA-protein interactions[RNA修饰和结构协作指导RNA-蛋白质相互作用]”,NatReviews Mol Cell Biol[自然评论：分子细胞生物学],2017,18:202-210中所描述。

不同的糖修饰、核苷酸修饰和/或核苷间键(例如，主链结构)可存在于序列中的不同位置处。本领域普通技术人员将理解，核苷酸类似物或一个或多个其他修饰可位于序列的任何一个或多个位置处，使得序列的功能基本上不降低。序列可包括约1％至约100％的经修饰的核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任一种或多种)或任何介于中间的百分比(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。

在一些实施例中，糖修饰(例如，2'位置或4'位置处)或序列的一个或多个核糖核苷酸处的糖替代以及主链修饰可包括磷酸二酯键的修饰或替代。序列的特定实例包括但不限于包括经修饰的主链或非天然核苷间键(例如核苷间修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替代)的序列。具有经修饰的主链的序列尤其包括在主链中不具有磷原子的那些。出于本申请的目的，并且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的RNA也可以被认为是寡核苷。在特定的实施例中，序列将包括在其核苷间主链中具有磷原子的核糖核苷酸。

经修饰的序列主链可包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(诸如3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(诸如3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'连接的硼烷磷酸酯、这些酯的2'-5'连接的类似物，以及具有相反极性的那些，其中相邻的核苷单元对3'-5'连接至5'-3'或2'-5'连接至5'-2'。也包括各种盐、混合盐和游离酸形式。在一些实施例中，序列可带负电荷或带正电荷。

可掺入序列中的经修饰的核苷酸可以在核苷间键(例如，磷酸酯主链)上被修饰。在本文中，在多核苷酸主链的上下文中，短语“磷酸酯”和“磷酸二酯”可互换地使用。可以通过用不同的取代基替代一个或多个氧原子来修饰主链磷酸酯基团。此外，经修饰的核苷和核苷酸可以包括用如本文所述的另一核苷间键对未经修饰的磷酸酯部分进行整体替代。经修饰的磷酸酯基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、亚磷酸硒酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate ester)、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧都被硫替代。也可以通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)替代连接氧来修饰磷酸酯接头。

提供α-硫代取代的磷酸酯部分以通过非天然硫代磷酸酯主链连接赋予RNA和DNA聚合物稳定性。硫代磷酸酯DNA和RNA具有增强的核酸酶抗性，并因此在细胞环境中具有更长的半衰期。

在特别的实施例中，经修饰的核苷包括α-硫代-核苷(例如5'-O-(1-硫代磷酸)-腺苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-胞苷(a-硫代胞苷)、5'-O-(1-硫代磷酸)-鸟苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-尿苷或5'-O-(1-硫代磷酸)-假尿苷)。

本文描述了可根据本发明使用的其他核苷间键，包括不含磷原子的核苷间键。

在一些实施例中，序列可包括一个或多个细胞毒性核苷。例如，可将细胞毒性核苷掺入序列中，诸如双功能修饰。细胞毒性核苷可包括但不限于阿糖腺苷、5-氮杂胞苷、4'-硫代阿糖胞苷、环戊烯基胞嘧啶、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、1-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)-胞嘧啶、地西他滨、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、吉西他滨、替加氟和尿嘧啶的组合、替加氟((RS)-5-氟-1-(四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)、曲沙他滨、替扎西他滨、2'-脱氧-2'-亚甲基胞苷(DMDC)和6-巯基嘌呤。其他实例包括氟达拉滨磷酸酯、N4-山嵛酰基-1-β-D-阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、N4-十八烷基-1-β-D-阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、N4-棕榈酰基-1-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)胞嘧啶和P-4055(阿糖胞苷5'-反油酸酯)。

在一些实施例中，序列包括一种或多种转录后修饰(例如，加帽、裂解、多聚腺苷酸化、剪接、poly-A序列、甲基化、酰化、磷酸化、赖氨酸和精氨酸残基的甲基化、乙酰化以及硫醇基团和酪氨酸残基的亚硝基化等)。该一个或多个转录后修饰可以是任何转录后修饰，如已经在RNA中鉴定出的多于一百种不同的核苷修饰中的任一种(Rozenski,J，Crain,P，和McCloskey,J.(1999).The RNA Modification Database:1999update[RNA修饰数据库：1999年更新].Nucl Acids Res[核酸研究]27:196-197)。在一些实施例中，第一分离的核酸包含信使RNA(mRNA)。在一些实施例中，mRNA包含选自由以下组成的组的至少一种核苷：吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧基甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基尿苷、1-牛磺酸基甲基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸基甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷。在一些实施例中，mRNA包含选自由以下组成的组的至少一种核苷：5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮-假异胞苷、1-甲基-1-去氮-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷。在一些实施例中，mRNA包含选自由以下组成的组的至少一种核苷：2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-去氮-2-氨基嘌呤、7-去氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-去氮-2,6-二氨基嘌呤、7-去氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨甲酰基腺苷、N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、2-甲基硫代-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。在一些实施例中，mRNA包含选自由以下组成的组的至少一种核苷：肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-去氮-鸟苷、7-去氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-去氮-鸟苷、6-硫代-7-去氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。

序列沿着分子的整个长度可以被或者可以不被均一地修饰。例如，一种或多种或所有类型的核苷酸(例如，天然存在的核苷酸嘌呤或嘧啶，或者A、G、U、C、I、pU中的任一种或多种或所有)可或可不在序列中或其给定的预定序列区域中被均匀修饰。在一些实施例中，序列包括假尿苷。在一些实施例中，序列包括肌苷，该肌苷可以帮助免疫系统将序列相对于病毒RNA表征为内源性。肌苷的掺入还可以介导改善的RNA稳定性/减少降解。参见例如，Yu,Z.等人(2015)RNA editing by ADAR1 marks dsRNA as“self”[ADAR1进行的RNA编辑将dsRNA标记为“自我”].Cell Res[细胞研究].25,1283-1284，将该文献通过援引以其全文并入。

靶核酸

本文披露的方法适用于多种靶核酸。在一些实施例中，靶核酸是DNA，例如DNA基因座。在一些实施例中，靶核酸是RNA，例如RNA基因座或mRNA。在一些实施例中，靶核酸是单链的(例如，单链DNA)。在一些实施例中，靶核酸是双链的(例如，双链DNA)。在一些实施例中，靶核酸包含单链区和双链区两者。在一些实施例中，靶核酸是线性的。在一些实施例中，靶核酸是环状的。在一些实施例中，靶核酸包含一个或多个经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸、受损核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施例中，靶核酸是未经修饰的。

靶核酸可以具有任何长度，例如约至少100bp、200bp、500bp、1000bp、2000bp、5000bp、10kb、20kb、50kb、100kb、200kb、500kb、1Mb之一或更长。靶核酸也可包含任何序列。在一些实施例中，靶核酸是富含GC的，诸如具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％或更高GC含量中的任一种。在一些实施例中，靶核酸具有至少约70％、80％或更高的GC含量。在一些实施例中，靶核酸是非富含GC的靶核酸中的富含GC的片段。在一些实施例中，靶核酸不是富含GC的。在一些实施例中，靶核酸具有一个或多个二级结构或更高级结构。在一些实施例中，靶核酸不处于凝聚状态，诸如在染色质中，以使变体多肽/RNA指导物复合物不能接近靶核酸。

在一些实施例中，靶核酸存在于细胞中。在一些实施例中，靶核酸存在于细胞核中。在一些实施例中，靶核酸对细胞是内源的。在一些实施例中，靶核酸是基因组DNA。在一些实施例中，靶核酸是染色体DNA。在一个实施例中，靶核酸是染色体外核酸。在一些实施例中，靶核酸是蛋白质编码基因或其功能区(诸如编码区)或调节元件(诸如启动子、增强子、5'或3'非翻译区等)。在一些实施例中，靶核酸是非编码基因，诸如转座子、miRNA、tRNA、核糖体RNA、核酶或lincRNA。在一些实施例中，靶核酸是质粒。

在一些实施例中，靶核酸对细胞是外源的。在一些实施例中，靶核酸是病毒核酸，诸如病毒DNA或病毒RNA。在一些实施例中，靶核酸是水平转移的质粒。在一些实施例中，靶核酸整合在细胞的基因组中。在一些实施例中，靶核酸不整合在细胞的基因组中。在一些实施例中，靶核酸是细胞中的质粒。在一些实施例中，靶核酸存在于染色体外阵列中。

在一些实施例中，靶核酸是分离的核酸，诸如分离的DNA或分离的RNA。在一些实施例中，靶核酸存在于无细胞环境中。在一些实施例中，靶核酸是分离的载体，诸如质粒。在一些实施例中，靶核酸是超纯质粒。

靶核酸是与RNA指导物杂交的靶核酸区段。在一些实施例中，靶核酸仅具有靶核酸的一个拷贝。在一些实施例中，靶核酸具有多于一个拷贝，诸如至少约2、3、4、5、10、100个或更多个拷贝的靶核酸中的任一种。例如，病毒核酸或细菌的基因组中包含重复序列的靶核酸可以由变体核蛋白靶向。

靶序列与如本文所述的本披露的原型间隔子相邻基序或PAM相邻。PAM可以紧邻靶序列，或例如在靶序列的少量(例如，1、2、3、4或5个)核苷酸内。在双链靶的情况下，靶向部分(例如，RNA指导物)与靶的第一链结合，并且如本文所述的PAM序列存在于第二互补链中。在此情况下，PAM序列紧邻与结合部分所结合的第一条链中的序列互补的第二条链中的序列(或在该序列的少量，例如1、2、3、4或5个核苷酸内)。在一些实施例中，序列特异性要求RNA指导物中的间隔子序列与靶核酸的非PAM链完全匹配。在其他实施例中，序列特异性要求RNA指导物中间隔子序列与靶核酸的非PAM链的部分(连续或非连续)匹配。

在一些实施例中，本文所述的RNA指导物或包含RNA指导物和变体多肽的复合物与靶核酸在由RNA指导物和靶序列之间的互补性区域所限定的序列处结合。在一些实施例中，本文所述的PAM序列直接位于靶核酸的靶序列的上游(例如，直接位于靶序列的5’)。在一些实施例中，本文所述的PAM序列直接位于靶核酸的非间隔子互补链(例如，非靶链)上的靶序列的5’。

在一些实施例中，对应于本发明的变体多肽的PAM包括5’-NNR-3’、5’-TNR-3’、5’-NTTN-3’、5’-NTTR-3’、或5’-TTTN-3’。如本文所用，N可以各自是任何核苷酸(例如，A、G、T或C)或其子集(例如，R(A或G)、Y(C或T)、K(G或T)、B(G、T或C)、H(A、C或T))。在一些实施例中，PAM包含5’-TTTG-3’、5’-TTCG-3’、5’-TTAG-3’、5’-TACG-3’、5’-ATTG-3’、5’-ATCG-3’、5’-TCTG-3’、5’-TTGG-3’、5’-CGTG-3’、5’-GTTA-3’、5’-TTAA-3’、5’-TTCA-3’、或5’-TGCG-3’。在一些实施例中，包含本发明的变体多肽的二元复合物结合相邻于5’-NNR-3’、5’-TNR-3’、5’-NTTN-3’、5’-NTTR-3’、或5’-TTTN-3’序列的靶核酸。在一些实施例中，包含本发明的变体多肽的二元复合物结合相邻于5’-TTTG-3’、5’-TTCG-3’、5’-TTAG-3’、5’-TACG-3’、5’-ATTG-3’、5’-ATCG-3’、5’-TCTG-3’、5’-TTGG-3’、5’-CGTG-3’、5’-GTTA-3’、5’-TTAA-3’、5’-TTCA-3’、或5’-TGCG-3’序列的靶核酸。

在一些实施例中，靶核酸存在于靶核酸的易接近区域中。在一些实施例中，靶核酸在靶基因的外显子中。在一些实施例中，靶核酸跨越靶基因的外显子-内含子连接部。在一些实施例中，靶核酸存在于非编码区(诸如基因的调节区)中。在一些实施例中，其中靶核酸对细胞是外源的，靶核酸包含在细胞的基因组中未发现的序列。

合适的DNA/RNA结合条件包括通常存在于细胞中的生理条件。其他合适的DNA/RNA结合条件(例如，无细胞系统中的条件)是本领域已知的；参见例如Sambrook，同上。靶核酸的与RNA指导物互补并与之杂交的链被称为“互补链”，并且靶核酸的与“互补链”互补(因此不与RNA指导物互补)的链被称为“非互补链”。

制备

在一些实施例中，本发明的变体多肽可以通过以下制备：(a)培养产生本发明的变体多肽的细菌，分离变体多肽，任选地，纯化变体多肽，以及使变体多肽与RNA指导物复合。变体多肽也可以通过(b)已知的基因工程技术制备，特别地，通过以下制备：从细菌中分离编码本发明的变体多肽的基因，构建重组表达载体，然后将载体转移到适当的宿主细胞中，该宿主细胞表达RNA指导物，用于在宿主细胞中表达与RNA指导物复合的重组蛋白。可替代地，变体多肽可以通过(c)体外偶联的转录-翻译系统制备，然后与RNA指导物复合。可以用于制备本发明的变体多肽的细菌没有特别限制，只要它们可以产生本发明的变体多肽。细菌的一些非限制性实例包括本文所述的大肠杆菌(E.coli)细胞。

载体

本发明提供了用于表达本文所述的变体多肽的载体或可将编码本文所述的变体的核酸掺入载体中。在一些实施例中，本发明的载体包括编码变体多肽的核苷酸序列。在一些实施例中，本发明的载体包括编码变体多肽的核苷酸序列。

本发明还提供了可用于制备如本文所述的变体多肽或包含变体多肽的组合物的载体。在一些实施例中，本发明包括细胞中的本文所述的组合物或载体。在一些实施例中，本发明包括在细胞中表达包含变体多肽的组合物或者编码变体多肽的载体或核酸的方法。该方法可包括提供组合物(例如，载体或核酸)以及将组合物递送到细胞的步骤。

天然或合成多核苷酸的表达典型地通过将编码感兴趣的基因的多核苷酸(例如，编码变体多肽的核苷酸序列)可操作地连接到启动子并将构建体掺入表达载体中来实现。表达载体没有特别限制，只要它包括编码本发明的变体多肽的多核苷酸并且可以适合于在真核细胞中复制和整合。

典型的表达载体包括可用于表达所希望多核苷酸的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。例如，可使用携带RNA聚合酶识别序列的质粒载体(pSP64、pBluescript等)。包括来源于逆转录病毒如慢病毒的那些载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。载体的实例包括表达载体、复制载体、探针产生载体、和测序载体。可以按病毒载体的形式，将表达载体提供给细胞。

病毒载体技术是本领域众所周知的，并且描述于多种病理学和分子生物学手册。可用作载体的病毒包括但不限于噬菌体病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有复制功能的起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点、和一种或多种选择性标志物。

载体的种类没有特别限制，可以适当地选择可以在宿主细胞中表达的载体。更特别地，取决于宿主细胞的种类，适当地选择启动子序列以确保从多核苷酸表达变体多肽，并且将该启动子序列和多核苷酸插入各种质粒等中的任一种中以制备表达载体。

另外的启动子元件(例如，增强序列)调节转录起始的频率。典型地，这些元件位于起始位点上游30-110bp的区域中，尽管最近已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。取决于启动子，似乎单个元件可以共同地或独立地发挥功能，以激活转录。

此外，本披露不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本披露的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，该分子开关能够当需要该启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达时启动这种表达，或者当不希望表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子、和四环素启动子。

待引入的表达载体还可以含有选择性标志物基因或报告基因或着选择性标志物基因和报告基因二者，从而便于从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞的群体中，鉴定和选择表达性细胞。在其他方面，选择性标志物可以在一段单独的DNA上进行，并且用于共转染程序。选择性标志物和报告基因二者侧翼可以是适当的转录控制序列，以使得能够在宿主细胞中表达。这种标志物的实例包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶基因和新霉素抗性基因；以及用于大肠杆菌和其他细菌培养的四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。通过使用这样的选择标志物，可以确认编码本发明的变体多肽的多核苷酸是否已被转移到宿主细胞中，然后被成功表达。

重组表达载体的制备方法没有特别限制，其实例包括使用质粒、噬菌体或粘粒的方法。

表达方法

本发明包括用于蛋白质表达的方法，该方法包括翻译本文所述的变体多肽。

在一些实施例中，本文所述的宿主细胞用于表达变体多肽。宿主细胞没有特别限制，并且可以优选地使用各种已知的细胞。宿主细胞的特定实例包括细菌，诸如大肠杆菌、酵母(芽殖酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和裂殖酵母粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、线虫(秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans))、爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞和动物细胞(例如，CHO细胞、COS细胞和HEK293细胞)。用于将上述表达载体转移到宿主细胞中的方法(即转化法)没有特别限制，并且可以使用已知的方法，诸如电穿孔、磷酸钙法、脂质体法和DEAE葡聚糖法。

在用表达载体转化宿主后，可培养、培育或繁殖宿主细胞以产生变体多肽。在表达变体多肽后，可以根据常规方法(例如，过滤、离心、细胞破坏、凝胶过滤色谱、离子交换色谱等)收集宿主细胞并且从培养物中纯化变体多肽等。

在一些实施例中，用于变体多肽表达的方法包括翻译变体多肽的至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸、至少300个氨基酸、至少400个氨基酸、至少500个氨基酸、至少600个氨基酸、至少700个氨基酸、至少800个氨基酸、至少900个氨基酸或至少1000个氨基酸。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括翻译变体多肽的约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约150个氨基酸、约200个氨基酸、约250个氨基酸、约300个氨基酸、约400个氨基酸、约500个氨基酸、约600个氨基酸、约700个氨基酸、约800个氨基酸、约900个氨基酸、约1000个氨基酸或更多氨基酸。

多种方法可以用于确定宿主细胞中成熟变体多肽的产生水平。此类方法包括但不限于例如利用对变体多肽具有特异性的多克隆或单克隆抗体或如本文别处所述的标记标签的方法。示例性方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(MA)、荧光免疫测定(FIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。这些和其他测定是本领域熟知的(参见例如Maddox等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]158:1211[1983])。

本披露提供了在细胞中体内表达变体多肽的方法，这些方法包括向宿主细胞提供编码变体多肽的多核糖核苷酸，其中多核糖核苷酸编码变体多肽；在细胞中表达变体多肽；以及从细胞获得变体多肽。

改变或突变的引入

可通过本领域已知的合成方法来产生编码变体多肽或多个变体多肽的核酸序列。使用编码亲本多肽本身的核酸序列作为框架，可以一次插入一个或多个改变或突变以改变编码亲本多肽的核酸序列。沿着同样的思路，可通过在以合成方式合成时将变化引入多肽序列中来改变或突变亲本多肽。这可通过本领域熟知的方法来完成。

产生改变或突变并将它们引入亲本多肽序列中可以使用本领域技术人员已知的任何方法来完成。特别地，在一些实施例中，用于PCR的寡核苷酸引物可用于DNA模板(包括编码变体多肽的核酸序列中的一个或多个改变或突变)的快速合成。位点特异性诱变也可用作通过对基础DNA进行特异性诱变来制备单个肽或者生物学功能等价蛋白或肽的有用技术。该技术进一步提供了结合一个或多个前述考虑通过将一个或多个核苷酸序列变化引入DNA中来制备和测试变体的现有能力。位点特异性诱变允许通过使用编码所希望突变的DNA序列的特异性寡核苷酸序列以及足够数量的相邻核苷酸来产生变体，以提供足够大小和序列复杂性的引物序列，从而在所穿过的缺失连接部的两侧形成稳定的双链体。典型地，长度为约17至25个核苷酸的引物是优选的，序列的连接部的两侧上约5至10个残基被改变。

引入结构变异(诸如作为氨基和/或羧基末端延伸的多肽融合)可以以与将改变或突变引入亲本多肽中类似的方式来完成。可通过将编码另外的肽的适当核酸序列包括到编码亲本多肽或变体多肽的核酸序列中来将另外的肽添加到亲本多肽或变体多肽上。任选地，可通过合成多肽产生来将另外的肽直接附加到变体多肽上。

在一个方面，本发明还提供了用于将改变或突变引入亲本多肽序列中以产生变体多肽的方法，与亲本多肽相比，该变体多肽具有增加的与靶核酸的两个或更多个基因座(例如，2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个)的中靶结合。

在一个方面，本发明还提供了用于将改变或突变引入亲本多肽序列中以产生多个变体多肽(例如，具有相同氨基酸序列的单独的变体多肽)的方法，与多个亲本多肽和RNA指导物相比，多个变体多肽在与多个不同的RNA指导物单独复合时具有增加的与靶核酸的两个或更多个基因座的中靶结合。

在一个方面，本发明还提供了用于将改变或突变引入亲本多肽序列中以产生变体多肽的方法，与亲本多肽相比，该变体多肽具有增加的与靶核酸的两个或更多个靶基因座的中靶三元复合物形成。

在一个方面，本发明还提供了用于将改变或突变引入亲本多肽序列中以产生多个变体多肽(例如，具有相同氨基酸序列的单独的变体多肽)的方法，与多个亲本多肽和RNA指导物相比，多个变体多肽在与多个不同的RNA指导物单独复合时具有增加的与靶核酸的两个或更多个基因座的三元复合物形成。

在一个方面，本发明还提供了用于将改变或突变引入亲本多肽序列中以产生变体多肽的方法，与亲本多肽相比，该变体多肽表现出对数量增加的靶核酸或靶基因座的靶向。

在一个方面，本发明还提供了用于将改变或突变引入亲本多肽序列中以产生多个变体多肽(例如，具有相同氨基酸序列的单独的变体多肽)的方法，与多个亲本多肽和RNA指导物相比，多个变体多肽在与多个不同的RNA指导物单独复合时表现出靶向数量增加的靶核酸或靶基因座。

在一个方面，本发明还提供了用于将改变或突变引入亲本多肽序列中以增强变体多肽的稳定性的方法。变体多肽的稳定性可以通过以下技术测定或可包括但不限于以下技术：热变性测定、热转变测定、差示扫描量热法(DSC)、差示扫描荧光测定法(DSF)、等温滴定量热法(ITC)、脉冲追踪法、漂白追踪法、放线菌酮追踪法、圆二色性(CD)光谱法、结晶和基于荧光的活性测定。

