CN117015601A - 用于adar介导的serpina1编辑的方法和组合物 - Google Patents

用于adar介导的serpina1编辑的方法和组合物 Download PDF

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CN117015601A CN202180059133.4A CN202180059133A CN117015601A CN 117015601 A CN117015601 A CN 117015601A CN 202180059133 A CN202180059133 A CN 202180059133A CN 117015601 A CN117015601 A CN 117015601A
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S·罗宾奈特
A·弗雷尼
M·R·普塔
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Coro Biology
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Abstract

本发明涉及用于编辑SERPINA1多核苷酸例如包含与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的SERPINA1多核苷酸的方法和组合物。本发明还涉及用于治疗或预防受试者的α1抗胰蛋白酶缺乏症的方法和组合物。

Description

用于ADAR介导的SERPINA1编辑的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年7月17日提交的美国临时申请第62/705,838号和2020年5月28日提交的美国临时申请第62/704,793号的优先权权益，所述申请各自出于任何目的以引用方式并入本文。
背景技术
SERPINA1基因编码丝氨酸蛋白酶抑制剂α-1抗胰蛋白酶(A1AT)。A1AT保护组织免受某些炎症酶的影响，所述酶包括中性粒细胞弹性蛋白酶。A1AT缺乏症(α1抗胰蛋白酶缺乏症，A1AD)可导致中性粒细胞弹性蛋白酶过度分解肺中的弹性蛋白。这可能会导致肺部弹性降低以及随后的呼吸系统并发症，包括肺气肿和慢性阻塞性肺病(COPD)。突变A1AT也可以在肝脏中积聚，从而导致肝硬化和肝衰竭。
A1AD可由E342K突变引起，所述突变与SNP rs28929474(A)相关。为了治疗可能导致肝衰竭和/或肺气肿的α1抗胰蛋白酶缺乏症(A1AD)，持续需要选择性且有效编辑SERPINA1基因并纠正所述基因中的任何致病性突变的方法。
发明内容
本发明提供了用于编辑SERPINA1多核苷酸的方法和组合物，以及使用指导寡核苷酸治疗或预防受试者的SERPINA1相关疾病的方法，所述指导寡核苷酸能够实现靶基因中作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变。在一些实施方案中，校正基因中的致病性突变的脱氨基作用将E342K突变逆转回野生型，从而逆转或减缓患者经历的SERPINA1相关疾病和任何相关症状。
实施方案1.一种编辑SERPINA1多核苷酸的方法，所述SERPINA1多核苷酸包含与可能导致肝衰竭或肺气肿的α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的单核苷酸多态性(SNP)，所述方法包括使SERPINA1多核苷酸与指导寡核苷酸接触，从而编辑SERPINA1多核苷酸，所述指导寡核苷酸能够实现与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变。
实施方案2.如实施方案1所述的方法，其中所述SERPINA1多核苷酸与所述指导寡核苷酸在细胞中接触。
实施方案3.如实施方案2所述的方法，其中所述细胞内源性表达ADAR。
实施方案4.如实施方案3所述的方法，其中所述ADAR是人ADAR。
实施方案5.如实施方案4所述的方法，其中所述ADAR是人ADAR1。
实施方案6.如实施方案4所述的方法，其中所述ADAR是人ADAR2。
实施方案7.如实施方案2-6中任一项所述的方法，其中所述细胞选自真核细胞、哺乳动物细胞和人细胞。
实施方案8.如实施方案2-7中任一项所述的方法，其中所述细胞是体内的。
实施方案9.如实施方案2-7中任一项所述的方法，其中所述细胞是离体的。
实施方案10.一种治疗有需要的受试者的α1抗胰蛋白酶缺乏症的方法，所述方法包括
a)鉴定在SERPINA1多核苷酸中具有与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的单核苷酸多态性(SNP)的受试者；
b)使受试者细胞中的SERPINA1多核苷酸与指导寡核苷酸接触，从而治疗所述受试者，所述指导寡核苷酸能够实现与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变。
实施方案11.一种治疗有需要的受试者的α1抗胰蛋白酶缺乏症的方法，所述方法包括
a)鉴定在SERPINA1多核苷酸中具有与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的单核苷酸多态性(SNP)的受试者；
b)使细胞中的所述SERPINA1多核苷酸与指导寡核苷酸接触，所述指导寡核苷酸能够实现与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变，以及
c)向所述受试者施用所述细胞，从而治疗所述受试者。
实施方案12.如实施方案11所述的方法，其中所述细胞对于受试者是自体的、同种异体的或异种的。
实施方案13.如实施方案10-12中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
实施方案14.如实施方案1-13中任一项所述的方法，其中所述指导寡核苷酸包含与SERPINA1 mRNA序列互补的核酸序列，所述SERPINA1 mRNA序列包含与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP。
实施方案15.如实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸还包含一种或多种作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)-募集结构域。
实施方案16.如实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述SERPINA1多核苷酸编码包含致病性氨基酸的SERPINA1蛋白，所述致病性氨基酸包含由SNP导致的位置342处的赖氨酸。
实施方案17.如实施方案16所述的方法，其中腺苷到肌苷的改变用野生型氨基酸取代致病性氨基酸。
实施方案18.如实施方案17所述的方法，其中位置342处的野生型氨基酸包含谷氨酸。
实施方案19.如实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述指导寡核苷酸包含以下结构：
[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
其中A和B各自是核苷酸；
m和n各自独立地是1至50的整数；
X1、X2和X3各自独立地是核苷酸，其中X1、X2或X3中的至少一个是替代性核苷酸。
实施方案20.如实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述指导寡核苷酸包含以下结构：
[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
其中A和B各自是核苷酸；
m和n各自独立地是1至50的整数；
X1、X2和X3各自独立地是核苷酸，其中X1、X2或X3中的至少一个具有式I-V中任一者的结构：
其中N1是氢或核碱基；
R1是羟基、卤素或C1-C6烷氧基；
R2是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基；
R3是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基；
R4是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基；并且
R5是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基。
实施方案21.如实施方案20所述的方法，其中R4是氢并且R5不是氢或羟基，R5是氢并且R4不是氢，或者R5是羟基并且R4不是氢。
实施方案22.如实施方案20或实施方案21所述的方法，其中[Am]和/或[Bn]的至少80％的核苷酸包括核碱基、糖和核苷间键。
实施方案23.如实施方案20至22中任一项所述的方法，其中R1是羟基、卤素或OCH3。
实施方案24.如实施方案20至23中任一项所述的方法，其中R2是氢。
实施方案25.如实施方案20至24中任一项所述的方法，其中X1、X2或X3中的至少一个具有式I、式II或式V的结构；并且X1、X2或X3均不具有式IV或式III的结构。
实施方案26.如实施方案20至25中任一项所述的方法，其中X1、X2或X3中的至少一个具有式I或式II的结构；并且X1、X2或X3均不具有式III、式IV或式V的结构。
实施方案27.如实施方案20至26中任一项所述的方法，其中所述卤素是氟。
实施方案28.如实施方案20至27中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式I的结构，其中R1是氟，并且N1是核碱基。
实施方案29.如实施方案28所述的方法，其中X1具有式I的结构，其中R1是氟，并且N1是核碱基。
实施方案30.如实施方案28或29所述的方法，其中X2具有式I的结构，其中R1是氟，并且N1是核碱基。
实施方案31.如实施方案28至30中任一项所述的方法，其中X3具有式I的结构，其中R1是氟，并且N1是核碱基。
实施方案32.如实施方案20至27中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式I的结构，其中R1是羟基，并且N1是核碱基。
实施方案33.如实施方案32所述的方法，其中X1具有式I的结构，其中R1是羟基，并且N1是核碱基。
实施方案34.如实施方案32或33所述的方法，其中X2具有式I的结构，其中R1是羟基，并且N1是核碱基。
实施方案35.如实施方案32至34中任一项所述的方法，其中X3具有式I的结构，其中R1是羟基，并且N1是核碱基。
实施方案36.如实施方案20至27中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式I的结构，其中R1是甲氧基，并且N1是核碱基。
实施方案37.如实施方案36所述的方法，其中X1具有式I的结构，其中R1是甲氧基，并且N1是核碱基；并且X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
实施方案38.如实施方案36或37所述的方法，其中X2具有式I的结构，其中R1是甲氧基，并且N1是核碱基。
实施方案39.如实施方案36至38中任一项所述的方法，其中X3具有式I的结构，其中R1是甲氧基，并且N1是核碱基。
实施方案40.如实施方案20至27中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式II的结构，其中R2是氢，并且N1是核碱基。
实施方案41.如实施方案40所述的方法，其中X2具有式II的结构，其中R2是氢，并且N1是核碱基。
实施方案42.如实施方案20至25中任一项所述的方法，其中X1和X2中的至少一个具有式V的结构。
实施方案43.如实施方案42所述的方法，其中X2具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是氢。
实施方案44.如实施方案42所述的方法，其中X2具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是羟基。
实施方案45.如实施方案42所述的方法，其中X1具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是氢。
实施方案46.如实施方案42所述的方法，其中X1具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是羟基。
实施方案47.如实施方案42所述的方法，其中X2具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是甲氧基。
实施方案48.如实施方案20-47中任一项所述的方法，其中当X1具有式I至V中任一者的结构时，X2和X3各自独立地是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸(arabinonucleic acid)-核苷酸、双环-核苷酸、′-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X2具有式I至V中任一者的结构时，X1和X3各自独立地是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、′-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X3具有式I至V中任一者的结构时，X1和X2各自独立地是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X2各自具有式I至V中任何一者的结构时，X3是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X3各自具有式I至V中任何一者的结构时，X2是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；并且当X2和X3各自具有式I至V中任一者的结构时，X1是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
实施方案49.如实施方案48所述的方法，其中当X1具有式I至V中任一者的结构时，X2和X3各自独立地是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X2具有式I至V中任一者的结构时，X1和X3各自独立地是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X3具有式I至V中任一者的结构时，X1和X2各自独立地是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X2各自具有式I至V中任一者的结构时，X3是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X3各自具有式I至V中任一者的结构时，X2是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；并且当X2和X3各自具有式I至V中任一者的结构时，X1是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
实施方案50.如实施方案49所述的方法，其中当X1具有式I至V中任一者的结构时，X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X2具有式I至V中任一者的结构时，X1和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X3具有式I至V中任一者的结构时，X1和X2各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X1和X2各自具有式I至V中任一者的结构时，X3是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X1和X3各自具有式I至V中任一者的结构时，X2是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；并且当X2和X3各自具有式I至V中任一者的结构时，X1是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
实施方案51.如实施方案20至40和42至50中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3均不具有式II的结构，其中N1是核碱基。
实施方案52.如实施方案51所述的方法，其中X1、X2和X3均不具有式II的结构，其中N1是胞嘧啶核碱基。
实施方案53.如实施方案20至44和47至52中任一项所述的方法，其中X1包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基。
实施方案54.如实施方案53所述的方法，其中X1包含尿嘧啶核碱基。
实施方案55.如20至44和47至52中任一项所述的方法，其中X1包含次黄嘌呤核碱基。
实施方案56.如实施方案20至44和47至52中任一项所述的方法，其中X1包含胞嘧啶核碱基。
实施方案57.如实施方案20至56中任一项所述的方法，其中X3包含鸟嘌呤核碱基。
实施方案58.如实施方案20至56中任一项所述的方法，其中X3包含次黄嘌呤核碱基。
实施方案59.如实施方案20至56中任一项所述的方法，其中X3包含腺嘌呤核碱基。
实施方案60.如实施方案20至42、46、47和48至59中任一项所述的方法，其中X2包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基。
实施方案61.如实施方案60所述的方法，其中X2包含胞嘧啶核碱基。
实施方案62.如实施方案20至24中任一项所述的方法，其中X2具有式I-V中任一者的结构。
实施方案63.如实施方案20至62中任一项所述的方法，其中X2不是2’-O-甲基-核苷酸。
实施方案64.如实施方案63所述的方法，其中X1、X2和X3不是2’-O-甲基-核苷酸。
实施方案65.如实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述指导寡核苷酸包含以下结构：
[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
其中A和B各自是核苷酸；
m和n各自独立地是1至50的整数；
X1、X2和X3各自独立地是核苷酸，其中X1、X2或X3中的至少一个具有式VI-XI中任一者的结构：
其中N1是氢或核碱基；
R12是氢、羟基、氟、卤素、C1-C6烷基、C1-C6杂烷基或C1-C6烷氧基；
R13是氢或C1-C6烷基，
其中X1、X2或X3中的至少一个具有式VI-IX中任一者的结构。
实施方案66.如实施方案65所述的方法，其中[Am]和/或[Bn]的至少80％的核苷酸包括核碱基、糖和核苷间键。
实施方案67.如实施方案65或66所述的方法，其中R12是氢、卤素、C1-C6烷基或C1-C6杂烷基。
实施方案68.如实施方案65至67中任一项所述的方法，其中所述卤素是氟。
实施方案69.如实施方案65至68中任一项所述的方法，其中R12是氢或C1-C6烷基；
实施方案70.如实施方案65至69中任一项所述的方法，其中R12是氢。
实施方案71.如实施方案65至70中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式VI的结构，并且N1是核碱基。
实施方案72.如实施方案71所述的方法，其中X1具有式VI的结构，并且N1是核碱基。
实施方案73.如实施方案71或72所述的方法，其中X2具有式VI的结构，并且N1是核碱基。
实施方案74.如实施方案65至70中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式VII的结构，并且N1是核碱基。
实施方案75.如实施方案74所述的方法，其中X1具有式VII的结构，并且N1是核碱基。
实施方案76.如实施方案74或75所述的方法，其中X2具有式VII的结构，并且N1是核碱基。
实施方案77.如实施方案65至70中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式IX的结构，并且N1是核碱基。
实施方案78.如实施方案77所述的方法，其中X1具有式IX的结构，并且N1是核碱基。
实施方案79.如实施方案77或78所述的方法，其中X2具有式IX的结构，并且N1是核碱基。
实施方案80.如实施方案65至70中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式VIII的结构，并且N1是核碱基。
实施方案81.如实施方案80所述的方法，其中X1具有式VIII的结构，并且N1是核碱基。
实施方案82.如实施方案80或81所述的方法，其中X2具有式VIII的结构，并且N1是核碱基。
实施方案83.如实施方案65至72和74至82中任一项所述的方法，其中X2不具有式VI的结构。
实施方案84.如实施方案65至83中任一项所述的方法，其中X3不具有式VI的结构。
实施方案85.如实施方案65至75和77至84中任一项所述的方法，其中X2不具有式VII的结构。
实施方案86.如实施方案65至85中任一项所述的方法，其中X3不具有式VII的结构。
实施方案87.如实施方案65至78和80至86中任一项所述的方法，其中X2不具有式IX的结构。
实施方案88.如实施方案65至70中任一项所述的方法，其中X2具有式VI或式VII的结构。
