CN117018205A - 基因工程菌sgn1与免疫检查点抑制剂联用在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

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CN117018205A CN202311044562.1A CN202311044562A CN117018205A CN 117018205 A CN117018205 A CN 117018205A CN 202311044562 A CN202311044562 A CN 202311044562A CN 117018205 A CN117018205 A CN 117018205A
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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及基因工程菌SGN1与免疫检查点抑制剂联用在肿瘤治疗中的应用。本发明发现，将携带甲硫氨酸酶(L‑methioninase)表达基因的细菌和免疫检查点抑制剂联用后，能够激活抗肿瘤免疫反应，并协同提升对肿瘤细胞的抑制效果，针对恶性肿瘤，尤其是缺少有效控制治疗手段的恶性肿瘤，比如胆管癌、黑色素瘤，都具有良好的应用效果。

Description

基因工程菌SGN1与免疫检查点抑制剂联用在肿瘤治疗中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及基因工程菌SGN1与免疫检查点抑制剂联用在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
研究证实甲硫氨酸(methionine,Met)依赖性是绝大多数肿瘤细胞的共同特征，如乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、黑色素瘤、神经胶质瘤等，而正常细胞不存在Met依赖性。甲硫氨酸酶(L-methioninase)能特异性地将Met分解为α-酮丁酸、甲基硫醇和氨，从而降低体内甲硫氨酸水平。当前以甲硫氨酸为治疗靶点的治疗方法主要包括饮食限制和注射甲硫氨酸酶，研究表明上述两种方法均对肿瘤生长有一定的抑制作用，但两种方法都有不能克服的缺点。具体地，限制甲硫氨酸的饮食能延缓肿瘤细胞的增殖，但是长期限制甲硫氨酸的摄入会引起机体营养不良、代谢障碍，还可因DNA长期处于低甲基化状态加剧癌变。注射甲硫氨酸酶可以抑制肿瘤的生长，也可以明显减少血浆中甲硫氨酸含量，但由于哺乳动物本身不表达甲硫氨酸酶，外源性注射的甲硫氨酸酶会引起机体的免疫反应。
目前以细菌作为基因治疗载体的研究已经取一定的进展，主流的载体包括沙门氏菌、大肠杆菌、李斯特菌等。而高表达甲硫氨酸酶的细菌理论上可以特异性消耗肿瘤组织内的甲硫氨酸，因而被广泛用于肿瘤治疗的研究，包括黑色素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌等。
T细胞是免疫反应的重要组成部分，其激活需要TCR信号通路和CD28信号通路的协同，而免疫检查点分子PD-1、CTLA-4等则发挥抑制T细胞激活的作用，正常生理调节下发挥调节T细胞的作用，防止过度激活导致机体损伤。而肿瘤病理条件下免疫检查点分子或其配体(PD-L1等)的表达增加，促使肿瘤细胞逃避正常免疫监控，最终导致肿瘤的生长。众多研究证明，靶向PD-1/PD-L1、CTLA-4等分子的抗体能够抑制肿瘤的生长。目前，国内外已有十多个免疫检查点抑制剂获得上市批准用于治疗恶性肿瘤，其中包括PD-L1单抗阿替利珠单抗、PD-1单抗帕博丽珠单抗、CTLA-4单抗伊匹木单抗等，同时多个临床试验正在开展研究免疫检查点抑制剂单用或联合其他药物治疗在治疗肿瘤中的作用和效应。
胆管癌(Cholangiocarcinoma，CCA)是仅次于肝细胞癌(HCC)的第二大原发性肝脏恶性肿瘤，约占所有原发性肝脏肿瘤的15％。胆管癌早期通常无症状，大多数患者确诊时已处于晚期或发生转移，因而仅有约25％患者适宜进行手术治疗。并且，由于胆管癌的高度侵袭性以及异质性，系统药物治疗和介入治疗并不能有效控制此类患者的疾病发展。对于适合进行手术切除的患者，施行手术后辅助化疗的中位生存期达到51.1月，中位无复发生存期达24.4月，但接受手术切除肿瘤的患者复发率则高达60％，复发患者分期一般为晚期且不宜进行手术治疗。而对于不可进行手术的患者，系统治疗方案包括吉西他滨联合顺铂全身化疗、放射栓塞术、立体定向放疗和分子靶向治疗等，而分子靶向治疗药物包括FGFR抑制剂、IDH抑制剂等，但中位生存期仅约11.7月。当前也有将免疫疗法尝试用于治疗胆管癌的研究，如默克的PD-L1/TGFβ双特异性融合蛋白M7824以及阿斯利康的抗PD-L1单抗——度伐利尤单抗(Imfinzi)等开展了针对胆管癌的临床实验，但是结果显示大部分患者并没有持久的临床获益。