变体二元复合

通常，变体多肽和RNA指导物以约1:1的摩尔比彼此结合以形成变体二元复合物。变体多肽和RNA指导物(单独或一起)不会天然存在。

在一些实施例中，变体多肽可以在宿主细胞中过表达并如本文所述对其进行纯化，然后使其与RNA指导物复合(例如，在试管中)以形成变体核糖核蛋白(RNP)(例如，变体二元复合物)。

在一些实施例中，变体二元复合物在一定孵育时间范围内表现出增加的对靶核酸的结合亲和力、增加的中靶结合活性、增加的中靶结合特异性、增加的与靶核酸的三元复合物形成和/或增加的稳定性。在一些实施例中，变体二元复合物在一定孵育时间范围内表现出降低的与非靶核酸的脱靶结合和/或降低的与靶核酸的解离。在一些实施例中，变体二元复合物在一定孵育时间范围内表现出增加的靶核酸复合物形成、靶核酸活性和/或靶核酸特异性。

在一些实施例中，二元复合物的复合在比20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃或55℃中约任一个低的温度下发生。在一些实施例中，变体多肽在约37℃下在10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时或更长时间中的至少任一个的孵育期内不从RNA指导物解离或与游离RNA结合。在一些实施例中，在二元复合物形成后，变体核糖核蛋白复合物不与不同的RNA交换RNA指导物。

在一些实施例中，使变体多肽和RNA指导物在二元复合缓冲液中复合。在一些实施例中，将变体多肽储存在被二元复合缓冲液替代的缓冲液中以与RNA指导物形成复合物。在一些实施例中，变体多肽储存在二元复合缓冲液中。

在一些实施例中，二元复合缓冲液具有约7.3至8.6范围内的pH。在一个实施例中，二元复合缓冲液的pH为约7.3。在一个实施例中，二元复合缓冲液的pH为约7.4。在一个实施例中，二元复合缓冲液的pH为约7.5。在一个实施例中，二元复合缓冲液的pH为约7.6。在一个实施例中，二元复合缓冲液的pH为约7.7。在一个实施例中，二元复合缓冲液的pH为约7.8。在一个实施例中，二元复合缓冲液的pH为约7.9。在一个实施例中，二元复合缓冲液的pH为约8.0。在一个实施例中，二元复合缓冲液的pH为约8.1。在一个实施例中，二元复合缓冲液的pH为约8.2。在一个实施例中，二元复合缓冲液的pH为约8.3。在一个实施例中，二元复合缓冲液的pH为约8.4。在一个实施例中，二元复合缓冲液的pH为约8.5。在一个实施例中，二元复合缓冲液的pH为约8.6。

变体多肽的热稳定性可以在有利条件下(诸如添加RNA指导物，例如结合RNA指导物)增加。

在一些实施例中，在如本文所述的纯化之前，变体多肽可以在宿主细胞中过表达并与RNA指导物复合。在一些实施例中，将编码变体多肽的mRNA或DNA引入细胞中，使得变体多肽在细胞中表达。还将RNA指导物(其将变体多肽引导到所希望靶核酸)与单个mRNA或DNA构建体同时、分开或依次引入细胞中，使得在细胞中形成必需的核糖核蛋白复合物。

评估变体二元复合物稳定性和功能性

本文在某些实施例中提供了用于鉴定最佳变体多肽/RNA指导物复合物(本文称为变体二元复合物)的方法，这些方法包括(a)组合样品中的变体多肽和RNA指导物以形成变体二元复合物；(b)测量变体二元复合物的值；以及(c)如果变体二元复合物的值大于参考分子的值，则确定变体二元复合物相对于参考分子是最佳的。在一些实施例中，该值可包括但不限于稳定性测量结果(例如，T_m值、热稳定性)、二元复合物形成速率、RNA指导物结合特异性和/或复合物活性。

在一些实施例中，通过以下步骤鉴定最佳变体多肽/RNA指导物复合物(即变体二元复合物)：(a)组合样品中的变体多肽和RNA指导物以形成变体二元复合物；(b)检测变体二元复合物的T_m值；以及(c)如果变体二元复合物的T_m值比参考分子的T_m值或T_m参考值大至少8℃，则确定变体二元复合物是稳定的。

涉及测量变体多肽/RNA指导物复合物(即变体二元复合物)的热稳定性的步骤的方法可包括但不限于确定变体二元复合物的稳定性的方法、确定促进稳定的变体二元复合物的条件的方法、筛选稳定的变体二元复合物的方法以及用于鉴定最佳gRNA以形成稳定的变体二元复合物的方法。在某些实施例中，可测量变体二元复合物的热稳定性值。

另外，在某些实施例中，还可测量参考分子的热稳定性值。在某些实施例中，如果变体二元复合物的测量的热稳定性值大于参考分子的测量的热稳定性值或在相同实验条件下测量的热稳定性参考值，如本文所述，则可将变体二元复合物确定为稳定的。在某些实施例中，参考分子可以是缺少RNA指导物的变体多肽。

在某些实施例中，测量的热稳定性值可以是变性温度值。在这些实施例中，热稳定性参考值是变性温度参考值。在某些实施例中，测量的热稳定性值可以是T_m值。在这些实施例中，热稳定性参考值可以是T_m参考值。在某些实施例中，可使用热转变测定来测量热稳定性值。在某些实施例中，用于测量热稳定性的测定可涉及本文所述的技术，包括但不限于热变性测定、热转变测定、差示扫描量热法(DSC)、差示扫描荧光测定法(DSF)、等温滴定量热法(ITC)、脉冲追踪法、漂白追踪法、放线菌酮追踪法、圆二色性(CD)光谱法、结晶和基于荧光的活性测定。

在某些实施例中，如果变体二元复合物的变体多肽/RNA指导物复合物形成速率、RNA指导物结合特异性和/或复合物活性大于参考分子的值或参考值(例如，亲本多肽/RNA指导物复合物(本文称为亲本二元复合物)的值)，则可鉴定变体二元复合物。例如，在某些实施例中，如果变体二元复合物的变体多肽/RNA指导物复合物形成速率、RNA指导物结合特异性和/或复合物活性的值比参考分子的值或参考值(例如，亲本二元复合物的值)大至少X％，则可鉴定变体二元复合物。在某些实施例中，本文所述的方法可进一步包括多个步骤，这些步骤包括测量如本文所述的变体二元复合物的活性。

变体三元复合

在一些实施例中，如本文所述的变体多肽、RNA指导物和靶核酸形成变体三元复合物(例如，在试管或细胞中)。通常，变体多肽、RNA指导物和靶核酸以约1:1:1的摩尔比彼此缔合以形成变体三元复合物。变体多肽、RNA指导物和靶核酸(单独或一起)不会天然存在。

在一些实施例中，如本文所述的变体二元复合物(例如，变体多肽和RNA指导物的复合物)进一步与靶核酸复合(例如，在试管或细胞中)以形成变体三元复合物。

在一些实施例中，三元复合物的复合在比20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃或55℃中约任一个低的温度下发生。在一些实施例中，变体二元复合物在约37℃下在10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时或更长时间中的至少任一个的孵育期内不从靶核酸解离或与游离核酸(例如，游离DNA)结合。在一些实施例中，在三元复合物形成后，变体二元复合物不与不同的核酸交换靶核酸。

在一些实施例中，变体多肽、RNA指导物和靶核酸在三元复合缓冲液中复合。在一些实施例中，将变体多肽储存在用三元复合缓冲液替代的缓冲液中以与RNA指导物和靶核酸形成复合物。在一些实施例中，将变体多肽储存在三元复合缓冲液中。

在一些实施例中，变体二元复合物和靶核酸在三元复合缓冲液中复合。在一些实施例中，将变体二元复合物储存在用三元复合缓冲液替代的缓冲液中以与靶核酸形成复合物。在一些实施例中，将变体二元复合物储存在三元复合缓冲液中。

在一些实施例中，三元复合缓冲液具有约7.3至8.6范围内的pH。在一个实施例中，三元复合缓冲液的pH为约7.3。在一个实施例中，三元复合缓冲液的pH为约7.4。在一个实施例中，三元复合缓冲液的pH为约7.5。在一个实施例中，三元复合缓冲液的pH为约7.6。在一个实施例中，三元复合缓冲液的pH为约7.7。在一个实施例中，三元复合缓冲液的pH为约7.8。在一个实施例中，三元复合缓冲液的pH为约7.9。在一个实施例中，三元复合缓冲液的pH为约8.0。在一个实施例中，三元复合缓冲液的pH为约8.1。在一个实施例中，三元复合缓冲液的pH为约8.2。在一个实施例中，三元复合缓冲液的pH为约8.3。在一个实施例中，三元复合缓冲液的pH为约8.4。在一个实施例中，三元复合缓冲液的pH为约8.5。在一个实施例中，三元复合缓冲液的pH为约8.6。

变体多肽的热稳定性可以在有利条件下(诸如添加RNA指导物和靶核酸)增加。

评估变体三元复合物稳定性和功能性

本文在某些实施例中提供了用于鉴定最佳变体三元复合物的方法，这些方法包括(a)组合样品中的变体多肽、RNA指导物和靶核酸以形成变体三元复合物；(b)测量变体三元复合物的值；以及(c)如果变体三元复合物的值大于参考分子的值，则确定变体三元复合物相对于参考分子是最佳的。在一些实施例中，该值可包括但不限于稳定性测量结果(例如，T_m值、热稳定性)、三元复合物形成速率、DNA结合亲和力测量结果、DNA结合特异性测量结果和/或复合物活性测量结果(例如，核酸酶活性测量结果)。

在一些实施例中，通过以下步骤鉴定最佳变体三元复合物：(a)组合样品中的变体多肽、RNA指导物和靶核酸以形成变体三元复合物；(b)检测变体三元复合物的T_m值；以及(c)如果变体三元复合物的T_m值比参考分子的T_m值或T_m参考值大至少8℃，则确定变体三元复合物是稳定的。

涉及测量变体三元复合物的热稳定性的步骤的方法可包括但不限于确定变体三元复合物的稳定性的方法、确定促进稳定的变体三元复合物的条件的方法、筛选稳定的变体三元复合物的方法以及用于鉴定最佳二元复合物以形成稳定的变体三元复合物的方法。在某些实施例中，可测量变体三元复合物的热稳定性值。

另外，在某些实施例中，还可测量参考分子的热稳定性值。在某些实施例中，如果测量的变体三元复合物的热稳定性值大于测量的参考分子的热稳定性值或在相同实验条件下测量的热稳定性参考值，如本文所述，则可将变体三元复合物确定为稳定的。在某些实施例中，参考分子可以是缺少RNA指导物和/或靶核酸的变体多肽。

在某些实施例中，测量的热稳定性值可以是变性温度值。在这些实施例中，热稳定性参考值是变性温度参考值。在某些实施例中，测量的热稳定性值可以是T_m值。在这些实施例中，热稳定性参考值可以是T_m参考值。在某些实施例中，可使用热转变测定来测量热稳定性值。在某些实施例中，用于测量热稳定性的测定可涉及本文所述的技术，包括但不限于差示扫描荧光测定法(DSF)、差示扫描量热法(DSC)或等温滴定量热法(ITC)。

在某些实施例中，如果变体三元复合物的三元复合物形成速率、DNA结合亲和力、DNA结合特异性和/或复合物活性(例如，核酸酶活性)大于参考分子的值或参考值(例如，亲本三元复合物的值)，则可鉴定变体三元复合物。例如，在某些实施例中，如果变体三元复合物的三元复合物形成速率、DNA结合亲和力、DNA结合特异性和/或复合物活性的值比参考分子的值或参考值(例如，亲本三元复合物的值)大至少X％，则可鉴定变体三元复合物。在某些实施例中，本文所述的方法可进一步包括多个步骤，这些步骤包括测量如本文所述的变体三元复合物的活性。

递送

可将本文所述的组合物或复合物配制成例如包括载剂(诸如载剂和/或聚合物载剂，例如脂质体)，并且通过已知方法递送到细胞(例如，原核细胞、真核细胞、植物细胞、哺乳动物细胞等)。此类方法包括但不限于转染(例如，脂质介导、阳离子聚合物、磷酸钙、树枝状大分子)；电穿孔或其他破坏膜的方法(例如，核转染)、病毒递送(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV)、显微注射、微粒轰击(“基因枪”)、fugene、直接声波加载、细胞挤压、光转染、原生质体融合、刺穿感染、磁转染、外泌体介导的转移、脂质纳米颗粒介导的转移以及它们的任何组合。

在一些实施例中，该方法包括将一种或多种核酸(例如，编码变体多肽的核酸、RNA指导物、供体DNA等)、它们的一种或多种转录物和/或预形成的变体多肽/RNA指导物复合物(即，变体二元复合物)递送到细胞。示例性细胞内递送方法包括但不限于：病毒或病毒样药剂；基于化学的转染方法，诸如使用磷酸钙、树枝状大分子、脂质体或阳离子聚合物(例如，DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺)的转染方法；非化学方法，诸如显微注射、电穿孔、细胞挤压、声孔效应、光转染、刺穿感染、原生质体融合、细菌缀合、质粒或转座子的递送；基于粒子的方法，诸如使用基因枪、磁转染或磁辅助转染、粒子轰击；以及混合方法，诸如核转染。在一些实施例中，本申请进一步提供了通过此类方法产生的细胞，以及包含此类细胞的或由此类细胞产生的生物体(例如，动物、植物或真菌)。

细胞

可将本文所述的多肽、组合物或复合物递送到多种细胞。在一些实施例中，细胞是分离的细胞。在一些实施例中，细胞在细胞培养物中。在一些实施例中，细胞是离体的。在一些实施例中，细胞从活生物体获得并且维持在细胞培养物中。在一些实施例中，细胞是单细胞生物体。

在一些实施例中，细胞是原核细胞。在一些实施例中，细胞是细菌细胞或来源于细菌细胞。在一些实施例中，细菌细胞与亲本多肽所来源的细菌物种无关。在一些实施例中，细胞是古细菌细胞或来源于古细菌细胞。在一些实施例中，细胞是真核细胞。在一些实施例中，细胞是植物细胞或来源于植物细胞。在一些实施例中，细胞是真菌细胞或来源于真菌细胞。在一些实施例中，细胞是动物细胞或来源于动物细胞。在一些实施例中，细胞是无脊椎动物细胞或来源于无脊椎动物细胞。在一些实施例中，细胞是脊椎动物细胞或来源于脊椎动物细胞。在一些实施例中，细胞是哺乳动物细胞或来源于哺乳动物细胞。在一些实施例中，细胞是人细胞。在一些实施例中，细胞是斑马鱼细胞。在一些实施例中，细胞是啮齿动物细胞。在一些实施例中，细胞是合成制成的，有时称为人工细胞。

在一些实施例中，细胞来源于细胞系。用于组织培养的多种多样的细胞系是本领域已知的。细胞系的实例包括但不限于293T、MF7、K562、HeLa以及它们的转基因品种。细胞系可从本领域技术人员已知的多种来源获得(例如，参见美国典型培养物保藏中心(ATCC)(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,Va.)))。在一些实施例中，将用本文所述的一种或多种核酸(诸如Ago编码载体和gDNA)或Ago-gDNA复合物转染的细胞用于建立包含一种或多种载体来源的序列的新细胞系，以建立包含对靶核酸的修饰的新细胞系。在一些实施例中，将用本文所述的一种或多种核酸(诸如变体多肽编码载体和RNA指导物)或变体多肽/RNA指导物复合物(即变体二元复合物)瞬时或非瞬时转染的细胞或者来源于此类细胞的细胞系用于评估一种或多种测试化合物。

在一些实施例中，该方法包括向宿主细胞中引入一种或多种核酸，该核酸包含编码靶向DNA的RNA(例如，RNA指导物)和/或变体多肽的核苷酸序列。在一个实施例中，包含靶DNA的细胞是体外、体内或离体的。在其他实施例中，包含编码靶向DNA的RNA(例如，RNA指导物)和/或变体多肽的核苷酸序列的核酸包括重组表达载体，例如但不限于腺相关病毒构建体、重组腺病毒构建体、重组慢病毒构建体、重组逆转录病毒构建体等。

在一些实施例中，细胞是原代细胞。例如，可以将原代细胞的培养物传代0次、1次、2次、4次、5次、10次、15次或更多次。在一些实施例中，通过任何已知方法从个体收获原代细胞。例如，可通过单采、白细胞单采、密度梯度分离等收获白细胞。可以通过活检收集组织(诸如皮肤、肌肉、骨髓、脾、肝、胰腺、肺、肠、胃等)的细胞。可使用适当的溶液来分散或悬浮收获的细胞。这种溶液通常可以是平衡盐溶液(例如，生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、汉克平衡盐溶液等)，方便地补充有胎牛血清或其他天然存在的因子，连同低浓度的可接受的缓冲液。缓冲液可以包括HEPES、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液等。可立即使用细胞，或者可将它们储存起来(例如，通过冷冻)。冷冻细胞可以解冻并且能够重复使用。可以将细胞冷冻在DMSO、血清、培养基缓冲液(例如，10％ DMSO、50％血清、40％缓冲培养基)和/或用于在冷冻温度下保存细胞的一些其他这样的常用溶液中。

在一些实施例中，变体多肽具有诱导靶核酸(例如，基因组DNA)中的双链断裂或单链断裂的核酸酶活性。双链断裂可以刺激细胞内源DNA修复途径，包括同源定向重组(HDR)、非同源末端连接(NHEJ)或替代性非同源末端连接(A-NHEJ)。NHEJ可以修复裂解的靶核酸，而无需同源模板。这可以导致一个或多个核苷酸缺失或插入靶核酸中。HDR可以与同源模板(诸如供体DNA)一起发生。同源模板可以包含与靶核酸裂解位点两侧的序列同源的序列。在一些情况下，HDR可以将外源多核苷酸序列插入裂解的靶核酸中。由于NHEJ和/或HDR引起的对靶DNA的修饰可以导致例如突变、缺失、改变、整合、基因矫正、基因替换、基因标记、转基因敲入、基因破坏和/或基因敲除。

在一些实施例中，使细胞培养同步以提高这些方法的效率。在一些实施例中，将处于S和G2期的细胞用于HDR介导的基因编辑。在一些实施例中，可以使细胞在任何细胞周期经受该方法。在一些实施例中，细胞过度铺板显著降低了该方法的功效。在一些实施例中，该方法以不超过约40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％汇合度中的任一个应用于细胞培养物。

在一些实施例中，变体多肽/RNA指导物复合物(即变体二元复合物)在细胞中与靶核酸的结合募集除DNA修复途径之外的一种或多种内源性细胞分子或途径以修饰靶核酸。在一些实施例中，变体二元复合物的结合阻断一种或多种内源性细胞分子或途径接近靶核酸，从而修饰靶核酸。例如，变体二元复合物的结合可阻断内源性转录或翻译机器以降低靶核酸的表达。

在一些实施例中，提供了用于修饰细胞中的靶DNA分子的方法。该方法包括使细胞内的靶DNA分子与以下接触：本文所述的变体多肽和单分子靶向DNA的RNA，该RNA以5'至3'顺序包含与靶DNA分子的靶序列杂交的第一核苷酸区段；核苷酸接头；以及与第一核苷酸区段杂交以形成双链RNA双链体的第二核苷酸区段。变体多肽与细胞内的单分子靶向DNA的RNA形成复合物，靶DNA分子得以修饰。

试剂盒

本发明还提供了可以用于例如实施本文所述的方法的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包括本发明的变体多肽，例如表2的变体。在一些实施例中，试剂盒包括编码这种变体多肽的多核苷酸，并且任选地多核苷酸包含在例如如本文所述的载体内。试剂盒还可以任选地包括例如如本文所述的RNA指导物。本发明的试剂盒的RNA指导物可以被设计成靶向感兴趣的序列，如本领域已知的。可以将变体多肽和RNA指导物包装在试剂盒内的同一小瓶或其他容器内，或者可以包装在单独的小瓶或其他容器中，可以在使用前混合它们的内容物。试剂盒可以另外任选地包括缓冲液以及/或者使用变体多肽和/或RNA指导物的说明书。

本文引用的所有参考文献和出版物特此通过援引并入。

实例

提供以下实例以进一步说明本发明的一些实施例但并非旨在限制本发明的范围；通过它们的示例性性质将理解，可替代地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。

实例1-变体构建体的工程化

在本实例中，产生了变体构建体。

使用从IDT^TM(综合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies,Inc.))订购的诱变正向引物和诱变反向引物，经由两个PCR步骤构建包含单突变的DNA模板。在第一步骤中，在384孔板中进行两组PCR反应以产生两个片段。两个PCR片段的重叠区域含有所希望的单突变并允许经由第二PCR装配整个DNA模板。在第二步骤中，将来自第一步骤的纯化片段用作重叠PCR(OL PCR)的模板，并将与退火至载体主链的Fw和Rv寡核苷酸用作OL PCR引物。所得的线性DNA模板含有T7启动子、T7终止子和多肽的开放阅读框。

将这些线性DNA模板直接用于无细胞转录和翻译系统以表达含有单突变的多肽变体。将变体构建体进一步单独转移到瞬时转染载体中。另外，通过PCR制备包含组合突变的DNA模板，随后将其转移到瞬时转染载体中。

实例2-用于变体二元复合物检测的荧光偏振测定

在本实例中，通过荧光偏振测定来评估野生型或变体核酸酶多肽和RNA指导物形成二元复合物的能力。

通过IDT^TM合成线性ssDNA片段，这些片段包含同向重复序列上游的T7 RNA聚合酶启动子序列的反向互补序列和所希望的20bp RNA指导物靶。然后通过将通用T7正向寡核苷酸(95-4℃，以5℃/分钟)退火至反向互补序列ssDNA并在25℃下用Klenow片段(NewEngland)填充15分钟来产生线性dsDNA体外转录(IVT)模板。然后使用HiScribeT7 High Yield RNA合成试剂盒(New England/>)在37℃下将所得IVT模板转录成RNA指导物，持续4小时。转录后，使用RNA清洁和浓缩试剂盒(兹莫公司(Zymo))纯化每个RNA指导物并将其储存在-20℃下直至使用。