实施方案89.如实施方案65-88中任一项所述的方法，其中当X1具有式VI至XI中任一者的结构时，X2和X3各自独立地是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X2具有式VI至XI中任一者的结构时，X1和X3各自独立地是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X3具有式VI至XI中任一者的结构时，X1和X2各自独立地是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X2各自具有式VI至XI中任一者的结构时，X3是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X3各自具有式VI至XI中任一者的结构时，X2是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；并且当X2和X3各自具有式VI至XI中任一者的结构时，X1是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
实施方案90.如实施方案89所述的方法，其中当X1具有式VI至XI中任一者的结构时，X2和X3各自独立地是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X2具有式VI至XI中任一者的结构时，X1和X3各自独立地是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X3具有式VI至XI中任一者的结构时，X1和X2各自独立地是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X2各自具有式VI至XI中任一者的结构时，X3是核糖核苷酸、2'-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X3各自具有式VI至XI中任一者的结构时，X2是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；并且当X2和X3各自具有式VI至XI中任一者的结构时，X1是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
实施方案91.如实施方案90所述的方法，其中当X1具有式VI至XI中任一者的结构时，X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X2具有式VI至XI中任一者的结构时，X1和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X3具有式VI至XI中任一者的结构时，X1和X2各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X1和X2各自具有式VI至XI中任一者的结构时，X3是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X1和X3各自具有式VI至XI中任一者的结构时，X2是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；并且当X2和X3各自具有式VI至XI中任一者的结构时，X1是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
实施方案92.如实施方案65至91中任一项所述的方法，其中X1包含次黄嘌呤核碱基。
实施方案93.如实施方案65至91中任一项所述的方法，其中X1包含尿嘧啶核碱基。
实施方案94.如实施方案65至91中任一项所述的方法，其中X1包含胞嘧啶核碱基。
实施方案95.如实施方案65至94中任一项所述的方法，其中X3包含次黄嘌呤核碱基。
实施方案96.如实施方案65至94中任一项所述的方法，其中X3包含鸟嘌呤核碱基。
实施方案97.如实施方案65至94中任一项所述的方法，其中X3包含腺嘌呤核碱基。
实施方案98.如实施方案65至97中任一项所述的方法，其中X2包含胞嘧啶核碱基。
实施方案99.如实施方案65至97中任一项所述的方法，其中X2包含尿嘧啶核碱基。
实施方案100.如实施方案65至97中任一项所述的方法，其中X2不包括核碱基。
实施方案101.如实施方案65至100中任一项所述的方法，其中X2不是2’-O-甲基-核苷酸。
实施方案102.如实施方案65至101中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3不是2’-O-甲基-核苷酸。
实施方案103.如实施方案1至19中任一项所述的方法，其中所述指导寡核苷酸包含以下结构：
[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
其中A和B各自是核苷酸；
m和n各自独立地是1至50的整数；
X1、X2和X3各自独立地是核苷酸，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式XII-XV中任一者的结构：
其中N1是氢或核碱基；
R6是氢、羟基或卤素；
R7是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基；
R8为氢或卤素；
R9是氢或羟基、卤素或C1-C6烷氧基；
R10是氢或卤素；并且
R11是氢或羟基、卤素或C1-C6烷氧基。
实施方案104.如实施方案103所述的方法，其中[Am]和/或[Bn]的至少80％的核苷酸包括核碱基、糖和核苷间键。
实施方案105.如实施方案103或104所述的方法，其中卤素是氟。
实施方案106.如实施方案103至105中任一项所述的方法，其中C1-C6烷氧基是OCH3。
实施方案107.如实施方案103至106中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式XIII的结构，其中R8和R9各自是氢。
实施方案108.如实施方案107所述的方法，其中X1具有式XIII的结构，其中R8和R9各自是氢。
实施方案109.如实施方案107或108所述的方法，其中X2具有式XIII的结构，其中R8和R9各自是氢。
实施方案110.如实施方案103至106中任一项所述的方法，其中X2具有式XII-XV中任一者的结构。
实施方案111.如实施方案103至110中任一项所述的方法，其中当X1具有式XII-XV中任一者的结构时，X2和X3各自独立地是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2'-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X2具有式XII-XV中任一者的结构时，X1和X3各自独立地是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X3具有式XII-XV中任一者的结构时，X1和X2各自独立地是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X2各自具有式XII-XV中任一者的结构时，X3是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X3各自具有式XII-XV中任一者的结构时，X2是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；并且当X2和X3各自具有式XII-XV中任一者的结构时，X1是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
实施方案112.如实施方案111所述的方法，其中当X1具有式XII-XV中任一者的结构时，X2和X3各自独立地是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X2具有式XII-XV中任一者的结构时，X1和X3各自独立地是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X3具有式XII-XV中任一者的结构时，X1和X2各自独立地是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X2各自具有式XII-XV中任一者的结构时，X3是核糖核苷酸、2'-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X3各自具有式XII-XV中任一者的结构时，X2是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；并且当X2和X3各自具有式XII-XV中任一者的结构时，X1是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
实施方案113.如实施方案112所述的方法，其中当X1具有式XII-XV中任一者的结构时，X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X2具有式XII-XV中任一者的结构时，X1和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X3具有式XII-XV中任一者的结构时，X1和X2各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X1和X2各自具有式XII-XV中任一者的结构时，X3是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X1和X3各自具有式XII-XV中任一者的结构时，X2是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；并且当X2和X3各自具有式XII-XV中任一者的结构时，X1是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
实施方案114.如实施方案103至113中任一项所述的方法，其中X1包括次黄嘌呤核碱基。
实施方案115.如实施方案103至113中任一项所述的方法，其中X1包括尿嘧啶核碱基。
实施方案116.如实施方案103至113中任一项所述的方法，其中X1包括胞嘧啶核碱基。
实施方案117.如实施方案103至116中任一项所述的方法，其中X3包括次黄嘌呤核碱基。
实施方案118.如实施方案103至116中任一项所述的方法，其中X3包括腺嘌呤核碱基。
实施方案119.如实施方案103至118中任一项所述的方法，其中X2包括胞嘧啶核碱基。
实施方案120.如实施方案103至118中任一项所述的方法，其中X2包括尿嘧啶核碱基。
实施方案121.如实施方案103至118中任一项所述的方法，其中X2不包括核碱基。
实施方案122.如实施方案103至121中任一项所述的方法，其中X2不是2’-O-甲基-核苷酸。
实施方案123.如实施方案103至122中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3不是2’-O-甲基-核苷酸。
实施方案124.如实施方案19至123中任一项所述的方法，其中[Am]包含至少一个核酸酶抗性核苷酸。
实施方案125.如实施方案19至124中任一项所述的方法，其中[Am]包含至少一个2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、至少一个2′-氨基-核苷酸、至少一个阿拉伯核酸-核苷酸、至少一个双环-核苷酸、至少一个2′-F-核苷酸、至少一个2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、至少一个限制性乙基(cEt)-核苷酸、至少一个LNA核苷酸和/或至少一个脱氧核糖核苷酸。
实施方案126.如实施方案125所述的方法，其中[Am]包含至少一个2’-O-甲基-核苷酸、至少一个2’-F-核苷酸、至少一个2’-O-甲氧基乙基-核苷酸、至少一个cEt-核苷酸、至少一个LNA-核苷酸和/或至少一个脱氧核糖核苷酸。
实施方案127.如实施方案20-126中任一项所述的方法，其中[Am]包含至少五个末端2’-O-甲基-核苷酸。
实施方案128.如实施方案20至127中任一项所述的方法，其中[Am]包含至少一个硫代磷酸酯键。
实施方案129.如实施方案20至128中任一项所述的方法，其中[Am]包含至少四个末端硫代磷酸酯键。
实施方案130.如实施方案128或129所述的方法，其中至少一个硫代磷酸酯键是立体纯的。
实施方案131.如实施方案20至130中任一项所述的方法，其中[Bn]包含至少一个核酸酶抗性核苷酸。
实施方案132.如实施方案20至131中任一项所述的方法，其中[Bn]包含至少一个至少一个2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、至少一个2′-氨基-核苷酸、至少一个阿拉伯核酸-核苷酸、至少一个双环-核苷酸、至少一个2′-F-核苷酸、至少一个2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、至少一个cEt-核苷酸、至少一个LNA-核苷酸和/或至少一个脱氧核糖核苷酸。
实施方案133.如实施方案132所述的方法，其中[Bn]包含至少一个2’-O-甲基-核苷酸、至少一个2'-F-核苷酸、至少一个2’-O-甲氧基乙基-核苷酸、至少一个cEt-核苷酸、至少一个LNA-核苷酸和/或至少一个脱氧核糖核苷酸。
实施方案134.如实施方案20至132中任一项所述的方法，其中[Bn]包含至少五个末端2’-O-甲基-核苷酸。
实施方案135.如实施方案20至134中任一项所述的方法，其中[Bn]包含至少一个硫代磷酸酯键。
实施方案136.如实施方案20至135中任一项所述的方法，其中[Bn]包含至少四个末端硫代磷酸酯键。
实施方案137.如实施方案135或实施方案136所述的方法，其中至少一个硫代磷酸酯键是立体纯的。
实施方案138.如实施方案20至137中任一项所述的方法，其中组合的[Am]和[Bn]的至少20％的核苷酸是2’-O-甲基-核苷酸。
实施方案139.如实施方案20至138中任一项所述的方法，其中寡核苷酸还包含5’-帽结构。
实施方案140.如实施方案20至139中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含至少一个替代性核碱基。
实施方案141.如实施方案20至140中任一项所述的方法，其中5’-末端核苷酸是2’-氨基-核苷酸。
实施方案142.如实施方案20至141中任一项所述的方法，其中组合的A和B由18至80个核苷酸组成。
实施方案143.如实施方案20至142中任一项所述的方法，其中m为5至40。
实施方案144.如实施方案20至143中任一项所述的方法，其中n为5至40。
实施方案145.如实施方案20所述的方法，其中m和n各自独立地是5至40的整数；X1、X2和X3中的至少一个具有式I的结构，其中R1是氟、羟基或甲氧基，并且N1是核碱基，或者具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是氢；不具有式I或式V的结构的X1、X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；[Am]和[Bn]各自包含至少五个末端2’-O-甲基-核苷酸和至少四个末端硫代磷酸酯键；并且组合的[Am]和[Bn]的至少20％的核苷酸是2’-O-甲基-核苷酸。
实施方案146.如实施方案65所述的方法，其中m和n各自独立地是5-40的整数；X1、X2和X3中的至少一个具有式VI、式VII、式VIII或式IX的结构，其中N1是核碱基，并且不具有式VI、式VII、式VIII或式IX的结构的X1、X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；[Am]和[Bn]各自包括至少五个末端2’-O-甲基-核苷酸和至少四个末端硫代磷酸酯键；并且组合的[Am]和[Bn]的至少20％的核苷酸是2’-O-甲基-核苷酸。
实施方案147.如实施方案103所述的方法，其中m和n各自独立地是5至40的整数；X1、X2和X3中的至少一个具有式XIII的结构，其中R8和R9各自是氢，并且不具有式XII的结构的X1、X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；[Am]和[Bn]各自包括至少五个末端2’-O-甲基-核苷酸和至少四个末端硫代磷酸酯键；并且组合的[Am]和[Bn]的至少20％的核苷酸是2’-O-甲基-核苷酸。
实施方案148.如实施方案19-147中任一项所述的方法，其中当寡核苷酸与SERPINA1 mRNA杂交时，X2与SNP rs28929474处的A对齐。
实施方案149.如实施方案1-148中任一项所述的方法，其中所述指导寡核苷酸能够实现SNP rs28929474处A的ADAR介导的腺苷到肌苷的改变。
实施方案150.如实施方案10-149中任一项所述的方法，其中所述治疗包括预防、逆转或减缓选自肝损伤、肝衰竭、肝硬化、黄疸、肺中弹性蛋白过度分解、肺气肿和COPD的至少一种A1AD症状。
实施方案151.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述指导寡核苷酸包含选自表5-19的寡核苷酸或由所述寡核苷酸组成。
实施方案152.一种寡核苷酸，其能够实现作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变或靶RNA，其中所述寡核苷酸包含以下结构：
[Am]-X1-X2-X3-X4-[Bn]
其中A和B各自是核苷酸；
m和n各自独立地是1至50的整数；
X1、X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸，并且X4是2’-氟核苷酸，其中当寡核苷酸与靶RNA杂交时，X2与待脱氨基为肌苷的腺苷相反。
实施方案153.一种寡核苷酸，其包含以下结构：
[Am]-X1-X2-X3-X4-[Bn]
其中A和B各自是核苷酸；
m和n各自独立地是1至50的整数；
X1、X2和X3各自独立地是核苷酸，并且X4选自2’-O-甲基核苷酸和2’-氟核苷酸；
其中X1、X2或X3中的至少一个具有式I-V中任一者的结构：
其中N1是氢或核碱基；
R1是羟基、卤素或C1-C6烷氧基；
R2是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基；
R3是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基；
R4是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基；并且
R5是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基。
实施方案154.如实施方案153所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够实现作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变或靶RNA。
实施方案155.如实施方案153或154所述的寡核苷酸，其中X2与待脱氨基为肌苷的腺苷相反。
实施方案156.如实施方案153至155中任一项所述的寡核苷酸，其中R4是氢并且R5不是氢或羟基，R5是氢并且R4不是氢，或者R5是羟基并且R4不是氢。
实施方案157.如实施方案153至156中任一项所述的寡核苷酸，其中R1是羟基、卤素或OCH3。
实施方案158.如实施方案153至157中任一项所述的寡核苷酸，其中R2是氢。
实施方案159.如实施方案153至158中任一项所述的寡核苷酸，其中X1、X2或X3中的至少一个具有式I、式II或式V的结构；并且X1、X2或X3均不具有式IV或式III的结构。
实施方案160.如实施方案153至159中任一项所述的寡核苷酸，其中X1、X2或X3中的至少一个具有式I或式II的结构；并且X1、X2或X3均不具有式III、式IV或式V的结构。
实施方案161.如实施方案153至160中任一项所述的寡核苷酸，其中所述卤素是氟。
实施方案162.如实施方案153至161中任一项所述的寡核苷酸，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式I的结构，其中R1是氟，并且N1是核碱基。
实施方案163.如实施方案162所述的寡核苷酸，其中X1具有式I的结构，其中R1是氟，并且N1是核碱基。
实施方案164.如实施方案162或163所述的寡核苷酸，其中X2具有式I的结构，其中R1是氟，并且N1是核碱基。
实施方案165.如实施方案162至164中任一项所述的寡核苷酸，其中X3具有式I的结构，其中R1是氟，并且N1是核碱基。
实施方案166.如实施方案153至161中任一项所述的寡核苷酸，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式I的结构，其中R1是羟基，并且N1是核碱基。
实施方案167.如实施方案166所述的寡核苷酸，其中X1具有式I的结构，其中R1是羟基，并且N1是核碱基。
实施方案168.如实施方案166或167所述的寡核苷酸，其中X2具有式I的结构，其中R1是羟基，并且N1是核碱基。
实施方案169.如实施方案166至168中任一项所述的寡核苷酸，其中X3具有式I的结构，其中R1是羟基，并且N1是核碱基。
实施方案170.如实施方案153至161中任一项所述的寡核苷酸，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式I的结构，其中R1是甲氧基，并且N1是核碱基。