黑色素瘤是起源于黑色素细胞的一类皮肤恶性肿瘤，占皮肤癌病例的2％，其恶性程度高、侵袭性强，晚期肿瘤易转移，且预后不良，是死亡率最高的皮肤癌类型。目前黑色素瘤的治疗手段主要包括：外科手术治疗、辅助治疗、靶向药物治疗和免疫检查点抑制剂治疗等，而手术切除肿瘤和肿瘤周围的组织是黑色素瘤的主要治疗方法。早期黑色素瘤可以通过切除原发病灶治愈疾病，而当晚期(IV期)出现远端转移时，患者主要通过靶向治疗和免疫治疗控制疾病发展。靶向治疗药物BRAF抑制剂Vemurafenib和Dabrafenib对近50％的BRAF突变黑色素瘤患者有效，并已被批准用于治疗转移性和不可切除的BRAF突变黑色素瘤。免疫检查点抑制剂也是目前黑色素瘤治疗的一线方案，如伊匹木单抗于2011年被批准用于治疗已经扩散或无法通过手术治疗的黑色素瘤，可显著提高患者生存期。但是，无论是靶向药物还是免疫检查点抑制剂，大多数患者在接受药物治疗后，会在相对较短的时间内出现继发性耐药，导致预后不良。
发明内容
本发明的第一目的在于提供基因工程菌和免疫检查点抑制剂的联合使用在以下任一方面的应用：1)预防、治疗或缓解肿瘤；2)制备用于预防、治疗或缓解肿瘤的药物；其中，所述基因工程菌为携带甲硫氨酸酶(L-methioninase)表达基因的细菌。
本发明的第二目的在于提供一种联合药物，其含有基因工程菌和免疫检查点抑制剂，所述基因工程菌为携带甲硫氨酸酶表达基因的细菌。
本发明发现，将携带甲硫氨酸酶(L-methioninase)表达基因的细菌和免疫检查点抑制剂联用后，能够激活抗肿瘤免疫反应，并协同提升对肿瘤细胞的抑制效果，针对恶性肿瘤，尤其是缺少有效控制治疗手段的恶性肿瘤，比如胆管癌、黑色素瘤，都具有良好的应用效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中体外给予基因工程菌SGN1处理胆管癌细胞后细胞数量变化的结果图。
图2是本发明实施例中体外给予基因工程菌SGN1与抗PD-L1抗体处理胆管癌细胞后细胞数量变化的结果图。
图3是本发明实施例中体外给予基因工程菌SGN1与抗PD-L1抗体处理胆管癌细胞后细胞凋亡比例的结果图。
图4是本发明实施例中体外给予基因工程菌SGN1处理胆管癌细胞后PD-L1表达量的结果图。
图5是本发明实施例中注射工程菌SGN1后黑色素瘤体积变化曲线结果图。
图6是本发明实施例中注射工程菌SGN1对荷瘤小鼠体重的影响结果图。
图7是本发明实施例中当PBS对照组肿瘤体积长到3500mm3左右时，荷瘤裸鼠肿瘤剥离后获得的肿瘤的展示图。
图8是本发明实施例中当PBS对照组肿瘤体积长到3500mm3左右时，不同处理组的荷瘤裸鼠肿瘤剥离后获得的肿瘤的重量统计分析图。
图9是本发明实施例中肿瘤组织HE染色结果图。
图10是本发明实施例中注射工程菌SGN1后肿瘤浸润CD8+T细胞的比例的流式细胞检测结果图。
图11是本发明实施例中注射工程菌SGN1后肿瘤浸润CD8+T细胞的比例的数据统计结果图。
图12是本发明实施例中注射工程菌SGN1后肿瘤组织PD-L1表达量的结果图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
本发明中涉及浓度数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以在相应的精度范围内波动。比如2％，可以允许±0.1％范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值，还允许其含义包括更大波动。比如100mM，可以允许±1％、±2％、±5％等范围内的波动。涉及分子量，允许其含义包括±10％的波动。
本发明中，涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上指大于等于2。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明首先提供基因工程菌和免疫检查点抑制剂的联合使用在以下任一方面的应用：1)预防、治疗或缓解肿瘤；2)制备用于预防、治疗或缓解肿瘤的药物；其中，所述基因工程菌为携带甲硫氨酸酶(L-methioninase)表达基因的细菌。
本发明发现，通过上述两种药物联合使用，取得了激活抗肿瘤免疫反应和抑制肿瘤生长的效果，协同增强了SGN1和抗PD-L1抗体治疗恶性肿瘤的效应。其中，基因工程菌表达的甲硫氨酸酶能够消耗甲硫氨酸及其它营养物质，使得肿瘤细胞缺乏营养而坏死，并同时激活肿瘤免疫微环境，增加免疫细胞进入，促进肿瘤细胞表达PD-L1蛋白；免疫检查点抑制剂能解除免疫检查点对免疫细胞抗肿瘤的抑制作用，进而发挥杀伤肿瘤作用。
本发明中，上述第1)方面所提到的应用相当于“一种联合使用基因工程菌和免疫检查点抑制剂来预防、治疗或缓解肿瘤的方法”，而在应用方案中的进一步说明也相当于对该方法的进一步说明。
本发明中所提到的基因工程菌和免疫检查点抑制剂的联合使用均代表使用有效量的基因工程菌和免疫检查点抑制剂。