然后用6-羧基荧光素(6-FAM)(IDT^TM)标记RNA指导物。用增加浓度的标记RNA指导物(7.5-250nM)滴定1X测定缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM KCl、5mM MgCl₂、1mMDTT)中的25nM核酸酶多肽(野生型或变体多肽)。将复合物在37℃下孵育30分钟，然后使用酶标仪(200 Pro，帝肯公司(Tecan))进行荧光偏振测量。

还研究了不同温度下的二元复合物形成。如上所述的进一步结合实验在25℃、50℃、60℃和70℃下等温进行。

在用增加浓度的RNA指导物滴定核酸酶多肽(野生型或变体多肽)时形成二元复合物(或在用增加浓度的核酸酶多肽滴定RNA指导物时形成二元复合物)导致荧光偏振信号(以毫偏振(mP)为单位)发生变化。通过绘制荧光偏振信号在RNA指导物浓度范围内的变化来产生结合曲线。

本实例指示可以如何测定和比较核酸酶多肽(野生型或变体多肽)与RNA指导物的结合亲和力。

实例3-用于变体二元复合物检测的RNA电泳迁移率变动测定

本实例描述了使用RNA EMSA来测定核酸酶多肽(野生型或变体)与RNA指导物结合的能力。

使用5’800CW(也称为IR800染料或IR800)用5’末端Tag标记试剂盒(Laboratories)和/>800CW马来酰亚胺(/>Biosciences)标记来自IDT^TM的合成RNA指导物，如先前在Yan等人,2018中详述的。标记后，清洗RNA指导物并经由苯酚氯仿提取对其进行浓缩。通过Nanodrop^TM定量浓度。

对于RNA结合测定，将核酸酶多肽(野生型或变体多肽)在1X结合缓冲液(50mMNaCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、1mM DTT，pH 7.9)中稀释至2.5μM。然后将多肽在1X结合缓冲液中从2.5μM连续稀释至37.5μM。将多肽再次在1X结合缓冲液加50nM IR800标记的RNA指导物中以1:10稀释并充分混合。这些反应可以进一步包括0.5-5μg tRNA，其用作竞争性抑制剂以降低多肽与RNA的非特异性结合，从而促进精确的特异性结合测定。将反应在37℃下孵育1小时。将1μL100X溴酚蓝添加到反应中以实现染料前沿可视化，然后将整个反应加载到6％ DNA阻滞凝胶(ThermoFisher Scientific^TM)上，使其在80V下运行90分钟。在CLx上对凝胶进行成像。

该测定依赖于RNA迁移通过凝胶的速率由其大小决定这一原理。只有RNA的样品能够迁移特定距离。然而，如果RNA与多肽结合，则会出现代表更大、移动性更低的RNA复合物的条带，该条带在凝胶上“上移”。

因此，测量两个条带的强度：1)只有RNA的条带和2)结合多肽的“上移”RNA条带。如果所有RNA都与多肽结合，则仅观察到上移条带。随着多肽的浓度降低，上移条带的强度降低，而只有RNA的条带的强度增加。在比较核酸酶多肽(野生型或变体多肽)的RNA结合亲和力时，较高的多肽/RNA亲和力以在较低浓度的多肽下更特异性的结合为特征。

本实例指示可以如何测定和比较野生型核酸酶多肽与RNA指导物的结合亲和力以及变体多肽与RNA指导物的结合亲和力。

实例4-变体二元复合物的体外裂解测定

本实例描述了用于制备RNP和用于确定RNP的体外生物化学活性的方法。

将编码野生型或变体多肽的载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)(New England)中并使其在T7启动子下表达。使转化的细胞最初在5mL Luria肉汤(TEKNOVA^TM)+50μg/mL卡那霉素中生长过夜，然后将其接种到1L Terrific肉汤培养基(TEKNOVA^TM)+50μg/mL卡那霉素中。使细胞在37℃下生长直至OD₆₀₀为0.6-0.8，然后用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达。然后使培养物在18℃下再生长14-18小时。收获培养物并经由离心沉淀，然后将每5g细胞沉淀重悬于1mL提取缓冲液(50mM HEPES，pH 7.5，500mM NaCl，5％甘油，0.5mM TCEP)中。经由细胞破裂器(恒定系统有限公司(Constant System Limited))裂解细胞，然后在4℃下以20,000x g离心20分钟以澄清裂解物。将0.2％聚乙烯亚胺(PEI)添加到澄清的裂解物中，并在4℃下以恒定的端对端旋转孵育20分钟。然后将裂解物以20,000x g再次离心10分钟。经由离子交换色谱纯化裂解物。纯化后，使级分在SDS-PAGE凝胶上运行，合并含有适当大小蛋白质的级分并使用30kD Amicon Ultra15离心装置浓缩。将蛋白质缓冲液交换到12.5mM HEPES pH 7.0、120mM NaCl、0.5mM TCEP和50％甘油中。然后使用Nanodrop(ThermoFisher Scientific^TM)测量浓度，并将蛋白质储存在-20℃下。

使用2:1比率的合成crRNA(综合DNA技术公司)与蛋白质来制备RNP。使RNP在37℃下在1X NEBuffer^TM 2(NEB2；New England50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mMMgCl₂，1mM DTT，pH 7.9)中复合30分钟。复合后，使用1X NEB2作为稀释缓冲液稀释RNP。以相同的方式制备apo反应(无RNA指导物的蛋白质)，用H₂O补足crRNA的体积。

将靶dsDNA底物(综合DNA技术公司)以20nM添加到RNP和apo样品中。将反应充分混合，然后在37℃下孵育1小时，然后用1μL20mg/mL蛋白酶K(ThermoFisher Scientific^TM)淬灭。将反应在50℃下再孵育15分钟，然后使整个反应在2％琼脂糖E-凝胶(ThermoFisherScientific^TM)上运行。在Gel Doc^TM EZ凝胶成像仪上通过溴化乙锭使凝胶可视化。

测量两种类型的条带的强度：1)全长(未裂解)DNA条带和2)一个或多个下移的裂解DNA条带。无活性RNP以全长DNA条带为特征。活性RNP产生一个或多个下移的裂解DNA条带。随着活性RNP的浓度降低，全长条带的强度增加，并且该一个或多个裂解条带的强度降低。在比较多个RNP的活性时，具有比另一个更高活性的RNP的特征在于在较低RNP浓度下更强的裂解条带。

本实例的方法允许比较野生型或变体RNP(二元复合物)对靶DNA的体外裂解活性。

实例5-变体多肽和变体二元复合物的体外稳定性测定

在本实例中，评估了变体RNP的稳定性。

对于加速稳定性研究，以与实例4中所述相同的方式产生RNP(5μM)，随后将样品在25℃下储存48小时。

对RNP样品进行体外裂解测定(如实例4中所述)。将这些结果与实例4的结果进行比较以确定在25℃下储存48小时的变体RNP保持生物化学活性的程度。

也将apo多肽(无RNA指导物)在25℃下孵育48小时。使用实例3中所述的方法对apo样品进行RNA EMSA测定。将这些结果与实例3的结果进行比较以确定变体多肽能够与RNA指导物形成二元复合物的程度。

使用实例4中所述的方法，使在25℃下孵育48小时的apo样品也与RNA指导物复合以形成RNP。然后根据实例4的方法进行体外裂解测定。将测定结果与实例4的测定结果进行比较以评估在25℃下孵育的与蛋白质形成的变体RNP的活性水平。

本实例的方法允许比较野生型和变体多肽以及野生型和变体RNP(二元复合物)的稳定性。证明与RNA指导物的特异性结合比另一种核酸酶多肽与RNA指导物的特异性结合更大的核酸酶多肽指示更稳定的多肽。证明靶DNA的体外裂解比另一种RNP的裂解更稳健的RNP指示更稳定的二元复合物。

实例6-用于变体三元复合物检测的DNA电泳迁移率变动测定

本实例描述了使用DNA EMSA来测定RNA指导物、核酸酶多肽(野生型或变体多肽)和靶DNA底物形成三元复合物的能力。

将编码野生型或变体多肽的载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)(New England)和BL21(DE3)pLySS/>中。使转化的细胞最初在5mL Luria肉汤(TEKNOVA^TM)+50μg/mL卡那霉素中生长过夜，然后将其接种到1L Terrific肉汤培养基(TEKNOVA^TM)+50μg/mL卡那霉素中。使细胞在37℃下生长直至OD₆₀₀为0.6-0.8，然后用0.5mMIPTG诱导蛋白质表达。然后使培养物在18℃下再生长14-18小时。收获培养物并经由离心沉淀，然后将每5g细胞沉淀重悬于1mL提取缓冲液(50mM HEPES，pH 7.5，500mM NaCl，5％甘油，0.5mM TCEP)中。经由细胞破裂器(恒定系统有限公司)裂解细胞，然后在4℃下以20,000x g离心20分钟以澄清裂解物。将0.2％聚乙烯亚胺(PEI)添加到澄清的裂解物中，并在4℃下以恒定的端对端旋转孵育20分钟。然后将裂解物以20,000x g再次离心10分钟。经由离子交换色谱纯化裂解物。纯化后，使级分在SDS-PAGE凝胶上运行，合并含有适当大小蛋白质的级分并使用30kD/>Ultra15离心装置浓缩。将蛋白质缓冲液交换到12.5mMHEPES pH 7.0、120mM NaCl、0.5mM TCEP和50％甘油中。然后使用Nanodrop^TM(ThermoFisherScientific^TM)测量浓度，并将蛋白质储存在-20℃下。

使用2:1比率的合成RNA指导物(综合DNA技术公司，IDT^TM)与多肽来制备RNP。选择本文披露的与PAM序列相邻的靶，并使用如本文所述的同向重复序列设计RNA指导物。使RNP在37℃下在1XNEBuffer^TM(NEB2；New England50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，1mM DTT，pH 7.9)中复合30分钟。复合后，使用1X NEB2作为稀释缓冲液进行从5μM到37.5μM的5点1:2连续稀释。以相同的方式制备apo反应(无RNA指导物的多肽)，用H₂O补足RNA指导物的体积。

通过PCR从寡核苷酸(综合DNA技术公司)产生dsDNA靶底物。在PCR之前，将正向引物的5'末端标记IR800染料，如Yan等人,2018中所述。使用Amplitaq(ThermoFisherScientific^TM)，然后用IR800标记的正向引物和未标记的反向引物扩增dsDNA底物。将所得dsDNA用DNA清洁和浓缩试剂盒(兹莫公司)纯化，并通过Nanodrop^TM(ThermoFisherScientific^TM)定量。

将RNP样品和Apo(对照)样品以1:10稀释到1X结合缓冲液(50mM NaCl、10mM Tris-HCl、1mM TCEP、10％甘油、2mM EDTA，pH 8.0)加20nM IR800标记的靶DNA底物中并充分混合。将反应在37℃下孵育1小时。将溴酚蓝添加到反应中以实现染料前沿可视化，然后将整个反应加载到6％ DNA阻滞凝胶(ThermoFisher Scientific^TM)上，使其在80V下运行90分钟。在CLx上对凝胶进行成像。

在该测定中，DNA迁移通过凝胶的速率由其大小决定。只有DNA的样品能够迁移特定距离。然而，如果RNP与DNA结合，则会出现代表更大、移动性更低的DNA复合物的条带，该条带在凝胶上“上移”。

本实例表明了如何可以将变体RNP(变体二元复合物)与DNA靶的亲和力(以产生三元复合物)和野生型RNP(野生型二元复合物)与DNA靶的亲和力相比较。

实例7-通过变体多肽对哺乳动物基因的靶向

本实例描述了使用通过瞬时转染引入至哺乳动物细胞中的变体对多个靶进行的插入缺失评估。

将SEQ ID NO:3的变体克隆进pcda3.1主链中。将RNA指导物克隆进pUC19主链(New England/>)中。然后将质粒大量制备并且稀释。RNA指导物和靶序列在表5中示出。使用的PAM序列是5’-TTTG-3’。

表5.哺乳动物靶和相应的crRNA。

在转染前大约16小时，将在DMEM/10％FBS+青霉素/链霉素(D10培养基)中的25,000个HEK293T细胞铺板至96孔板中的每个孔中。在转染的当天，细胞的汇合度为70％-90％。对于待转染的每个孔，制备Lipofectamine^TM 2000和Opti-MEM^TM的混合物，并在室温下孵育5分钟(溶液1)。在孵育之后，将Lipofectamine 2000^TM:Opti-MEM^TM混合物添加至含有核酸酶质粒、RNA指导物质粒和Opti-MEM^TM的单独混合物中(溶液2)。在阴性对照的情况下，溶液2中不包含RNA指导物质粒。将溶液1和2通过向上和向下吸移进行混合，且然后在室温下孵育25分钟。在孵育后，将溶液1和2混合物逐滴添加至含有细胞的96孔板的每个孔。在转染后大约72小时，通过以下方式使细胞胰蛋白酶化：向每个孔的中心添加TrypLE^TM并且在37℃下孵育大约5分钟。然后将D10培养基添加至每个孔并且混合以重悬细胞。将重悬的细胞以500g离心10分钟以获得沉淀，并弃去上清液。然后将细胞沉淀重悬于QuickExtract^TM缓冲液中，并将细胞在65℃下孵育15分钟，在68℃下孵育15分钟，并且在98℃下孵育10分钟。

通过两轮PCR制备用于下一代测序的样品。使用第一轮(PCR1)来扩增根据靶的特定基因组区域。进行第2轮PCR(PCR2)以添加Illumina衔接子和索引。然后将反应液合并并且通过柱纯化进行纯化。使用150循环NextSeq 500/550中或高输出v2.5试剂盒进行测序运行。

包含相对于SEQ ID NO:3的单E38R、T60R、D89R、S223R、P353G、L354G、L360G、K368G、E566R、或D730R取代的变体多肽相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽表现出增加的插入缺失活性。每种变体多肽的插入缺失活性的增加与亲本多肽的插入缺失活性相比大约高2-4倍。图1示出了具有D89R、L354G、K368G、或E566R取代的变体多肽的插入缺失活性。

在HEK293T细胞中进一步筛选了表6的组合突变。如图1所示，每种组合突变体表现出比SEQ ID NO:3的野生型多肽更高的插入缺失活性。

表6.相对于SEQ ID NO:3的多肽的变体。

/>

本实例表明SEQ ID NO:3的多肽经工程化以增加插入缺失(例如，核酸酶)活性。

实例8-通过包含点突变的变体多肽对哺乳动物基因的靶向

将四十五种变体多肽(相对于SEQ ID NO:3，各自包含单个氨基酸取代)工程化并在表7中列出的三个靶处测试了活性。将变体多肽克隆进pcDNA3.1主链中。将表7的RNA指导物(crRNA)克隆进pUC19主链(New England/>)中。然后制备质粒，进行柱纯化并稀释。

表7.哺乳动物靶和相应的crRNA。

在转染前大约16小时，将在DMEM/10％FBS+青霉素/链霉素(D10培养基)中的25,000个HEK293T细胞铺板至96孔板中的每个孔中。在转染的当天，细胞的汇合度为70％-90％。对于待转染的每个孔，制备Lipofectamine 2000^TM和Opti-MEM^TM的混合物，并在室温下孵育5分钟(溶液1)。在孵育之后，将Lipofectamine 2000^TM:Opti-MEM^TM混合物添加至含有核酸酶质粒、RNA指导物质粒和Opti-MEM^TM的单独混合物中(溶液2)。在阴性对照的情况下，溶液2中不包含RNA指导物质粒。将溶液1和2通过向上和向下吸移进行混合，且然后在室温下孵育25分钟。在孵育后，将溶液1和2混合物逐滴添加至含有细胞的96孔板的每个孔。在转染后大约72小时，通过以下方式使细胞胰蛋白酶化：向每个孔的中心添加TrypLE^TM并且在37℃下孵育大约5分钟。然后将D10培养基添加至每个孔并且混合以重悬细胞。将重悬的细胞以500g离心10分钟以获得沉淀，并弃去上清液。然后将细胞沉淀重悬于QuickExtract^TM缓冲液中，并将细胞在65℃下孵育15分钟，在68℃下孵育15分钟，并且在98℃下孵育10分钟。

图2A和2B示出了变体多肽的插入缺失活性(计算为表现出插入缺失的NGS读段的百分比)。以下二十一种变体与SEQ ID NO:3的亲本多肽相比表现出增加的插入缺失活性：Q683K、E586G、Q556R、D356G、Q421R、Q556K、N579K、N501K、D482K、S722K、Q359G、V557R、N620R、E589K、T480K、L523K、E571R、E571K、E566K、L523R、和E319R。除了Q556R和Q556K在AAVS1靶处产生了与亲本多肽相似的插入缺失水平之外，二十一种变体与亲本多肽相比在每个靶处产生了增加的插入缺失活性。将对三个靶的插入缺失活性进行平均，二十一种变体中的每一个的插入缺失活性相对于亲本多肽的插入缺失活性高大约1.2到3.4倍。在测试的所有变体中，E319R产生了最高的插入缺失活性增加。

实例9-通过组合变体多肽对哺乳动物基因的靶向

在本实例中，通过瞬时转染将组合变体引入哺乳动物细胞中并在多个靶上评估插入缺失活性。

将包含相对于SEQ ID NO:3的4至8个取代的十一种组合变体克隆进pcDNA3.1主链中。引入的取代与实例7和8中的增加的插入缺失活性相关。氨基酸序列在表8中示出。靶和RNA指导物序列在表7中示出。如实例8中所述，进行细胞转染方案。

表8.相对于SEQ ID NO:3的多肽的变体。

/>

如图3所示，所有变体相对于SEQ ID NO:3的亲本多肽表现出更高的插入缺失活性。对测试的三个靶进行平均的组合突变体的插入缺失活性与亲本多肽的插入缺失活性相比高大约7.3到9.9倍。在本实例测试的最高表现的变体SEQ ID NO:51包含以下七个取代：D89R、K368G、E566R、D730R、T60R、D356G、P353G、和E571R。