实施方案171.如实施方案170所述的寡核苷酸，其中X1具有式I的结构，其中R1是甲氧基，并且N1是核碱基；并且X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
实施方案172.如实施方案170或171所述的寡核苷酸，其中X2具有式I的结构，其中R1是甲氧基，并且N1是核碱基。
实施方案173.如实施方案170至172中任一项所述的寡核苷酸，其中X3具有式I的结构，其中R1是甲氧基，并且N1是核碱基。
实施方案174.如实施方案153至161中任一项所述的寡核苷酸，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式II的结构，其中R2是氢，并且N1是核碱基。
实施方案175.如实施方案174所述的寡核苷酸，其中X2具有式II的结构，其中R2是氢，并且N1是核碱基。
实施方案176.如实施方案153至159中任一项所述的寡核苷酸，其中X1和X2中的至少一个具有式V的结构。
实施方案177.如实施方案176所述的寡核苷酸，其中X2具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是氢。
实施方案178.如实施方案176所述的寡核苷酸，其中X2具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是羟基。
实施方案179.如实施方案176所述的寡核苷酸，其中X1具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是氢。
实施方案180.如实施方案176所述的寡核苷酸，其中X1具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是羟基。
实施方案181.如实施方案176所述的寡核苷酸，其中X2具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是甲氧基。
实施方案182.如实施方案153-181中任一项所述的寡核苷酸，其中不具有式I-V中任一者的结构的X1、X2或X3各自是脱氧核糖核苷酸。
实施方案183.如实施方案153至173和176至182中任一项所述的寡核苷酸，其中X1、X2和X3均不具有式II的结构，其中N1是核碱基。
实施方案184.如实施方案183所述的寡核苷酸，其中X1、X2和X3均不具有式II的结构，其中N1是胞嘧啶核碱基。
实施方案185.如实施方案153至178和181至184中任一项所述的寡核苷酸，其中X1包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基。
实施方案186.如实施方案185所述的寡核苷酸，其中X1包含尿嘧啶核碱基。
实施方案187.如153至178和181至184中任一项所述的寡核苷酸，其中X1包含次黄嘌呤核碱基。
实施方案188.如实施方案153至178和181至184中任一项所述的寡核苷酸，其中X1包含胞嘧啶核碱基。
实施方案189.如实施方案153至188中任一项所述的寡核苷酸，其中X3包含鸟嘌呤核碱基。
实施方案190.如实施方案153至188中任一项所述的寡核苷酸，其中X3包含次黄嘌呤核碱基。
实施方案191.如实施方案153至188中任一项所述的寡核苷酸，其中X3包含腺嘌呤核碱基。
实施方案192.如实施方案153至176、179、180和182至191中任一项所述的寡核苷酸，其中X2包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基。
实施方案193.如实施方案192所述的寡核苷酸，其中X2包含胞嘧啶核碱基。
实施方案194.如实施方案153至158中任一项所述的寡核苷酸，其中X2具有式I-V中任一者的结构。
实施方案195.如实施方案153至194中任一项所述的寡核苷酸，其中X2不是2’-O-甲基-核苷酸。
实施方案196.如实施方案196所述的寡核苷酸，其中X1、X2和X3不是2’-O-甲基-核苷酸。
实施方案197.如实施方案152至196中任一项所述的寡核苷酸，其中[Am]和/或[Bn]的至少80％的核苷酸包括核碱基、糖和核苷间键。
实施方案198.如实施方案152至197中任一项所述的寡核苷酸，其中[Am]包含至少一个核酸酶抗性核苷酸。
实施方案199.如实施方案152至198中任一项所述的寡核苷酸，其中[Am]包含至少一个2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、至少一个2′-氨基-核苷酸、至少一个阿拉伯核酸-核苷酸、至少一个双环-核苷酸、至少一个2′-F-核苷酸、至少一个2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、至少一个限制性乙基(cEt)-核苷酸、至少一个LNA-核苷酸和/或至少一个脱氧核糖核苷酸。
实施方案200.如实施方案199所述的寡核苷酸，其中[Am]包含至少一个2’-O-甲基-核苷酸、至少一个2’-F-核苷酸、至少一个2’-O-甲氧基乙基-核苷酸、至少一个cEt-核苷酸、至少一个LNA-核苷酸和/或至少一个脱氧核糖核苷酸。
实施方案201.如实施方案152至200中任一项所述的寡核苷酸，其中[Am]包含至少五个末端2’-O-甲基-核苷酸。
实施方案202.如实施方案152至201中任一项所述的寡核苷酸，其中[Am]包含至少一个硫代磷酸酯键。
实施方案203.如实施方案152至202中任一项所述的寡核苷酸，其中[Am]包含至少四个末端硫代磷酸酯键。
实施方案204.如实施方案202或实施方案203所述的寡核苷酸，其中至少一个硫代磷酸酯键是立体纯的。
实施方案205.如实施方案152至204中任一项所述的寡核苷酸，其中[Bn]包含至少一个核酸酶抗性核苷酸。
实施方案206.如实施方案152至205中任一项所述的寡核苷酸，其中[Bn]包含至少一个2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、至少一个2′-氨基-核苷酸、至少一个阿拉伯核酸-核苷酸、至少一个双环-核苷酸、至少一个2′-F-核苷酸、至少一个2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、至少一个cEt-核苷酸、至少一个LNA-核苷酸和/或至少一个脱氧核糖核苷酸。
实施方案207.如实施方案206所述的寡核苷酸，其中[Bn]包含至少一个2’-O-甲基-核苷酸、至少一个2’-F-核苷酸、至少一个2’-O-甲氧基乙基-核苷酸、至少一个cEt-核苷酸、至少一个LNA-核苷酸和/或至少一个脱氧核糖核苷酸。
实施方案208.如实施方案152至207中任一项所述的寡核苷酸，其中[Bn]包含至少五个末端2’-O-甲基-核苷酸。
实施方案209.如实施方案152至208中任一项所述的寡核苷酸，其中[Bn]包含至少一个硫代磷酸酯键。
实施方案210.如实施方案152至209中任一项所述的寡核苷酸，其中[Bn]包含至少四个末端硫代磷酸酯键。
实施方案211.如实施方案209或实施方案210所述的寡核苷酸，其中至少一个硫代磷酸酯键是立体纯的。
实施方案212.如实施方案152至208中任一项所述的寡核苷酸，其中组合的[Am]和[Bn]的至少20％的核苷酸是2’-O-甲基-核苷酸。
实施方案213.如实施方案152至212中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸还包含5’-帽结构。
实施方案214.如实施方案152至213中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个替代性核碱基。
实施方案215.如实施方案152至214中任一项所述的寡核苷酸，其中所述5’-末端核苷酸是2’-氨基-核苷酸。
实施方案216.如实施方案152至215中任一项所述的寡核苷酸，其中组合的A和B由18至80个核苷酸组成。
实施方案217.如实施方案152至216中任一项所述的寡核苷酸，其中m是5至40。
实施方案218.如实施方案152至217中任一项所述的寡核苷酸，其中n是5至40。
实施方案219.如实施方案152至218中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸还包含一种或多种作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)-募集结构域。
实施方案220.如实施方案152至219中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够实现与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变。
实施方案221.如实施方案220所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含与SERPINA1 mRNA序列互补的核酸序列，所述SERPINA1mRNA序列包含与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP。
实施方案222.如实施方案221所述的寡核苷酸，其中所述SNP是rs28929474(A)。
实施方案223.如实施方案222所述的寡核苷酸，其中所述SERPINA1 mRNA编码包含致病性氨基酸的SERPINA1蛋白，所述致病性氨基酸包含由所述SNP导致的位置342处的赖氨酸。
实施方案224.如实施方案222或实施方案223所述的寡核苷酸，其中当所述寡核苷酸与SERPINA1 mRNA杂交时，X2与SNP rs28929474处的A对齐。
实施方案225.如实施方案220至224中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够实现SNP rs28929474处A的ADAR介导的腺苷到肌苷的改变。
实施方案226.一种缀合物，其包含如实施方案152-225中任一项所述的寡核苷酸与靶向部分的缀合物。
实施方案227.如实施方案226所述的缀合物，其中所述靶向部分是脂质、甾醇、碳水化合物和/或肽。
实施方案228.一种复合物，其包含：
如实施方案152至225中任一项所述的寡核苷酸或如实施方案226或227所述的缀合物；和
mRNA，
其中所述寡核苷酸或缀合物和mRNA彼此杂交，并且所述复合物在所述mRNA的腺苷处包含第一个错配。
实施方案229.如实施方案228所述的复合物，其中所述复合物包括第二个错配，所述第二个错配是第一个错配的5’的四个核苷酸。
实施方案230.如实施方案228或229所述的复合物，其中所述复合物包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个错配。
实施方案231.如实施方案228至230中任一项所述的复合物，其中所述mRNA包含可被脱氨基以产生治疗结果的腺苷。
实施方案232.如实施方案228至230中任一项所述的复合物，其中与相应的天然mRNA相比，所述mRNA包括鸟苷到腺苷的突变。
实施方案233.如实施方案232所述的复合物，其中所述鸟苷到腺苷的突变是错义或无义突变。
实施方案234.如实施方案228至233中任一项所述的复合物，其中所述第一个错配位于所述mRNA的起始密码子中的腺苷处。
实施方案235.如实施方案228至233中任一项所述的复合物，其中所述第一个错配位于所述mRNA的终止密码子中的腺苷处。
实施方案236.如实施方案235所述的复合物，其中所述终止密码子是提前终止密码子。
实施方案237.一种产生如实施方案228至236中任一项所述的复合物的方法，所述方法包括使细胞与如实施方案152-225中任一项所述的寡核苷酸或如实施方案226或227所述的缀合物接触。
实施方案238.一种用于使mRNA中的腺苷脱氨基的方法，所述方法包括使细胞与如实施方案152-225中任一项所述的寡核苷酸或如实施方案226或227所述的缀合物接触。
实施方案239.一种治疗有需要的受试者的病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如实施方案152-226中任一项所述的寡核苷酸或如实施方案226或227所述的缀合物。
实施方案240.一种编辑SERPINA1多核苷酸的方法，所述SERPINA1多核苷酸包含与可能导致肝衰竭或肺气肿的α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的单核苷酸多态性(SNP)，所述方法包括使所述SERPINA1多核苷酸与如实施方案220-225中任一项所述的寡核苷酸或如实施方案226或实施方案227所述的缀合物接触，从而编辑所述SERPINA1多核苷酸。
实施方案241.如实施方案240所述的方法，其中所述SERPINA1多核苷酸与所述指导寡核苷酸在细胞中接触。
实施方案242.如实施方案241所述的方法，其中所述细胞内源性表达ADAR。
实施方案243.如实施方案242所述的方法，其中所述ADAR是人ADAR。
实施方案244.如实施方案243所述的方法，其中所述ADAR是人ADAR1。
实施方案245.如实施方案243所述的方法，其中所述ADAR是人ADAR2。
实施方案246.如实施方案241-245中任一项所述的方法，其中所述细胞选自真核细胞、哺乳动物细胞和人细胞。
实施方案247.如实施方案241-246中任一项所述的方法，其中所述细胞是体内的。
实施方案248.如实施方案241-246中任一项所述的方法，其中所述细胞是离体的。
实施方案249.一种治疗有需要的受试者的α1抗胰蛋白酶缺乏症的方法，所述方法包括
鉴定在SERPINA1多核苷酸中具有与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的单核苷酸多态性(SNP)的受试者；
使所述受试者的细胞中的所述SERPINA1多核苷酸与如实施方案220-225中任一项所述的寡核苷酸或如实施方案226或实施方案227所述的缀合物接触，从而治疗所述受试者。
实施方案250.一种治疗有需要的受试者的α1抗胰蛋白酶缺乏症的方法，所述方法包括
鉴定在SERPINA1多核苷酸中具有与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的单核苷酸多态性(SNP)的受试者；
使细胞中的所述SERPINA1多核苷酸与如实施方案220-225中任一项所述的寡核苷酸或如实施方案226或实施方案227所述的缀合物接触，以及
向所述受试者施用所述细胞，从而治疗所述受试者。
实施方案251.如实施方案250所述的方法，其中所述细胞对于受试者是自体的、同种异体的或异种的。
实施方案252.如实施方案249-251中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
实施方案253.如实施方案240-252中任一项所述的方法，其中所述指导寡核苷酸包含与SERPINA1 mRNA序列互补的核酸序列，所述SERPINA1 mRNA序列包含与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP。
实施方案254.如实施方案240-253中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸还包含一种或多种作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)-募集结构域。
实施方案255.如实施方案240-254中任一项所述的方法，其中所述SERPINA1多核苷酸编码包含致病性氨基酸的SERPINA1蛋白，所述致病性氨基酸包含由SNP导致的位置342处的赖氨酸。
实施方案256.如实施方案255所述的方法，其中腺苷到肌苷的改变用野生型氨基酸取代致病性氨基酸。
实施方案257.如实施方案256所述的方法，其中位置342处的野生型氨基酸包含谷氨酸。
附图简要说明
图1示出了在+2和-2位置处包含各种核苷酸修饰的指导寡核苷酸在两种不同浓度下进行靶mRNA编辑的灵敏度。对于每组条，顶部条是100nM指导寡核苷酸，并且底部条是10nM指导寡核苷酸。
具体实施方式
本发明提供了编辑SERPINA1多核苷酸例如包含与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的单核苷酸多态性(SNP)的SERPINA1多核苷酸的方法，以及用于使用指导寡核苷酸治疗或预防受试者的SERPINA1相关疾病及其症状例如α1抗胰蛋白酶缺乏症的方法，所述指导寡核苷酸能够实现靶基因中作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变，例如与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的ADAR介导的腺苷到肌苷的改变。在一些实施方案中，校正基因中的致病性突变的脱氨基作用逆转了E342K突变，从而恢复谷氨酸并逆转和/或减缓由α1抗胰蛋白酶缺乏症引起的肝和/或肺症状。
以下详细描述公开了用于使用能够实现ADAR介导的腺苷到肌苷的改变的指导寡核苷酸编辑SERPINA1多核苷酸的方法，如何制备和使用含有能够实现ADAR介导的腺苷到肌苷的改变的指导寡核苷酸的组合物，以及用于治疗患有将受益于SERPINA1基因序列的编辑的SERPINA1相关疾病的受试者的组合物、用途和方法。
I.定义.
为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。此外，应该注意的是，每当引用参数的值或值的范围时，预期介于所陈述值之间的值和范围也意图是本发明的一部分。
冠词“一个/种(a/an)”在本文中用于指代一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)所述冠词的语法对象。举例来说，“一个元素”意味着一个元素或多于一个元素，例如多个元素。
术语“包括”在本文中用于意指短语“包括但不限于”，并与其可互换使用。
除非上下文清楚地相反地指出，否则术语“或”在本文中意指术语“和/或”，并且与术语“和/或”可互换使用。
术语“约”在本文中用于意指在本领域的典型公差范围内，例如，可接受的剂量之间的时间变化、可接受的剂量单位量的变化。例如，“约”可以理解为在平均值的约2个标准偏差之内。在某些实施方案中，约意指+10％。在某些实施方案中，约意指+5％。当约出现在一系列数字或范围之前时，应理解为“约”可以修饰所述系列或范围中的每个数字。
在一个数字或一系列数字之前的术语“至少”被理解为包括与术语“至少”相邻的数字以及逻辑上可被包括的所有后续数字或整数，如从上下文中清楚可见的。例如，核酸分子中的核苷酸数量必须是整数。例如，“21个核苷酸核酸分子中的至少18个核苷酸的”意指18、19、20或21个核苷酸具有所示的性质。当至少出现在一系列数字或范围之前时，应理解“至少”可以修饰所述系列或范围中的每个数字。
如本文所用，“不大于”或“小于”被理解为与短语和逻辑低值或整数相邻的值，从上下文来看在逻辑上是零。例如，具有“不超过5个未修饰的核苷酸”的寡核苷酸具有5、4、3、2、1或0个未修饰的核苷酸。当“不大于”出现在一系列数字或范围之前时，应理解为“不大于”可以修饰所述系列或范围中的每个数字。
如本文所用，“SERPINA1”或“丝氨酸蛋白酶抑制剂家族A成员1”是指熟知的基因和蛋白质。SERPINA1也称为PI、A1A、AAT、PI1、A1AT、nNIF、PRO2275和α1AT。最常见的致病性AAT变体是Z(Glu342Lys)，它导致AAT在肝细胞和其他产生AAT的细胞内错误折叠和聚合。人SERPINA1 mRNA转录物的序列可在国家生物技术信息中心(NCBI)RefSeq登记号NM_000295.5处找到，并且A1AT前体的编码蛋白序列可在NP_000286.3处找到。SERPINA1 mRNA序列的其他实例可使用公开获得的数据库容易地获得，例如GenBank、UniProt和OMIM。
如本文所用，“SERPINA1相关疾病”旨在包括与SERPINA1基因或蛋白相关的任何疾病。这种疾病可能由例如SERPINA1基因突变、SERPINA1蛋白的过量产生、SERPINA1蛋白的异常裂解、SERPINA1四聚体的不稳定性、SERPINA1与其他蛋白质或其他内源性或外源性物质之间的异常相互作用引起。在一些实施方案中，“SERPINA1相关疾病”是α1抗胰蛋白酶缺乏症(A1AD)。A1AD的非限制性示例性症状包括肝硬化、肝性脑病、腹水、黄疸、COPD、肺气肿、支气管扩张、哮喘、体力活动后的气短、体重减轻、视力改变、疲劳、反复呼吸道感染、站立时的心跳加速和/或桶状胸部。在一些实施方案中，A1AD导致肝衰竭和/或肺气肿和/或COPD。
如本文所用，术语“单核苷酸多态性(SNP)”是指个体间DNA序列中单个位置的变异。如果超过1％的人群在DNA序列的特定位置没有携带相同的核苷酸，那么这种变异可以被归类为SNP。如果SNP发生在基因内，那么所述基因被描述为具有超过一个的等位基因。在这些情况下，SNP可能导致氨基酸序列的变异。例如，在人基因组中的特定碱基位置处，C核苷酸可以出现在大多数个体中，但在少数个体中，所述位置被A占据。这意味着在该特定位置处存在SNP，并且两种可能的核苷酸变异C或A是该位置的两个等位基因。
SNP可以位于基因的编码区、基因的非编码区或基因间区(基因之间的区域)。在一些实施方案中，由于遗传密码的简并性，编码序列中的SNP不一定改变所产生的蛋白质的氨基酸序列。编码区的SNP有两种类型：同义SNP和非同义SNP。同义SNP不影响蛋白质序列，而非同义SNP改变蛋白质的氨基酸序列。非同义SNP有两种类型：错义和无义。不在蛋白质编码区的SNP仍可以影响基因剪接、转录因子结合、信使RNA降解或非编码RNA序列。受这种类型的SNP影响的基因表达被称为eSNP(表达SNP)并且可以在基因的上游或下游。单核苷酸变体是没有任何频率限制的单个核苷酸变异，并且可以在体细胞中出现。体细胞单核苷酸变异也可以称为单核苷酸改变。