在一些实施方式中，所述细菌为msbB基因和purI基因缺失的减毒鼠伤寒沙门菌株。其中，msbB基因为脂质酰化为内毒素所必需，其缺失使类脂质A末端不能酰化，降低了载体本身毒性；purI基因参与嘌呤代谢，其缺失使细菌的繁殖需要外源性腺嘌呤。同时缺失上述两个基因的减毒鼠伤寒沙门菌株在本发明中的应用效果更佳。
在一些实施方式中，所述基因工程菌为SGN1，其为携带甲硫氨酸酶表达基因的减毒伤寒沙门氏菌VNP20009。
VNP20009已在多个专利申请中公开过，也可通过市售途径获得，其为msbB、purI基因缺失的减毒鼠伤寒沙门菌株，遗传稳定，对抗生素敏感，还降低了自身诱导机体产生的肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，TNF)，因而有助于减少炎性反应，临床安全性更佳。
而基因工程菌SGN1可以在肿瘤组织持续表达L-methioninase，大量消耗甲硫氨酸及其它营养物质，加速肿瘤细胞坏死，且对抗肿瘤免疫反应的激活效果更优。在本发明中将其与免疫检查点抑制剂联用后，上述各方面效果得到了进一步明显提升，且基因工程菌SGN1能使对免疫检查点抑制剂不敏感的肿瘤细胞表现出敏感性，有助于延迟或减少肿瘤细胞对免疫检查点抑制剂的耐药性，进而呈现出了更好的抑癌效果。
在一些实施方式中，基因工程菌SGN1为携带甲硫氨酸酶表达质粒的减毒伤寒沙门氏菌VNP20009。
在一些具体的实施方式中，所述甲硫氨酸酶表达质粒为含有甲硫氨酸酶表达基因的pSVSPORT质粒、pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质粒或pET23a质粒。
本发明对基因工程菌SGN1的构建方法不作特别限定，本领域人员可结合本发明的公开内容与本领域常识确认基因工程菌SGN1的具体构建方法。比如，作为示例，可以将甲硫氨酸酶表达基因亚克隆至质粒中，得到甲硫氨酸酶表达质粒，而后将甲硫氨酸酶表达质粒转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，从而得到基因工程菌SGN1。
在一些具体的实施方式中，所述基因工程菌的给药方式为瘤内注射、静脉注射或介入灌注。
在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂的靶点包括PD-1、PD-L1、CTLA-4中的一种或多种。比如，其可以为针对其中一个靶点的抗体，如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA-4抗体，也可以为针对两个以上靶点的双抗或多抗，如抗PD-1/PD-L1双特异性抗体。
在一些优选的实施方式中，所述免疫检查点抑制剂的靶点包括PD-L1。当本发明的基因工程菌与针对PD-L1的免疫检查点抑制剂联用时，对肿瘤的抑制和杀伤效果更优。
在一些优选的实施方式中，所述免疫检查点抑制剂为抗PD-L1抗体。本发明中所提到的“抗PD-L1抗体”包括抗PD-L1单抗和抗PD-L1多抗。
在更优选的实施方式中，所述免疫检查点抑制剂为抗PD-L1单抗。
在实施本发明方案时，采用抗PD-L1抗体(尤其是抗PD-L1单抗)均可以获得较优的实施效果。
在一些具体的实施方式中，所述免疫检查点抑制剂为阿替利珠单抗(Atezolizumab)、度伐利尤单抗(Durvalumab)或阿维单抗(Avelumab)。
本发明所提到的肿瘤包括良性肿瘤与恶性肿瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤为具有甲硫氨酸依赖性的肿瘤。其中，所述甲硫氨酸依赖性的肿瘤包括但不限于乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、胆管癌、黑色素瘤、神经胶质瘤中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述肿瘤包括但不限于胆管癌和黑色素瘤。
在一些实施方式中，所述联合使用的目的包括以下至少一种：a)激活抗肿瘤免疫反应；b)抑制肿瘤细胞的生长。
在一些实施方式中，所述联合使用的目的包括以下至少一种：i)增强免疫检查点抑制剂的作用效果；ii)增强肿瘤细胞对免疫检查点抑制剂的敏感性；iii)延迟或减少肿瘤细胞对免疫检查点抑制剂的耐药性。
在一些实施方式中，所述联合使用的给药时机为同时给药或先后给药。
在一些优选的实施方式中，使基因工程菌先于免疫检查点抑制剂发挥药效。在具体实施时，可以通过先使用基因工程菌、后使用免疫检查点抑制剂的方式实现，可以同时给药，但控制基因工程菌先于免疫检查点抑制剂到达病灶位置，或者控制基因工程菌的释放早于免疫检查点抑制剂。通过上述方式可以先提高肿瘤PD-L1的表达，并使得对免疫检查点抑制剂(尤其包括抗PD-L1抗体)不敏感的肿瘤患者可以选择免疫检查点抑制剂进行治疗，为对抗PD-L1抗体不敏感甚至耐药的肿瘤患者提供使用免疫抑制剂的治疗机会。