序列表

<110> 阿伯生物技术公司（ARBOR BIOTECHNOLOGIES, INC.）

<120> 包含变体多肽的组合物及其用途

<130> A2186-7045WO

<140>

<141>

<150> 63/176,021

<151> 2021-04-16

<150> 63/158,738

<151> 2021-03-09

<160> 66

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 1792

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 对未知的描述：

亲本序列

<400> 1

attggtgata tcgcgagctt cctgaaagaa gcgaccaaca aggataccat cccgacctat 60

attaacatgg gcctgagcga ggaatggaag tacaaaccga tttatcacct gttcaccgac 120

gattaccacg agaagagcgc gaacaacctg ctgtacgcgt attttaagga gaaaaacctg 180

gactgctata acggtaacat cctgaacctg agcgaaacct actatcgtcg taacggttac 240

ttcaaaagcg tggttggcaa ctatcgtacc aagatccgta ccctgaacta caagattaag 300

cgtaagaacg tggacgagaa cagcaccaac gaggatatcg aactgcaggt tatgtatgaa 360

atcgcgaagc gtaagctgaa cattaagaaa gactgggaga actacatcag ctatattgag 420

aacgtggaaa acatcaacat caagaacatc gatcgttaca acctgctgta taagcacttc 480

tgcgagaacg aaagcaccat taactgcaag atggaactgc tgagcgtgga gcaactgaaa 540

gaatttggtg gctgcgttat gaagcagcac atcaacagca tgaccatcaa cattcaagat 600

ttcaaaatcg agaacaagga aaacagcctg ggttttattc tgaacctgcc gctgaacaag 660

aaaaagtacc agatcgagct gtggggtaac cgtcaaatta aaaagggcaa caaagataac 720

tacaagaccc tggtggattt catcaacacc tatggccaga acatcatctt caccatcaag 780

aacaacaaga tctacgtggt tttcagctat gagtgcgaac tgaaggagaa ggaaatcaac 840

ttcgacaaga tcgtgggtat tgatgttaac ttcaagcacg cgctgtttgt tgcgagcgag 900

cgtgacaaaa acccgctgca ggataacaac caactgaaag gctacatcaa cctgtacaag 960

tatctgctgg agcacaacga gttcaccagc ctgctgacca aagaggagct ggacatctac 1020

aaagaaattg cgaagggtgt gaccttctgc ccgctggagt ataacctgct gtttacccgt 1080

atcgaaaaca aaggtggcaa gagcaacgat aaagagcagg ttctgagcaa gctgctgtac 1140

agcctgcaaa ttaaactgaa gaacgagaac aaaatccagg aatacattta tgtgagctgc 1200

gttaacaaac tgcgtgcgaa gtacgtgagc tatttcatcc tgaaagagaa gtactatgaa 1260

aaacaaaagg agtacgacat tgaaatgggc tttaccgacg atagcaccga gagcaaagaa 1320

agcatggata agcgtcgtct ggagttcccg tttcgtaaca cccagatcgc gaacggtttc 1380

ctggagaagc tgagcaacgt tcagcaagac attaacggct gcctgaaaaa catcattaac 1440

tacgcgtata aggtgttcga acaaaacggt tttggcgtta tcgcgctgga gaacctggaa 1500

aacagcaact ttgagaaaac ccaagtgctg ccgaccatta aaagcctgct ggagtaccac 1560

aagctggaaa accagaacat caacaacatt aacgcgagcg acaaagttaa ggagtatatc 1620

gagaaggaat actatgaact gaccaccaac gagaacaacg aaattgtgga tgcgaaatac 1680

accaaaaagg gtatcattaa ggttaaaaag gcgaacttct ttaacctgat gatgaaaagc 1740

ctgcacttcg cgagcaacaa ggacgaattt atcctgctga gcaacaacgg ca 1792

<210> 2

<211> 2268

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 对未知的描述：

亲本序列

<400> 2

atgaccacaa agcaggtgaa gagcatcgtg ctgaaggtga agaacaccaa tgagtgccca 60

atcacaaagg acgtgatcaa cgagtacaag aagtactata atatctgttc cgagtggatc 120

aaggacaacc tgacctccat cacaatcggc gatatcgcct ctttcctgaa ggaggccacc 180

aataaggata ccatccccac atatatcaac atgggcctgt ccgaggagtg gaagtacaag 240

cctatctatc acctgttcac agacgattac cacgagaagt ctgccaacaa tctgctgtac 300

gcctacttca aggagaagaa cctggactgc tataacggca atatcctgaa tctgtccgag 360

acctactatc ggagaaacgg ctacttcaag tctgtggtgg gcaattatcg gaccaagatc 420

agaacactga actacaagat caagaggaag aatgtggacg agaactctac aaatgaggat 480

atcgagctgc aggtcatgta tgagatcgcc aagcgcaagc tgaacatcaa gaaggactgg 540

gagaattaca tcagctatat cgagaacgtg gagaacatca atatcaagaa catcgatagg 600

tacaatctgc tgtataagca cttctgcgag aacgagagca ccatcaattg taagatggag 660

ctgctgtccg tggagcagct gaaggagttt ggcggctgcg tgatgaagca gcacatcaac 720

tctatgacaa tcaatatcca ggatttcaag atcgagaaca aggagaatag cctgggcttt 780

atcctgaacc tgcccctgaa caagaagaag taccagatcg agctgtgggg caaccggcag 840

atcaagaagg gcaacaagga caattacaag accctggtgg atttcatcaa cacatatggc 900

cagaacatca tctttaccat caagaacaat aagatctacg tggtgttctc ctatgagtgt 960

gagctgaagg agaaggagat caactttgac aagatcgtgg gcatcgatgt gaatttcaag 1020

cacgccctgt ttgtggcctc tgagagagac aagaacccac tgcaggataa caatcagctg 1080

aagggctaca tcaacctgta caagtatctg ctggagcaca atgagttcac cagcctgctg 1140

acaaaggagg agctggacat ctacaaggag atcgccaagg gcgtgacctt ctgccccctg 1200

gagtataacc tgctgtttac aaggatcgag aacaagggcg gcaagtccaa tgataaggag 1260

caggtgctga gcaagctgct gtactccctg cagatcaagc tgaagaacga gaataagatc 1320

caggagtaca tctacgtgag ctgcgtgaat aagctgcgcg ccaagtacgt gagctatttc 1380

atcctgaagg agaagtacta tgagaagcag aaggagtacg acatcgagat gggctttacc 1440

gacgatagca cagagtccaa ggagtctatg gataagaggc gcctggagtt cccttttcgg 1500

aacacccaga tcgccaatgg cttcctggag aagctgagca acgtgcagca ggacatcaat 1560

ggctgtctga agaacatcat caattacgcc tataaggtgt tcgagcagaa cggctttggc 1620

gtgatcgccc tggagaatct ggagaacagc aattttgaga agacccaggt gctgccaaca 1680

atcaagtccc tgctggagta ccacaagctg gagaaccaga atatcaacaa tatcaacgcc 1740

tctgacaagg tgaaggagta tatcgagaag gagtactatg agctgaccac aaatgagaac 1800

aatgagatcg tggatgccaa gtacaccaag aagggcatca tcaaggtgaa gaaggccaac 1860

ttctttaatc tgatgatgaa gtctctgcac ttcgccagca acaaggacga gtttatcctg 1920

ctgtccaaca atggcaagac ccagatcgcc ctggtgccca gcgagtacac atcccagatg 1980

gattctatcg agcactgcct gtatgtggac aagaacggca agaaggtgga taagaagaag 2040

gtgcggcaga agcaggagac ccacatcaac ggcctgaatg ccgacttcaa tgccgccaac 2100

aatatcaagt acatcatcga gaacgagaat ctgagaaagc tgttttgtgg caagctgaag 2160

gtgtccggct ataacacccc tatcctggat gccacaaaga agggccagtt caacatcctg 2220

gccgagctga agaagcagaa taagatcaag atctttgaga tcgagaag 2268

<210> 3

<211> 756

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 对未知的描述：

亲本序列

<400> 3

Met Thr Thr Lys Gln Val Lys Ser Ile Val Leu Lys Val Lys Asn Thr

1 5 10 15

Asn Glu Cys Pro Ile Thr Lys Asp Val Ile Asn Glu Tyr Lys Lys Tyr

20 25 30

Tyr Asn Ile Cys Ser Glu Trp Ile Lys Asp Asn Leu Thr Ser Ile Thr

35 40 45

Ile Gly Asp Ile Ala Ser Phe Leu Lys Glu Ala Thr Asn Lys Asp Thr

50 55 60

Ile Pro Thr Tyr Ile Asn Met Gly Leu Ser Glu Glu Trp Lys Tyr Lys

65 70 75 80

Pro Ile Tyr His Leu Phe Thr Asp Asp Tyr His Glu Lys Ser Ala Asn

85 90 95

Asn Leu Leu Tyr Ala Tyr Phe Lys Glu Lys Asn Leu Asp Cys Tyr Asn

100 105 110

Gly Asn Ile Leu Asn Leu Ser Glu Thr Tyr Tyr Arg Arg Asn Gly Tyr

115 120 125

Phe Lys Ser Val Val Gly Asn Tyr Arg Thr Lys Ile Arg Thr Leu Asn

130 135 140

Tyr Lys Ile Lys Arg Lys Asn Val Asp Glu Asn Ser Thr Asn Glu Asp

145 150 155 160

Ile Glu Leu Gln Val Met Tyr Glu Ile Ala Lys Arg Lys Leu Asn Ile

165 170 175

Lys Lys Asp Trp Glu Asn Tyr Ile Ser Tyr Ile Glu Asn Val Glu Asn

180 185 190

Ile Asn Ile Lys Asn Ile Asp Arg Tyr Asn Leu Leu Tyr Lys His Phe

195 200 205

Cys Glu Asn Glu Ser Thr Ile Asn Cys Lys Met Glu Leu Leu Ser Val

210 215 220

Glu Gln Leu Lys Glu Phe Gly Gly Cys Val Met Lys Gln His Ile Asn

225 230 235 240

Ser Met Thr Ile Asn Ile Gln Asp Phe Lys Ile Glu Asn Lys Glu Asn

245 250 255

Ser Leu Gly Phe Ile Leu Asn Leu Pro Leu Asn Lys Lys Lys Tyr Gln

260 265 270

Ile Glu Leu Trp Gly Asn Arg Gln Ile Lys Lys Gly Asn Lys Asp Asn

275 280 285

Tyr Lys Thr Leu Val Asp Phe Ile Asn Thr Tyr Gly Gln Asn Ile Ile

290 295 300

Phe Thr Ile Lys Asn Asn Lys Ile Tyr Val Val Phe Ser Tyr Glu Cys

305 310 315 320

Glu Leu Lys Glu Lys Glu Ile Asn Phe Asp Lys Ile Val Gly Ile Asp

325 330 335

Val Asn Phe Lys His Ala Leu Phe Val Ala Ser Glu Arg Asp Lys Asn

340 345 350

Pro Leu Gln Asp Asn Asn Gln Leu Lys Gly Tyr Ile Asn Leu Tyr Lys

355 360 365

Tyr Leu Leu Glu His Asn Glu Phe Thr Ser Leu Leu Thr Lys Glu Glu

370 375 380

Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Ile Ala Lys Gly Val Thr Phe Cys Pro Leu

385 390 395 400

Glu Tyr Asn Leu Leu Phe Thr Arg Ile Glu Asn Lys Gly Gly Lys Ser

405 410 415

Asn Asp Lys Glu Gln Val Leu Ser Lys Leu Leu Tyr Ser Leu Gln Ile

420 425 430

Lys Leu Lys Asn Glu Asn Lys Ile Gln Glu Tyr Ile Tyr Val Ser Cys

435 440 445

Val Asn Lys Leu Arg Ala Lys Tyr Val Ser Tyr Phe Ile Leu Lys Glu

450 455 460

Lys Tyr Tyr Glu Lys Gln Lys Glu Tyr Asp Ile Glu Met Gly Phe Thr

465 470 475 480

Asp Asp Ser Thr Glu Ser Lys Glu Ser Met Asp Lys Arg Arg Leu Glu

485 490 495

Phe Pro Phe Arg Asn Thr Gln Ile Ala Asn Gly Phe Leu Glu Lys Leu

500 505 510

Ser Asn Val Gln Gln Asp Ile Asn Gly Cys Leu Lys Asn Ile Ile Asn

515 520 525

Tyr Ala Tyr Lys Val Phe Glu Gln Asn Gly Phe Gly Val Ile Ala Leu

530 535 540

Glu Asn Leu Glu Asn Ser Asn Phe Glu Lys Thr Gln Val Leu Pro Thr

545 550 555 560

Ile Lys Ser Leu Leu Glu Tyr His Lys Leu Glu Asn Gln Asn Ile Asn

565 570 575

Asn Ile Asn Ala Ser Asp Lys Val Lys Glu Tyr Ile Glu Lys Glu Tyr

580 585 590

Tyr Glu Leu Thr Thr Asn Glu Asn Asn Glu Ile Val Asp Ala Lys Tyr

595 600 605

Thr Lys Lys Gly Ile Ile Lys Val Lys Lys Ala Asn Phe Phe Asn Leu

610 615 620

Met Met Lys Ser Leu His Phe Ala Ser Asn Lys Asp Glu Phe Ile Leu

625 630 635 640

Leu Ser Asn Asn Gly Lys Thr Gln Ile Ala Leu Val Pro Ser Glu Tyr

645 650 655

Thr Ser Gln Met Asp Ser Ile Glu His Cys Leu Tyr Val Asp Lys Asn

660 665 670

Gly Lys Lys Val Asp Lys Lys Lys Val Arg Gln Lys Gln Glu Thr His

675 680 685

Ile Asn Gly Leu Asn Ala Asp Phe Asn Ala Ala Asn Asn Ile Lys Tyr

690 695 700

Ile Ile Glu Asn Glu Asn Leu Arg Lys Leu Phe Cys Gly Lys Leu Lys

705 710 715 720

Val Ser Gly Tyr Asn Thr Pro Ile Leu Asp Ala Thr Lys Lys Gly Gln

725 730 735

Phe Asn Ile Leu Ala Glu Leu Lys Lys Gln Asn Lys Ile Lys Ile Phe

740 745 750

Glu Ile Glu Lys

755

<210> 4

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

寡核苷酸

<400> 4

ccuguuguga auacucuuuu auagguauca aacaac 36

<210> 5

<211> 35

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

寡核苷酸

<400> 5

ccuguuguga auacucuuua uagguaucaa acaac 35

<210> 6

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

寡核苷酸

<400> 6

ccuguuguga auacuc 16

<210> 7

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

寡核苷酸

<400> 7

uuauagguau caaacaac 18

<210> 8

<211> 61

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

寡核苷酸

<400> 8

ccuguuguga auacucuuuu auagguauca aacaacagcc aguguugcua gucaagggca 60

g 61

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 对未知的描述：

EMX1哺乳动物靶序列

<400> 9

agccagtgtt gctagtcaag ggcag 25

<210> 10

<211> 61

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

寡核苷酸

<400> 10

ccuguuguga auacucuuuu auagguauca aacaacgaaa ucuauugagg cucuggagag 60

a 61

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 对未知的描述：

VEGFA哺乳动物靶序列

<400> 11

gaaatctatt gaggctctgg agaga 25

<210> 12

<211> 61

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

寡核苷酸

<400> 12

ccuguuguga auacucuuuu auagguauca aacaacuagc cucucccgcu cugguucagg 60

g 61

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 对未知的描述：

AAVS1哺乳动物靶序列

<400> 13

tagcctctcc cgctctggtt caggg 25

<210> 14

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 14

Met Thr Thr Lys Gln Val Lys Ser Ile Val Leu Lys Val Lys Asn Thr

1 5 10 15

Asn Glu Cys Pro Ile Thr Lys Asp Val Ile Asn Glu Tyr Lys Lys Tyr

20 25 30

Tyr Asn Ile Cys Ser Glu Trp Ile Lys Asp Asn Leu Thr Ser Ile Thr

35 40 45

Ile Gly Asp Ile Ala Ser Phe Leu Lys Glu Ala Thr Asn Lys Asp Thr

50 55 60

Ile Pro Thr Tyr Ile Asn Met Gly Leu Ser Glu Glu Trp Lys Tyr Lys

65 70 75 80

Pro Ile Tyr His Leu Phe Thr Asp Arg Tyr His Glu Lys Ser Ala Asn

85 90 95

Asn Leu Leu Tyr Ala Tyr Phe Lys Glu Lys Asn Leu Asp Cys Tyr Asn

100 105 110

Gly Asn Ile Leu Asn Leu Ser Glu Thr Tyr Tyr Arg Arg Asn Gly Tyr

115 120 125

Phe Lys Ser Val Val Gly Asn Tyr Arg Thr Lys Ile Arg Thr Leu Asn

130 135 140

Tyr Lys Ile Lys Arg Lys Asn Val Asp Glu Asn Ser Thr Asn Glu Asp

145 150 155 160

Ile Glu Leu Gln Val Met Tyr Glu Ile Ala Lys Arg Lys Leu Asn Ile

165 170 175

Lys Lys Asp Trp Glu Asn Tyr Ile Ser Tyr Ile Glu Asn Val Glu Asn

180 185 190

Ile Asn Ile Lys Asn Ile Asp Arg Tyr Asn Leu Leu Tyr Lys His Phe

195 200 205

Cys Glu Asn Glu Ser Thr Ile Asn Cys Lys Met Glu Leu Leu Ser Val

210 215 220

Glu Gln Leu Lys Glu Phe Gly Gly Cys Val Met Lys Gln His Ile Asn

225 230 235 240

Ser Met Thr Ile Asn Ile Gln Asp Phe Lys Ile Glu Asn Lys Glu Asn

245 250 255

Ser Leu Gly Phe Ile Leu Asn Leu Pro Leu Asn Lys Lys Lys Tyr Gln

260 265 270

Ile Glu Leu Trp Gly Asn Arg Gln Ile Lys Lys Gly Asn Lys Asp Asn

275 280 285

Tyr Lys Thr Leu Val Asp Phe Ile Asn Thr Tyr Gly Gln Asn Ile Ile

290 295 300

Phe Thr Ile Lys Asn Asn Lys Ile Tyr Val Val Phe Ser Tyr Glu Cys

305 310 315 320

Glu Leu Lys Glu Lys Glu Ile Asn Phe Asp Lys Ile Val Gly Ile Asp

325 330 335

Val Asn Phe Lys His Ala Leu Phe Val Ala Ser Glu Arg Asp Lys Asn

340 345 350

Pro Leu Gln Asp Asn Asn Gln Leu Lys Gly Tyr Ile Asn Leu Tyr Lys

355 360 365

Tyr Leu Leu Glu His Asn Glu Phe Thr Ser Leu Leu Thr Lys Glu Glu

370 375 380

Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Ile Ala Lys Gly Val Thr Phe Cys Pro Leu

385 390 395 400

Glu Tyr Asn Leu Leu Phe Thr Arg Ile Glu Asn Lys Gly Gly Lys Ser

405 410 415

Asn Asp Lys Glu Gln Val Leu Ser Lys Leu Leu Tyr Ser Leu Gln Ile

420 425 430

Lys Leu Lys Asn Glu Asn Lys Ile Gln Glu Tyr Ile Tyr Val Ser Cys

435 440 445

Val Asn Lys Leu Arg Ala Lys Tyr Val Ser Tyr Phe Ile Leu Lys Glu

450 455 460

Lys Tyr Tyr Glu Lys Gln Lys Glu Tyr Asp Ile Glu Met Gly Phe Thr

465 470 475 480

Asp Asp Ser Thr Glu Ser Lys Glu Ser Met Asp Lys Arg Arg Leu Glu

485 490 495

Phe Pro Phe Arg Asn Thr Gln Ile Ala Asn Gly Phe Leu Glu Lys Leu

500 505 510

Ser Asn Val Gln Gln Asp Ile Asn Gly Cys Leu Lys Asn Ile Ile Asn

515 520 525

Tyr Ala Tyr Lys Val Phe Glu Gln Asn Gly Phe Gly Val Ile Ala Leu

530 535 540

Glu Asn Leu Glu Asn Ser Asn Phe Glu Lys Thr Gln Val Leu Pro Thr

545 550 555 560

Ile Lys Ser Leu Leu Glu Tyr His Lys Leu Glu Asn Gln Asn Ile Asn

565 570 575

Asn Ile Asn Ala Ser Asp Lys Val Lys Glu Tyr Ile Glu Lys Glu Tyr

580 585 590

Tyr Glu Leu Thr Thr Asn Glu Asn Asn Glu Ile Val Asp Ala Lys Tyr

595 600 605

Thr Lys Lys Gly Ile Ile Lys Val Lys Lys Ala Asn Phe Phe Asn Leu

610 615 620

Met Met Lys Ser Leu His Phe Ala Ser Asn Lys Asp Glu Phe Ile Leu

625 630 635 640

Leu Ser Asn Asn Gly Lys Thr Gln Ile Ala Leu Val Pro Ser Glu Tyr

645 650 655

Thr Ser Gln Met Asp Ser Ile Glu His Cys Leu Tyr Val Asp Lys Asn

660 665 670

Gly Lys Lys Val Asp Lys Lys Lys Val Arg Gln Lys Gln Glu Thr His

675 680 685

Ile Asn Gly Leu Asn Ala Asp Phe Asn Ala Ala Asn Asn Ile Lys Tyr

690 695 700

Ile Ile Glu Asn Glu Asn Leu Arg Lys Leu Phe Cys Gly Lys Leu Lys

705 710 715 720

Val Ser Gly Tyr Asn Thr Pro Ile Leu Asp Ala Thr Lys Lys Gly Gln

725 730 735

Phe Asn Ile Leu Ala Glu Leu Lys Lys Gln Asn Lys Ile Lys Ile Phe

740 745 750

Glu Ile Glu Lys

755

<210> 15

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 15

Met Thr Thr Lys Gln Val Lys Ser Ile Val Leu Lys Val Lys Asn Thr

1 5 10 15

Asn Glu Cys Pro Ile Thr Lys Asp Val Ile Asn Glu Tyr Lys Lys Tyr

20 25 30

Tyr Asn Ile Cys Ser Glu Trp Ile Lys Asp Asn Leu Thr Ser Ile Thr

35 40 45

Ile Gly Asp Ile Ala Ser Phe Leu Lys Glu Ala Thr Asn Lys Asp Thr

50 55 60

Ile Pro Thr Tyr Ile Asn Met Gly Leu Ser Glu Glu Trp Lys Tyr Lys

65 70 75 80

Pro Ile Tyr His Leu Phe Thr Asp Asp Tyr His Glu Lys Ser Ala Asn

85 90 95

Asn Leu Leu Tyr Ala Tyr Phe Lys Glu Lys Asn Leu Asp Cys Tyr Asn

100 105 110

Gly Asn Ile Leu Asn Leu Ser Glu Thr Tyr Tyr Arg Arg Asn Gly Tyr

115 120 125

Phe Lys Ser Val Val Gly Asn Tyr Arg Thr Lys Ile Arg Thr Leu Asn

130 135 140

Tyr Lys Ile Lys Arg Lys Asn Val Asp Glu Asn Ser Thr Asn Glu Asp

145 150 155 160

Ile Glu Leu Gln Val Met Tyr Glu Ile Ala Lys Arg Lys Leu Asn Ile

165 170 175

Lys Lys Asp Trp Glu Asn Tyr Ile Ser Tyr Ile Glu Asn Val Glu Asn

180 185 190

Ile Asn Ile Lys Asn Ile Asp Arg Tyr Asn Leu Leu Tyr Lys His Phe

195 200 205

Cys Glu Asn Glu Ser Thr Ile Asn Cys Lys Met Glu Leu Leu Ser Val

210 215 220

Glu Gln Leu Lys Glu Phe Gly Gly Cys Val Met Lys Gln His Ile Asn

225 230 235 240

Ser Met Thr Ile Asn Ile Gln Asp Phe Lys Ile Glu Asn Lys Glu Asn

245 250 255

Ser Leu Gly Phe Ile Leu Asn Leu Pro Leu Asn Lys Lys Lys Tyr Gln

260 265 270

Ile Glu Leu Trp Gly Asn Arg Gln Ile Lys Lys Gly Asn Lys Asp Asn

275 280 285

Tyr Lys Thr Leu Val Asp Phe Ile Asn Thr Tyr Gly Gln Asn Ile Ile

290 295 300

Phe Thr Ile Lys Asn Asn Lys Ile Tyr Val Val Phe Ser Tyr Glu Cys

305 310 315 320

Glu Leu Lys Glu Lys Glu Ile Asn Phe Asp Lys Ile Val Gly Ile Asp

325 330 335

Val Asn Phe Lys His Ala Leu Phe Val Ala Ser Glu Arg Asp Lys Asn

340 345 350

Pro Gly Gln Asp Asn Asn Gln Leu Lys Gly Tyr Ile Asn Leu Tyr Lys

355 360 365

Tyr Leu Leu Glu His Asn Glu Phe Thr Ser Leu Leu Thr Lys Glu Glu

370 375 380

Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Ile Ala Lys Gly Val Thr Phe Cys Pro Leu