虽然特异性SNP可能不会导致病症，但一些SNP与某些疾病有关。这些相关性允许使用特异性SNP来评估个体发生疾病的遗传倾向。此外，如果已知某些SNP与某一性状相关，那么检查这些SNP附近的某些DNA片段将有助于鉴定负责所述性状的基因。
如本文所用，短语“与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP”是指与α1抗胰蛋白酶缺乏症的发作或发展相关的任何SNP。与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的示例性SNP可包括但不限于SERPINA1多核苷酸中导致SERPINA1蛋白位置342处的致病性氨基酸的任何单核苷酸变化。在一些实施方案中，与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP是rs28929474，其有时被称为“Pi-Z”等位基因。SNP rs28929474(A)与导致A1AD的Glu342Lys病理变体相关。
术语“致病性氨基酸”是指蛋白质中非野生型氨基酸的并导致发病机理的任何氨基酸。
术语“致病性突变”、“致病变体”、“导致疾病的突变”、“导致疾病的变体”或“有害突变”是指增加个体对某种疾病或病症的易感性或倾向的遗传改变或突变。在一些实施方案中，致病性突变包含由基因编码的蛋白质中的至少一个致病性氨基酸取代的至少一个野生型氨基酸。
如本文所用，术语“腺苷脱氨酶”是指能够催化腺嘌呤或腺苷水解脱氨基的多肽或其片段。在一些实施方案中，脱氨酶或脱氨酶结构域是催化腺苷水解脱氨基为肌苷或催化脱氧腺苷水解脱氨基为脱氧肌苷的腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶催化脱氧核糖核酸(DNA)中腺嘌呤或腺苷的水解脱氨基。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶催化核糖核酸(RNA)中腺嘌呤或腺苷的水解脱氨基。腺苷脱氨酶可以来自任何生物体，例如人、黑猩猩、大猩猩、猴、牛、狗、大鼠或小鼠。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶来自细菌，例如大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、伤寒沙门氏菌(S.typhi)、腐败希瓦氏菌(S.putrefaciens)、流感嗜血杆菌(H.influenzae)或新月柄杆菌(C.crescentus)。在一些实施方案中，脱氨酶或脱氨酶结构域是来自生物体，例如人、黑猩猩、大猩猩、猴、牛、狗、大鼠或小鼠的天然存在的脱氨酶的变体。在一些实施方案中，脱氨酶或脱氨酶结构域不是天然存在的。例如，在一些实施方案中，脱氨酶或脱氨酶结构域与天然存在的脱氨酶具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％同一性。例如，脱氨酶结构域描述于国际PCT申请号PCT/2017/045381(WO 2018/027078)和PCT/US2016/058344(WO 2017/070632)中，所述申请各自以引用方式整体并入本文。还参见Komor，A.C.等人，Nature533，420-424(2016)；Gaμdelli，N.M.等人，Nature 551，464-471(2017)；Komor，A.C.等人，ScienceAdvances 3：eaao4774(2017)；以及Rees，H.A.等人，Nat Rev Genet.2018；19(12)：770-788.doi：10.1038/s41576-018-0059-1，所述文献的整体内容以引用方式整体并入本文。
如本文所用，术语“作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)”是指能够识别双链RNA(dsRNA)的某些结构基序、与dsRNA结合并通过脱氨基作用将腺苷转化为肌苷，从而导致氨基酸密码子的重新编码的编辑酶，所述重新编码可导致所编码的蛋白质及其功能的改变。编辑位点周围的核碱基，尤其是紧接编辑位点5’端的一个核碱基和紧接编辑位点3’端的一个核碱基(它们与编辑位点一起被称为三联体)在腺苷脱氨基作用中起重要作用。对于相对于编辑位点的5′位置的U和3′位置的G的偏好，从由过表达的人ADAR2和ADAR1有效编辑的酵母RNA的分析中揭示。(参见Wang等人，(2018)Biochemistry，57：1640-1651；Eifler等人，(2013)Biochemistry，52：7857-7869；以及Eggington等人，(2011)Nat.Commun.，319：1-9。)存在三种已知在人体内表达的ADAR蛋白质ADAR1、ADAR2和ADAR3。ADAR1和ADAR2在全身表达，而ADAR3仅在大脑中表达。ADAR1和ADAR2具有催化活性，而ADAR3被认为是无活性的。将ADAR募集到选定转录物的特定位点以及腺苷脱氨基而不考虑邻近的碱基，为疾病的治疗带来了巨大的希望。
如本文所用，术语“ADAR募集结构域”是指可以是本发明的寡核苷酸的一部分并且能够募集ADAR酶的核苷酸序列。例如，此类募集结构域可以形成茎环结构，所述结构充当ADAR酶的募集和结合区域。包含此类ADAR募集结构域的寡核苷酸可被称为“axiomer AON”或“自环AON”ADAR募集结构域部分可以用于募集细胞中存在的内源性ADAR酶。此类ADAR募集结构域不需要缀合实体或存在修饰的重组ADAR酶。或者，ADAR募集部分可以用于募集重组ADAR融合蛋白，所述重组ADAR融合蛋白已经通过包含编码ADAR融合蛋白的多核苷酸的表达载体构建体递送至细胞或受试者。此类ADAR-融合蛋白可以包含ADAR1或ADAR2酶的脱氨酶结构域与另一种蛋白质例如MS2噬菌体外壳蛋白的融合物。ADAR募集结构域可以是基于天然底物的核苷酸序列(例如GluR2受体前体mRNA；例如GluR2 ADAR募集结构域)、Z-DNA结构或已知募集作为ADAR融合蛋白的一部分的另一种蛋白质的结构域，例如已知被ADAR的dsRNA结合区识别的MS2 ADAR募集结构域。ADAR募集结构域的茎环结构可以是由两条分开的核酸链形成的分子间茎环结构，或者是在单个核酸链内形成的分子内茎环结构。
如本文所用，术语“Z-DNA”指DNA双螺旋或RNA茎环结构的左旋构象。此类DNA或dsRNA螺旋以之字形向左侧缠绕(与右侧相反，如更常见的B-DNA形式)。Z-DNA是已知的高亲和力ADAR结合底物，并已显示与人ADAR1酶结合。
“G”、“C”、“A”、“T”和“U”各自通常分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷和尿嘧啶作为碱基的天然存在的核苷酸。然而，应当理解，术语“核苷酸”也可以是指如下文进一步详述的替代性核苷酸或者替代的置换部分。技术人员很清楚，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其他部分置换，而基本上不改变包含携带这种置换部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对性质。例如但不限于，包含次黄嘌呤作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此，在本发明的寡核苷酸的核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以被含有例如次黄嘌呤的核苷酸置换。在另一个实例中，寡核苷酸中任何地方的腺嘌呤和胞嘧啶可以分别被鸟嘌呤和尿嘧啶置换，以形成与靶mRNA的G-U摇摆碱基配对。含有此类置换部分的序列适用于本发明的组合物和方法。
术语“核碱基”和“碱基”包括存在于在核酸杂交中形成氢键的核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分。在本发明的上下文中，术语核碱基还包括替代性核碱基，其可能不同于天然存在的核碱基，但在核酸杂交期间是功能性的。在本文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶核苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及替代性核碱基。此类变体例如描述于Hirao等人(2012)Accounts ofChemical Research第45卷，第2055页以及Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry增补版37第1章，第4.1单元。
在一些实施方案中，通过将嘌呤或嘧啶改变成修饰的嘌呤或嘧啶，例如取代的嘌呤或取代的嘧啶来修饰核碱基部分，例如选自以下的“替代性核碱基”：异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑-尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2′-硫代-胸腺嘧啶、次黄嘌呤、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6--二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
核碱基部分可以由每个相应核碱基的字母代码表示，例如A、T、G、C或U，其中每个字母可以任选地包括功能等同的替代性核碱基。
“糖”或“糖部分”包括具有呋喃糖环的天然存在的糖。糖还包括“替代性糖”，其被定义为能够置换核苷呋喃糖环的结构。在某些实施方案中，替代性糖是非呋喃糖(或4′-取代的呋喃糖)环或环系统或开放系统。此类结构包含相对于天然呋喃糖环诸如六元环的简单变化，或者可以更复杂，如肽核酸中使用的非环系统的情况。替代性糖也可包括糖替代物，其中呋喃糖环已被另一个环系统，例如吗啉代或己糖醇环系统置换。可用于制备具有基序的寡核苷酸的糖部分包括但不限于β-D-核糖、p-D-2′-脱氧核糖、取代糖(例如2′，5′和双取代糖)、4′-S-糖(例如4′-S-核糖、4′-S-2′-脱氧核糖和4′-S-2′-取代核糖)、双环替代性糖(例如2′-O-CH2-4′或2′-O-(CH2)2-4′桥接核糖衍生性双环糖)和糖替代品(诸如当核糖环被吗啉代或己糖醇环系统置换时)。在每个位置使用的杂环碱基和核苷间键的类型是可变的，并且不是决定基序的因素。在大多数具有替代性糖部分的核苷中，通常保持杂环核碱基以允许杂交。
如本文所用，“核苷酸”是指寡核苷酸或多核苷酸的单体单元，其包括核苷和核苷间键。核苷间键可以包括或不包括磷酸酯键。类似地，“连接的核苷”可以通过或不通过磷酸键连接。本领域已知许多“替代性核苷间连接”，包括但不限于硫代磷酸酯键和硼代磷酸酯键。替代性核苷包括双环核苷(BNA)(例如锁式核苷(LNA)和限制性乙基(cEt)核苷)、肽核苷(PNA)、磷酸三酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和天然核苷的磷酸主链的其他变体，包括本文所述的那些。
如本文所用，“替代性核苷酸”是指具有替代性核碱基或替代性糖以及核苷间键的核苷酸，所述核苷间键可以包括替代性核苷键。
术语“核苷”是指具有核碱基和糖部分的寡核苷酸或多核苷酸的单体单元。核苷可以包括天然存在的核苷以及替代性核苷，例如本文所述的核苷。核苷的核碱基可以是天然存在的核碱基或替代性核碱基。类似地，核苷的糖部分可以是天然存在的糖或替代性糖。
术语“替代性核苷”是指具有替代性糖或替代性核碱基的核苷，诸如本文所述的那些。
如本文所用，术语“核酸酶抗性核苷酸”是指限制寡核苷酸的核酸酶降解的核苷酸。核酸酶抗性核苷酸通常通过作为核酸酶的不良底物来增加寡核苷酸的稳定性。核酸酶抗性核苷酸是本领域中已知的，例如2’-O-甲基-核苷酸和2’-氟-核苷酸。
如本文所用，术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”如技术人员通常理解的，被定义为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。此类共价结合的核苷也可以称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成接着纯化来制备。当提及寡核苷酸序列时，是指共价连接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸可以是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化的或分离的。寡核苷酸还旨在包括(i)具有一个或多个呋喃糖部分的化合物，所述呋喃糖部分被可用作碱基部分的共价连接点的呋喃糖衍生物或任何环状或非环状结构置换，(ii)具有一个或多个磷酸二酯键的化合物，所述磷酸二酯键被修饰，如在氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键的情况下，或完全被合适的连接部分置换，如在甲醛或核糖缩醛键的情况下，和/或(iii)具有一个或多个连接的呋喃糖-磷酸二酯键部分的化合物，所述呋喃糖-磷酸二酯键部分被可用作碱基部分的共价连接点的任何环状或非环状结构置换。本发明的寡核苷酸可以包含一个或多个替代性核苷或核苷酸(例如，包括本文所述的那些)。还应理解，寡核苷酸包含缺少糖部分或核碱基但仍能够与靶序列配对或杂交的组合物。
“寡核苷酸”是指短多核苷酸(例如，100个或更少的连接的核苷)。
短语“能够实现作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变的寡核苷酸”或“能够实现ADAR介导的腺苷到肌苷的改变的指导寡核苷酸”是指对靶序列具有特异性并能够通过ADAR介导的途径用于靶序列中特异性腺苷的脱氨基反应的寡核苷酸。寡核苷酸可以包含与靶序列，例如包含与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的SERPINA1 mRNA序列互补的核酸序列。在一些实施方案中，除了至少一个错配之外，寡核苷酸可以包含与靶mRNA互补的核酸序列。寡核苷酸包含与靶腺苷相反的错配。在一些实施方案中，用于本发明的方法中的寡核苷酸不包括通过本领域已知的任何其他基因编辑技术例如CRISPR使用的寡核苷酸。
寡核苷酸可以具有任何长度，并且长度范围可以是约10-100碱基，例如长度为约15-100个碱基或长度为约18-100个碱基，例如长度约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个碱基，诸如长度约15-50、15-49、15-48、15-47、15-46、15-45、15-44、15-43、15-42、15-41、15-40、15-39、15-38、15-37、15-36、15-35、15-34、15-33、15-32、15-31、15-31、15-30、18-50、18-49、18-48、18-47、18-46、18-45、18-44、18-43、18-42、18-41、18-40、18-39、18-38、18-37、18-36、18-35、18-34、18-33、18-32、18-31、18-31、18-30、19-50、19-49、19-48、19-47、19-46、19-45、19-44、19-43、19-42、19-41、19-40、19-39、19-38、19-37、19-36、19-35、19-34、19-33、19-32、19-31、19-31、19-30、20-50、20-49、20-48、20-47、20-46、20-45、20-44，20-43、20-42、20-41、20-40、20-39、20-38、20-37、20-36、20-35、20-34、20-33、20-32、20-31、20-31、20-30、21-50、21-49、21-48、21-47、21-46、21-45、21-44、21-43、21-42、21-41、21-40、21-39、21-38、21-37、21-36、21-35、21-34、21-33、21-32、21-31、21-31或21-30个碱基。介于上述范围和长度之间的范围和长度也被认为是本发明的一部分。
术语“接头”或“连接基团”是两个原子之间的连接，其通过一个或多个共价键将一个感兴趣的化学基团或片段连接到另一个感兴趣的化学基团或片段。缀合物部分可以直接或通过连接部分(例如接头或系链)连接到寡核苷酸。接头用于将第三区域，例如缀合物部分共价连接到寡核苷酸(例如区域A或C的末端)。在本发明的一些实施方案中，本发明的缀合物或寡核苷酸缀合物可以任选地包含位于寡核苷酸和缀合物部分之间的接头区域。在一些实施方案中，缀合物和寡核苷酸之间的接头是生物可裂解的。含有磷酸二酯的生物可裂解接头更详细地描述于WO 2014/076195(以引用方式并入本文)中。
“互补”多核苷酸是能够根据标准沃森-克里克(Watson-Crick)互补规则进行碱基配对的那些多核苷酸。具体来说，嘌呤将与嘧啶发生碱基配对，以在DNA的情况下形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G：C)和腺嘌呤与胸腺嘧啶配对(A：T)的组合，或在RNA的情况下形成腺嘌呤与尿嘧啶配对(A：U)。应当理解，两个多核苷酸可以彼此杂交，即使它们彼此不完全互补，只要每个多核苷酸具有至少一个彼此基本上互补的区域。本文所述的寡核苷酸和靶序列之间的互补序列包括在一个或两个核苷酸序列的全长上，包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸的碱基配对。此类序列在本文中可被认为彼此“完全互补”。然而，当本文中第一序列被认为相对于第二序列“基本上互补”时，这两个序列可以是完全互补的，或者它们可以在对于多至30个碱基对的双链体进行杂交时形成一个或多个，但通常不超过5、4、3或2个错配的碱基对，同时保留在与其最终应用最相关的条件下杂交的能力，例如腺苷的脱氨基作用。“基本上互补”也可以是指与感兴趣的mRNA(例如，具有靶腺苷的mRNA)的连续部分基本上互补的多核苷酸。例如，如果序列与感兴趣的mRNA的非中断部分基本上互补，则多核苷酸与感兴趣的mRNA的至少一部分互补。在一些实施方案中，寡核苷酸或寡核苷酸部分与参考序列(例如，靶序列)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％互补。在此类实施方案中，互补性百分比是在寡核苷酸或其部分的长度上计算的。
如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“互补”当用于描述与第二核苷酸或核苷序列相关的第一核苷酸或核苷序列时，是指包含第一核苷酸或核苷序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力，如本领域技术人员应理解的。此类条件可以是例如严格条件，其中严格条件可以包括：400mMNaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA、50℃或70℃、12-16小时，然后洗涤(参见例如″Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook，等人(1989)Cold SpringHarbor LaboratoryPress)。可以应用其他条件，例如在生物体内可能遇到的生理相关条件。根据杂交核苷酸或核苷的最终应用，技术人员将能够确定一组最适合于两个序列的互补性测试的条件。
如本文所用，术语“变体”和“衍生物”可互换使用，并且是指本文所述的化合物、肽、蛋白质或其他物质的天然存在的、合成的和半合成的类似物。本文所述的化合物、肽、蛋白质或其他物质的变体或衍生物可以保留或提高原始材料的生物活性。
如本文所用，术语“突变”是指序列例如核酸或氨基酸序列内的残基被另一个残基取代或者序列中一个或多个残基的缺失或插入。突变在本文中通常通过识别原始残基，随后通过残基在序列中的位置和新取代的残基的身份来描述。用于进行本文提供的氨基酸取代(突变)的各种方法是本领域熟知的，并由例如Green and Sambrook，MolecularCloning：A Laboratory Manual(第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpringHarbor，N.Y.(2012))。在一些实施方案中，本发明公开的组合物可以有效地在核酸(例如，受试者基因组内的核酸)中产生“预期突变”，例如点突变，而不产生大量的非预期突变，例如非预期点突变。在一些实施方案中，预期突变是由特定指导寡核苷酸产生的突变，所述特定指导寡核苷酸被特别设计来产生预期突变。通常，对相对于参考(或野生型)序列(即不含所述突变的序列)在序列(例如，如本文所述的氨基酸序列)中产生或鉴定的突变进行编号。本领域技术人员将容易理解如何确定氨基酸和核酸序列相对于参考序列的突变位置。
如本文所用，术语“接触”包括通过任何方式接触靶基因，例如SERPINA1。在一些实施方案中，靶基因与指导寡核苷酸在细胞中接触。使细胞中的SERPINA1多核苷酸与指导寡核苷酸接触包括使细胞中的SERPINA1多核苷酸在体外与指导寡核苷酸接触，或使细胞中的SERPINA1多核苷酸在体内与指导寡核苷酸接触。
体外接触细胞可以通过例如将细胞与指导寡核苷酸一起孵育来完成。体内接触细胞可以通过例如将指导寡核苷酸注射到细胞所在的组织中或其附近，或通过将指导寡核苷酸剂注射到另一个区域例如血流或皮下空间，使得剂随后将到达待接触细胞所在的组织。例如，指导寡核苷酸可以包含和/或偶联到配体，所述配体将寡核苷酸引导到感兴趣位点。体外和体内接触方法的组合也是可能的。例如，细胞也可以在体外与指导寡核苷酸接触，然后移植到受试者体内。
在一个实施方案中，使细胞与指导寡核苷酸接触包括通过促进或实现细胞的摄取或吸收来“将寡核苷酸引入或递送到细胞中”。指导寡核苷酸的吸收或摄取可通过独立的扩散或活性细胞过程，或通过助剂或装置发生。将指导寡核苷酸引入细胞中可以是在体外和/或体内进行的。例如，对于体内引入，可以将寡核苷酸注射到组织部位或全身施用。体外引入细胞包括本领域已知的方法，诸如电穿孔和脂转染。另外的方法在下文中描述和/或是本领域中已知的。