在一些实施方式中，所述基因工程菌和免疫检查点抑制剂的联用剂量低于其单用剂量。这样可以在保证治疗效应的同时，降低药物毒副作用，兼顾安全性与抗肿瘤效应，并且能降低治疗成本。
在一些具体实施方式中，本发明的组合所使用的所述基因工程菌和免疫检查点抑制剂的给药量根据年龄、体重、症状、治疗效果、给药方法、处理时间等而不同，可以带来最优的期望效果的方式进行调整。
在一些实施方式中，所述联合使用的施用对象包括：a)对免疫检查点抑制剂不敏感或耐药的患者；b)对免疫检查点抑制剂敏感的患者。
在具体实施时，本领域人员还可以基于以下一个或多个目的而选择联用其他药物和/或其他疗法：①发挥协同治疗作用以提高疗效；②延迟或减少耐药性的发生；③减少毒副反应。比如，与选自外科手术治疗、化疗、靶向药物治疗等现有药物及现有疗法中的一种或多种方式联用。
本发明还提供了一种联合药物，其含有基因工程菌和免疫检查点抑制剂，所述基因工程菌为携带甲硫氨酸酶表达基因的细菌。
在一些实施方式中，所述细菌为msbB基因和purI基因缺失的减毒鼠伤寒沙门菌株。
在一些实施方式中，所述基因工程菌为SGN1，其为携带甲硫氨酸酶表达基因的减毒伤寒沙门氏菌VNP20009。
在一些实施方式中，基因工程菌SGN1为携带甲硫氨酸酶表达质粒的减毒伤寒沙门氏菌VNP20009。
在一些具体的实施方式中，所述甲硫氨酸酶表达质粒为含有甲硫氨酸酶表达基因的pSVSPORT质粒、pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质粒或pET23a质粒。
在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂的靶点包括PD-1、PD-L1、CTLA-4中的一种或多种。
在一些优选的实施方式中，所述免疫检查点抑制剂的靶点包括PD-L1。
在一些优选的实施方式中，所述免疫检查点抑制剂为抗PD-L1抗体。
在更优选的实施方式中，所述免疫检查点抑制剂为抗PD-L1单抗。
在一些具体的实施方式中，所述免疫检查点抑制剂为阿替利珠单抗(Atezolizumab)、度伐利尤单抗(Durvalumab)或阿维单抗(Avelumab)。
在一些实施方式中，所述联合药物为瘤内注射制剂、静脉注射制剂或介入灌注制剂。
在一些实施方式中，所述基因工程菌和免疫检查点抑制剂的联用剂量低于其单用剂量。
在一些实施方式中，所述基因工程菌的释放早于免疫检查点抑制剂。
在具体实施时，本领域人员还可以基于以下一个或多个目的而在本发明的联合药物中添加其他药物：①发挥协同治疗作用以提高疗效；②延迟或减少耐药性的发生；③减少毒副反应。比如，与选自化疗药、靶向药物等现有药物中的一种或多种药物联用。
在一些具体的实施方式中，所述联合药物中还含有药学上可接受的赋形剂和/或载体。本领域人员可结合用药需求及常识选用具体的赋形剂和/或载体，并对其用量进行调整，在本发明中对其不作特别限定。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。
为了便于比对效果，以下实施例中所使用的抗PD-L1抗体均为阿替利珠单抗(Atezolizumab)。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1基因工程菌SGN1的构建
(1)关于减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009
减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009已在专利名称为“一种治疗乳腺癌的基因工程菌及其构建方法和应用”(专利号ZL201310062253.7)、专利名称为“减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用”(专利号ZL201310688936.3)、专利名称为“减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗前列腺癌的药物上的应用”(专利号ZL201410183149.8)、专利名称为“减毒鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌在制备治疗肝癌药物上的应用”(专利号201510546063.1)、申请名称为“基因工程菌VNP20009-M在制备治疗恶性肉瘤药物中的应用”(申请号CN201710216811.9)等中公开。同时，其也可通过市售途径获得。
(2)基因工程菌的构建