385 390 395 400

Glu Tyr Asn Leu Leu Phe Thr Arg Ile Glu Asn Lys Gly Gly Lys Ser

405 410 415

Asn Asp Lys Glu Gln Val Leu Ser Lys Leu Leu Tyr Ser Leu Gln Ile

420 425 430

Lys Leu Lys Asn Glu Asn Lys Ile Gln Glu Tyr Ile Tyr Val Ser Cys

435 440 445

Val Asn Lys Leu Arg Ala Lys Tyr Val Ser Tyr Phe Ile Leu Lys Glu

450 455 460

Lys Tyr Tyr Glu Lys Gln Lys Glu Tyr Asp Ile Glu Met Gly Phe Thr

465 470 475 480

Asp Asp Ser Thr Glu Ser Lys Glu Ser Met Asp Lys Arg Arg Leu Glu

485 490 495

Phe Pro Phe Arg Asn Thr Gln Ile Ala Asn Gly Phe Leu Glu Lys Leu

500 505 510

Ser Asn Val Gln Gln Asp Ile Asn Gly Cys Leu Lys Asn Ile Ile Asn

515 520 525

Tyr Ala Tyr Lys Val Phe Glu Gln Asn Gly Phe Gly Val Ile Ala Leu

530 535 540

Glu Asn Leu Glu Asn Ser Asn Phe Glu Lys Thr Gln Val Leu Pro Thr

545 550 555 560

Ile Lys Ser Leu Leu Glu Tyr His Lys Leu Glu Asn Gln Asn Ile Asn

565 570 575

Asn Ile Asn Ala Ser Asp Lys Val Lys Glu Tyr Ile Glu Lys Glu Tyr

580 585 590

Tyr Glu Leu Thr Thr Asn Glu Asn Asn Glu Ile Val Asp Ala Lys Tyr

595 600 605

Thr Lys Lys Gly Ile Ile Lys Val Lys Lys Ala Asn Phe Phe Asn Leu

610 615 620

Met Met Lys Ser Leu His Phe Ala Ser Asn Lys Asp Glu Phe Ile Leu

625 630 635 640

Leu Ser Asn Asn Gly Lys Thr Gln Ile Ala Leu Val Pro Ser Glu Tyr

645 650 655

Thr Ser Gln Met Asp Ser Ile Glu His Cys Leu Tyr Val Asp Lys Asn

660 665 670

Gly Lys Lys Val Asp Lys Lys Lys Val Arg Gln Lys Gln Glu Thr His

675 680 685

Ile Asn Gly Leu Asn Ala Asp Phe Asn Ala Ala Asn Asn Ile Lys Tyr

690 695 700

Ile Ile Glu Asn Glu Asn Leu Arg Lys Leu Phe Cys Gly Lys Leu Lys

705 710 715 720

Val Ser Gly Tyr Asn Thr Pro Ile Leu Asp Ala Thr Lys Lys Gly Gln

725 730 735

Phe Asn Ile Leu Ala Glu Leu Lys Lys Gln Asn Lys Ile Lys Ile Phe

740 745 750

Glu Ile Glu Lys

755

<210> 16

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 16

Met Thr Thr Lys Gln Val Lys Ser Ile Val Leu Lys Val Lys Asn Thr

1 5 10 15

Asn Glu Cys Pro Ile Thr Lys Asp Val Ile Asn Glu Tyr Lys Lys Tyr

20 25 30

Tyr Asn Ile Cys Ser Glu Trp Ile Lys Asp Asn Leu Thr Ser Ile Thr

35 40 45

Ile Gly Asp Ile Ala Ser Phe Leu Lys Glu Ala Thr Asn Lys Asp Thr

50 55 60

Ile Pro Thr Tyr Ile Asn Met Gly Leu Ser Glu Glu Trp Lys Tyr Lys

65 70 75 80

Pro Ile Tyr His Leu Phe Thr Asp Asp Tyr His Glu Lys Ser Ala Asn

85 90 95

Asn Leu Leu Tyr Ala Tyr Phe Lys Glu Lys Asn Leu Asp Cys Tyr Asn

100 105 110

Gly Asn Ile Leu Asn Leu Ser Glu Thr Tyr Tyr Arg Arg Asn Gly Tyr

115 120 125

Phe Lys Ser Val Val Gly Asn Tyr Arg Thr Lys Ile Arg Thr Leu Asn

130 135 140

Tyr Lys Ile Lys Arg Lys Asn Val Asp Glu Asn Ser Thr Asn Glu Asp

145 150 155 160

Ile Glu Leu Gln Val Met Tyr Glu Ile Ala Lys Arg Lys Leu Asn Ile

165 170 175

Lys Lys Asp Trp Glu Asn Tyr Ile Ser Tyr Ile Glu Asn Val Glu Asn

180 185 190

Ile Asn Ile Lys Asn Ile Asp Arg Tyr Asn Leu Leu Tyr Lys His Phe

195 200 205

Cys Glu Asn Glu Ser Thr Ile Asn Cys Lys Met Glu Leu Leu Ser Val

210 215 220

Glu Gln Leu Lys Glu Phe Gly Gly Cys Val Met Lys Gln His Ile Asn

225 230 235 240

Ser Met Thr Ile Asn Ile Gln Asp Phe Lys Ile Glu Asn Lys Glu Asn

245 250 255

Ser Leu Gly Phe Ile Leu Asn Leu Pro Leu Asn Lys Lys Lys Tyr Gln

260 265 270

Ile Glu Leu Trp Gly Asn Arg Gln Ile Lys Lys Gly Asn Lys Asp Asn

275 280 285

Tyr Lys Thr Leu Val Asp Phe Ile Asn Thr Tyr Gly Gln Asn Ile Ile

290 295 300

Phe Thr Ile Lys Asn Asn Lys Ile Tyr Val Val Phe Ser Tyr Glu Cys

305 310 315 320

Glu Leu Lys Glu Lys Glu Ile Asn Phe Asp Lys Ile Val Gly Ile Asp

325 330 335

Val Asn Phe Lys His Ala Leu Phe Val Ala Ser Glu Arg Asp Lys Asn

340 345 350

Pro Leu Gln Asp Asn Asn Gln Leu Lys Gly Tyr Ile Asn Leu Tyr Gly

355 360 365

Tyr Leu Leu Glu His Asn Glu Phe Thr Ser Leu Leu Thr Lys Glu Glu

370 375 380

Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Ile Ala Lys Gly Val Thr Phe Cys Pro Leu

385 390 395 400

Glu Tyr Asn Leu Leu Phe Thr Arg Ile Glu Asn Lys Gly Gly Lys Ser

405 410 415

Asn Asp Lys Glu Gln Val Leu Ser Lys Leu Leu Tyr Ser Leu Gln Ile

420 425 430

Lys Leu Lys Asn Glu Asn Lys Ile Gln Glu Tyr Ile Tyr Val Ser Cys

435 440 445

Val Asn Lys Leu Arg Ala Lys Tyr Val Ser Tyr Phe Ile Leu Lys Glu

450 455 460

Lys Tyr Tyr Glu Lys Gln Lys Glu Tyr Asp Ile Glu Met Gly Phe Thr

465 470 475 480

Asp Asp Ser Thr Glu Ser Lys Glu Ser Met Asp Lys Arg Arg Leu Glu

485 490 495

Phe Pro Phe Arg Asn Thr Gln Ile Ala Asn Gly Phe Leu Glu Lys Leu

500 505 510

Ser Asn Val Gln Gln Asp Ile Asn Gly Cys Leu Lys Asn Ile Ile Asn

515 520 525

Tyr Ala Tyr Lys Val Phe Glu Gln Asn Gly Phe Gly Val Ile Ala Leu

530 535 540

Glu Asn Leu Glu Asn Ser Asn Phe Glu Lys Thr Gln Val Leu Pro Thr

545 550 555 560

Ile Lys Ser Leu Leu Glu Tyr His Lys Leu Glu Asn Gln Asn Ile Asn

565 570 575

Asn Ile Asn Ala Ser Asp Lys Val Lys Glu Tyr Ile Glu Lys Glu Tyr

580 585 590

Tyr Glu Leu Thr Thr Asn Glu Asn Asn Glu Ile Val Asp Ala Lys Tyr

595 600 605

Thr Lys Lys Gly Ile Ile Lys Val Lys Lys Ala Asn Phe Phe Asn Leu

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Met Met Lys Ser Leu His Phe Ala Ser Asn Lys Asp Glu Phe Ile Leu

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Leu Ser Asn Asn Gly Lys Thr Gln Ile Ala Leu Val Pro Ser Glu Tyr

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Gly Lys Lys Val Asp Lys Lys Lys Val Arg Gln Lys Gln Glu Thr His

675 680 685

Ile Asn Gly Leu Asn Ala Asp Phe Asn Ala Ala Asn Asn Ile Lys Tyr

690 695 700

Ile Ile Glu Asn Glu Asn Leu Arg Lys Leu Phe Cys Gly Lys Leu Lys

705 710 715 720

Val Ser Gly Tyr Asn Thr Pro Ile Leu Asp Ala Thr Lys Lys Gly Gln

725 730 735

Phe Asn Ile Leu Ala Glu Leu Lys Lys Gln Asn Lys Ile Lys Ile Phe

740 745 750

Glu Ile Glu Lys

755

<210> 17

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 17

Met Thr Thr Lys Gln Val Lys Ser Ile Val Leu Lys Val Lys Asn Thr

1 5 10 15

Asn Glu Cys Pro Ile Thr Lys Asp Val Ile Asn Glu Tyr Lys Lys Tyr

20 25 30

Tyr Asn Ile Cys Ser Glu Trp Ile Lys Asp Asn Leu Thr Ser Ile Thr

35 40 45

Ile Gly Asp Ile Ala Ser Phe Leu Lys Glu Ala Thr Asn Lys Asp Thr

50 55 60

Ile Pro Thr Tyr Ile Asn Met Gly Leu Ser Glu Glu Trp Lys Tyr Lys

65 70 75 80

Pro Ile Tyr His Leu Phe Thr Asp Asp Tyr His Glu Lys Ser Ala Asn

85 90 95

Asn Leu Leu Tyr Ala Tyr Phe Lys Glu Lys Asn Leu Asp Cys Tyr Asn

100 105 110

Gly Asn Ile Leu Asn Leu Ser Glu Thr Tyr Tyr Arg Arg Asn Gly Tyr

115 120 125

Phe Lys Ser Val Val Gly Asn Tyr Arg Thr Lys Ile Arg Thr Leu Asn

130 135 140

Tyr Lys Ile Lys Arg Lys Asn Val Asp Glu Asn Ser Thr Asn Glu Asp

145 150 155 160

Ile Glu Leu Gln Val Met Tyr Glu Ile Ala Lys Arg Lys Leu Asn Ile

165 170 175

Lys Lys Asp Trp Glu Asn Tyr Ile Ser Tyr Ile Glu Asn Val Glu Asn

180 185 190

Ile Asn Ile Lys Asn Ile Asp Arg Tyr Asn Leu Leu Tyr Lys His Phe

195 200 205

Cys Glu Asn Glu Ser Thr Ile Asn Cys Lys Met Glu Leu Leu Ser Val

210 215 220

Glu Gln Leu Lys Glu Phe Gly Gly Cys Val Met Lys Gln His Ile Asn

225 230 235 240

Ser Met Thr Ile Asn Ile Gln Asp Phe Lys Ile Glu Asn Lys Glu Asn

245 250 255

Ser Leu Gly Phe Ile Leu Asn Leu Pro Leu Asn Lys Lys Lys Tyr Gln

260 265 270

Ile Glu Leu Trp Gly Asn Arg Gln Ile Lys Lys Gly Asn Lys Asp Asn

275 280 285

Tyr Lys Thr Leu Val Asp Phe Ile Asn Thr Tyr Gly Gln Asn Ile Ile

290 295 300

Phe Thr Ile Lys Asn Asn Lys Ile Tyr Val Val Phe Ser Tyr Glu Cys

305 310 315 320

Glu Leu Lys Glu Lys Glu Ile Asn Phe Asp Lys Ile Val Gly Ile Asp

325 330 335

Val Asn Phe Lys His Ala Leu Phe Val Ala Ser Glu Arg Asp Lys Asn

340 345 350

Pro Leu Gln Asp Asn Asn Gln Leu Lys Gly Tyr Ile Asn Leu Tyr Lys

355 360 365

Tyr Leu Leu Glu His Asn Glu Phe Thr Ser Leu Leu Thr Lys Glu Glu

370 375 380

Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Ile Ala Lys Gly Val Thr Phe Cys Pro Leu

385 390 395 400

Glu Tyr Asn Leu Leu Phe Thr Arg Ile Glu Asn Lys Gly Gly Lys Ser

405 410 415

Asn Asp Lys Glu Gln Val Leu Ser Lys Leu Leu Tyr Ser Leu Gln Ile

420 425 430

Lys Leu Lys Asn Glu Asn Lys Ile Gln Glu Tyr Ile Tyr Val Ser Cys

435 440 445

Val Asn Lys Leu Arg Ala Lys Tyr Val Ser Tyr Phe Ile Leu Lys Glu

450 455 460

Lys Tyr Tyr Glu Lys Gln Lys Glu Tyr Asp Ile Glu Met Gly Phe Thr

465 470 475 480

Asp Asp Ser Thr Glu Ser Lys Glu Ser Met Asp Lys Arg Arg Leu Glu

485 490 495

Phe Pro Phe Arg Asn Thr Gln Ile Ala Asn Gly Phe Leu Glu Lys Leu

500 505 510

Ser Asn Val Gln Gln Asp Ile Asn Gly Cys Leu Lys Asn Ile Ile Asn

515 520 525

Tyr Ala Tyr Lys Val Phe Glu Gln Asn Gly Phe Gly Val Ile Ala Leu

530 535 540

Glu Asn Leu Glu Asn Ser Asn Phe Glu Lys Thr Gln Val Leu Pro Thr

545 550 555 560

Ile Lys Ser Leu Leu Arg Tyr His Lys Leu Glu Asn Gln Asn Ile Asn

565 570 575

Asn Ile Asn Ala Ser Asp Lys Val Lys Glu Tyr Ile Glu Lys Glu Tyr

580 585 590

Tyr Glu Leu Thr Thr Asn Glu Asn Asn Glu Ile Val Asp Ala Lys Tyr

595 600 605

Thr Lys Lys Gly Ile Ile Lys Val Lys Lys Ala Asn Phe Phe Asn Leu

610 615 620

Met Met Lys Ser Leu His Phe Ala Ser Asn Lys Asp Glu Phe Ile Leu

625 630 635 640

Leu Ser Asn Asn Gly Lys Thr Gln Ile Ala Leu Val Pro Ser Glu Tyr

645 650 655

Thr Ser Gln Met Asp Ser Ile Glu His Cys Leu Tyr Val Asp Lys Asn

660 665 670

Gly Lys Lys Val Asp Lys Lys Lys Val Arg Gln Lys Gln Glu Thr His

675 680 685

Ile Asn Gly Leu Asn Ala Asp Phe Asn Ala Ala Asn Asn Ile Lys Tyr

690 695 700

Ile Ile Glu Asn Glu Asn Leu Arg Lys Leu Phe Cys Gly Lys Leu Lys

705 710 715 720

Val Ser Gly Tyr Asn Thr Pro Ile Leu Asp Ala Thr Lys Lys Gly Gln

725 730 735

Phe Asn Ile Leu Ala Glu Leu Lys Lys Gln Asn Lys Ile Lys Ile Phe

740 745 750

Glu Ile Glu Lys

755

<210> 18

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 18

Met Thr Thr Lys Gln Val Lys Ser Ile Val Leu Lys Val Lys Asn Thr

1 5 10 15

Asn Glu Cys Pro Ile Thr Lys Asp Val Ile Asn Glu Tyr Lys Lys Tyr

20 25 30

Tyr Asn Ile Cys Ser Glu Trp Ile Lys Asp Asn Leu Thr Ser Ile Thr

35 40 45

Ile Gly Asp Ile Ala Ser Phe Leu Lys Glu Ala Thr Asn Lys Asp Thr

50 55 60

Ile Pro Thr Tyr Ile Asn Met Gly Leu Ser Glu Glu Trp Lys Tyr Lys

65 70 75 80

Pro Ile Tyr His Leu Phe Thr Asp Asp Tyr His Glu Lys Ser Ala Asn

85 90 95

Asn Leu Leu Tyr Ala Tyr Phe Lys Glu Lys Asn Leu Asp Cys Tyr Asn

100 105 110

Gly Asn Ile Leu Asn Leu Ser Glu Thr Tyr Tyr Arg Arg Asn Gly Tyr

115 120 125

Phe Lys Ser Val Val Gly Asn Tyr Arg Thr Lys Ile Arg Thr Leu Asn

130 135 140

Tyr Lys Ile Lys Arg Lys Asn Val Asp Glu Asn Ser Thr Asn Glu Asp

145 150 155 160

Ile Glu Leu Gln Val Met Tyr Glu Ile Ala Lys Arg Lys Leu Asn Ile

165 170 175

Lys Lys Asp Trp Glu Asn Tyr Ile Ser Tyr Ile Glu Asn Val Glu Asn

180 185 190

Ile Asn Ile Lys Asn Ile Asp Arg Tyr Asn Leu Leu Tyr Lys His Phe

195 200 205

Cys Glu Asn Glu Ser Thr Ile Asn Cys Lys Met Glu Leu Leu Ser Val

210 215 220

Glu Gln Leu Lys Glu Phe Gly Gly Cys Val Met Lys Gln His Ile Asn

225 230 235 240

Ser Met Thr Ile Asn Ile Gln Asp Phe Lys Ile Glu Asn Lys Glu Asn

245 250 255

Ser Leu Gly Phe Ile Leu Asn Leu Pro Leu Asn Lys Lys Lys Tyr Gln

260 265 270

Ile Glu Leu Trp Gly Asn Arg Gln Ile Lys Lys Gly Asn Lys Asp Asn

275 280 285

Tyr Lys Thr Leu Val Asp Phe Ile Asn Thr Tyr Gly Gln Asn Ile Ile

290 295 300

Phe Thr Ile Lys Asn Asn Lys Ile Tyr Val Val Phe Ser Tyr Glu Cys

305 310 315 320

Glu Leu Lys Glu Lys Glu Ile Asn Phe Asp Lys Ile Val Gly Ile Asp

325 330 335

Val Asn Phe Lys His Ala Leu Phe Val Ala Ser Glu Arg Asp Lys Asn

340 345 350

Pro Leu Gln Asp Asn Asn Gln Leu Lys Gly Tyr Ile Asn Leu Tyr Lys

355 360 365

Tyr Leu Leu Glu His Asn Glu Phe Thr Ser Leu Leu Thr Lys Glu Glu

370 375 380

Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Ile Ala Lys Gly Val Thr Phe Cys Pro Leu

385 390 395 400

Glu Tyr Asn Leu Leu Phe Thr Arg Ile Glu Asn Lys Gly Gly Lys Ser

405 410 415

Asn Asp Lys Glu Gln Val Leu Ser Lys Leu Leu Tyr Ser Leu Gln Ile

420 425 430

Lys Leu Lys Asn Glu Asn Lys Ile Gln Glu Tyr Ile Tyr Val Ser Cys

435 440 445

Val Asn Lys Leu Arg Ala Lys Tyr Val Ser Tyr Phe Ile Leu Lys Glu

450 455 460

Lys Tyr Tyr Glu Lys Gln Lys Glu Tyr Asp Ile Glu Met Gly Phe Thr

465 470 475 480

Asp Asp Ser Thr Glu Ser Lys Glu Ser Met Asp Lys Arg Arg Leu Glu

485 490 495

Phe Pro Phe Arg Asn Thr Gln Ile Ala Asn Gly Phe Leu Glu Lys Leu

500 505 510

Ser Asn Val Gln Gln Asp Ile Asn Gly Cys Leu Lys Asn Ile Ile Asn

515 520 525

Tyr Ala Tyr Lys Val Phe Glu Gln Asn Gly Phe Gly Val Ile Ala Leu

530 535 540

Glu Asn Leu Glu Asn Ser Asn Phe Glu Lys Thr Gln Val Leu Pro Thr

545 550 555 560

Ile Lys Ser Leu Leu Glu Tyr His Lys Leu Glu Asn Gln Asn Ile Asn

565 570 575

Asn Ile Asn Ala Ser Asp Lys Val Lys Glu Tyr Ile Glu Lys Glu Tyr

580 585 590

Tyr Glu Leu Thr Thr Asn Glu Asn Asn Glu Ile Val Asp Ala Lys Tyr

595 600 605

Thr Lys Lys Gly Ile Ile Lys Val Lys Lys Ala Asn Phe Phe Asn Leu

610 615 620

Met Met Lys Ser Leu His Phe Ala Ser Asn Lys Asp Glu Phe Ile Leu

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Leu Ser Asn Asn Gly Lys Thr Gln Ile Ala Leu Val Pro Ser Glu Tyr

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755

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<211> 756

<212> PRT

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755

<210> 21

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 21

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<210> 22

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 22

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<210> 23

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 23

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755

<210> 24

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

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<400> 24

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<210> 25

<211> 756

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755

<210> 26

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 26

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<210> 27

<211> 756

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<213> 人工序列

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<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 27

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<210> 28

<211> 756

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<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 28

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<210> 29

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 29

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755

<210> 30

<211> 756

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<223> 对人工序列的描述：合成

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755

<210> 31

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 31

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755

<210> 32

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 32

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<210> 33

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 33

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755

<210> 34

<211> 756

<212> PRT

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<400> 34

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<210> 35

<211> 756

<212> PRT

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<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

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<400> 35

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<210> 37

<211> 756

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<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

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<400> 37

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<210> 38

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 38

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<210> 39

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 39

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Phe Lys Ser Val Val Gly Asn Tyr Arg Thr Lys Ile Arg Thr Leu Asn

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Tyr Lys Ile Lys Arg Lys Asn Val Asp Glu Asn Ser Thr Asn Glu Asp

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Lys Lys Asp Trp Glu Asn Tyr Ile Ser Tyr Ile Glu Asn Val Glu Asn

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755

<210> 40

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 40

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<210> 41

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

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Phe Asn Ile Leu Ala Glu Leu Lys Lys Gln Asn Lys Ile Lys Ile Phe

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755

<210> 42

<211> 56

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

寡核苷酸

<400> 42

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<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 对未知的描述：

AAVS1哺乳动物靶序列

<400> 43

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<210> 44

<211> 56

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

寡核苷酸

<400> 44

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<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 对未知的描述：

VEGFA哺乳动物靶序列

<400> 45

tccagaccac caatgggcac 20

<210> 46

<211> 56

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

寡核苷酸

<400> 46

ccuguuguga auacucuuuu auagguauca aacaacccgc cgcuuccuga gccauc 56

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 对未知的描述：

EMX1哺乳动物靶序列

<400> 47

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<210> 48

<400> 48

000

<210> 49

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 49

Met Thr Thr Lys Gln Val Lys Ser Ile Val Leu Lys Val Lys Asn Thr

1 5 10 15

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Tyr Asn Ile Cys Ser Glu Trp Ile Lys Asp Asn Leu Thr Ser Ile Thr