如本文所用，“脂质纳米颗粒”或“LNP”是包括包封药物活性分子，例如核酸分子，例如寡核苷酸的脂质层的囊泡。LNP是指稳定的核酸-脂质颗粒。LNP通常含有阳离子、可电离的脂质、非阳离子脂质和防止颗粒聚集的脂质(例如，PEG-脂质缀合物)。LNP描述于例如美国专利号6,858,225；6,815,432；8,158,601；和8,058,069中，所述专利的全部内容特此以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“脂质体”是指由排列在至少一个双层例如一个双层或多个双层中的两亲性脂质组成的囊泡。脂质体包括单层和多层囊泡，其具有由亲脂性材料形成的膜和水性内部。水性部分含有寡核苷酸组合物。亲脂性材料将水性内部与水性外部隔离，所述水性外部通常不包含寡核苷酸组合物，尽管在一些实例中，它可以包含。脂质体还包括“空间稳定的”脂质体，如本文所用，术语“空间稳定的”脂质体是指包含一种或多种特化脂质的脂质体，所述特化脂质当掺入脂质体时，相对于缺乏此类特定脂质的脂质体，导致循环寿命延长。
“胶束”在本文中被定义为一种特殊类型的分子组装体，其中两亲性分子以球形结构排列，使得分子的所有疏水部分都指向内部，从而使得亲水部分与周围的水相接触。如果环境是疏水性的，则存在相反的排列。
“确定蛋白质的水平”意指通过本领域已知的方法直接或间接检测蛋白质或编码蛋白质的mRNA。“直接确定”意指执行过程(例如，对样品执行测定或测试或“分析样品”，如该术语在本文中定义的)以获得物理实体或值。“间接确定”是指从另一方或来源(例如，直接获得物理实体或值的第三方实验室)接收物理实体或值。测量蛋白质水平的方法通常包括但不限于蛋白质印迹、免疫印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀、免疫荧光、表面等离子体共振、化学发光、荧光偏振、磷光、免疫组织化学分析、基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱、液相色谱(LC)-质谱、微量细胞计数、显微镜、荧光激活细胞分选(FACS)和流式细胞仪，以及基于蛋白质的性质(包括但不限于酶促活性或与其他蛋白质配位体的相互作用)的测定。测量mRNA水平的方法是本领域已知的。
关于参考多核苷酸或多肽序列的“序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并在必要时引入缺口以达到最大序列同一性百分比之后，候选序列中的核酸或氨基酸与参考多核苷酸或多肽序列中的核酸或氨基酸相同的百分比。用于确定核酸或氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术人员能力范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2或Megalign软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，可以使用序列比较计算机程序BLAST产生序列同一性百分比值。作为说明，给定核酸或氨基酸序列A与给定核酸或氨基酸序列B的序列同一性百分比(或者可以表述为给定核酸或氨基酸序列A与给定核酸或氨基酸序列B具有一定的序列同一性百分比)计算如下：
100乘以(分数X/Y)
其中X是由序列比对程序(例如BLAST)在该程序的A和B的比对中记为相同匹配的核苷酸或氨基酸的数目，并且其中Y是B中核酸的总数。应当理解，当核酸或氨基酸序列A的长度不等于核酸或氨基酸序列B的长度时，A与B的序列同一性百分比将不等于B与A的序列同一性百分比。
“水平”意指与参考相比，蛋白质或编码蛋白质的mRNA的水平或活性。参考可以是本文定义的任何有用的参考。蛋白质的“降低的水平”或“增加的水平”意指与参考相比蛋白质水平的降低或增加(例如，与参考相比降低或增加约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约150％、约200％、约300％、约400％、约500％或更多；降低或增加超过约10％、约15％、约20％、约50％、约75％、约100％或约200％；降低或增加小于约0.01倍、约0.02倍、约0.1倍、约0.3倍、约0.5倍、约0.8倍或更少；或增加超过约1.2倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.8倍、约2倍、约3倍、约3.5倍、约4.5倍、约5倍、约10倍、约1 5倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约100倍、约1000倍或更多)。蛋白质的水平可以用质量/体积(例如，g/dL、mg/mL、μg/mL、ng/mL)或相对于样品中总蛋白质或mRNA的百分比来表示。
如本文所用，术语“药物组合物”代表含有本文所述的化合物的组合物，所述化合物与药学上可接受的赋形剂一起配制，并且所述组合物优选在政府管理机构的批准下作为用于治疗哺乳动物疾病的治疗方案的一部分来生产或销售。药物组合物可被配制成例如用于单位剂型的口服施用(例如，片剂、胶囊、囊片、胶丸或糖浆)；用于局部施用(例如，作为乳膏、凝胶、洗液或软膏)；用于静脉内施用(例如，作为不含颗粒栓塞的无菌溶液，并且在适用于静脉内使用的溶剂系统中)；用于鞘内注射；用于脑室内注射；用于脑实质内注射；或任何其他药学上可接受的制剂。
如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”是指除本文所述的化合物之外的并且具有对患者基本无毒和非炎症的性质的任何成分(例如，能够悬浮或溶解活性化合物的媒介物)。赋形剂可包括例如：抗粘附剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料(色素)、润肤剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣、调味剂、香料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂和水合水。示例性赋形剂包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(二元)、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、淀粉乙醇酸钠、山梨醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指本文所述的任何化合物的任何药学上可接受的盐。例如，本文所述的任何化合物的药学上可接受的盐包括在合理的医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触而没有不适当的毒性、刺激、过敏反应并且具有合理的效益/风险比的那些盐。药学上可接受的盐是本领域熟知的。例如，药学上可接受的盐描述于Berge等人，J.Pharmaceutical Sciences 66：1-19，1977以及Pharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use，(Eds.P.H.Stahl and C.G.Wermuth)，Wiley-VCH，2008。盐可以在本文所述的化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或者通过使游离碱基与合适的有机酸反应单独制备。
本文所述的化合物可以具有可电离的基团，以便能够制备成药学上可接受的盐。这些盐可以是涉及无机酸或有机酸的酸加成盐，或者在本文所述的化合物的酸性形式的情况下，这些盐可以由无机碱或有机碱制备。通常，这些化合物被制备或用作以药学上可接受的酸或碱的加成产物形式制备的药学上可接受的盐。合适的药学上可接受的酸和碱以及用于制备适当的盐的方法是本领域熟知的。盐可以由药学上可接受的无毒酸和碱制备，包括无机和有机酸和碱。代表性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐和戊酸盐。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐和镁盐，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺和乙胺。
“参考”意指用于比较蛋白质或mRNA水平或活性的任何有用的参考。参考可以是用于比较目的的任何样品、标准、标准曲线或水平。参考可以是正常参考样品或参考标准或水平。“参考样品”可以是例如对照，例如预定的阴性对照值诸如“正常对照”或取自同一受试者的先前样品；来自正常健康受试者的样品，例如正常细胞或正常组织；来自未患有疾病的受试者的样品(例如，细胞或组织)；来自被诊断为患有疾病但尚未用本文所述的化合物治疗的受试者的样品；来自已经用本文所述的化合物治疗的受试者的样品；或已知正常浓度的纯化的蛋白质样品(例如，本文所述的任一种)。“参考标准或水平”意指从参考样品得到的值或数值。“正常对照值”是指示非疾病状态的预定值，例如健康对照受试者的预期值。通常，正常对照值表示为范围(“X和Y之间”)、高阈值(“不高于X”)或低阈值(“不低于X”)。特定生物标记物的测量值在正常对照值内的受试者通常被认为该生物标记物的“在正常限度内”。正常参考标准或水平可以是来自不患有疾病或病症的正常受试者；已经用本文所述的化合物治疗的受试者的值或数值。在优选的实施方案中，参考样品、标准或水平通过以下标准中的至少一个与样品受试者样品相匹配：年龄、体重、性别、疾病阶段和总体健康状况。在正常参考范围内的纯化蛋白质(例如本文所述的任何蛋白质)水平的标准曲线也可以用作参考。
如本文所用，术语“受试者”是指例如出于实验、诊断、预防和/或治疗目的，可以对其施用根据本发明的组合物的任何生物体。典型的受试者包括任何动物(例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人)。受试者可能寻求或需要治疗、需要治疗、正在接受治疗、正在接受未来的治疗，或者是由受过训练的专业人员针对特定疾病或疾患进行护理的人或动物。
如本文所用，术语“施用”是指向受试者或系统施用组合物(例如，化合物或包括本文所述的化合物的制剂)。向动物受试者(例如，向人)施用可以通过任何合适的途径，例如本文所述的途径进行。
如本文所用，“组合治疗”或“组合施用”意指将两种(或更多种)不同的药物或治疗方法作为特定疾病或疾患的确定治疗方案的一部分向受试者施用。治疗方案确定了每种药物的剂量和施用周期，使得各种剂对受试者的作用重叠。在一些实施方案中，两种或更多种剂的递送是同时或并行的，并且剂可以是共同配制的。在一些实施方案中，两种或更多种剂不是共同配制的，并且作为处方方案的一部分以顺序方式施用。在一些实施方案中，组合施用两种或更多种剂或治疗使得症状或与病症相关的其他参数的减轻大于使用单独递送的一种剂或治疗或在另一种剂或治疗不存在下观察到的减轻。这两种治疗的效果可以是部分相加的、完全相加的或大于相加的(例如，协同)。每种治疗剂的顺序施用或基本同时施用可以通过任何合适的途径实现，包括但不限于口服途径、静脉内途径、肌内途径和通过粘膜组织直接吸收。治疗剂可以通过相同的途径或不同的途径施用。例如，组合的第一治疗剂可以通过静脉注射施用，而组合的第二治疗剂可以口服施用。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗的(treated)”或“治疗(treating)”是指治疗性治疗和预防性或预防措施，其中目标是防止或减缓(减轻)不期望的生理病状、病症或疾病，或获得有益的或期望的临床结果。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解；疾患、病症或疾病程度的减轻；疾患、病症或疾病的稳定(即，未恶化)状态；疾患、病症或疾病进展的发作延迟或减缓；疾患、病症或疾病状态的改善或缓解(无论是部分或全部)，无论是可检测的还是不可检测的；至少一个可测量的物理参数的改善，所述物理参数不一定是患者可辨别的；或疾患、病症或疾病的增强或改善。治疗包括引发临床上显著的响应，而无过度的副作用。治疗还包括与不接受治疗时的预期生存期相比延长生存期。
如本文所用，术语“有效量”、“治疗有效量”和产生本文所述的治疗效果(例如，在细胞或受试者中)的剂的“足够量”是指当向包括人在内的受试者施用时，足以产生有益的或期望的结果(包括临床结果)的量，并且因此，“有效量”或其同义词取决于其应用的上下文。例如，在治疗病症的情况下，它是与不施用时获得的反应相比，足以实现治疗反应的剂的量。给定的剂的量将根据各种因素而变化，例如给定的剂、药物制剂、施用途径、疾病或病症的类型、治疗的受试者或宿主的身份(例如、年龄、性别和/或体重)等，但仍可由本领域技术人员常规确定。此外，如本文所用，剂的“治疗有效量”是与对照相比在受试者中产生有益或期望的结果的量。如本文所定义，普通技术人员可以通过本领域已知的常规方法容易地确定药物的治疗有效量。剂量方案可以调整以提供最佳的治疗反应。
如本文所用，“预防有效量”意在包括当向患有或易患病症的受试者施用时，足以预防或改善疾病或疾病的一种或多种症状的寡核苷酸的量。改善疾病包括减缓疾病进程或降低后期疾病的严重性。“预防有效量”可以根据寡核苷酸、药物的施用方式、疾病的风险程度、病史、年龄、体重、家族史、基因构成、先前治疗或联合治疗的类型(如果有的话)以及待治疗患者的其他个体特征而变化。
“治疗有效量”或“预防有效量”还包括以适用于任何治疗的合理效益/风险比产生一些期望的局部或全身效应的寡核苷酸的量(以单剂量或多剂量施用)。本发明的方法中使用的寡核苷酸可以足够量施用，以产生适用于这种治疗的合理的效益/风险比。
预防有效量也可以是指例如当向包括人在内的受试者施用时，与预测的发作相比足以将本文所述的一种或多种病症的发作延迟至少120天，例如延迟至少6个月、至少12个月、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少1 0年或更长时间的量。
对于以下任何化学定义，原子符号后的数字表示特定化学部分中存在的该元素的原子总数。可以理解，在需要时，可以存在如本文所述的其他原子诸如H原子或取代基，以满足原子的化合价。例如，未取代的C2烷基具有式-CH2CH3。当与本文定义的基团一起使用时，提及的碳原子数包括缩醛和缩酮基团中的二价碳，但不包括酰基、酯、碳酸酯或氨基甲酸酯基团中的羰基碳。提及的杂芳基中的氧、氮或硫原子数仅包括形成杂环一部分的那些原子。
当特定的取代基可以在相同的结构中多次出现时，取代基的每个实例可以独立地选自该取代基的可能定义的列表。
如本文所用，术语“烷基”是指1至20个碳原子(例如，1至16个碳原子、1至10个碳原子、1至6个碳原子或1至3个碳原子)的支链或直链一价饱和脂族烃基。
亚烷基是二价烷基。如本文所用，术语“烯基”单独或与其他基团组合，是指具有碳-碳双键并具有2至20个碳原子(例如，2至16个碳原子、2至10个碳原子、2至6个碳原子或2个碳原子)的直链或支链烃残基。
如本文所用，术语“卤素”是指氟(氟代)、氯(氯代)、溴(溴代)或碘(碘代)基团。
如本文所用，术语“杂烷基”是指本文定义的烷基，其中一个或多个组成碳原子已被氮、氧或硫置换。在一些实施方案中，杂烷基可以进一步被1、2、3或4个取代基置换，如本文针对烷基所述。杂烷基的实例是“烷氧基”，如本文所用，所述烷氧基是指烷基-O-(例如，甲氧基和乙氧基)。杂亚烷基是二价杂烷基。如本文所用，术语“杂烯基”是指如本文定义的烯基，其中一个或多个组成碳原子已被氮、氧或硫置换。在一些实施方案中，杂烯基可以进一步被1、2、3或4个取代基取代，如本文针对烯基所述。杂烯基的实例是“烯氧基”，如本文所用，所述烯氧基是指烯基-O-。杂亚烯基是二价杂烯基。如本文所用，术语“杂炔基”是指如本文定义的炔基，其中一个或多个组成碳原子已被氮、氧或硫置换。在一些实施方案中，杂炔基可以进一步被1、2、3或4个取代基取代，如本文针对炔基所述。杂炔基的实例是“炔氧基”，如本文所用，所述炔氧基是指炔基-O-。杂亚炔基是二价杂炔基。
如本文所用，术语“羟基”代表-OH基团。
烷基、杂烷基可以是取代的或未取代的。当被取代时，除非另有说明，否则通常存在1至4个取代基。取代基包括例如：烷基(例如，未取代和取代的，其中取代基包括本文所述的任何基团，例如芳基、卤素、羟基)、芳基(例如，取代和未取代的苯基)、碳环基(例如，取代和未取代的环烷基)、卤素(例如，氟)、羟基、杂烷基(例如，取代和未取代的甲氧基、乙氧基或硫代烷氧基)、杂芳基、杂环基、氨基(例如，NH2或单烷基氨基或二烷基氨基)、叠氮基、氰基、硝基或硫醇。芳基、碳环基(例如，环烷基)、杂芳基和杂环基也可以被烷基取代(未取代和取代的，例如芳基烷基(例如，取代和未取代的苄基))。
本发明的化合物可以具有一个或多个不对称碳原子，并且可以以光学纯的对映异构体、对映异构体混合物(例如外消旋物)、光学纯的非对映异构体、非对映异构体混合物、非对映异构体外消旋物或非对映异构体外消旋物混合物的形式存在。光学活性形式可以例如通过拆分外消旋物、通过不对称合成或不对称色谱(用手性吸附剂或洗脱剂的色谱)获得。也就是说，某些公开的化合物可以以各种立体异构形式存在。立体异构体是仅在空间排列上不同的化合物。对映异构体是镜像不可叠加的立体异构体对，最常见的原因是它们含有一个不对称取代的碳原子作为手性中心。“对映体”意指互为镜像且不可叠加的一对分子之一。非对映异构体是没有镜像关系的立体异构体，最常见的原因是它们含有两个或更多个不对称取代的碳原子并且代表一个或多个手性碳原子周围取代基的构型。化合物的对映异构体可通过例如使用一种或多种熟知的技术和方法，例如手性色谱和基于此的分离方法，从外消旋物中分离对映异构体来制备。本领域技术人员可以容易地确定从外消旋混合物中分离本文所述的化合物的对映异构体的合适技术和/或方法。“外消旋物”或“外消旋混合物”意指含有两种对映异构体的化合物，其中此类混合物不显示光学活性；即，它们不旋转偏振光的平面。“几何异构体”意指与碳-碳双键、环烷基环或桥连双环系统相关的取代基原子取向不同的异构体。碳-碳双键每一侧上的原子(除H外)可以是E构型(取代基位于碳-碳双键的25相对侧)或Z构型(取代基位于同一侧)。“R”、“S”、“S*”、“R*”、“E”、“Z”、“顺式”和“反式”表示相对于核心分子的构型。某些公开的化合物可以阻转异构体形式存在。阻转异构体是由围绕单键的受阻旋转产生的立体异构体，其中旋转的空间应变势垒足够高以允许分离构象异构体。本发明的化合物可以通过异构体特异性合成或从异构体混合物中拆分来制备为单独的异构体。常规拆分技术包括使用光学活性酸形成异构体对的每种异构体的游离碱的盐(随后分步结晶并再生游离碱)，使用光学活性胺形成异构体对的每种异构体的酸形式的盐(随后分步结晶并再生游离酸)，使用光学纯的酸、胺或醇形成异构体对的每个异构体的酯或酰胺35(随后进行色谱分离并除去手性助剂)，或者使用各种熟知的色谱方法拆分起始材料或最终产物的异构体混合物。当所公开化合物的立体化学由结构命名或描绘时，所命名或描绘的立体异构体是相对于其他立体异构体按重量计至少60％、70％、80％、90％、99％或99.9％。当单一对映异构体由结构命名或描绘时，所描绘或命名的对映异构体为按重量计至少60％、70％、80％、90％、99％或99.9％光学纯的。当单个非对映异构体由结构命名或描绘时，所描绘或命名的非对映异构体为按重量计至少60％、70％、80％、90％、99％或99.9％纯的。光学纯度百分比是对映异构体的重量与对映异构体的重量加上其光学异构体的重量之比。按重量计的非对映异构体纯度是一种非对映异构体的重量与所有非对映异构体的重量之比。当所公开化合物的立体化学由结构命名或描绘时，所命名或描绘的立体异构体是相对于其他立体异构体按摩尔分数计至少60％、70％、80％、90％、99％或99.9％纯的。当单一对映异构体由结构命名或描绘时，所描绘或命名的对映异构体为按摩尔分数计至少60％、70％、80％、90％、99％或99.9％纯的。当单个非对映异构体由结构命名或描绘时，所描绘或命名的非对映异构体为按摩尔分数计至少60％、70％、80％、90％、99％或99.9％纯的。按摩尔分数计的纯度百分比是对映异构体的摩尔数与对映异构体的摩尔数加上其光学活性异构体的摩尔数之比。类似地，按摩尔分数计的纯度百分比是非对映体的摩尔数与非对映体的摩尔数加上其异构体的摩尔数之比。当所公开的化合物由结构命名或描绘而没有指明立体化学，并且所述化合物具有至少一个手性中心时，应理解该名称或结构包括不含相应光学活性异构体的化合物的任一对映异构体、所述化合物的外消旋混合物或相对于其相应光学活性异构体富含一种对映异构体的混合物。当所公开的化合物由结构命名或描绘而没有指明立体化学并且具有两个或更多个手性中心时，应理解所述名称或结构包括不含其他非对映体的非对映体、不含其他非对映体对的大量非对映体、非对映体混合物、非对映体对混合物、其中一种非对映体相对于其他非对映体富集的非对映体混合物、或者其中一种或多种非对映体相对于其他非对映体富集的非对映体混合物。本发明包括所有这些形式。
除非另有限定，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明领域内的普通技术人员对于该发明所属的通常理解的意义相同的意义。本文描述了用于本公开的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。所述材料、方法和示例仅是说明性的而不是旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均以引用方式整体并入本文。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。
在以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据说明书和权利要求书，本发明的其他特征、目标和优点将变得显而易见。
II.本发明的方法.