将L-methioninase编码基因通过Kpn I和Hind III酶切位点亚克隆至pSVSPORT质粒中，得到L-methioninase表达质粒；将L-methioninase表达质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，得到携带克隆有L-methioninase基因的质粒的VNP20009菌(本发明中命名为SGN1)，另将空载质粒pSVSPORT转至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，得到携带空载质粒pSVSPORT的VNP20009菌(本发明中也称为VNP-V)，SGN1和VNP-V的详细构建方法已在专利名称为“一种治疗乳腺癌的基因工程菌及其构建方法和应用”(专利号ZL201310062253.7)、专利名称为“减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用”(专利号ZL201310688936.3)、专利名称为“减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗前列腺癌的药物上的应用”(专利号ZL201410183149.8)、专利名称为“减毒鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌在制备治疗肝癌药物上的应用”(专利号ZL201510546063.1)、申请名称为“基因工程菌VNP20009-M在制备治疗恶性肉瘤药物中的应用”(申请号CN201710216811.9)等中公开，其中，携带克隆有L-methioninase基因的质粒的VNP20009菌(本发明命名为SGN1)在上述专利或专利申请中的名称为VNP20009-M，携带空载质粒pSVSPORT的VNP20009菌在上述专利或专利申请中的名称为VNP20009-V。
实施例2基因工程菌与免疫检查点抑制剂联用的抑制胆管癌细胞生长的效果
(1)用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基培养胆管癌细胞HCCC-9810或RBE，并收集细胞悬液；使用培养基调节细胞悬液浓度至1×105cells/mL，于6孔板中加入1mL细胞悬液，并补充培养基至2mL，置于37℃，5％ CO2培养箱培养过夜。
(2)将实施例1获得的基因工程菌SGN1按感染复数MOI为1、5、10、20设置SGN1处理组，并设置PBS组为对照组；按照分组配制相应浓度的SGN1，并将SGN1或PBS加入至细胞板对应的孔中；菌胞共培养5h后，弃掉旧培养基，更换含庆大霉素的培养基，继续培养24h；培养24h后，使用胰酶消化，并收集细胞，使用血球计数板计数。
(3)使用含有肝素钠的抗凝采血管收集人静脉血，加入等体积的含2％胎牛血清的无菌PBS缓冲液混匀，转移至50mL离心管中；往SepMateTM管中加入15mL淋巴细胞分离液，并沿管壁缓慢加入稀释后的静脉血，室温1200×g离心10min，离心减速度设置为0；离心后溶液分为四层，吸取第三层淋巴细胞层至新的无菌15mL离心管中，加入含2％胎牛血清的无菌PBS溶液至10mL，300×g离心8min，弃上清；加入5mL含2％胎牛血清的无菌PBS重悬细胞300×g离心8min，得到人外周血单核细胞(PBMC)；用RPMI 1640完全培养基重悬PBMC细胞，调节细胞浓度至3×106cell/mL；加入2μg/mL的抗CD28抗体与50ng/mL重组IL-2蛋白，并用移液枪混匀；
(4)将铺有胆管癌细胞HCC-3810或REB的6孔板置于37℃，5％CO2培养箱中过夜培养；培养24h后，根据肿瘤细胞与PBMC的比例设置1:2、1:4、1:8组，根据分组加入对应数量的PBMC；PBMC与胆管癌细胞共培养5h后，收集细胞，并用血球计数板计数。
(5)根据前述方法得PBMC与胆管癌细胞共培养(胆管癌HCC-9810细胞：PBMC比例为1:8，胆管癌REB细胞：PBMC比例为1:4)的六孔板，设置分组：胆管癌细胞单独培养组、胆管癌细胞与PBMC共培养组、细胞共培养合并抗PD-L1抗体(10μg/mL)处理组、细胞共培养合并SGN1(1MOI)处理组，以及细胞共培养合并PD-L1(10μg/mL)抗体、SGN1(1MOI)共处理组；细胞处理5h后，加入庆大霉素灭活细菌，再培养36h；收集细胞，并用血球计数板计数。
(6)根据前述方法将PBMC与胆管癌细胞共培养，并加入抗PD-L1抗体、SGN1处理，分组：胆管癌细胞单独培养组、胆管癌细胞与PBMC共培养组、细胞共培养合并抗PD-L1抗体(10μg/mL)处理组、细胞共培养合并SGN1(1MOI)处理组，以及细胞共培养合并PD-L1(10μg/mL)抗体、SGN1(1MOI)共处理组；细胞处理5h后，加入庆大霉素灭活细菌；细胞继续培养36h后，收集细胞，并加入预冷的PBS缓冲液，300×g离心5min，弃掉上清液，重复两次；离心后加入PBS缓冲液重悬细胞，并吸取100μL细胞悬液加到流式管中；于流式管中加入5μL的FITC-Annexin V染液，轻轻涡旋婚育，室温避光孵育15min；使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