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85 90 95

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100 105 110

Gly Asn Ile Leu Asn Leu Ser Glu Thr Tyr Tyr Arg Arg Asn Gly Tyr

115 120 125

Phe Lys Ser Val Val Gly Asn Tyr Arg Thr Lys Ile Arg Thr Leu Asn

130 135 140

Tyr Lys Ile Lys Arg Lys Asn Val Asp Glu Asn Ser Thr Asn Glu Asp

145 150 155 160

Ile Glu Leu Gln Val Met Tyr Glu Ile Ala Lys Arg Lys Leu Asn Ile

165 170 175

Lys Lys Asp Trp Glu Asn Tyr Ile Ser Tyr Ile Glu Asn Val Glu Asn

180 185 190

Ile Asn Ile Lys Asn Ile Asp Arg Tyr Asn Leu Leu Tyr Lys His Phe

195 200 205

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Glu Ile Glu Lys

755

<210> 50

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 50

Met Thr Thr Lys Gln Val Lys Ser Ile Val Leu Lys Val Lys Asn Thr

1 5 10 15

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Tyr Asn Ile Cys Ser Glu Trp Ile Lys Asp Asn Leu Thr Ser Ile Thr

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115 120 125

Phe Lys Ser Val Val Gly Asn Tyr Arg Thr Lys Ile Arg Thr Leu Asn

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165 170 175

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180 185 190

Ile Asn Ile Lys Asn Ile Asp Arg Tyr Asn Leu Leu Tyr Lys His Phe

195 200 205

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275 280 285

Tyr Lys Thr Leu Val Asp Phe Ile Asn Thr Tyr Gly Gln Asn Ile Ile

290 295 300

Phe Thr Ile Lys Asn Asn Lys Ile Tyr Val Val Phe Ser Tyr Glu Cys

305 310 315 320

Glu Leu Lys Glu Lys Glu Ile Asn Phe Asp Lys Ile Val Gly Ile Asp

325 330 335

Val Asn Phe Lys His Ala Leu Phe Val Ala Ser Glu Arg Asp Lys Asn

340 345 350

Gly Leu Gln Gly Asn Asn Gln Leu Lys Gly Tyr Ile Asn Leu Tyr Gly

355 360 365

Tyr Leu Leu Glu His Asn Glu Phe Thr Ser Leu Leu Thr Lys Glu Glu

370 375 380

Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Ile Ala Lys Gly Val Thr Phe Cys Pro Leu

385 390 395 400

Glu Tyr Asn Leu Leu Phe Thr Arg Ile Glu Asn Lys Gly Gly Lys Ser

405 410 415

Asn Asp Lys Glu Gln Val Leu Ser Lys Leu Leu Tyr Ser Leu Gln Ile

420 425 430

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Lys Tyr Tyr Glu Lys Gln Lys Glu Tyr Asp Ile Glu Met Gly Phe Thr

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485 490 495

Phe Pro Phe Arg Asn Thr Gln Ile Ala Asn Gly Phe Leu Glu Lys Leu

500 505 510

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515 520 525

Tyr Ala Tyr Lys Val Phe Glu Gln Asn Gly Phe Gly Val Ile Ala Leu

530 535 540

Glu Asn Leu Glu Asn Ser Asn Phe Glu Lys Thr Gln Val Leu Pro Thr

545 550 555 560

Ile Lys Ser Leu Leu Arg Tyr His Lys Leu Glu Asn Gln Asn Ile Asn

565 570 575

Asn Ile Asn Ala Ser Asp Lys Val Lys Glu Tyr Ile Glu Lys Glu Tyr

580 585 590

Tyr Glu Leu Thr Thr Asn Glu Asn Asn Glu Ile Val Asp Ala Lys Tyr

595 600 605

Thr Lys Lys Gly Ile Ile Lys Val Lys Lys Ala Asn Phe Phe Asn Leu

610 615 620

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755

<210> 51

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

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<210> 53

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 53

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<210> 54

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 54

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<210> 55

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 55

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690 695 700

Ile Ile Glu Asn Glu Asn Leu Arg Lys Leu Phe Cys Gly Lys Leu Lys

705 710 715 720

Val Ser Gly Tyr Asn Thr Pro Ile Leu Arg Ala Thr Lys Lys Gly Gln

725 730 735

Phe Asn Ile Leu Ala Glu Leu Lys Lys Gln Asn Lys Ile Lys Ile Phe

740 745 750

Glu Ile Glu Lys

755

<210> 56

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 56

Met Thr Thr Lys Gln Val Lys Ser Ile Val Leu Lys Val Lys Asn Thr

1 5 10 15

Asn Glu Cys Pro Ile Thr Lys Asp Val Ile Asn Glu Tyr Lys Lys Tyr

20 25 30

Tyr Asn Ile Cys Ser Glu Trp Ile Lys Asp Asn Leu Thr Ser Ile Thr

35 40 45

Ile Gly Asp Ile Ala Ser Phe Leu Lys Glu Ala Arg Asn Lys Asp Thr

50 55 60

Ile Pro Thr Tyr Ile Asn Met Gly Leu Ser Glu Glu Trp Lys Tyr Lys

65 70 75 80

Pro Ile Tyr His Leu Phe Thr Asp Arg Tyr His Glu Lys Ser Ala Asn

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Asn Leu Leu Tyr Ala Tyr Phe Lys Glu Lys Asn Leu Asp Cys Tyr Asn

100 105 110

Gly Asn Ile Leu Asn Leu Ser Glu Thr Tyr Tyr Arg Arg Asn Gly Tyr

115 120 125

Phe Lys Ser Val Val Gly Asn Tyr Arg Thr Lys Ile Arg Thr Leu Asn

130 135 140

Tyr Lys Ile Lys Arg Lys Asn Val Asp Glu Asn Ser Thr Asn Glu Asp

145 150 155 160

Ile Glu Leu Gln Val Met Tyr Glu Ile Ala Lys Arg Lys Leu Asn Ile

165 170 175

Lys Lys Asp Trp Glu Asn Tyr Ile Ser Tyr Ile Glu Asn Val Glu Asn

180 185 190

Ile Asn Ile Lys Asn Ile Asp Arg Tyr Asn Leu Leu Tyr Lys His Phe

195 200 205

Cys Glu Asn Glu Ser Thr Ile Asn Cys Lys Met Glu Leu Leu Ser Val

210 215 220

Glu Gln Leu Lys Glu Phe Gly Gly Cys Val Met Lys Gln His Ile Asn

225 230 235 240

Ser Met Thr Ile Asn Ile Gln Asp Phe Lys Ile Glu Asn Lys Glu Asn

245 250 255

Ser Leu Gly Phe Ile Leu Asn Leu Pro Leu Asn Lys Lys Lys Tyr Gln

260 265 270

Ile Glu Leu Trp Gly Asn Arg Gln Ile Lys Lys Gly Asn Lys Asp Asn

275 280 285

Tyr Lys Thr Leu Val Asp Phe Ile Asn Thr Tyr Gly Gln Asn Ile Ile

290 295 300

Phe Thr Ile Lys Asn Asn Lys Ile Tyr Val Val Phe Ser Tyr Glu Cys

305 310 315 320

Glu Leu Lys Glu Lys Glu Ile Asn Phe Asp Lys Ile Val Gly Ile Asp

325 330 335

Val Asn Phe Lys His Ala Leu Phe Val Ala Ser Glu Arg Asp Lys Asn

340 345 350

Gly Gly Gln Asp Asn Asn Gln Leu Lys Gly Tyr Ile Asn Leu Tyr Lys

355 360 365

Tyr Leu Leu Glu His Asn Glu Phe Thr Ser Leu Leu Thr Lys Glu Glu

370 375 380

Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Ile Ala Lys Gly Val Thr Phe Cys Pro Leu

385 390 395 400

Glu Tyr Asn Leu Leu Phe Thr Arg Ile Glu Asn Lys Gly Gly Lys Ser

405 410 415

Asn Asp Lys Glu Gln Val Leu Ser Lys Leu Leu Tyr Ser Leu Gln Ile

420 425 430

Lys Leu Lys Asn Glu Asn Lys Ile Gln Glu Tyr Ile Tyr Val Ser Cys

435 440 445

Val Asn Lys Leu Arg Ala Lys Tyr Val Ser Tyr Phe Ile Leu Lys Glu

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Lys Tyr Tyr Glu Lys Gln Lys Glu Tyr Asp Ile Glu Met Gly Phe Thr

465 470 475 480

Asp Asp Ser Thr Glu Ser Lys Glu Ser Met Asp Lys Arg Arg Leu Glu

485 490 495

Phe Pro Phe Arg Asn Thr Gln Ile Ala Asn Gly Phe Leu Glu Lys Leu

500 505 510

Ser Asn Val Gln Gln Asp Ile Asn Gly Cys Leu Lys Asn Ile Ile Asn

515 520 525

Tyr Ala Tyr Lys Val Phe Glu Gln Asn Gly Phe Gly Val Ile Ala Leu

530 535 540

Glu Asn Leu Glu Asn Ser Asn Phe Glu Lys Thr Gln Val Leu Pro Thr

545 550 555 560

Ile Lys Ser Leu Leu Arg Tyr His Lys Leu Glu Asn Gln Asn Ile Asn

565 570 575

Asn Ile Asn Ala Ser Asp Lys Val Lys Glu Tyr Ile Glu Lys Glu Tyr

580 585 590

Tyr Glu Leu Thr Thr Asn Glu Asn Asn Glu Ile Val Asp Ala Lys Tyr

595 600 605

Thr Lys Lys Gly Ile Ile Lys Val Lys Lys Ala Asn Phe Phe Asn Leu

610 615 620

Met Met Lys Ser Leu His Phe Ala Ser Asn Lys Asp Glu Phe Ile Leu

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Leu Ser Asn Asn Gly Lys Thr Gln Ile Ala Leu Val Pro Ser Glu Tyr

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660 665 670

Gly Lys Lys Val Asp Lys Lys Lys Val Arg Gln Lys Gln Glu Thr His

675 680 685

Ile Asn Gly Leu Asn Ala Asp Phe Asn Ala Ala Asn Asn Ile Lys Tyr

690 695 700

Ile Ile Glu Asn Glu Asn Leu Arg Lys Leu Phe Cys Gly Lys Leu Lys

705 710 715 720

Val Ser Gly Tyr Asn Thr Pro Ile Leu Arg Ala Thr Lys Lys Gly Gln

725 730 735

Phe Asn Ile Leu Ala Glu Leu Lys Lys Gln Asn Lys Ile Lys Ile Phe

740 745 750

Glu Ile Glu Lys

755

<210> 57

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 57

Met Thr Thr Lys Gln Val Lys Ser Ile Val Leu Lys Val Lys Asn Thr

1 5 10 15

Asn Glu Cys Pro Ile Thr Lys Asp Val Ile Asn Glu Tyr Lys Lys Tyr

20 25 30

Tyr Asn Ile Cys Ser Glu Trp Ile Lys Asp Asn Leu Thr Ser Ile Thr

35 40 45

Ile Gly Asp Ile Ala Ser Phe Leu Lys Glu Ala Arg Asn Lys Asp Thr

50 55 60

Ile Pro Thr Tyr Ile Asn Met Gly Leu Ser Glu Glu Trp Lys Tyr Lys

65 70 75 80

Pro Ile Tyr His Leu Phe Thr Asp Arg Tyr His Glu Lys Ser Ala Asn

85 90 95

Asn Leu Leu Tyr Ala Tyr Phe Lys Glu Lys Asn Leu Asp Cys Tyr Asn

100 105 110

Gly Asn Ile Leu Asn Leu Ser Glu Thr Tyr Tyr Arg Arg Asn Gly Tyr

115 120 125

Phe Lys Ser Val Val Gly Asn Tyr Arg Thr Lys Ile Arg Thr Leu Asn

130 135 140

Tyr Lys Ile Lys Arg Lys Asn Val Asp Glu Asn Ser Thr Asn Glu Asp

145 150 155 160

Ile Glu Leu Gln Val Met Tyr Glu Ile Ala Lys Arg Lys Leu Asn Ile

165 170 175

Lys Lys Asp Trp Glu Asn Tyr Ile Ser Tyr Ile Glu Asn Val Glu Asn

180 185 190

Ile Asn Ile Lys Asn Ile Asp Arg Tyr Asn Leu Leu Tyr Lys His Phe

195 200 205

Cys Glu Asn Glu Ser Thr Ile Asn Cys Lys Met Glu Leu Leu Ser Val

210 215 220

Glu Gln Leu Lys Glu Phe Gly Gly Cys Val Met Lys Gln His Ile Asn

225 230 235 240

Ser Met Thr Ile Asn Ile Gln Asp Phe Lys Ile Glu Asn Lys Glu Asn

245 250 255

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290 295 300

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305 310 315 320

Glu Leu Lys Glu Lys Glu Ile Asn Phe Asp Lys Ile Val Gly Ile Asp

325 330 335

Val Asn Phe Lys His Ala Leu Phe Val Ala Ser Glu Arg Asp Lys Asn

340 345 350

Pro Gly Gln Asp Asn Asn Gln Leu Lys Gly Tyr Ile Asn Leu Tyr Lys

355 360 365

Tyr Leu Leu Glu His Asn Glu Phe Thr Ser Leu Leu Thr Lys Glu Glu

370 375 380

Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Ile Ala Lys Gly Val Thr Phe Cys Pro Leu

385 390 395 400

Glu Tyr Asn Leu Leu Phe Thr Arg Ile Glu Asn Lys Gly Gly Lys Ser

405 410 415

Asn Asp Lys Glu Gln Val Leu Ser Lys Leu Leu Tyr Ser Leu Gln Ile

420 425 430

Lys Leu Lys Asn Glu Asn Lys Ile Gln Glu Tyr Ile Tyr Val Ser Cys

435 440 445

Val Asn Lys Leu Arg Ala Lys Tyr Val Ser Tyr Phe Ile Leu Lys Glu

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Lys Tyr Tyr Glu Lys Gln Lys Glu Tyr Asp Ile Glu Met Gly Phe Thr

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Asp Asp Ser Thr Glu Ser Lys Glu Ser Met Asp Lys Arg Arg Leu Glu

485 490 495

Phe Pro Phe Arg Asn Thr Gln Ile Ala Asn Gly Phe Leu Glu Lys Leu

500 505 510

Ser Asn Val Gln Gln Asp Ile Asn Gly Cys Leu Lys Asn Ile Ile Asn

515 520 525

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530 535 540

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565 570 575

Asn Ile Asn Ala Ser Asp Lys Val Lys Glu Tyr Ile Glu Lys Glu Tyr

580 585 590

Tyr Glu Leu Thr Thr Asn Glu Asn Asn Glu Ile Val Asp Ala Lys Tyr

595 600 605

Thr Lys Lys Gly Ile Ile Lys Val Lys Lys Ala Asn Phe Phe Asn Leu

610 615 620

Met Met Lys Ser Leu His Phe Ala Ser Asn Lys Asp Glu Phe Ile Leu

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675 680 685

Ile Asn Gly Leu Asn Ala Asp Phe Asn Ala Ala Asn Asn Ile Lys Tyr

690 695 700

Ile Ile Glu Asn Glu Asn Leu Arg Lys Leu Phe Cys Gly Lys Leu Lys

705 710 715 720

Val Ser Gly Tyr Asn Thr Pro Ile Leu Arg Ala Thr Lys Lys Gly Gln

725 730 735

Phe Asn Ile Leu Ala Glu Leu Lys Lys Gln Asn Lys Ile Lys Ile Phe

740 745 750

Glu Ile Glu Lys

755

<210> 58

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多肽

<400> 58

Met Thr Thr Lys Gln Val Lys Ser Ile Val Leu Lys Val Lys Asn Thr

1 5 10 15

Asn Glu Cys Pro Ile Thr Lys Asp Val Ile Asn Glu Tyr Lys Lys Tyr

20 25 30

Tyr Asn Ile Cys Ser Glu Trp Ile Lys Asp Asn Leu Thr Ser Ile Thr

35 40 45

Ile Gly Asp Ile Ala Ser Phe Leu Lys Glu Ala Arg Asn Lys Asp Thr

50 55 60

Ile Pro Thr Tyr Ile Asn Met Gly Leu Ser Glu Glu Trp Lys Tyr Lys

65 70 75 80

Pro Ile Tyr His Leu Phe Thr Asp Arg Tyr His Glu Lys Ser Ala Asn

85 90 95

Asn Leu Leu Tyr Ala Tyr Phe Lys Glu Lys Asn Leu Asp Cys Tyr Asn

100 105 110

Gly Asn Ile Leu Asn Leu Ser Glu Thr Tyr Tyr Arg Arg Asn Gly Tyr

115 120 125

Phe Lys Ser Val Val Gly Asn Tyr Arg Thr Lys Ile Arg Thr Leu Asn

130 135 140

Tyr Lys Ile Lys Arg Lys Asn Val Asp Glu Asn Ser Thr Asn Glu Asp

145 150 155 160

Ile Glu Leu Gln Val Met Tyr Glu Ile Ala Lys Arg Lys Leu Asn Ile

165 170 175

Lys Lys Asp Trp Glu Asn Tyr Ile Ser Tyr Ile Glu Asn Val Glu Asn

180 185 190

Ile Asn Ile Lys Asn Ile Asp Arg Tyr Asn Leu Leu Tyr Lys His Phe

195 200 205

Cys Glu Asn Glu Ser Thr Ile Asn Cys Lys Met Glu Leu Leu Ser Val

210 215 220

Glu Gln Leu Lys Glu Phe Gly Gly Cys Val Met Lys Gln His Ile Asn

225 230 235 240

Ser Met Thr Ile Asn Ile Gln Asp Phe Lys Ile Glu Asn Lys Glu Asn

245 250 255

Ser Leu Gly Phe Ile Leu Asn Leu Pro Leu Asn Lys Lys Lys Tyr Gln

260 265 270

Ile Glu Leu Trp Gly Asn Arg Gln Ile Lys Lys Gly Asn Lys Asp Asn

275 280 285

Tyr Lys Thr Leu Val Asp Phe Ile Asn Thr Tyr Gly Gln Asn Ile Ile

290 295 300

Phe Thr Ile Lys Asn Asn Lys Ile Tyr Val Val Phe Ser Tyr Glu Cys

305 310 315 320

Glu Leu Lys Glu Lys Glu Ile Asn Phe Asp Lys Ile Val Gly Ile Asp

325 330 335

Val Asn Phe Lys His Ala Leu Phe Val Ala Ser Glu Arg Asp Lys Asn

340 345 350

Gly Gly Gln Gly Asn Asn Gln Leu Lys Gly Tyr Ile Asn Leu Tyr Lys

355 360 365

Tyr Leu Leu Glu His Asn Glu Phe Thr Ser Leu Leu Thr Lys Glu Glu

370 375 380

Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Ile Ala Lys Gly Val Thr Phe Cys Pro Leu

385 390 395 400

Glu Tyr Asn Leu Leu Phe Thr Arg Ile Glu Asn Lys Gly Gly Lys Ser

405 410 415

Asn Asp Lys Glu Gln Val Leu Ser Lys Leu Leu Tyr Ser Leu Gln Ile

420 425 430

Lys Leu Lys Asn Glu Asn Lys Ile Gln Glu Tyr Ile Tyr Val Ser Cys

435 440 445

Val Asn Lys Leu Arg Ala Lys Tyr Val Ser Tyr Phe Ile Leu Lys Glu

450 455 460

Lys Tyr Tyr Glu Lys Gln Lys Glu Tyr Asp Ile Glu Met Gly Phe Thr

465 470 475 480

Asp Asp Ser Thr Glu Ser Lys Glu Ser Met Asp Lys Arg Arg Leu Glu

485 490 495

Phe Pro Phe Arg Asn Thr Gln Ile Ala Asn Gly Phe Leu Glu Lys Leu

500 505 510

Ser Asn Val Gln Gln Asp Ile Asn Gly Cys Leu Lys Asn Ile Ile Asn

515 520 525

Tyr Ala Tyr Lys Val Phe Glu Gln Asn Gly Phe Gly Val Ile Ala Leu

530 535 540

Glu Asn Leu Glu Asn Ser Asn Phe Glu Lys Thr Gln Val Leu Pro Thr

545 550 555 560

Ile Lys Ser Leu Leu Arg Tyr His Lys Leu Arg Asn Gln Asn Ile Asn

565 570 575

Asn Ile Asn Ala Ser Asp Lys Val Lys Glu Tyr Ile Glu Lys Glu Tyr

580 585 590

Tyr Glu Leu Thr Thr Asn Glu Asn Asn Glu Ile Val Asp Ala Lys Tyr

595 600 605

Thr Lys Lys Gly Ile Ile Lys Val Lys Lys Ala Asn Phe Phe Asn Leu

610 615 620

Met Met Lys Ser Leu His Phe Ala Ser Asn Lys Asp Glu Phe Ile Leu

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Leu Ser Asn Asn Gly Lys Thr Gln Ile Ala Leu Val Pro Ser Glu Tyr

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Thr Ser Gln Met Asp Ser Ile Glu His Cys Leu Tyr Val Asp Lys Asn

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Gly Lys Lys Val Asp Lys Lys Lys Val Arg Gln Lys Gln Glu Thr His