本发明提供了编辑SERPINA1多核苷酸例如包含与α1抗胰蛋白酶缺乏症(例如肝衰竭和/或肺气肿)相关的单核苷酸多态性(SNP)的SERPINA1多核苷酸的方法，以及用于治疗或预防受试者的SERPINA1相关疾病例如α1抗胰蛋白酶缺乏症的方法。所述方法包括使SERPINA1多核苷酸与指导寡核苷酸接触，所述指导寡核苷酸能够实现与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变。
本发明用于在细胞或受试者中，通过使用寡核苷酸定点编辑核苷酸，在靶序列例如包含与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的SERPINA1多核苷酸中进行所需的改变，所述寡核苷酸能够实现SNP的作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变。因此，靶序列通过由ADAR介导的腺苷脱氨基反应进行编辑，从而将腺苷转化为肌苷。在一些实施方案中，因为I被识别为G，校正基因中的致病性突变的脱氨基作用将E342K突变逆转回野生型，从而逆转或减缓患者经历的与A1AD相关的症状。
所述改变可以位于靶RNA的5’或3’非翻译区、剪接位点、外显子(改变从靶RNA翻译的蛋白质中的氨基酸、通过改变外显子剪接沉默子或增强子来改变密码子使用或剪接行为、和/或引入或去除起始密码子或终止密码子)、内含子(通过改变内含子剪接沉默子或内含子剪接增强子、分支点来改变剪接)以及通常影响RNA稳定性、结构或功能的任何区域。靶RNA序列可以包含人们希望纠正或改变的突变，例如转换或颠换。
RNA编辑酶是本领域已知的。在一些实施方案中，RNA编辑酶是人或人细胞中的作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)，例如hADARI和hADAR2。
作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)催化腺苷(A)转化为肌苷(I)，从而编辑具有双链(ds)结构的RNA。A到I RNA编辑导致核苷酸取代，因为核糖体和RNA聚合酶都将I识别为G，而不是A。A到I取代也可导致dsRNA不稳定，因为I：U错配碱基对不如A：U碱基对稳定。病毒和细胞RNA都会发生A到I编辑，并且所述编辑影响广泛的生物学过程。这些过程包括病毒生长和持续、细胞凋亡和胚胎发生、神经递质受体和离子通道功能、胰腺细胞功能和微小RNA的转录后基因调节。为了理解在ADAR催化的A到I(＝G)编辑事件后的生理变化而提供框架的生物化学过程包括通过改变密码子从而改变蛋白质的氨基酸序列的mRNA翻译；通过改变剪接位点识别序列的前体mRNA剪接；通过改变参与核酸酶识别的序列来稳定RNA；在RNA病毒基因组的情况下，通过在病毒RNA复制期间改变序列的遗传稳定性；以及依赖RNA结构的活性，诸如微小RNA产生或靶向或蛋白质-RNA相互作用。
已知三种人ADAR基因，其中两种编码活性脱氨酶(ADAR1和ADAR2)。现有技术中已描述了人ADAR3(hADAR3)，但是据报告其没有脱氨酶活性。替代性启动子和替代性剪接产生了两种蛋白质大小形式的ADAR1：结合dsRNA和Z-DNA的干扰素诱导型ADAR1-p150脱氨酶和组成型表达的ADAR1-p110脱氨酶。ADAR2，像ADAR1-p110一样，组成型表达并结合dsRNA。已知仅ADAR1的较长同种型能够结合Z-DNA结构，所述结构可以包含在根据本发明的寡核苷酸构建体的募集部分中。因此，细胞中存在的1 50kDa同种型的水平可能受到干扰素，特别是干扰素-γ(IFN-γ)的影响。hADARI也可被TNF-α诱导。这提供了开发组合疗法的机会，由此将干扰素-γ或TNF-α和根据本发明的包含Z-DNA作为募集部分的寡核苷酸构建体作为组合产品或作为单独产品同时或随后以任何顺序向患者施用。某些疾病病状可能已经与患者某些组织中IFN-γ或TNF-α水平的增加相一致，这进一步为针对患病组织进行更具特异性的编辑创造了机会。
将ADAR募集到选定转录物的特定位点并将腺苷脱氨基而不考虑邻近碱基，为疾病的治疗带来了巨大的希望。在一些实施方案中，能够实现SNP的作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变的寡核苷酸例如本文所述的指导寡核苷酸还包含ADAR募集结构域。在一些实施方案中，ADAR募集结构域包含可共价连接至用于本发明的方法中的寡核苷酸，并且可以形成充当ADAR酶的募集和结合区域的茎环结构的核苷酸序列。包含此类ADAR募集结构域的寡核苷酸可被称为“axiomer AON”或“自环AON”ADAR募集结构域部分可以用于募集细胞中存在的内源性ADAR酶。此类ADAR募集结构域不需要缀合实体或存在修饰的重组ADAR酶。或者，ADAR募集部分可以用于募集重组ADAR融合蛋白，所述重组ADAR融合蛋白已经通过包含编码ADAR融合蛋白的多核苷酸的表达载体构建体递送至细胞或受试者。此类ADAR-融合蛋白可以包含ADAR1或ADAR2酶的脱氨酶结构域与另一种蛋白质例如MS2噬菌体外壳蛋白的融合物。ADAR募集结构域可以是基于天然底物的核苷酸序列(例如GluR2受体前体mRNA；例如GluR2 ADAR募集结构域)、Z-DNA结构或已知募集作为ADAR融合蛋白的一部分的另一种蛋白质的结构域，例如已知被ADAR的dsRNA结合区识别的MS2 ADAR募集结构域。ADAR募集结构域的茎环结构可以是由两条分开的核酸链形成的分子间茎环结构，或者是在单个核酸链内形成的分子内茎环结构。
在一些实施方案中，ADAR在细胞中内源性表达。细胞选自由以下组成的组：细菌细胞、真核细胞、哺乳动物细胞和人细胞。原则上，本发明可用于任何哺乳动物物种的细胞，但优选用于人细胞。
能够实现SNP的作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变的寡核苷酸，例如如本文所述的指导寡核苷酸，包含与编码与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的SERPINA1 mRNA互补的核酸序列。在一些实施方案中，除了至少一个错配之外，指导寡核苷酸与靶mRNA互补。寡核苷酸包含与靶腺苷相反的错配。
一旦寡核苷酸与靶mRNA序列杂交，它就形成双链RNA结构，所述双链RNA结构可以被ADAR识别，并促进ADAR向靶序列募集。因此，ADAR可以催化与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP中特定腺苷的脱氨基反应使其成为肌苷。
通过本发明的方法成功编辑后，rs28929474(A)等位基因被ADAR脱氨基并转化为rs28929474(G)等位基因，并且这种ADAR介导的腺苷到肌苷的改变将SERPINA1蛋白的位置342的致病性氨基酸丝氨酸取代为野生型氨基酸甘氨酸，从而消除SERPINA1蛋白中的致病性突变或导致疾病的突变。
本发明的方法可用于来自任何器官的细胞，例如皮肤、肺、心脏、肾、肝、胰腺、肠、肌肉、腺体、眼、脑、血液等。本发明特别适用于修饰牵涉到(人)受试者的疾病状态的细胞、组织或器官中的序列。这些细胞包括但不限于肝细胞、肝细胞样细胞和/或肺泡II型细胞。
本发明的方法也可用于生物体中非天然存在的哺乳动物细胞，例如细胞系或胚胎干(ES)细胞。本发明的方法可用于各种类型的干细胞，包括多能干细胞、全能干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞等。
细胞可以位于体外或体内。本发明的一个优点在于，它可用于活生物体中的原位细胞，但也可用于培养中的细胞。在一些实施方案中，离体处理细胞，并且然后将其引入活生物体中(例如，重新引入到它们最初来源的生物体中)。在一些实施方案中，在体内接触细胞。在其他实施方案中，细胞是离体细胞。
本发明的方法也可用于编辑所谓类器官内的细胞中的靶RNA序列。类器官是来源于干细胞的自组织三维组织结构。此类培养物可以被精心制作以复制器官的大部分复杂性，或表达其选定的方面，如仅产生某些类型的细胞(Lancaster&Knoblich，Science 2014，第345卷第6194期1247125)。在治疗环境中，它们是有用的，因为它们可以在体外从患者的细胞中获得，并且然后可以将类器官作为比正常移植更不容易被排斥的自体材料重新引入患者体内。因此，根据另一个优选的实施方案，本发明可以在取自患者的组织样品(例如来自其胃肠道；参见Sala等人J Surg Res.2009；156(2)：205-12和Sato等人Gastroenterology2011；141：1762-72)中生长的类器官上实施。在根据本发明的RNA编辑后，类器官或驻留在类器官内的干细胞可用于移植回患者体内以改善器官功能。
在一些实施方案中，待处理的细胞具有遗传突变。突变可以是杂合的或纯合的。本发明可用于修饰点突变，例如校正G到A的突变。在其他实施方案中，待处理的细胞没有遗传突变。本发明可用于产生点突变，例如产生A到G的突变。
因此，本发明不限于纠正突变，因为通过应用根据本发明的寡核苷酸将野生型序列改变成突变的序列可能是有用的。修饰野生型腺苷可能有利的一个实例是引起外显子的跳跃，例如通过修饰恰好是所述外显子剪接所需的分支位点的腺苷。另一个实例是，腺苷定义了蛋白质结合的识别序列或者是其一部分，或者参与了定义mRNA稳定性的二级结构。然而，在一些实施方案中，本发明以相反的方式，通过将疾病相关突变引入细胞系或动物来使用，以便为所述疾病提供有用的研究工具。作为建立用于研究目的的疾病模型的一个实例，本文所述的寡核苷酸序列提供了在人细胞中募集编辑活性以在SERPINA1中产生突变，例如SERPINA1突变，所述突变形成了α1抗胰蛋白酶缺乏症发作的基础。因此，本发明可用于提供疾病的研究工具，以引入比现有突变更无害的新突变。
通过RNA编辑回复的突变可能出现在染色体或一些其他形式的DNA(例如线粒体DNA)或RNA(包括前体mRNA、核糖体RNA或线粒体RNA)的水平上。待进行的改变可以是在细胞或受试者已感染的病原体的靶RNA中，所述病原体包括真菌、酵母、寄生虫、动质体、细菌、噬菌体、病毒等。随后，可以在RNA水平上对这种细胞、受试者或病原体内的靶序列进行编辑。某些病原体，诸如病毒，将它们的核酸、DNA或RNA释放到受感染宿主(细胞)的细胞中。其他病原体驻留于受感染宿主体内或在其中循环。本发明的寡核苷酸构建体可用于编辑驻留于受感染真核宿主细胞中的靶RNA序列，或编辑在真核宿主中驻留或循环的病原体细胞内的RNA序列，只要进行编辑的细胞含有与向其施用的寡核苷酸构建体相容的编辑实体。
不希望受到理论束缚，通过ADAR1和ADAR2进行RNA编辑被认为在转录或剪接期间发生在细胞核中的前体mRNA上。不排除对线粒体RNA密码子或成熟mRNA中的非编码序列进行编辑。
使用本文公开的寡核苷酸进行的腺苷脱氨基作用包括任何水平的腺苷脱氨基作用，例如靶序列内至少1个脱氨基腺苷(例如靶序列中至少1、2、3或更多个脱氨基腺苷)。
腺苷脱氨基作用可以通过与对照水平相比靶序列中腺苷的绝对或相对水平的降低来评定。对照水平可以是本领域中使用的任何类型的对照水平，例如给药前基线水平或由未治疗或用对照(例如像，仅缓冲液对照或无活性剂对照)治疗的类似受试者、细胞或样品确定的水平。
因为ADAR的酶活性将腺苷转化为肌苷，腺苷脱氨基作用可以通过与对照水平相比靶序列中肌苷的绝对或相对水平的增加来评定。类似地，对照水平可以是本领域中使用的任何类型的对照水平，例如给药前基线水平或由未治疗或用对照(例如像，仅缓冲液对照或无活性剂对照)治疗的类似受试者、细胞或样品确定的水平。
靶序列中腺苷和/或肌苷的水平可以使用本领域已知的用于确定多核苷酸序列的核苷酸组成的任何方法来评定。例如，靶序列中腺苷或肌苷的相对或绝对水平可以使用核酸测序技术进行评定，包括但不限于Sanger测序方法、下一代测序(NGS；例如焦磷酸测序、通过可逆终止子化学的测序、通过连接的测序和实时测序)，例如在可商购获得的平台(例如Illumina、Qiagen、Pacific Biosciences、Thermo Fisher、Roche和Oxford NanoporeTechnologies)上提供的那些。NGS靶序列的克隆扩增可以使用实时聚合酶链反应(也称为qPCR)在来自Applied Biosystems、Roche、Stratagene、Cepheid、Eppendorf或Bio-RadLaboratories的可商购获得的平台上进行。另外地或替代地，乳液PCR方法可用于使用可商购获得的平台诸如Bio-Rad Laboratories的Droplet Digital PCR来扩增靶序列。
在某些实施方案中，替代标记物可用于检测靶序列中的腺苷脱氨基作用。例如，如可接受的诊断和监测标准所证明的，用本公开的寡核苷酸对患有涉及G到A突变的遗传病症的受试者进行的有效治疗可以理解为证明了临床上相关的腺苷脱氨基作用。在某些实施方案中，所述方法包括临床上相关的腺苷脱氨基作用，例如如用本公开的寡核苷酸治疗受试者后临床上相关的结果所证明的。
感兴趣基因中的腺苷脱氨基作用可以通过第一细胞或第一细胞群(例如，此类细胞可以存在于来源于受试者的样品中)表达的mRNA水平的增加或减少来证明，其中感兴趣基因被转录并且被处理或已被处理(例如通过使一个或多个细胞与本公开的寡核苷酸接触，或通过向其中存在或曾经存在所述细胞的受试者施用本公开的寡核苷酸)，使得与基本上与第一细胞或细胞群相同但未被如此处理的第二细胞或细胞群(未用寡核苷酸处理或未用靶向感兴趣基因的寡核苷酸处理的对照细胞)相比，感兴趣基因的表达增加或减少。感兴趣基因的mRNA水平的增加或减少程度可以根据以下来表示：
在其他实施方案中，基因水平的变化可以根据与感兴趣基因的表达，例如感兴趣基因的蛋白质表达或蛋白质下游的信号传导功能性关联的参数的减少来评定。感兴趣基因水平的变化可以在表达感兴趣基因的任何细胞中以及通过本领域已知的任何测定法测定，所述基因是与表达构建体呈内源性或异源性。
感兴趣基因表达水平的变化可以通过由细胞或细胞群表达的感兴趣基因产生的蛋白质水平(例如，源自受试者的样品中表达的蛋白质水平)的增加或减少来证明。如上文所解释，为了评定mRNA抑制，处理的细胞或细胞群中蛋白质表达水平的变化可以类似地表示为对照细胞或细胞群中蛋白质水平的百分比。
可用于评定感兴趣基因表达变化的对照细胞或细胞群包括尚未与本公开的寡核苷酸接触的细胞或细胞群。例如，在用寡核苷酸治疗个体受试者之前，对照细胞或细胞群可来源于所述个体受试者(例如，人或动物受试者)。
由细胞或细胞群表达的感兴趣基因的mRNA水平可以使用本领域已知用于评定mRNA表达的任何方法来确定。在一个实施方案中，样品中感兴趣基因的表达水平通过检测感兴趣基因的转录多核苷酸或其部分例如mRNA来确定。RNA可以使用RNA提取技术从细胞中提取，所述提取技术包括例如使用酸性酚/异硫氰酸胍提取(RNAzol B；Biogenesis)、RNEASYTM RNA制备试剂盒(Qiagen)或PAXgene(PreAnalytix，Switzerland)。利用核糖核酸杂交的典型分析形式包括核连续测定、RT-PCR、RNA酶保护测定、RNA印迹、原位杂交和微阵列分析。感兴趣基因的循环mRNA可以使用PCT公开WO2012/177906中描述的方法来检测，所述公开的全部内容以引用方式并入本文。在一些实施方案中，感兴趣基因的表达水平使用核酸探针测定。如本文所用，术语“探针”是指能够选择性结合特定序列，例如mRNA或多肽的任何分子。探针可以由本领域技术人员合成，或者衍生自适当的生物制剂。探针可以被特别设计来标记。可用作探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
分离的mRNA可用于杂交或扩增测定，其包括但不限于DNA印迹或RNA印迹分析、聚合酶链反应(PCR)分析和探针阵列。一种用于确定mRNA水平的方法包括使分离的mRNA与可以与感兴趣基因的mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。在一个实施方案中，mRNA被固定在固体表面上并与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上运行分离的mRNA并将mRNA从凝胶转移到膜例如硝酸纤维素上来进行。在另一个实施方案中，探针被固定在固体表面上，并且使mRNA与探针接触，例如在AFFYMETRIX基因芯片阵列中。技术人员可以容易地采用已知的mRNA检测方法来用于确定感兴趣基因的mRNA水平。
用于确定样品中感兴趣基因表达水平的另一种方法包括例如通过以下方法对样品中例如mRNA例如进行核酸扩增和/或逆转录酶(以制备cDNA)的方法：RT-PCR(Mullis，1987，美国专利号4,683,202中陈述的实验实施方案)、连接酶链反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193)、自持续序列复制(Guatell等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等人(1988)Bio/Technology 6：1197)、滚环复制(Lizardi等人，美国专利号5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，随后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。如果核酸分子以非常低的数目存在，则这些检测方案尤其可用于检测此类分子。在本发明的特定方面，感兴趣基因的表达水平通过定量荧光RT-PCR(即，TAQMANTM系统)或DUAL-荧光素酶测定来确定。
感兴趣基因的mRNA表达水平可使用膜印迹(诸如用于杂交分析，诸如RNA印迹、DNA印迹、斑点印迹等)或微孔、样品管、凝胶、珠粒或纤维(或包含结合的核酸的任何固体支持物)来监测。参见美国专利号5,770,722；5,874,219；5,744,305；5,677,195；和5,445,934，所述专利以引用方式并入本文。基因表达水平的测定也可以包括使用溶液中的核酸探针。
在一些实施方案中，mRNA表达水平使用分支DNA(bDNA)测定或实时PCR(qPCR)来评定。在本文给出的实施例中描述并举例说明了这种PCR方法的使用。此类方法也可用于检测感兴趣基因的核酸。
通过感兴趣基因的表达产生的蛋白质水平可以使用本领域已知用于测量蛋白质水平的任何方法来确定。这些方法包括例如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、超扩散色谱、液体或凝胶沉淀素反应、吸收光谱、比色测定、分光光度测定、流式细胞术、免疫扩散(单次或双重)、免疫电泳、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、电化学发光测定等。此类测定也可用于检测指示感兴趣基因产生的蛋白质的存在或复制的蛋白质。此外，上述测定可用于报告感兴趣mRNA序列的变化，其导致蛋白质功能的恢复或变化，从而为受试者提供治疗效果和益处、治疗受试者的病症和/或减少受试者的病症的症状。
治疗方法
本发明还包括治疗或预防SERPINA1相关性疾病或病症例如α1抗胰蛋白酶缺乏症的方法。例如，本发明的方法可用于治疗或预防任何SERPINA1相关性病症，所述病症可由鸟苷到腺苷的突变、过早终止密码子的引入或不期望的蛋白质的表达引起。在一些实施方案中，用于本发明的方法中的寡核苷酸当引入到细胞或受试者时，可以导致鸟苷到腺苷的突变的校正。在一些实施方案中，用于本发明的方法的寡核苷酸可以导致过早终止密码子的关闭，从而表达所需蛋白质。在一些实施方案中，用于本发明的方法的寡核苷酸可以导致不需要的蛋白质的表达受到抑制。
在一个方面，本发明涉及治疗有需要的受试者的α1抗胰蛋白酶缺乏症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括鉴定在SERPINA1多核苷酸中具有与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的单核苷酸多态性(SNP)的受试者；以及使受试者细胞中的SERPINA1多核苷酸与指导寡核苷酸接触，从而治疗受试者，所述指导寡核苷酸能够实现与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变。
在另一方面，本发明涉及治疗有需要的受试者的α1抗胰蛋白酶缺乏症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括鉴定在SERPINA1多核苷酸中具有与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的单核苷酸多态性(SNP)的受试者；使细胞中的SERPINA1多核苷酸与指导寡核苷酸接触，并向受试者施用所述细胞，从而治疗受试者，所述指导寡核苷酸能够实现与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变。
在一些实施方案中，本文提供的方法防止、逆转或减缓患有A1AD的受试者肝脏中突变A1AT的累积。在一些实施方案中，本文提供的方法预防、逆转或减缓与A1AD相关的肝损伤。在一些实施方案中，本文提供的方法预防、逆转或减缓患有A1AD的受试者的肝衰竭。在一些实施方案中，本文提供的方法预防、逆转或减缓患有A1AD的受试者的肝硬化发展。在一些实施方案中，本文提供的方法预防、逆转或减缓患有A1AD的受试者的黄疸发展。在一些实施方案中，本文提供的方法预防、逆转或减缓腹水(即，腹腔中流体的异常积聚)发展。在一些实施方案中，本文提供的方法预防、逆转或减缓肝性脑病发展。
在一些实施方案中，本文提供的方法预防、逆转或减缓患有A1AD的受试者肺部弹性蛋白的过度分解。在一些实施方案中，本文提供的方法预防、逆转或减缓患有A1AD的受试者的肺气肿发展。在一些实施方案中，本文提供的方法预防、逆转或减缓患有A1AD的受试者的COPD发展。在一些实施方案中，本文提供的方法预防或减少患有A1AD的受试者的呼吸道感染次数。在一些实施方案中，本文提供的方法预防、逆转或减缓哮喘发展。在一些实施方案中，本文提供的方法防止、逆转或减缓支气管扩张发展。
在一些实施方案中，受试者是人受试者。
因此，本发明的方法可以包括鉴定在SERPINA1多核苷酸中具有与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的单核苷酸多态性(SNP)的受试者的步骤。具体而言，本发明的方法包括鉴定靶RNA序列中所需核苷酸改变或SNP的存在，从而验证靶RNA序列的导致疾病的突变已得到校正或编辑的步骤。该步骤通常将包括对靶RNA序列的相关部分或其cDNA拷贝(或在靶RNA是前体mRNA的情况下其剪接产物的cDNA拷贝)进行测序，并且因此可以容易地验证序列变化。替代地，修饰可以在蛋白质水平上(长度、糖基化、功能等)或通过一些功能读数来评定。
本文公开的方法还包括使细胞或受试者(包括被鉴定为需要这种治疗的受试者或疑似处于患病风险下并需要这种治疗的受试者)中具有与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的单核苷酸多态性(SNP)的SERPINA1多核苷酸与如本文所述的指导寡核苷酸接触，所述指导寡核苷酸能够实现与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变。
用于本发明的方法中的指导寡核苷酸被设计成特异性靶向有需要的受试者(例如人患者)的SERPINA1基因，并且能够实现SERPINA1基因中与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP中的ADAR介导的腺苷到肌苷的改变。在一些实施方案中，指导寡核苷酸能够将ADAR募集到靶mRNA，然后催化靶mRNA中靶腺苷的脱氨基作用。这种治疗将被适当地引入到罹患、患有、易于发展α1抗胰蛋白酶缺乏症或处于发展所述疾病风险下的受试者，特别是人受试者。在一些实施方案中，校正基因中的致病性突变的这种脱氨基作用将E342K突变逆转回野生型，从而减少α1抗胰蛋白酶缺乏症并逆转或减缓肝脏和/或肺气肿相关症状。本文公开的组合物也可用于治疗可能牵涉到α1抗胰蛋白酶缺乏症的任何其他病症。