(7)根据前述方法将PBMC与胆管癌细胞共培养，并加入抗PD-L1抗体、SGN1处理，分组：胆管癌细胞单独培养组、胆管癌细胞与PBMC共培养组，和细胞共培养合并SGN1(1MOI)处理组；细胞处理5h后，加入庆大霉素灭活细菌；细胞继续培养36h后，收集细胞，并加入预冷的PBS缓冲液，300×g离心5min，弃掉上清液，重复两次；离心后加入PBS缓冲液重悬细胞，并吸取100μL细胞悬液加到流式管中；加入5μL的PE-PD-L1荧光抗体至流式管中，轻轻涡旋吹打混匀，在室温下避光孵育15min；使用流式细胞仪检测PD-L1的表达情况。
结果如图1～4所示，图1是体外给予基因工程菌SGN1处理胆管癌细胞后细胞数量变化的结果图，图2是体外给予基因工程菌SGN1与抗PD-L1抗体处理胆管癌细胞后细胞数量变化的结果图，图3是体外给予基因工程菌SGN1与抗PD-L1抗体处理胆管癌细胞后细胞凋亡比例的结果图，图4是体外给予基因工程菌SGN1处理胆管癌细胞后PD-L1表达量的结果图。从图1可以看出，不加SGN1处理的胆管癌细胞数约为2.5×105个，使用10MOI以上的SGN1处理能够显著抑制胆管癌细胞的增殖，并且SGN1呈剂量依赖性的抑制胆管癌细胞的增殖，20MOI处理组中胆管癌细胞的数量约为1.0×105～1.5×105个。从图2可以看出PBMC与胆管癌细胞共培养组，胆管癌细胞数约为1.4×105(HCCC-9810细胞)或2.1×105(RBE细胞)个；单独加入抗PD-L1抗体或SGN1处理，胆管癌细胞数显著降低，约为0.7×105个(HCCC-9810细胞)和1.7×105个(RBE细胞)，但抗PD-L1抗体处理组的细胞数与SGN1处理组之间无显著差异；抗PD-L1抗体和SGN1同时处理能够进一步降低胆管癌细胞数至约0.2×105个(HCCC-9810细胞)和1.3×105个(RBE细胞)。从图3可以看出，在PBMC共培养的条件下，抗PD-L1抗体可以引起胆管细胞RBE的凋亡比例增加(约21％)，而对HCCC-9810则无明显作用，而SGN1能够引起HCCC-9810和RBE凋亡比例增加，凋亡比例分别约为17％和30％，SGN1和PD-L1同时处理，能够进一步增加胆管癌细胞的凋亡比例(HCCC-9810约为28％，RBE约为36％)。从图4可以看出，SGN1在PBMC共培养的条件下，能够显著上调胆管癌细胞中PD-L1的表达量，其中PBMC共培养和SGN1处理后，HCCC-9810细胞PD-L1阳性细胞比例约为75％，RBE细胞的约为52％。
上述结果说明经基因工程改造表达甲硫氨酸酶的减毒沙门氏菌SGN1与抗PD-L1抗体联合使用能够发挥抑制胆管癌生长的作用，并且抑制效果比SGN1或抗PD-L1抗体单独使用有明显的提升。实现该效果的部分原因在于，SGN1可以激活免疫反应，增强抗PD-L1抗体的作用效果，使本对抗PD-L1抗体不敏感的肿瘤细胞(如HCCC-9810)表现出敏感性，从而协同改善抑癌效果。
实施例3基因工程菌与免疫检查点抑制剂联用的抗黑色素瘤效果
(1)用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养黑色素瘤细胞B16F10，并收集细胞悬液；利用PBS溶液调整细胞悬液浓度，悬液目标浓度为3×107个/mL；然后将细胞悬液按照100μl/只的用量皮下接种于C57BL/6小鼠右侧腋下，并将荷瘤小鼠随机分组：PBS对照组、抗PD-L1抗体(150μg/只)组、SGN1(2×104CFU/只)组和抗PD-L1抗体(150μg/只)+SGN1(2×104CFU/只)组。
(2)使用实施例1获得的基因工程菌SGN1；当荷瘤小鼠肿瘤的体积达到80mm3左右时，按照(1)中所述的分组给药处理，抗PD-L1抗体的给药方式为腹腔注射，分别于第一天和第四天给药，SGN1的给药方式则为瘤内注射，于第一天给药，而对照组注射同等体积PBS。给药后定期观察小鼠状态，用游标卡尺测量肿瘤大小(体积＝0.52×长×宽2)，绘制小鼠肿瘤体积变化曲线(图5)，用天平称量小鼠体重，绘制小鼠体重变化曲线(图6)。当PBS对照组肿瘤体积达到3500mm3左右时，对照组和实验组各选取3只小鼠，剥离小鼠肿瘤，拍照，称重(图7、图8)。另取肿瘤组织用4％的多聚甲醛固定液固定24h，经石蜡包埋、切片和HE染色(图9)。