675 680 685

Ile Asn Gly Leu Asn Ala Asp Phe Asn Ala Ala Asn Asn Ile Lys Tyr

690 695 700

Ile Ile Glu Asn Glu Asn Leu Arg Lys Leu Phe Cys Gly Lys Leu Lys

705 710 715 720

Val Ser Gly Tyr Asn Thr Pro Ile Leu Arg Ala Thr Lys Lys Gly Gln

725 730 735

Phe Asn Ile Leu Ala Glu Leu Lys Lys Gln Asn Lys Ile Lys Ile Phe

740 745 750

Glu Ile Glu Lys

755

<210> 59

<211> 2268

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 59

atgactacca agcaagtcaa atccatagta ctgaaggtta agaatacaaa tgaatgccca 60

atcaccaagg atgtgatcaa cgagtacaag aagtattata atatctgtag cgagtggatt 120

aaagataatc tgacctctat aaccatcggc gacatcgcct cttttttgaa agaagcaaca 180

aacaaagata ctatcccaac gtacatcaat atgggactta gtgaagagtg gaaatacaag 240

cctatctacc atctctttac cgacagatac cacgagaaat cagccaacaa cctgctttat 300

gcttacttta aggaaaagaa tctggattgt tataatggca atatcctcaa cttgtccgag 360

acatactacc gtcgcaatgg atacttcaag tcggtagtgg ggaactatcg tacaaaaatt 420

cgcacactta actataagat taagagaaaa aacgttgacg agaatagcac caatgaagat 480

attgaactcc aagttatgta tgaaatcgca aagcgcaagc tgaacattaa gaaggactgg 540

gagaattata tctcatacat tgagaatgtc gagaacatca acatcaaaaa tatcgatcgg 600

tacaacctgc tatacaagca tttctgtgaa aatgagtcca ccatcaactg caagatggag 660

ttgctctctg tggaacagct caaagagttc gggggttgtg tgatgaagca gcacataaat 720

tccatgacga taaacataca ggactttaag attgaaaaca aggagaactc actgggtttc 780

atcctgaacc tgcccttgaa caagaaaaag taccagatag aactgtgggg gaaccgacaa 840

atcaaaaaag ggaataagga taactataag acgctggttg actttatcaa cacttatggt 900

cagaacatta ttttcaccat taaaaataat aaaatttacg tcgtgttcag ctacgagtgt 960

gaattaaagg agaaggaaat caatttcgac aagattgtcg ggattgatgt gaatttcaag 1020

cacgccctgt ttgtggcttc cgagcgggac aaaaacccac tgcaagataa taaccagcta 1080

aaagggtaca taaacctgta tggctatctt ctggagcata atgaatttac aagcctgctg 1140

accaaggagg aactggacat ttataaagaa attgcgaagg gcgtcacatt ttgtcccctg 1200

gagtacaact tgcttttcac tagaatagag aataagggcg gaaagtctaa cgacaaagaa 1260

caggtgctga gcaagctgct ctatagcttg cagatcaaac tcaaaaatga aaataagatt 1320

caggagtata tctatgtgag ttgcgtaaat aagctccgag ccaaatacgt gtcatacttt 1380

atcttgaaag aaaaatacta cgaaaagcag aaagagtacg acatcgagat gggcttcacg 1440

gatgactcga ctgagtctaa agagtctatg gacaagaggc ggctggagtt cccctttagg 1500

aatactcaga ttgctaatgg cttcctcgaa aaactctcca acgtgcagca agatatcaac 1560

ggatgcttaa agaatattat taactatgcc tataaagtat tcgagcaaaa cggatttgga 1620

gtcatcgcac tggaaaactt agagaacagc aacttcgaaa agacacaggt cttacctaca 1680

atcaagagtc tacttcggta tcataagttg gagaatcaga atattaataa tattaacgcg 1740

agtgacaagg tgaaagagta catagagaag gagtattacg aactaactac caacgagaac 1800

aatgaaatag tcgatgctaa atacactaaa aagggaatta tcaaggtgaa aaaagctaac 1860

ttttttaacc taatgatgaa atccctgcac tttgccagta acaaagatga gttcatcttg 1920

ctgagcaata acggtaaaac acaaattgca ctggttccga gcgagtatac ctcccagatg 1980

gactctatag aacactgcct ctacgtggac aaaaatggga aaaaagtgga caaaaagaag 2040

gttaggcaga agcaggaaac tcacatcaac ggcctcaacg ccgatttcaa cgccgctaac 2100

aatataaagt acatcatcga aaacgagaat cttaggaagc tgttttgcgg caagctgaag 2160

gtgtcaggtt ataacacccc tatcctcaga gccaccaaaa agggccagtt caatattctg 2220

gcagagctga agaagcagaa taagattaaa atcttcgaga ttgagaaa 2268

<210> 60

<211> 2268

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 60

atgaccacca agcaagtgaa gagcatcgtg ctgaaggtga agaacaccaa cgagtgcccc 60

atcaccaagg acgtgatcaa cgagtacaag aagtactaca acatctgcag cgagtggatc 120

aaggacaacc tgacaagcat caccatcggc gacatcgcta gcttcctgaa ggaggccacc 180

aacaaggaca ccatccccac ctacatcaac atgggcctga gcgaggagtg gaagtacaag 240

cccatctacc acctgttcac cgacagatac cacgagaaga gcgccaataa cctgctgtac 300

gcctatttca aggagaagaa cctggactgc tacaacggca acatcctgaa cctgagcgag 360

acctactaca gaagaaacgg ctacttcaag agcgtggtgg gcaactacag aaccaagatc 420

agaaccctga actataagat caagcgtaaa aacgtggacg agaacagcac caacgaggac 480

atcgagctgc aagtgatgta cgagatcgcc aaaagaaagc tgaacatcaa gaaggactgg 540

gagaactaca tcagctacat cgagaacgtg gaaaacatca atattaagaa catcgacaga 600

tataaccttt tgtacaagca tttctgcgag aacgagagca ccatcaactg caagatggag 660

ctgctgagcg tggagcagct gaaggagttc ggcggctgcg tgatgaagca gcacatcaac 720

agcatgacca tcaacatcca agacttcaag atcgaaaaca aagaaaacag cctgggcttt 780

atcctcaacc ttccactgaa caagaagaag tatcagatcg agctgtgggg caacagacag 840

atcaagaagg gcaacaagga caactataag acgttagtgg acttcatcaa cacctacggg 900

cagaacatca tcttcaccat caagaacaac aagatctacg tggtgttcag ctacgagtgc 960

gagctgaaag agaaggaaat caacttcgac aagatcgtgg gcatcgacgt gaacttcaag 1020

cacgccctgt tcgtggctag cgagagagac aagaaccccc tgcaagacaa caatcagctg 1080

aagggctaca tcaacctgta cggctacctg ctggagcaca acgagttcac aagcctgctg 1140

accaaggagg agctggacat ctacaaggag atcgccaagg gtgtcacctt ctgccccctg 1200

gagtacaacc ttcttttcac aagaatcgag aacaagggcg gcaagagcaa cgacaaggag 1260

caagtgctga gcaagctgct gtacagcctg cagatcaagc tgaagaacga gaacaagatc 1320

caagagtaca tctacgtgag ctgcgtgaac aagctgagag ccaagtacgt gagctacttc 1380

atcctgaagg aaaagtacta cgagaagcag aaggagtacg acatcgagat gggcttcacc 1440

gacgacagca ccgagagcaa ggagagcatg gacaagagaa gactggagtt ccccttcaga 1500

aacacacaga tcgccaacgg gttcctggag aagctgagca acgtgcagca agacatcaac 1560

ggctgcctga agaacatcat caactacgcc tacaaggtgt tcgagcagaa cggcttcggc 1620

gtgatcgccc tggagaacct ggagaacagc aacttcgaga agacccaagt gctgcccacc 1680

atcaagagcc tgctgagata ccacaagctg gagaaccaaa atatcaataa tatcaatgct 1740

agcgacaagg tgaaggagta catcgagaag gagtactacg agctgaccac caacgagaac 1800

aacgagatcg tggacgccaa gtacactaag aagggtataa tcaaggtgaa gaaggccaac 1860

ttcttcaacc tgatgatgaa gagcctgcac ttcgctagca acaaggacga gttcatcctg 1920

ctgagcaaca acggcaagac acagatcgca ctggtgccta gcgagtacac atctcagatg 1980

gacagcatcg agcactgcct gtacgtggac aagaacggca agaaggtgga caagaagaag 2040

gtgagacaga agcaagagac ccacatcaac ggcctgaacg ccgacttcaa cgccgccaac 2100

aacatcaagt atatcatcga gaacgagaac ctgagaaagc tgttctgcgg caagctgaag 2160

gtgagcggct acaacacccc catcctgaga gccacaaaga aagggcagtt taacatcctg 2220

gccgagctga agaagcagaa caagatcaag atctttgaga tcgagaag 2268

<210> 61

<211> 2268

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 61

atgaccacca agcaggtgaa gagcatcgtg ctgaaggtga agaacaccaa cgagtgcccc 60

atcaccaagg acgtgatcaa cgagtacaag aagtactaca acatctgcag cgagtggatc 120

aaggacaacc tgaccagcat caccatcggc gacatcgcca gcttcctgaa ggaggccacc 180

aacaaggaca ccatccccac ctacatcaac atgggcctga gcgaggagtg gaagtacaag 240

cccatctacc acctgttcac cgaccggtac cacgagaaga gcgccaacaa cctgctgtac 300

gcctacttca aggagaagaa cctggactgc tacaacggca acatcctgaa cctgagcgag 360

acctactacc ggcggaacgg ctacttcaag agcgtggtgg gcaactaccg gaccaagatc 420

cggaccctga actacaagat caagcggaag aacgtggacg agaacagcac caacgaggac 480

atcgagctgc aggtgatgta cgagatcgcc aagcggaagc tgaacatcaa gaaggactgg 540

gagaactaca tcagctacat cgagaacgtg gagaacatca acatcaagaa catcgaccgg 600

tacaacctgc tgtacaagca cttctgcgag aacgagagca ccatcaactg caagatggag 660

ctgctgagcg tggagcagct gaaggagttc ggcggctgcg tgatgaagca gcacatcaac 720

agcatgacca tcaacatcca ggacttcaag atcgagaaca aggagaacag cctgggcttc 780

atcctgaacc tgcccctgaa caagaagaag taccagatcg agctgtgggg caaccggcag 840

atcaagaagg gcaacaagga caactacaag accctggtgg acttcatcaa cacctacggc 900

cagaacatca tcttcaccat caagaacaac aagatctacg tggtgttcag ctacgagtgc 960

gagctgaagg agaaggagat caacttcgac aagatcgtgg gcatcgacgt gaacttcaag 1020

cacgccctgt tcgtggccag cgagcgggac aagaaccccc tgcaggacaa caaccagctg 1080

aagggctaca tcaacctgta cggctacctg ctggagcaca acgagttcac cagcctgctg 1140

accaaggagg agctggacat ctacaaggag atcgccaagg gcgtgacctt ctgccccctg 1200

gagtacaacc tgctgttcac ccggatcgag aacaagggcg gcaagagcaa cgacaaggag 1260

caggtgctga gcaagctgct gtacagcctg cagatcaagc tgaagaacga gaacaagatc 1320

caggagtaca tctacgtgag ctgcgtgaac aagctgcggg ccaagtacgt gagctacttc 1380

atcctgaagg agaagtacta cgagaagcag aaggagtacg acatcgagat gggcttcacc 1440

gacgacagca ccgagagcaa ggagagcatg gacaagcggc ggctggagtt ccccttccgg 1500

aacacccaga tcgccaacgg cttcctggag aagctgagca acgtgcagca ggacatcaac 1560

ggctgcctga agaacatcat caactacgcc tacaaggtgt tcgagcagaa cggcttcggc 1620

gtgatcgccc tggagaacct ggagaacagc aacttcgaga agacccaggt gctgcccacc 1680

atcaagagcc tgctgcggta ccacaagctg gagaaccaga acatcaacaa catcaacgcc 1740

agcgacaagg tgaaggagta catcgagaag gagtactacg agctgaccac caacgagaac 1800

aacgagatcg tggacgccaa gtacaccaag aagggcatca tcaaggtgaa gaaggccaac 1860

ttcttcaacc tgatgatgaa gagcctgcac ttcgccagca acaaggacga gttcatcctg 1920

ctgagcaaca acggcaagac ccagatcgcc ctggtgccca gcgagtacac cagccagatg 1980

gacagcatcg agcactgcct gtacgtggac aagaacggca agaaggtgga caagaagaag 2040

gtgcggcaga agcaggagac ccacatcaac ggcctgaacg ccgacttcaa cgccgccaac 2100

aacatcaagt acatcatcga gaacgagaac ctgcggaagc tgttctgcgg caagctgaag 2160

gtgagcggct acaacacccc catcctgcgg gccaccaaga agggccagtt caacatcctg 2220

gccgagctga agaagcagaa caagatcaag atcttcgaga tcgagaag 2268

<210> 62

<211> 2268

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 62

atgactacga aacaagtaaa gtctattgtg cttaaagtga agaatactaa cgagtgtccc 60

attaccaagg atgttataaa tgaatacaaa aaatattata acatctgcag cgaatggata 120

aaagataacc ttacttctat tactataggg gatatagcgt cctttctgaa ggaggcgacg 180

aacaaagaca ctatcccgac ctacatcaac atggggctct ccgaagaatg gaagtacaag 240

cctatctacc atcttttcac cgacagatat catgagaaat ccgcaaataa tttgttgtat 300

gcttacttca aagagaagaa cttggattgc tacaacggta atattcttaa tctctcagag 360

acttattaca ggaggaacgg gtactttaaa agcgtggtcg gaaattatcg cacaaaaata 420

cgcacattga attataaaat caagcgaaaa aacgtcgatg aaaactctac aaacgaggat 480

attgagctgc aagtgatgta tgaaatcgca aagagaaaac tgaacatcaa gaaggattgg 540

gagaattaca tatcctatat cgaaaacgtg gagaatatca acatcaagaa catagataga 600

tataatctgc tctataagca tttttgcgaa aacgagtcta caattaactg caagatggag 660

ctgctttccg tagagcaact taaggaattt ggtggatgcg ttatgaagca gcatatcaac 720

agtatgacta ttaatataca ggattttaag atcgagaata aggaaaactc cctgggcttt 780

attctcaatc tgcccctgaa caaaaaaaag tatcagatag aactctgggg caatagacag 840

attaagaaag gtaataagga caattataaa accctcgtag actttataaa tacatacggg 900

caaaacatca ttttcacgat taagaataac aaaatttatg ttgtgttctc ctatgagtgt 960

gaactgaagg agaaagagat taacttcgat aagatagttg ggattgatgt gaactttaaa 1020

cacgcccttt tcgttgcgtc cgagagggac aagaatccct tgcaggataa taatcaactg 1080

aagggttaca tcaatctcta tggatacttg ctggaacaca acgaattcac aagtctcctg 1140

acgaaggagg aactcgatat ttataaggaa atagccaaag gagttacctt ttgtccgctc 1200

gagtataatc ttctcttcac acggatcgaa aacaaaggag gaaagagcaa tgataaagaa 1260

caagtacttt ccaaacttct ttatagtctc caaattaagc tgaagaacga gaacaagatc 1320

caggagtata tatatgtgtc atgtgtgaat aagctgcgag cgaaatacgt atcttacttc 1380

attctcaaag aaaaatatta tgagaagcag aaagaatacg atattgaaat gggctttaca 1440

gacgactcaa ccgagtccaa agagtctatg gacaaaagac gattggagtt cccgtttcga 1500

aatacacaga tcgccaatgg tttcctcgag aagctgagta atgtgcagca agatataaat 1560

ggctgcctta agaatataat taactacgct tacaaggtgt ttgaacaaaa tgggttcggc 1620

gttatcgccc tcgaaaacct tgaaaattct aactttgaaa agacgcaagt ccttcctaca 1680

attaagtccc ttcttcgcta tcacaaactg gagaaccaaa atatcaataa cattaatgct 1740

tcagataaag ttaaggaata catagaaaag gagtactacg aacttaccac caacgaaaac 1800

aatgaaattg tagacgctaa gtacacaaag aagggcatta taaaagttaa aaaagcgaac 1860

ttctttaact tgatgatgaa atcacttcat tttgcgtcaa acaaagacga gtttatcttg 1920

ctcagcaata atggtaagac tcaaatcgcc ctcgtccctt ctgagtatac aagccagatg 1980

gattctattg agcactgtct ctacgtggat aagaacggaa agaaagtaga caagaaaaag 2040

gtcaggcaga aacaagagac acacatcaat gggctgaatg ccgactttaa tgccgcaaac 2100

aacataaagt atataatcga gaacgaaaac ctccgaaagc tgttttgcgg taaactgaaa 2160

gtgagcgggt acaatacacc tatcctgcgc gctaccaaaa aaggccaatt taatatactg 2220

gctgagctca agaagcaaaa taaaatcaaa atctttgaga tagagaag 2268

<210> 63

<211> 2268

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 63

atgaccacca agcaagtgaa atctatcgtg ctgaaggtga agaacaccaa cgaatgccct 60

atcaccaagg atgtgatcaa cgagtacaag aagtattata acatctgcag cgagtggatc 120

aaagataatt tgacaagcat caccatcggc gacatcgcct ccttcctgaa ggaagccacc 180

aacaaggata caatacccac ctacatcaac atgggcctga gcgaggaatg gaaatacaag 240

cccatctacc atctgtttac cgaccgctac cacgagaaaa gcgccaacaa cctgctctac 300

gcttatttca aggagaagaa cctggactgc tacaatggaa atatcctgaa cctgtctgag 360

acatactaca gaagaaacgg ctatttcaag agtgtggtcg gaaactacag gaccaaaatc 420

cggaccctga actacaagat caagcggaag aacgtggacg agaattctac caacgaggac 480

atcgagctgc aggtgatgta cgagatcgct aagcggaagc tgaatatcaa gaaagactgg 540

gagaactaca tcagctacat cgagaacgtg gaaaacatca acatcaagaa tatcgataga 600

tacaatctgc tgtacaagca cttctgcgag aacgagagca ccatcaactg caagatggaa 660

ctcctgagcg tggaacagct gaaagagttc ggcggctgtg tgatgaaaca acacatcaat 720

agcatgacca tcaacattca ggacttcaag atcgagaaca aggaaaatag cttgggcttc 780

atcctgaacc tgcctctgaa caagaagaag taccagatcg agctctgggg caacagacag 840

atcaagaaag gcaataagga taactacaaa accctggtcg atttcatcaa cacatacggg 900

cagaacataa tctttacaat caagaacaac aaaatctacg tggtgttcag ctacgaatgt 960

gaactgaagg aaaaagaaat caacttcgac aagattgtgg gcatcgacgt gaactttaag 1020

cacgccctgt tcgtggcctc tgaaagagat aagaatcctc tgcaagacaa caatcaactg 1080

aagggctaca tcaacctcta cggctacctg ctggagcaca acgagttcac atctctgctg 1140

accaaggaag aactggatat ctataaggag attgccaagg gtgttacatt ctgcccactg 1200

gaatacaacc tgctgttcac cagaatcgag aacaagggcg gaaagtccaa cgacaaggag 1260

caggtgctgt ctaagctgct gtacagcctg cagatcaagc tgaagaatga aaacaagatc 1320

caggagtaca tctacgtgag ctgcgtgaac aagctgcggg ccaaatacgt gtcctacttc 1380

atcctgaagg aaaaatacta cgagaagcag aaggaatacg acatcgagat gggatttaca 1440

gacgacagca ccgagagcaa ggaaagcatg gacaaacgga gactggaatt ccccttcaga 1500

aacacccaga tcgccaacgg cttcctggaa aagctgagca acgtgcagca ggacatcaac 1560

ggctgtctga aaaacatcat taactacgcc tacaaagtct tcgagcagaa cggctttggc 1620

gtgatagctc tggaaaacct ggaaaacagc aacttcgaga agacccaggt gctgcctacc 1680

atcaagagcc tgctgcggta ccacaagctc gagaaccaga atattaacaa cattaatgcc 1740

agcgacaagg tgaaggagta tattgagaag gaatactacg agctgacaac caacgagaac 1800

aacgaaatcg tggacgccaa gtacaccaag aagggcatca tcaaggtgaa gaaggccaat 1860

tttttcaacc tgatgatgaa gtctctgcac ttcgcctcta ataaagatga gttcatcctg 1920

ctgtccaaca atggcaaaac ccagatcgct ctggtgccta gcgagtatac tagccagatg 1980

gatagcatcg agcactgtct gtacgtggac aagaacggca agaaggtgga caagaagaaa 2040

gttagacaga aacaggagac ccacatcaac ggacttaacg ccgactttaa cgccgctaac 2100

aacataaagt acatcatcga gaatgagaac cttagaaagc tgttttgcgg caagctgaaa 2160

gtctccggct acaacacccc tatcctgaga gccacaaaga aaggacagtt caacatcctg 2220

gccgagctga agaaacagaa caagatcaag atcttcgaga tcgagaag 2268

<210> 64

<211> 2268

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 64

atgaccacta agcaagtgaa atccatcgtc ttgaaagtaa agaataccaa tgagtgccct 60

attacaaagg acgttatcaa tgagtataaa aaatactaca acatctgttc tgaatggatt 120