在一个实施方案中，本发明提供了一种监测治疗进展的方法。所述方法包括在罹患或易于发展α1抗胰蛋白酶缺乏症或α1抗胰蛋白酶缺乏症相关症状的受试者中确定诊断标记物(标记物)(例如，与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP)或诊断测量值(例如，筛选、测定)的水平的步骤，其中已向所述受试者施用足以治疗所述疾病或其症状的治疗量的本文公开的组合物。可以将所述方法中确定的标记物水平与健康正常对照或其他患病患者中的已知标记物水平进行比较，以确定受试者的疾病状态。在优选的实施方案中，在确定第一水平后的时间点确定受试者的第二水平的标记物，并且比较这两个水平以监测疾病进程或治疗功效。在某些优选的实施方案中，在开始根据本发明的治疗之前，确定受试者的治疗前标记物水平；然后可以将该治疗前标记物水平与治疗开始后受试者的标记物水平进行比较，以确定治疗的功效。
在一些实施方案中，从受试者获得细胞，并使其与如本文提供的本发明的寡核苷酸组合物接触。在一些实施方案中，细胞对受试者而言是自体的、同种异体的或异种的。在一些实施方案中，任选地在细胞中已经实现或检测到所需基因组修饰之后，将从受试者中取出并与本发明的寡核苷酸组合物离体接触的细胞重新引入到受试者中。
在一些实施方案中，将用于本公开的方法中的寡核苷酸引入到受试者中，使得寡核苷酸被递送至受试者体内的特定位点。感兴趣基因的表达变化可通过测量来源于受试者特定位点的样品中由感兴趣基因产生的mRNA或蛋白质的水平或水平变化来评定。
在其他实施方案中，将寡核苷酸以一定量和时间引入到细胞或受试者中，以有效地导致以下情况中的一种(或多种，例如，两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种：(a)减少感兴趣基因的靶序列中腺苷的数量，(b)减少靶蛋白例如SERPINA1中的致病性突变的数量，(c)延迟α1抗胰蛋白酶缺乏症的发作，(d)增加受试者的存活率，(e)恢复或改变蛋白质功能，和(f)减少与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的一种或多种症状，例如肺气肿或肝衰竭。
与未治疗群体相比，治疗与G到A突变相关的病症也可以导致治疗的受试者群体的死亡率降低。例如，死亡率降低超过2％(例如，超过5％、10％或25％)。可以通过任何可重复的方法来测量治疗的受试者群体的死亡率的降低，例如通过计算用本文所述的化合物或化合物的药学上可接受的盐开始治疗后群体每单位时间内疾病相关死亡的平均数。还可以例如通过计算用本文所述的化合物或化合物的药学上可接受的盐完成第一轮治疗后群体每单位时间内疾病相关死亡的平均数来测量群体死亡率的降低。
A.施用方法
将用于本发明的方法中的寡核苷酸递送至细胞，例如受试者体内的细胞，例如人受试者(例如，有需要的受试者，例如患有α1抗胰蛋白酶缺乏症的受试者)，可以多种不同方式实现。例如，可以通过使细胞与本发明的寡核苷酸在体外或体内接触来边行递送。体内递送也可以通过向受试者施用包含寡核苷酸的组合物来直接进行。替代地，体内递送可通过施用一种或多种编码寡核苷酸并指导寡核苷酸表达的载体间接进行。接触细胞的体外方法和体内方法的组合也是可能的。接触细胞可以是直接的或间接的。此外，接触细胞可通过靶向配体完成，所述靶向配体包括本文所述或本领域已知的任何配体。在一些实施方案中，靶向配体是碳水化合物部分，例如GalNAc3配体，或将寡核苷酸引导到感兴趣位点例如肝和/或肺的任何其他配体。
细胞与寡核苷酸的接触可以在体外或体内进行。已知的方法可以适用于本发明的寡核苷酸(参见例如Akhtar S.和Julian R L.，(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144以及WO94/02595，所述文献以引用方式整体并入本文)。对于体内递送，为了递送寡核苷酸分子而考虑的因素包括例如所递送分子的生物稳定性、非特异性效应的预防和所递送分子在靶组织中的积累。寡核苷酸的非特异性作用可通过局部施用，例如通过直接注射或植入到组织中或局部施用制剂来最小化。对治疗部位的局部施用使药物的局部浓度最大化，限制了剂对全身组织的暴露，否则全身组织会被剂损害或会降解药物，并允许施用较低的寡核苷酸分子总剂量。
为了全身性施用寡核苷酸以治疗疾病，寡核苷酸可以包含替代性核碱基、替代性糖部分和/或替代性核苷间键，或者替代地使用药物递送系统递送；这两种方法都可以防止寡核苷酸在体内被核酸内切酶和核酸外切酶快速降解。寡核苷酸或药物载体的修饰也可以允许将寡核苷酸组合物靶向靶组织并避免不期望的脱靶效应。寡核苷酸分子可以通过与亲脂性基团诸如胆固醇发生化学缀合来进行修饰，以增强细胞摄取并防止降解。在一个替代性实施方案中，寡核苷酸可以使用药物递送系统来递送，所述药物递送系统例如纳米颗粒、脂质纳米颗粒、polyplex纳米颗粒、阳离子脂质体复合物(lipoplex)纳米颗粒、树枝状聚合物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统。带正电荷的阳离子递送系统促进寡核苷酸分子(带负电荷)的结合，并且还增强带负电荷的细胞膜上的相互作用，以允许细胞有效摄取寡核苷酸。阳离子脂质、树枝状聚合物或聚合物可以与寡核苷酸结合，或者被诱导以形成包裹寡核苷酸的囊泡或胶束。当全身施用时，囊泡或胶束的形成进一步防止了寡核苷酸的降解。一般来说，本领域已知的任何核酸递送方法都可适用于递送本发明的寡核苷酸。用于制备和施用阳离子寡核苷酸复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如Sorensen，D R.等人(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma，U N.等人，(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold，A S等人，(2007)J.Hypertens.25：197-205，所述文献以引用方式整体并入本文)。可用于全身性递送寡核苷酸的药物递送系统的一些非限制性实例包括DOTAP(Sorensen，D R.等人(2003)，同上；Verma，U N.等人，(2003)，同上)、Oligofectamine“固体核酸脂质颗粒”(Zimmermann，T S.等人，(2006)Nature 441：111-114)、心磷脂(Chien，P Y.等人，(2005)Cancer Gene Ther.12：321-328；Pal，A.等人，(2005)Int J.Onc0l.26：1087-1091)、聚乙烯亚胺(Bonnet M E.等人，(2008)Pharm.Res.八月16日印刷前电子版；Aigner，A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu，S.(2006)Mol.Pharm.3：472-487)和聚酰胺基胺(Tomalia，D A.等人，(2007)Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo，H.等人，(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。在一些实施方案中，寡核苷酸与环糊精形成复合物，以用于全身施用。寡核苷酸和环糊精的施用方法和药物组合物可见于美国专利号7,427,605，所述专利以引用方式整体并入本文。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸通过polyplex或阳离子脂质体复合物纳米颗粒递送。寡核苷酸和polyplex纳米颗粒和阳离子脂质体复合物纳米颗粒的施用方法和药物组合物可见于美国专利申请号2017/0121454；2016/0369269；2016/0279256；2016/0251478；2016/0230189；2015/0335764；2015/0307554；2015/0174549；2014/0342003；2014/0135376；和2013/0317086，所述专利申请以引用方式整体并入本文。
i.膜分子组装递送方法
用于本发明的方法中的寡核苷酸也可以使用多种膜分子组装递送方法来递送，包括本领域已知的聚合的、可生物降解的微粒或微胶囊递送装置。例如，可以使用胶体分散系统来靶向递送本文所述的寡核苷酸剂。胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。脂质体是人工膜囊泡，其可用作体外和体内递送媒介物。已表明，大小范围为0.2-4.0μm的大单层囊泡(LUV)可以包封相当百分比的含有大分子的水性缓冲液。脂质体可用于将活性成分转移并递送至作用位点。因为脂质体膜在结构上类似于生物膜，当将脂质体应用于组织时，脂质体双层与细胞膜的双层融合。随着脂质体和细胞融合的进行，包含寡核苷酸的内部水性内容物被递送到细胞中，在细胞中寡核苷酸可以特异性结合靶RNA，并且可以介导ADAR介导的RNA编辑。在一些情况下，脂质体也被特异性靶向，例如以将寡核苷酸引导到特定细胞类型。脂质体的组成通常是磷脂的组合，通常与类固醇，尤其是胆固醇组合。也可以使用其他磷脂或其他脂质。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。
含有寡核苷酸的脂质体可以通过多种方法制备。在一个实例中，将脂质体的脂质组分溶解在洗涤剂中，从而与脂质组分形成胶束。例如，脂质组分可以是两亲性阳离子脂质或脂质缀合物。洗涤剂可以具有高临界胶束浓度，并且可以是非离子的。示例性洗涤剂包括胆酸盐、CHAPS、辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐和月桂酰肌氨酸。然后将寡核苷酸制剂添加到包含脂质组分的胶束中。脂质上的阳离子基团与寡核苷酸相互作用，并在寡核苷酸周围缩合以形成脂质体。缩合后，例如通过透析去除洗涤剂，得到寡核苷酸的脂质体制剂。
如果需要，在缩合反应期间，可以例如通过控制添加来添加有助于缩合的载体化合物。例如，载体化合物可以是除核酸以外的聚合物(例如，精胺或亚精胺)。也可以调节pH以利于缩合。
例如，WO 96/37194中进一步描述了用于产生稳定的多核苷酸递送媒介物的方法，其将多核苷酸/阳离子脂质复合物作为递送媒介物的结构成分并入，所述专利的全部内容以引用方式并入本文。脂质体形成还可以包括以下文献中描述的示例性方法的一个或多个方面：Feigner，P.L.等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8：7413-7417；美国专利号4,897,355；美国专利号5,171,678；Bangham等人，(1965)M.Mol.Biol.23：238；Olson等人，(1979)Biochim.Biophys.Acta 557：9；Szoka等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.75：4194；Mayhew等人，(1984)Biochim.Biophys.Acta 775：169；Kim等人，(1983)Biochim.Biophys.Acta 728：339；以及Fukunaga等人，(1984)Endocrinol.115：757。用于制备用作递送媒介物的适当大小的脂质聚集体的常用技术包括超声处理和冻融加挤出(参见例如Mayer等人，(1986)Biochim.Biophys.Acta 858：161。当需要一致小的(50至200nm)和相对均匀的聚集体时，可以使用微流化(Mayhew等人，(1984)Biochim.Biophys.Acta 775：169。这些方法容易适用于将寡核苷酸制剂包装到脂质体中。
脂质体分为两大类。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，它与带负电荷的核酸分子相互作用以形成稳定的复合物。带正电荷的核酸/脂质体复合物与带负电荷的细胞表面结合，并被内化到核内体中。由于核内体内的酸性pH，脂质体破裂，将其内容物释放到细胞质中(Wang等人(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.，147：980-985)。
脂质体是pH敏感的或带负电荷的，它捕获核酸而不是与核酸复合。因为核酸和脂质都带相似的电荷，所以发生排斥而不是复合物形成。然而，一些核酸被截留在这些脂质体的水性内部。pH敏感性脂质体已被用于将编码胸苷激酶基因的核酸递送至培养的细胞单层。在靶细胞中检测到外源基因的表达(Zhou等人(1992)Joumal of Controlled Release，19：269-274)。
一种主要类型的脂质体组合物包含除天然来源的磷脂酰胆碱以外的磷脂。中性脂质体组合物例如可以由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子脂质体组合物通常由二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而阴离子融合脂质体主要由二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一种类型的脂质体组合物由磷脂酰胆碱(PC)，例如大豆PC和卵PC形成。另一种类型由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。
在体外和体内将脂质体引入到细胞中的其他方法的实例包括美国专利号5,283,185；美国专利号5,171,678；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；Feigner，(1994)J.Biol.Chem.269：2550；Nabel，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：11307；Nabel，(1992)Human Gene Ther.3：649；Gershon，(1993)Biochem.32：7143；以及Strauss，(1992)EMBOJ.11：417。
还检测了非离子脂质体系统，以确定其在将药物递送至皮肤中的效用，特别是包含非离子表面活性剂和胆固醇的系统。使用包括NOVASOMETM I(甘油二月桂酸酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和NOVASOMETM II(甘油二硬脂酸酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子脂质体制剂将环孢菌素-A递送到小鼠皮肤的真皮中。结果表明，此类非离子脂质体系统可有效促进环孢菌素A沉积在皮肤不同层中(Hu等人，(1994)S.T.P.Pharma.Sci.，4(6)：466)。
脂质体也可以是包含一种或多种特化脂质的空间稳定的脂质体，其相对于缺乏这种特化脂质的脂质体，导致循环寿命延长。空间稳定的脂质体的实例是如下那些：其中脂质体的囊泡形成脂质部分的一部分(A)包含一种或多种糖脂，诸如单唾液酸神经节苷脂GM1，或(B)用一种或多种亲水聚合物，诸如聚乙二醇(PEG)部分衍生化。虽然不希望受任何特定理论的束缚，但本领域认为，至少对于含有神经节苷脂、鞘磷脂或PEG衍生化脂质的空间稳定的脂质体，这些空间稳定的脂质体的循环半衰期延长来源于网状内皮系统(RES)的细胞摄取减少(Allen等人，(1987)FEBS Letters，223：42；Wu等人，(1993)Cancer Research，53：3765)。
包含一种或多种糖脂的各种脂质体是本领域已知的。Papahadjopoulos等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.，(1987)，507：64)报告了单唾液酸神经节苷脂GM1、半乳糖脑苷脂硫酸盐和磷脂酰肌醇提高脂质体血液半衰期的能力。Gabizon等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，(1988)，85：6949)阐述了这些发现。Allen等人的美国专利4,837,028和WO 88/04924公开了包含(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂GM1或半乳糖脑苷脂硫酸酯的脂质体。美国专利号5,543,152(Webb等人)公开了包含鞘磷脂的脂质体。WO 97/13499(Lim等人)中公开了包含1，2-sn-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的脂质体。
在一个实施方案中，使用阳离子脂质体。阳离子脂质体具有能够融合到细胞膜上的优点。非阳离子脂质体虽然不能与质膜有效融合，但在体内被巨噬细胞吸收，并可用于将寡核苷酸递送至巨噬细胞。
脂质体的其他优点包括：从天然磷脂获得的脂质体是生物相容的和可生物降解的；脂质体可以掺入多种水溶性和脂溶性药物；脂质体可以保护其内部隔室中包封的寡核苷酸免于代谢和降解(Rosoff，in″Pharmaceutical Dosage Forms，″Lieberman，Riegerand Banker(Eds.)，1988，第1卷，第245页)。在脂质体制剂的制备中，重要的考虑因素是脂质体的脂质表面电荷、囊泡大小和水性体积。
带正电荷的合成阳离子脂质N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)可用于形成小脂质体，其自发地与核酸相互作用以形成脂质-核酸复合物，所述复合物能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电荷的脂质融合，从而导致寡核苷酸的递送(参见例如Feigner，P.L.等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8：7413-7417，以及用于描述DOTMA和其与DNA的用途的美国专利号4，897，355)。
DOTMA类似物1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)可以与磷脂组合使用，以形成DNA复合囊泡。LIPOFECTINTM Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，Md.)是将高度阴离子核酸递送至活组织培养细胞中的有效试剂，所述高度阴离子核酸包括带正电荷的DOTMA脂质体，其自发地与带负电荷的多核苷酸相互作用以形成复合物。当使用足够的带正电荷的脂质体时，所得复合物上的净电荷也是正电荷。以这种方式制备的带正电荷的复合物自发地附接到带负电荷的细胞表面，与质膜融合，并有效地将功能性核酸递送到例如组织培养细胞中。另一种可商购获得的阳离子脂质1，2-双(油酰氧基)-3，3-(三甲基氨)丙烷(“DOTAP”)(Boehringer Mannheim，Indianapolis，Ind.)与DOTMA的不同之处在于油酰基部分通过酯而不是醚键连接。
其他报告的阳离子脂质化合物包括已与多种部分缀合的那些化合物，包括例如已与两种类型的脂质之一缀合的羧基精胺，并且包括诸如5-羧基精胺酰基甘氨酸二辛油酰胺(“DOGS”)(TRANSFECTAMTM，Promega，Madison，Wis.)和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺酰基酰胺(“DPPES”)(参见例如美国专利号5,171,678)。
另一种阳离子脂质缀合物包括脂质与胆固醇的衍生物(“DC-胆固醇”)，胆固醇已与DOPE组合配制成脂质体(参见Gao，X.和Huang，L.，(1991)Biochim.Biophys.Res.Commun.179：280)。据报告，通过将聚赖氨酸与DOPE缀合而制成的脂多糖赖氨酸在血清存在下有效于转染(Zhou，X.等人，(1991)Biochim.Biophys.Acta 1065：8)。对于某些细胞系，据说这些含有缀合阳离子脂质的脂质体比含有DOTMA的组合物表现出更低的毒性并提供更有效的转染。其他可商购获得的阳离子脂质产品包括DMRIE和DMRIE-HP(Vical，La Jolla，Calif.)以及Lipofectamine(DOSPA)(Life Technology，Inc.，Gaithersburg，Md.)。WO98/39359和WO 96/37194中描述了适用于递送寡核苷酸的其他阳离子脂质。
脂质体制剂特别适用于局部施用，相对于其他制剂，脂质体呈现几个优点。此类优点包括与所施用的高全身吸收相关的副作用减少、所施用的药物在所需靶标的累积增加以及能够将寡核苷酸施用到皮肤中。在一些实施方式中，脂质体用于将寡核苷酸递送至表皮细胞，并且还用于增强寡核苷酸到真皮组织，例如皮肤中的渗透。例如，脂质体可以局部施用。已有文献记载将配制成脂质体的药物局部递送至皮肤(参见例如Weiner等人，(1992)Journal of Drug Targeting，第2卷，405-410以及du Plessis等人，(1992)AntiviralResearch，18：259-265；Mannino，R.J.和Fould-Fogerite，S.，(1998)Biotechniques 6：682-690；Itani，T.等人，(1987)Gene 56：267-276；Nicolau，C.等人(1987)Meth.Enzymol.149：157-176；Straubinger，R.M.和Papahadjopoulos，D.(1983)Meth.Enzymol.101：512-527；Wang，C.Y.和Huang，L.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7851-7855)。
还检测了非离子脂质体系统，以确定其在将药物递送至皮肤中的效用，特别是包含非离子表面活性剂和胆固醇的系统。使用包括Novasome I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和Novasome II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子脂质体制剂将药物递送到小鼠皮肤的真皮中。具有寡核苷酸的此类制剂可用于治疗皮肤病。
脂质体的靶向基于例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性也是可能的，并且是本领域已知的。在脂质体靶向递送系统的情况下，可以将脂质基团掺入脂质体的脂质双层中，以便保持靶向配体与脂质体双层稳定缔合。各种连接基团可用于将脂质链连接到靶向配体上。其他方法是本领域已知的，并描述于例如美国专利申请公开号20060058255中，所述专利申请的连接基团以引用方式并入本文。
包含寡核苷酸的脂质体可以制成高度可变形的。这种可变形性能够使脂质体渗透穿过小于脂质体平均半径的孔。例如，传递体是另一种类型的脂质体，并且是高度可变形的脂质聚集体，其为药物递送媒介物的有吸引力的候选物。传递体可以被描述为高度可变形的脂质液滴，使得它们能够容易地穿过小于液滴的孔。传递体可以通过向标准脂质体组合物中添加表面边缘活化剂，通常是表面活性剂来制备。为了将寡核苷酸递送至皮肤中的角质化细胞，可以通过例如感染来皮下递送包含寡核苷酸的传递体。为了穿过完整的哺乳动物皮肤，在合适的透皮梯度的影响下，脂质囊泡必须穿过一系列各自直径小于50nm的细孔。此外，由于脂质性质，这些传递体可以自我优化(适应孔的形状，例如在皮肤中的孔)，自我修复，并且可以经常到达它们的靶标而不断裂，并且经常自我装载。传递体已被用于将血清白蛋白递送至皮肤。已显示传递体介导的血清白蛋白递送与含有血清白蛋白的溶液的皮下注射一样有效。
适用于本发明的其他制剂描述于2008年1月2日提交的美国临时申请序列号61/018,616；2008年1月2日提交的美国临时申请序列号61/018,611；2008年3月26日提交的美国临时申请序列号61/039,748；2008年4月22日提交的美国临时申请序列号6I/047,087；以及2008年5月8日提交的美国临时申请序列号61/051,528。2007年10月3日提交的PCT申请号PCT/US2007/080331也描述了适于本发明的制剂。