(3)将10×的PBS溶液与Percoll原液按体积比1:9配置成Percoll工作溶液，再将Percoll溶液和1×的PBS溶液按体积比4:6和8:2分别配置成40％Percoll溶液和80％Percoll溶液。往1×PBS溶液加入DNaseⅠ(终浓度为0.05mg/mL的)和CollagenaseⅣ(终浓度为1mg/mL)，得Enzyme Mix溶液，备用。将(2)所得的肿瘤剪碎，剪碎后转移至15mL离心管中，加入PBS溶液至10mL，300×g，离心5min。除去上清，往15mL离心管中加入5mL Enzyme Mix溶液，置于摇床上消化40min，转速设置为125rpm，温度为37℃。将消化后的肿瘤悬液用70μm筛网过滤得肿瘤滤液。300×g，5min离心肿瘤滤液，除去上清，加入10mL PBS溶液重悬。300×g，5min再次离心细胞悬液，除去上清，加入40％Percoll溶液重悬细胞。于新的15mL离心管中加入4mL的80％Percoll溶液，然后用巴氏滴管小心将4mL含肿瘤细胞的40％Percoll溶液沿壁加到80％Percoll溶液的上面；以4℃，600×g，22min(升速＝5，降速＝1)的离心参数将溶液离心两次，溶液分为四层；收集第二层免疫细胞，转移到1.5mL的EP管中，在4℃、500×g的条件下离心5min；除去上清，用200μL的Standing Buffer重悬细胞，加入0.2μL的FSV780，涡旋混匀，并在冰上孵育15min；加入500μL的Standing Buffer终止反应，500×g离心5min，除去上清；再次加入500μL的Standing Buffer，涡旋混匀，500×g离心5min，除去上清；加入50μL的Standing Buffer，各加入2.5μL抗体溶液(含有分别靶向CD45、CD3和CD8的荧光抗体)，常温孵育15min；加入500μL的Standing Buffer终止反应，300×g离心5min，弃去上清，重复三次；加入200μL的Standing Buffer重悬；使用流式细胞仪检测CD8+T细胞的比例的变化情况(图10、图11)。
结果如图5～11所示，图5是注射工程菌SGN1后黑色素瘤体积变化曲线结果图，图6是注射工程菌SGN1对荷瘤小鼠体重的影响结果图，图7是当PBS对照组肿瘤体积长到3500mm3左右时，荷瘤裸鼠肿瘤剥离后获得的肿瘤的展示图，图8是当PBS对照组肿瘤体积长到3500mm3左右时，不同处理组的荷瘤裸鼠肿瘤剥离后获得的肿瘤的重量统计分析图，图9是肿瘤组织HE染色结果图，图10、图11是注射工程菌SGN1后肿瘤浸润的CD8+T细胞比例的结果图。
从图5～8可以看出，PBS对照组小鼠的肿瘤生长迅速，而给予表达甲硫氨酸酶的减毒鼠沙门氏菌SGN1和抗PD-L1抗体治疗后，小鼠的肿瘤均受到抑制，而SGN1和抗PD-L1抗体联用组中小鼠肿瘤的体积和肿瘤显著小于SGN1或抗PD-L1抗体单用组。给药后处理后各组小鼠的体重也没有显著差异(图6)。
肿瘤组织HE染色结果见图9，从图9中可以看出，PBS对照组着色连续、均匀，而SGN1组和SGN1和抗PD-L1抗体组中出现较大区域着色不均匀，出现较明显的紫红色区域，提示这些区域发生了细胞核染色异常，放大到100倍，发现SGN1治疗组细胞肿胀，胞核固缩，失去正常形态，说明肿瘤组织坏死。
肿瘤免疫细胞比例结果见图10、图11，从图10、图11可以看出，PBS对照组CD8+T细胞的比例约为20％，抗PD-L1抗体组CD8+T细胞的比例约为24％，SGN1组的约为26％，而SGN1+抗PD-L1抗体组的则约为40％，显著高于对照组、抗PD-L1抗体组和SGN1组，说明SGN1和抗PD-L1抗体联用能显著增加CD8+T细胞的浸润比例。
上述结果说明经基因工程改造表达甲硫氨酸酶的减毒沙门氏菌SGN1与抗PD-L1抗体联合使用能够发挥抑制黑色素瘤生长的作用，并且抑制效果比SGN1或抗PD-L1抗体单独使用有明显的提升。
实施例4基因工程菌与免疫检查点抑制剂联用增强黑色素瘤的PD-L1表达
(1)用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养黑色素瘤细胞B16F10(购买自中国科学院细胞库)，并收集细胞悬液；利用PBS溶液调整细胞悬液浓度，悬液目标浓度为3×107个/mL；然后将细胞悬液按照100μL/只的用量皮下接种于C57BL/6小鼠右侧腋下，并将荷瘤小鼠随机分组：PBS对照组、VNP20009(2×106CFU/只)静脉组和SGN1(2×106CFU/只)静脉组。
(2)当荷瘤小鼠肿瘤的体积达到80mm3左右时，使用实施例1获得的基因工程菌SGN1，按照(1)中所述的分组给药处理，对照组注射同等体积PBS。给药后定期观察小鼠状态，用游标卡尺测量肿瘤大小(体积＝0.52×长×宽2)，试验结束时取肿瘤组织用蛋白质裂解液进行研磨，提取组织蛋白质，将提取液离心，除去不溶物后，对蛋白提取液进行定量分析和加热变性得样品；制备SDS-PAGE胶，并依次进行凝胶电泳、转膜、封闭、孵育一抗、二抗操作，得附有目标蛋白的转印膜，最后往转印膜加入化学发光显色影液，显影曝光拍照并分析目标蛋白的表达情况(图12)。
注射工程菌SGN1后肿瘤PD-L1表达量结果见图12，从图可以看出，PBS组和VNP-V组的肿瘤组织，PD-L1的相对表达水平较低，约为1％左右，而注射SGN1之后，肿瘤组织中PD-L1的相对表达水平显著增加，约为2％，约为PBS组或VNP-V组的两倍，说明表达甲硫氨酸酶的SGN1能够激活肿瘤组织的免疫检查点分子PD-L1的表达，暴露免疫检查点抑制剂的作用靶点。