aaagacaacc tcacgagcat cactatagga gatatcgcat ccttcctgaa ggaggcaacc 180

aacaaggata ccatccctac atatataaac atggggcttt cagaggagtg gaaatacaag 240

cccatttatc accttttcac agatagatac cacgaaaaaa gtgcaaataa cttgctttac 300

gcttacttta aagagaaaaa cttggactgt tacaatggta acattctgaa cctgtccgag 360

acatactaca gacggaacgg ctacttcaaa tcagtcgtcg ggaattatag gaccaagatc 420

cggaccttga actacaaaat taaaagaaaa aatgttgatg agaatagcac aaacgaagac 480

attgagctgc aagtaatgta tgagattgca aagagaaagc tgaacatcaa aaaggattgg 540

gagaattaca tatcctacat tgagaatgtg gaaaatatca acattaagaa tatagaccgc 600

tacaacctgc tgtataaaca cttctgcgag aatgaaagca ctataaattg caagatggag 660

ctgctgtcag tggagcagtt gaaagaattt ggagggtgtg tgatgaagca acatatcaat 720

agtatgacaa ttaacataca ggacttcaag attgaaaaca aggagaattc cctgggattc 780

atcctcaatc tgccattgaa taaaaagaaa taccaaatag aattgtgggg aaaccgacag 840

atcaagaagg gaaataagga caactataag accctggtcg actttatcaa cacatatggc 900

cagaacatta ttttcactat aaaaaacaac aagatctacg tggtattcag ctacgagtgc 960

gagctgaaag agaaagaaat taattttgac aaaattgtag gaatcgatgt gaacttcaaa 1020

cacgccctgt tcgtcgccag cgaaagagac aagaatccgc tgcaggataa caatcagctg 1080

aagggctaca tcaatctcta tggttatctc ctggagcaca atgaattcac aagtctgctg 1140

accaaagagg aattggatat ctacaaggaa atcgccaagg gggtcacctt ttgtccactg 1200

gagtacaacc tgctgttcac gcgcatcgag aataaaggcg ggaaaagtaa tgataaagaa 1260

caagtactga gtaagctgtt gtatagcctg cagattaagc tcaagaatga aaacaagatc 1320

caggagtaca tttacgtgag ctgcgtcaat aagctgaggg ctaagtacgt gtcatatttt 1380

attctcaaag aaaagtatta tgagaaacag aaagagtacg acatcgagat gggatttaca 1440

gacgattcta ccgaaagcaa ggaatcaatg gacaagcgcc gcttggagtt tcctttcaga 1500

aacactcaga tcgccaatgg attcctggaa aagctgagta acgtgcaaca ggacatcaat 1560

ggttgtctca agaacattat taactacgca tacaaggtgt ttgaacagaa cgggttcggt 1620

gtgattgctc ttgaaaacct ggaaaatagc aacttcgaaa agacacaggt cctcccaaca 1680

attaaatcac tgctcagata tcacaagctc gaaaaccaga acatcaataa tatcaacgcc 1740

tccgataaag tgaaagagta cattgaaaag gagtactacg agctgacaac caacgaaaac 1800

aatgaaattg tggatgctaa gtacaccaaa aagggaatta tcaaggtgaa gaaagctaat 1860

tttttcaacc tgatgatgaa gagcctgcat ttcgcttcca ataaggatga atttattctt 1920

ctgtcaaaca atggaaagac ccagatcgcc ctcgtgccaa gtgagtatac atcacagatg 1980

gactctattg agcattgtct ctatgtggat aagaacggaa agaaggtcga taagaagaaa 2040

gtgcgacaga aacaagagac gcatatcaat ggcctcaatg ctgattttaa tgccgcaaac 2100

aatataaaat atatcattga aaacgagaat ttgcgcaagc tgttttgcgg gaagctgaaa 2160

gtttctgggt ataatacccc tatcttgcgc gccactaaga agggacaatt taatatcctg 2220

gctgagctga agaaacaaaa taaaatcaaa atattcgaga tcgagaag 2268

<210> 65

<211> 2268

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 65

atgaccacca agcaggtgaa atcaattgtg ctgaaggtga agaataccaa tgagtgcccc 60

atcacaaagg acgtgatcaa cgagtacaag aagtactata atatctgtag cgagtggatc 120

aaggacaatc tgacatccat cactatcggc gacatcgcct ccttcctgaa ggaggccacc 180

aacaaggaca caatccctac ttacatcaac atgggactgt ccgaggaatg gaagtacaag 240

ccaatctacc acctgtttac cgataggtac cacgagaaat ccgccaataa cctgctgtac 300

gcatatttca aggaaaagaa tctggactgc tataacggga atatcctgaa cctgtccgag 360

acgtactacc ggcgcaacgg atacttcaag agcgtggtgg gcaactaccg caccaagatc 420

agaaccctga attacaagat taagagaaaa aacgtggacg aaaatagcac caacgaggat 480

atcgagctgc aggtgatgta cgagatcgcc aaacggaaac tgaatatcaa gaaagattgg 540

gagaactata tcagttatat tgagaatgtg gagaatatca acatcaaaaa cattgacaga 600

tacaacctgc tctacaaaca cttttgtgaa aacgagtcta ccatcaattg taagatggag 660

ctgctgtccg tggaacagct gaaggagttt ggcggctgtg tgatgaagca gcatatcaac 720

tccatgacca tcaatatcca ggacttcaag atcgagaata aggagaatag cctggggttt 780

atcctgaacc tgcctctgaa caagaagaag tatcagatcg agctgtgggg aaaccgccag 840

atcaagaagg gcaacaaaga taactataag accctggtgg acttcatcaa cacatacggg 900

cagaatatca tcttcaccat taagaacaac aagatctatg tggtgtttag ttacgagtgc 960

gagctgaagg agaaggagat taatttcgac aagatcgtgg gaattgacgt gaatttcaag 1020

cacgctctgt tcgtggcttc agagagagac aagaatccac tgcaggacaa caaccagctg 1080

aagggttaca ttaaccttta cggctacctg ctggagcaca atgagtttac cagcctgctg 1140

actaaggagg agctggacat atacaaggaa atcgccaagg gcgtgacgtt ctgcccactg 1200

gagtataacc tgctctttac acggatcgag aataaaggcg ggaaaagcaa tgacaaggag 1260

caggtgctgt ctaaactgct gtattcactg cagatcaagc tgaaaaacga gaacaagatc 1320

caggaataca tttacgtgag ctgcgtgaac aaactgaggg ccaagtatgt gtcatatttc 1380

atcctgaagg agaagtacta tgagaagcag aaggagtacg acatcgagat gggatttact 1440

gacgactcca ccgagagcaa ggagagcatg gataagagaa gactggagtt cccattccgc 1500

aacacccaga tcgccaacgg ctttctggaa aaactgagta acgtgcagca ggacattaat 1560

ggatgtctga agaatatcat caactacgct tacaaggtgt ttgagcagaa cggatttggc 1620

gttatcgccc tggaaaacct ggaaaactcc aactttgaga agacacaggt gctgccaacc 1680

atcaagagcc tgctgaggta ccacaagctg gagaatcaga acattaacaa tatcaacgct 1740

agcgacaaag tgaaggagta cattgagaaa gaatactacg agctgaccac caatgaaaac 1800

aacgagatcg tggacgccaa gtataccaag aaaggcatca tcaaggtcaa aaaggctaat 1860

ttcttcaatc tgatgatgaa aagcctgcac tttgcctcca ataaagacga gtttattctc 1920

ctgagtaata acggcaagac ccagatcgcc ctggtgccat cagagtatac cagccagatg 1980

gattcaattg agcactgtct gtacgtggac aagaatggca agaaagtgga caagaagaaa 2040

gttcgacaga agcaggaaac ccacatcaat ggactcaatg cagatttcaa tgccgccaac 2100

aatatcaagt acattatcga gaacgagaac ctccggaagc tgttttgcgg caagctgaag 2160

gtgtccgggt acaatacccc catcctgcgc gccaccaaga aggggcagtt caacatcctg 2220

gccgaactga aaaagcagaa caagatcaag atctttgaga tcgagaag 2268

<210> 66

<211> 2268

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 66

atgaccacaa agcaggtgaa gagcatcgtg ctgaaggtga agaacaccaa tgagtgccca 60

atcacaaagg acgtgatcaa cgagtacaag aagtactata atatctgttc cgagtggatc 120

aaggacaacc tgacctccat cacaatcggc gatatcgcct ctttcctgaa ggaggccacc 180

aataaggata ccatccccac atatatcaac atgggcctgt ccgaggagtg gaagtacaag 240

cctatctatc acctgttcac agaccgttac cacgagaagt ctgccaacaa tctgctgtac 300

gcctacttca aggagaagaa cctggactgc tataacggca atatcctgaa tctgtccgag 360

acctactatc ggagaaacgg ctacttcaag tctgtggtgg gcaattatcg gaccaagatc 420

agaacactga actacaagat caagaggaag aatgtggacg agaactctac aaatgaggat 480

atcgagctgc aggtcatgta tgagatcgcc aagcgcaagc tgaacatcaa gaaggactgg 540

gagaattaca tcagctatat cgagaacgtg gagaacatca atatcaagaa catcgatagg 600

tacaatctgc tgtataagca cttctgcgag aacgagagca ccatcaattg taagatggag 660

ctgctgtccg tggagcagct gaaggagttt ggcggctgcg tgatgaagca gcacatcaac 720

tctatgacaa tcaatatcca ggatttcaag atcgagaaca aggagaatag cctgggcttt 780

atcctgaacc tgcccctgaa caagaagaag taccagatcg agctgtgggg caaccggcag 840

atcaagaagg gcaacaagga caattacaag accctggtgg atttcatcaa cacatatggc 900

cagaacatca tctttaccat caagaacaat aagatctacg tggtgttctc ctatgagtgt 960

gagctgaagg agaaggagat caactttgac aagatcgtgg gcatcgatgt gaatttcaag 1020

cacgccctgt ttgtggcctc tgagagagac aagaacccac tgcaggataa caatcagctg 1080

aagggctaca tcaacctgta cggctatctg ctggagcaca atgagttcac cagcctgctg 1140

acaaaggagg agctggacat ctacaaggag atcgccaagg gcgtgacctt ctgccccctg 1200

gagtataacc tgctgtttac aaggatcgag aacaagggcg gcaagtccaa tgataaggag 1260

caggtgctga gcaagctgct gtactccctg cagatcaagc tgaagaacga gaataagatc 1320

caggagtaca tctacgtgag ctgcgtgaat aagctgcgcg ccaagtacgt gagctatttc 1380

atcctgaagg agaagtacta tgagaagcag aaggagtacg acatcgagat gggctttacc 1440

gacgatagca cagagtccaa ggagtctatg gataagaggc gcctggagtt cccttttcgg 1500

aacacccaga tcgccaatgg cttcctggag aagctgagca acgtgcagca ggacatcaat 1560

ggctgtctga agaacatcat caattacgcc tataaggtgt tcgagcagaa cggctttggc 1620

gtgatcgccc tggagaatct ggagaacagc aattttgaga agacccaggt gctgccaaca 1680

atcaagtccc tgctgcgtta ccacaagctg gagaaccaga atatcaacaa tatcaacgcc 1740

tctgacaagg tgaaggagta tatcgagaag gagtactatg agctgaccac aaatgagaac 1800

aatgagatcg tggatgccaa gtacaccaag aagggcatca tcaaggtgaa gaaggccaac 1860

ttctttaatc tgatgatgaa gtctctgcac ttcgccagca acaaggacga gtttatcctg 1920

ctgtccaaca atggcaagac ccagatcgcc ctggtgccca gcgagtacac atcccagatg 1980

gattctatcg agcactgcct gtatgtggac aagaacggca agaaggtgga taagaagaag 2040

gtgcggcaga agcaggagac ccacatcaac ggcctgaatg ccgacttcaa tgccgccaac 2100

aatatcaagt acatcatcga gaacgagaat ctgagaaagc tgttttgtgg caagctgaag 2160

gtgtccggct ataacacccc tatcctgcgt gccacaaaga agggccagtt caacatcctg 2220

gccgagctga agaagcagaa taagatcaag atctttgaga tcgagaag 2268

Claims

1.一种变体多肽，其包含与SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个中所示的序列具有至少95％同一性的序列。

2.如权利要求1所述的变体多肽，其中该变体多肽是SEQ ID NO:3的亲本多肽的变体。

3.如权利要求1或2所述的变体多肽，其中该变体多肽包含表2的取代。

4.如权利要求1至3中任一项所述的变体多肽，其中该变体多肽包含以下取代中的一个或多个：E38R、T60R、D89R、S223R、E319R、P353G、L354G、Q355G、D356G、N357G、N358G、Q359G、L360G、K368G、Q421R、T480K、D482K、N501K、L523R、L523K、Q556R、Q556K、V557R、E566K、E566R、E571R、E571K、N579K、E586G、E589K、N620R、Q683K、S722K、和D730R。

5.一种变体多肽，其包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列并且相对于SEQ ID NO:3包含在以下位置中的一个或多个处的取代：E38、T60、D89、S223、E319、P353、L354、Q355、D356、N357、N358、Q359、L360、K368、Q421、T480、D482、N501、L523、Q556、V557、E566、E571、N579、E586、E589、N620、Q683、S722、和D730。

6.一种变体多肽，其包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列并且包含以下取代中的一个或多个：E38R、T60R、D89R、S223R、E319R、P353G、L354G、Q355G、D356G、N357G、N358G、Q359G、L360G、K368G、Q421R、T480K、D482K、N501K、L523R、L523K、Q556R、Q556K、V557R、E566K、E566R、E571R、E571K、N579K、E586G、E589K、N620R、Q683K、S722K、和D730R。

7.如权利要求1至6中任一项所述的变体多肽，其包含SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个中所示的序列。

8.如权利要求1至7中任一项所述的变体多肽，其包含SEQ ID NO:39中所示的序列。

9.如权利要求1至7中任一项所述的变体多肽，其包含SEQ ID NO:51中所示的序列。

10.如权利要求1至9中任一项所述的变体多肽，其中相对于亲本多肽，该变体多肽表现出增加的与RNA指导物的二元复合物形成。

11.如权利要求1至10中任一项所述的变体多肽，其中相对于亲本二元复合物，包含该变体多肽的二元复合物表现出增加的稳定性。

12.如权利要求1至11中任一项所述的变体多肽，其中相对于亲本多肽，该变体多肽表现出增加的核酸酶活性。

13.一种组合物，其包含如权利要求1至12中任一项所述的变体多肽，其中该组合物进一步包含RNA指导物或编码该RNA指导物的核酸，其中该RNA指导物包含同向重复序列和间隔子序列。

14.如权利要求13所述的组合物，其中该同向重复序列与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有至少90％同一性或者包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少90％同一性的序列。

15.如权利要求13所述的组合物，其中该同向重复序列与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有至少95％同一性或者包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的序列。

16.如权利要求13所述的组合物，其中该同向重复序列是SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或者包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的序列。

17.如权利要求13至16中任一项所述的组合物，其中该间隔子序列的长度为约15个核苷酸至约35个核苷酸。

18.如权利要求13至17中任一项所述的组合物，其中该间隔子序列与靶核酸的靶链序列结合，并且其中该靶核酸序列的非靶链序列与原型间隔子相邻基序(PAM)序列相邻。

19.如权利要求18所述的组合物，其中该PAM序列是5’-NNR-3’、5’-TNR-3’、5’-NTTN-3’、5’-NTTR-3’、或5’-TTTN-3’，其中N是任何核苷酸并且R是A或G。

20.如权利要求19所述的组合物，其中该PAM序列是5’-TTG-3’、5’-TTTG-3’、5’-TTA-3’、5’-TTTA-3’、或5’-ATTG-3’。

21.如任一前述权利要求所述的变体多肽或组合物，其中该变体多肽进一步包含核定位信号(NLS)。

22.如任一前述权利要求所述的变体多肽或组合物，其中该变体多肽进一步包含肽标签、荧光蛋白、碱基编辑结构域、DNA甲基化结构域、组蛋白残基修饰结构域、定位因子、转录修饰因子、光门控因子、化学诱导型因子或染色质可视化因子。

23.一种包含核酸的组合物，该核酸编码如任一前述权利要求所述的变体多肽和/或RNA指导物。

24.如权利要求23所述的组合物，其中该核酸经密码子优化以用于在细胞中表达。

25.如权利要求23或24所述的组合物，其中该核酸可操作地连接至启动子。

26.如权利要求23至25中任一项所述的组合物，其中该核酸位于载体中。

27.如权利要求26所述的组合物，其中该载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体、腺相关载体或单纯疱疹载体。

28.如任一前述权利要求所述的变体多肽或组合物，其中该变体多肽存在于包含纳米颗粒(例如，脂质纳米颗粒)、脂质体、外泌体、微泡、或基因枪的递送系统中。

29.一种细胞，其包含如任一前述权利要求所述的变体多肽或组合物。

30.如权利要求29所述的细胞，其中该细胞是真核细胞。

31.如权利要求29或30所述的细胞，其中该细胞是哺乳动物细胞或植物细胞。

32.如权利要求29至31中任一项所述的细胞，其中该细胞是人细胞。

33.一种组合物，其包含变体多肽或含有该变体多肽的复合物，其中该变体多肽包含与SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个中所示的序列具有至少95％同一性的序列，并且其中相对于亲本多肽或包含该亲本多肽的复合物，该变体多肽或该复合物表现出增强的酶活性、增强的结合活性、增强的结合特异性、和/或增强的稳定性。

34.如权利要求33所述的组合物，其中该变体多肽包含表2的取代。

35.如权利要求33或34所述的组合物，其中该变体多肽包含以下取代中的一个或多个：E38R、T60R、D89R、S223R、E319R、P353G、L354G、Q355G、D356G、N357G、N358G、Q359G、L360G、K368G、Q421R、T480K、D482K、N501K、L523R、L523K、Q556R、Q556K、V557R、E566K、E566R、E571R、E571K、N579K、E586G、E589K、N620R、Q683K、S722K、和D730R。

36.如权利要求33至35中任一项所述的组合物，其中该变体多肽包含SEQ ID NO:14-41或49-58中的任一个中所示的序列。

37.如权利要求33至36中任一项所述的组合物，其中该变体多肽包含SEQ ID NO:39中所示的序列。

38.如权利要求33至36中任一项所述的组合物，其中该变体多肽包含SEQ ID NO:51中所示的序列。

39.如权利要求33至38中任一项所述的组合物，其中该增强的酶活性是增强的核酸酶活性。

40.如权利要求33至39中任一项所述的组合物，其中相对于该亲本多肽，该变体多肽表现出增强的与RNA指导物的结合活性。

41.如权利要求33至40中任一项所述的组合物，其中相对于该亲本多肽，该变体多肽表现出增强的与RNA指导物的结合特异性。

42.如权利要求33至41中任一项所述的组合物，其中该含有该变体多肽的复合物是进一步包含RNA指导物的变体二元复合物，并且相对于亲本二元复合物，该变体二元复合物表现出增强的与靶核酸的结合活性(例如，中靶结合活性)。

43.如权利要求33至42中任一项所述的组合物，其中该含有该变体多肽的复合物是进一步包含RNA指导物的变体二元复合物，并且相对于亲本二元复合物，该变体二元复合物表现出增强的与靶核酸的结合特异性(例如，中靶结合特异性)。

44.如权利要求33至43中任一项所述的组合物，其中该含有该变体多肽的复合物是进一步包含RNA指导物的变体二元复合物，并且相对于亲本二元复合物，该变体二元复合物表现出增强的稳定性。

45.如权利要求33至44中任一项所述的组合物，其中该变体二元复合物和靶核酸形成变体三元复合物，并且相对于亲本三元复合物，该变体三元复合物表现出增加的稳定性。

46.如权利要求33至45中任一项所述的组合物，其中相对于该亲本多肽，该变体多肽进一步表现出增强的二元复合物形成、增强的蛋白质-RNA相互作用、和/或降低的与RNA指导物的解离。

47.如权利要求33至46中任一项所述的组合物，其中相对于该亲本二元复合物，该变体二元复合物进一步表现出降低的与靶核酸的解离、和/或降低的与非靶核酸的脱靶结合。

48.如权利要求33至47中任一项所述的组合物，其中该增强的酶活性、增强的结合活性、增强的结合特异性、和/或增强的稳定性发生在例如20℃至65℃的温度范围内。

49.如权利要求33至48中任一项所述的组合物，其中该增强的酶活性、增强的结合活性、增强的结合特异性、和/或增强的稳定性发生在一定孵育时间范围内。

50.如权利要求33至49中任一项所述的组合物，其中该增强的酶活性、增强的结合活性、增强的结合特异性、和/或增强的稳定性发生在具有约7.3至约8.6范围内的pH的缓冲液中。

51.如权利要求33至50中任一项所述的组合物，其中当该变体多肽、变体二元复合物、或变体三元复合物的T_m值比该亲本多肽、亲本二元复合物、或亲本三元复合物的T_m值大至少8℃时，该增强的酶活性、增强的结合活性、增强的结合特异性、和/或增强的稳定性发生。

52.如权利要求33至51中任一项所述的组合物，其中该变体多肽包含RuvC结构域或拆分型RuvC结构域。

53.如权利要求33至52中任一项所述的组合物，其中该亲本多肽包含SEQ ID NO:3的序列。

54.如权利要求33至53中任一项所述的组合物，其中该RNA指导物包含同向重复序列和间隔子序列。

55.如权利要求54所述的组合物，其中该同向重复序列与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有至少90％同一性或者包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少90％同一性的序列。

56.如权利要求54所述的组合物，其中该同向重复序列与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有至少95％同一性或者包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的序列。

57.如权利要求54所述的组合物，其中该同向重复序列是SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或者包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的序列。

58.如权利要求54至57中任一项所述的组合物，其中该间隔子序列的长度为15至35个核苷酸。

59.如权利要求54至58中任一项所述的组合物，其中该间隔子序列包含与靶核酸的靶链序列的互补性。

60.如权利要求59所述的组合物，其中该靶核酸包含与原型间隔子相邻基序(PAM)序列相邻的非靶链序列。

61.如权利要求60所述的组合物，其中该PAM序列是5’-NNR-3’、5’-TNR-3’、5’-NTTN-3’、5’-NTTR-3’、或5’-TTTN-3’，其中N是任何核苷酸并且R是A或G。

62.如权利要求61所述的组合物，其中该PAM序列是5’-TTG-3’、5’-TTTG-3’、5’-TTA-3’、5’-TTTA-3’、或5’-ATTG-3’。

63.如权利要求33至62中任一项所述的组合物，其中该变体多肽进一步包含肽标签、荧光蛋白、碱基编辑结构域、DNA甲基化结构域、组蛋白残基修饰结构域、定位因子、转录修饰因子、光门控因子、化学诱导型因子或染色质可视化因子。

64.一种包含核酸的组合物，该核酸编码如权利要求1-12或33至63中任一项所述的变体多肽，其中任选地，该核酸经密码子优化以用于在细胞中表达。

65.如权利要求64所述的组合物，其中该细胞是真核细胞。

66.如权利要求64或65所述的组合物，其中该细胞是哺乳动物细胞或植物细胞。

67.如权利要求64至66中任一项所述的组合物，其中该细胞是人细胞。

68.如权利要求64至67中任一项所述的组合物，其中该编码该变体多肽的核酸可操作地连接至启动子。

69.如权利要求64至68中任一项所述的组合物，其中该编码该变体多肽的核酸位于载体中。

70.如权利要求69所述的组合物，其中该载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体、腺相关载体或单纯疱疹载体。

71.如权利要求33至70中任一项所述的组合物，其中该组合物存在于包含纳米颗粒(例如，脂质纳米颗粒)、脂质体、外泌体、微泡、或基因枪的递送组合物中。

72.一种用于编辑细胞中的基因的方法，该方法包括使该细胞与如权利要求1至28或33至71中任一项所述的变体多肽或组合物接触。

73.一种核酸分子，其编码如权利要求1至12、21或22中任一项所述的变体多肽。

74.如权利要求73所述的核酸分子，其中该核酸分子的序列与选自由SEQ ID NO:59-66组成的组的序列具有95％同一性。

75.一种编码SEQ ID NO:39的变体多肽的核酸分子，其中该核酸分子的序列与选自由SEQ ID NO:59-66组成的组的序列具有95％同一性。

76.如权利要求75所述的核酸分子，其中该核酸分子的序列包含选自由SEQ ID NO:59-66组成的组的序列。