此外，本发明还参照实施例3的方式，按照PBS对照组、抗PD-L1抗体(150μg/只)+SGN1(2×104CFU/只)组和抗PD-L1抗体(150μg/只)+VNP20009(2×104CFU/只)组的分组方式进行了两种联用方式的平行对照试验。结果显示，抗PD-L1抗体与SGN1的联用效果显著优于抗PD-L1抗体与VNP20009的联用效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (21)

1.基因工程菌和免疫检查点抑制剂的联合使用在以下任一方面的应用：
1)预防、治疗或缓解肿瘤；
2)制备用于预防、治疗或缓解肿瘤的药物；
其中，所述基因工程菌为携带甲硫氨酸酶(L-methioninase)表达基因的细菌。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述细菌为msbB基因和purI基因缺失的减毒鼠伤寒沙门菌株；优选所述基因工程菌为SGN1，其为携带甲硫氨酸酶表达基因的减毒伤寒沙门氏菌VNP20009。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，基因工程菌SGN1为携带甲硫氨酸酶表达质粒的减毒伤寒沙门氏菌VNP20009，所述甲硫氨酸酶表达质粒为含有甲硫氨酸酶表达基因的pSVSPORT质粒、pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质粒或pET23a质粒。
4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述基因工程菌的给药方式为瘤内注射、静脉注射或介入灌注。
5.根据权利要求1所述的应用，其中，所述免疫检查点抑制剂的靶点包括PD-1、PD-L1、CTLA-4中的一种或多种；优选所述免疫检查点抑制剂的靶点包括PD-L1。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述免疫检查点抑制剂为抗PD-L1抗体，优选为抗PD-L1单抗，更优选为阿替利珠单抗(Atezolizumab)、度伐利尤单抗(Durvalumab)或阿维单抗(Avelumab)。
7.根据权利要求1所述的应用，其中，所述免疫检查点抑制剂的给药方式为静脉注射、瘤内注射或口服。
8.根据权利要求1所述的应用，其中，所述肿瘤为具有甲硫氨酸依赖性的肿瘤。
9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述肿瘤包括但不限于胆管癌和黑色素瘤。
10.根据权利要求1所述的应用，其中，所述联合使用的目的包括以下至少一种：
a)激活抗肿瘤免疫反应；
b)抑制肿瘤细胞的生长。
11.根据权利要求1或10所述的应用，其中，所述联合使用的目的包括以下至少一种：
i)增强免疫检查点抑制剂的作用效果；
ii)增强肿瘤细胞对免疫检查点抑制剂的敏感性；
iii)延迟或减少肿瘤细胞对免疫检查点抑制剂的耐药性。
12.根据权利要求1所述的应用，其中，所述联合使用的给药时机为同时给药或先后给药；优选使基因工程菌先于免疫检查点抑制剂发挥药效。
13.根据权利要求1所述的应用，其中，所述基因工程菌和免疫检查点抑制剂的联用剂量低于其单用剂量。
14.根据权利要求1所述的应用，其中，所述联合使用的施用对象包括：a)对免疫检查点抑制剂不敏感或耐药的患者；b)对免疫检查点抑制剂敏感的患者。
15.一种联合药物，其含有基因工程菌和免疫检查点抑制剂，所述基因工程菌为携带甲硫氨酸酶表达基因的细菌。
16.根据权利要求15所述的联合药物，其中，所述细菌为msbB基因和purI基因缺失的减毒鼠伤寒沙门菌株；优选所述基因工程菌为SGN1，其为携带甲硫氨酸酶表达基因的减毒伤寒沙门氏菌VNP20009。
17.根据权利要求16所述的联合药物，其中，基因工程菌SGN1为携带甲硫氨酸酶表达质粒的减毒伤寒沙门氏菌VNP20009，所述甲硫氨酸酶表达质粒为含有甲硫氨酸酶表达基因的pSVSPORT质粒、pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质粒或pET23a质粒。
18.根据权利要求15所述的联合药物，其中，所述免疫检查点抑制剂的靶点包括PD-1、PD-L1、CTLA-4中的一种或多种；优选所述免疫检查点抑制剂的靶点包括PD-L1。
19.根据权利要求18所述的联合药物，其中，所述免疫检查点抑制剂为抗PD-L1抗体，优选为抗PD-L1单抗，更优选为阿替利珠单抗(Atezolizumab)、度伐利尤单抗(Durvalumab)或阿维单抗(Avelumab)。
20.根据权利要求15所述的联合药物，其中，所述联合药物为瘤内注射制剂、静脉注射制剂或介入灌注制剂。
21.根据权利要求15所述的联用药物，其中，所述基因工程菌和免疫检查点抑制剂的联用剂量低于其单用剂量；和/或，所述基因工程菌的释放早于免疫检查点抑制剂。
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