表面活性剂在诸如乳液(包括微乳液)和脂质体的制剂中有广泛的应用。对许多不同类型的天然和合成表面活性剂进行分类和排序的最常见方法是使用亲水/亲油平衡(HLB)。亲水基团(也称为“头”)的性质为对制剂中使用的不同表面活性剂进行分类提供了最有用的方法(Rieger，in Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，1988，第285页)。
如果表面活性剂分子没有离子化，则可以将它分类为非离子表面活性剂。非离子表面活性剂在药物和化妆品中有广泛的应用，并且可以在很宽的pH值范围内使用。一般来说，根据它们的结构，它们的HLB值范围为2到约1 8。非离子表面活性剂包括非离子酯，例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨醇酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非离子链烷醇酰胺和醚诸如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇以及乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物也包括在这一类别中。聚氧乙烯表面活性剂是非离子表面活性剂类中最受欢迎的成员。
如果表面活性剂分子当溶解或分散在水中时带有负电荷，则表面活性剂被分类为阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂包括羧酸盐(诸如皂)、酰基乳酸盐、氨基酸的酰基酰胺、硫酸盐(诸如烷基硫酸盐和乙氧基化烷基硫酸盐)、磺酸盐(诸如烷基苯磺酸盐)、酰基羟乙基磺酸盐、酰基牛磺酸盐和磺基琥珀酸盐，以及磷酸盐。阴离子表面活性剂类别中最重要的成员是烷基硫酸盐和皂类。
如果表面活性剂分子当溶解或分散在水中时带正电荷，则表面活性剂被分类为阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂包括季铵盐和乙氧基化胺。季铵盐是这一类中最常用的成员。
如果表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，则表面活性剂被分类为两性表面活性剂。两性表面活性剂包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。
已综述了表面活性剂在药物产品、制剂和乳液中的应用(Rieger，inPharmaceutical Dosage Forms，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，第285页)。
用于本发明的方法中的寡核苷酸也可以胶束制剂的形式提供。胶束是特殊类型的分子组装体，其中两亲性分子以球形结构排列，使得分子的所有疏水部分都指向内部，从而使亲水部分与周围的水相接触。如果环境是疏水性的，则存在相反的排列。
ii.基于脂质纳米颗粒的递送方法
用于本发明的方法中的寡核苷酸可以完全包封在脂质制剂，例如脂质纳米颗粒(LNP)或其他核酸-脂质颗粒中。LNP对于全身性应用极其有用，因为它们在静脉内(i.v.)注射后表现出延长的循环寿命，并在远端位点(例如，与施用位点物理分离的位点)累积。LNP包括“pSPLP”，其包括如PCT公开号WO 00/03683中陈述的包封的缩合剂-核酸复合物。本发明的颗粒通常具有约50nm至约150nm，更通常约60nm至约130nm，更通常约70nm至约110nm，最通常约70nm至约90nm的平均直径，并且基本上是无毒的。此外，当存在于本发明的核酸-脂质颗粒中时，核酸在水溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸-脂质颗粒及其制备方法公开于例如美国专利号5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；美国公开号2010/0324120和PCT公开号WO 96/40964中。
在一个实施方案中，脂质与药物的比例(质量/质量比)(例如，脂质与寡核苷酸的比例)的范围将为约1∶1至约50∶1、约1∶1至约25∶1、约3∶1至约15∶1、约4∶1至约10∶1、约5∶1至约9∶1或约6∶1至约9∶1。介于上述范围之间的范围也被认为是本发明的一部分。
阳离子脂质的非限制性实例包括N，N-二油酰基-N，N-二甲基氯化铵(DODAC)、N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(I-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N--(I-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N，N-二甲基-2，3-二油酰氧基)丙胺(DODMA)、1，2-二亚油酰氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1，2-二次亚麻氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1，2-二亚油酰氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1，2-二亚麻油酰氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1，2-二亚麻油酰氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1，2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1，2-二亚油酰硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1，2-二亚油酰氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1，2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1，2-二亚油酰氧基-3-(N-甲基哌嗪子基)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N，N-二亚油酰基氨基)-1，2-丙二醇(DLinAP)、3-(N，N-二油酰基氨基)-1，2-丙二醇(DOAP)、1，2-二亚油酰氧代-3-(2-N，N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1，2-二次亚麻氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2，2-二亚油酰基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(DLin＝K-DMA)或其类似物、(3aR，5s，6aS)-N，N-二甲基-2，2-二((9Z，12Z)-十八-9，12-二烯四氢--3aH-环戊[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-胺(ALN100)、(6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七烷-6，9，28，31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)、1，1′-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基以及氮烷二烯二-十二烷-2-醇(Tech G1)或其混合物。阳离子脂质可占例如颗粒中存在的总脂质的约20摩尔％至约50摩尔％或约40摩尔％。
可电离/非阳离子脂质可以是阴离子脂质或中性脂质，包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇或其混合物。如果包含胆固醇，则非阳离子脂质可以是例如颗粒中存在的总脂质的约5摩尔％至约90摩尔％、约10摩尔％或约58摩尔％。
抑制颗粒聚集的缀合脂质可以是例如聚乙二醇(PEG)-脂质，包括但不限于PEG-二酰基甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)或其混合物。PEG-DAA缀合物可以是例如PEG-二月桂酰氧基丙基(Ci2)、PEG-二肉豆蔻酰氧基丙基(Ci4)、PEG-二棕榈酰氧基丙基(Ci6)或PEG-二硬脂酰氧基丙基(C]8)。防止颗粒聚集的缀合脂质可以是例如颗粒中存在的总脂质的0摩尔％至约20摩尔％或约2摩尔％。
在一些实施方案中，核酸-脂质颗粒还包含胆固醇，其例如为颗粒中存在的总脂质的约10摩尔％至约60摩尔％或约50摩尔％。
B.组合疗法
本发明的方法可以单独使用或与另外的治疗剂，例如治疗同一种病症(例如α1抗胰蛋白酶缺乏症或与之相关的症状)的其他剂组合使用，或与针对所述病症的其他类型的疗法组合使用。在组合治疗中，一种或多种治疗化合物的剂量可以从单独施用时的标准剂量减少。例如，剂量可以凭经验由药物组合和排列确定，或者可以通过等剂量分析推导。当组合时，化合物的剂量应提供治疗效果。
在一些实施方案中，第二治疗剂是防止、减缓或逆转肝损伤的药物。在一些实施方案中，第二治疗剂是柳氮磺胺吡啶。在一些实施方案中，第二治疗剂是乙酰半胱氨酸。在一些实施方案中，第二治疗剂是控制相关并发症，从而为肝脏愈合提供时间的药物。
在一些实施方案中，第二治疗剂是预防、减缓或逆转肺气肿和/或COPD的药物。在一些实施方案中，第二治疗剂是抗生素、支气管扩张剂、咳嗽药、流感疫苗和/或肺炎球菌疫苗。在一些实施方案中，第二治疗剂是阿奇霉素、克拉霉素、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢地尼、泰利霉素、强力霉素或甲氧苄啶/磺胺甲恶唑。在一些实施方案中，第二治疗剂是沙丁胺醇、左沙丁胺醇或异丙托铵。在一些实施方案中，第二治疗剂是阿地溴铵、阿福莫特罗(arformotero)、福莫特罗(formoterol)、格隆溴铵(glycopyrrolate)、茚达特罗(indacaterol)、奥达特罗(olodaterol)、雷芬那辛(revefenacin)、沙美特罗(salmeterol)、噻托溴铵(tiotropium)或乌美溴铵(umeclidinium)。
第二剂也可以是治疗剂，其是预防、减缓或逆转肝损伤的非药物治疗。在一些实施方案中，第二治疗剂是为了帮助肝功能恢复而规定的调整饮食和增加锻炼。在其他实施方案中，第二治疗剂是肝脏移植。
第二剂也可以是治疗剂，是预防、减缓或逆转肺气肿和/或COPD的非药物治疗。在一些实施方案中，第二治疗剂是需要从生活环境中去除肺部刺激物的生活方式改变。在一些实施方案中，第二治疗剂是呼吸练习，以增强呼吸肌肉。在一些实施方案中，第二治疗剂是氧气疗法。在一些实施方案中，第二治疗剂是通常为了增强体质而规定的调整饮食和增加锻炼。在其他实施方案中，第二治疗剂是移除受损肺组织或提供肺移植的手术。
在本文所述的任何组合实施方案中，第一治疗剂和第二治疗剂以任一顺序同时或依次施用。第一治疗剂可以在第二治疗剂之前或之后立即施用，在此之前或之后多至1小时、多至2小时、多至3小时、多至4小时、多至5小时、多至6小时、多至7小时、多至8小时、多至9小时、多至10小时、多至11小时、多至12小时、多至13小时、14小时、多至16小时、多至17小时、多至18小时、多至19小时、多至20小时、多至21小时、多至22小时、多至23小时、多至24小时或多至1-7、1-14、1-21或1-30天施用。
III.用于本发明的方法中的组合物
用于本发明的方法，即编辑SERPINA1多核苷酸例如包含与α1抗胰蛋白酶缺乏症(其可能导致肝衰竭或肺气肿)相关的单核苷酸多态性(SNP)的SERPINA1多核苷酸的方法以及用于治疗或预防受试者中SERPINA1相关疾病例如α1抗胰蛋白酶缺乏症的方法的组合物包括能够实现与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的作用于RNA的肌苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变的指导寡核苷酸。
用于本发明的方法中的寡核苷酸或指导寡核苷酸可用于将特定mRNA上的靶腺苷脱氨基，所述靶腺苷例如可被脱氨基以例如在有需要的受试者中产生治疗结果的腺苷。
下表1和2提供了由靶密码子内靶腺苷的脱氨基作用产生的修饰的实例。
表1
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表2.靶标密码子碱基组成和所得的修饰密码子
靶标密码子 修饰密码子
AAA AIA
AAC AIC
AAG AIG
AAU AIU
CAA CIA
CAC CIC
CAG CIG
CAU CIU
GAA GIA
GAC GIC
GAG GIG
GAU GIU
UAA UIA
UAC UIC
UAG UIG
UAU UIU
因为腺苷脱氨基为肌苷可能导致蛋白质在靶位置不再遭受突变A，所以脱氨基为肌苷的鉴定可以是功能性读出，例如评定是否存在功能性蛋白质，或者甚至评定由腺苷的存在引起的疾病被是否(部分)逆转。本文提及的每种疾病的功能评定通常将根据技术人员已知的方法进行。当靶腺苷的存在导致异常剪接时，读出可以是异常剪接是否仍在发生或发生更少的评定。另一方面，当靶腺苷的脱氨基作用需要引入剪接位点时，可以使用类似的方法来检查所需类型的剪接是否确实发生。在靶腺苷脱氨基后鉴定肌苷存在的非常合适的方式当然是使用本领域技术人员熟知的方法的RT-PCR和测序。
通常，使用本发明的寡核苷酸构建体可以逆转的任何靶RNA中的突变是G到A突变，并且因此可以设计寡核苷酸构建体。在募集腺苷脱氨酶的情况下，可以使用根据本发明的寡核苷酸构建体靶向的突变还包括C到A、U到A(在DNA水平上T到A)。尽管在后一种情况下RNA编辑不一定会使突变回复为野生型，但编辑的核苷酸可能引起相对于原始突变的改善。例如，导致框内终止密码子的突变(翻译后产生截短的蛋白质)可能被改变为编码氨基酸的密码子，所述氨基酸可能不是该位置的原始氨基酸，但产生具有至少一些功能性的(全长)蛋白质，至少比截短的蛋白质具有更多功能性。
寡核苷酸剂
用于本发明的方法中的寡核苷酸与包含与疾病例如α1抗胰蛋白酶缺乏症(其可能导致肝衰竭或肺气肿)相关的SNP的靶mRNA序列例如SERPINA1互补。在一些实施方案中，除了至少一个错配之外，指导寡核苷酸与靶mRNA互补。寡核苷酸包含与靶腺苷相反的错配。
指导寡核苷酸还能够募集作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)酶以使靶mRNA上的所选腺苷脱氨基。在一些实施方案中，寡核苷酸还包含一个或多个ADAR募集结构域。在一些实施方案中，仅一种腺苷被脱氨基。在一些实施方案中，1、2或3个腺苷被脱氨基。
用于本发明的方法中的寡核苷酸可以还包含增加稳定性和/或增加脱氨基效率的修饰(例如，替代性核苷酸)。
A.寡核苷酸
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸是天然存在的，并且不包含例如本领域已知的和本文描述的化学修饰和/或缀合。在另一个实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸被化学修饰，以增强稳定性或其他有益特征(例如，替代性核苷酸)。不受任何特定理论的束缚，据信某些修饰可增加核酸酶抗性和/或血清稳定性，或降低免疫原性。例如，本发明的多核苷酸可以含有发现天然存在于DNA或RNA中的核苷酸(例如，腺嘌呤、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷或肌苷)，或者可以含有对核苷酸的一个或多个组分(例如，核碱基、糖或磷酸-接头部分)具有一种或多种化学修饰的核苷酸。本发明的寡核苷酸可以通过天然存在的磷酸二酯键彼此连接，或者可以被修饰以通过硫代磷酸酯、3’-亚甲基膦酸酯、5’-亚甲基膦酸酯、3’-磷酸酰胺酯、2’-5’磷酸二酯、胍盐、S-甲基硫脲或肽键进行共价连接。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸具有式I-V中任一者的结构：
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸具有式I中任一者的结构，例如具有以下结构：
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸具有式II中任一者的结构，例如具有以下结构：
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸具有式III中任一者的结构。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸具有式IV中任一者的结构，例如具有以下结构：
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸具有式V中任一者的结构，例如具有以下结构：
在本发明的某些实施方案中，本发明的寡核苷酸的基本上所有核苷酸都是替代性核苷酸。在本发明的其他实施方案中，本发明的寡核苷酸的所有核苷酸都是替代性核苷酸。本发明的寡核苷酸(其中“基本上所有的核苷酸都是替代性核苷酸”)被大量但不完全修饰，并且可以包含不超过5、4、3、2或1个天然存在的核苷酸。在本发明的其他实施方案中，本发明的寡核苷酸可以包含不超过5、4、3、2或1个替代性核苷酸。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含以下结构：
[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
其中A和B各自是核苷酸；m和n各自独立地是5至40的整数；并且X1、X2和X3中的至少一个具有式I-V中任一者的结构。在一些实施方案中，X1、X2和X3中的至少一个具有式I的结构，其中R1是氟、羟基或甲氧基，并且N1是核碱基，或者具有式V的结构，其中R4是氢并且R5是氢；不具有式I结构的X1、X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；[Am]和[Bn]各自包含至少五个末端2’-O-甲基-核苷酸和至少四个末端硫代磷酸酯键，并且组合的[Am]和[Bn]的至少20％的核苷酸是2′-O-甲基-核苷酸。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含以下结构：
[Am]-X1-X2-X3-X4-[Bn]
其中A和B各自是核苷酸，m和n各自独立地是1至50的整数；X1、X2和X3各自独立地是核苷酸，并且X4选自2'-O-甲基核苷酸和2’-氟核苷酸；并且其中X1、X2或X3中的至少一个具有以上式I-V中任一者的结构，其中N1是氢或核碱基，R1是羟基、卤素或C1-C6烷氧基，R2是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基，R3是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基，R4是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基，并且R5是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基。
在一些实施方案中，X1包含腺嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含腺嘌呤核碱基；X1包含腺嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基；X1包含腺嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基；X1包含腺嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基；X1包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含腺嘌呤核碱基；X1包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基；X1包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基；X1包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基；X1包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含腺嘌呤核碱基；X1包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基；X1包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基；X1包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基；X1包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含腺嘌呤核碱基；X1包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基；X1包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基；或者X1包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸具有式VI-XI中任一者的结构：
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸具有式VI中任一者的结构。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸具有式VII中任一者的结构。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸具有式VIII中任一者的结构。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸具有式IX中任一者的结构，例如具有以下结构：
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸具有式X中任一者的结构，例如具有以下结构：
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸具有式XI中任一者的结构，例如具有以下结构：
在本发明的某些实施方案中，本发明的寡核苷酸的基本上所有核苷酸都是替代性核苷酸。在本发明的其他实施方案中，本发明的寡核苷酸的所有核苷酸都是替代性核苷酸。本发明的寡核苷酸(其中“基本上所有的核苷酸都是替代性核苷酸”)被大量但不完全修饰，并且可以包含不超过5、4、3、2或1个天然存在的核苷酸。在本发明的其他实施方案中，本发明的寡核苷酸可以包含不超过5、4、3、2或1个替代性核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含以下结构：
[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
其中A和B各自是核苷酸；m和n各自独立地是5至40的整数；X1、X2和X3中的至少一个具有式VI-XI中任一者的结构。在一些实施方案中，X1、X2和X3中的至少一个具有式VI、式VII、式VIII或式IX的结构，其中N1是核碱基，并且不具有式VI、式VII、式VIII、式IX的结构的X1、X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；[Am]和[Bn]各自包含至少五个末端2’-O-甲基-核苷酸和至少四个末端硫代磷酸酯键；并且组合的[Am]和[Bn]的至少20％的核苷酸是2’-O-甲基-核苷酸。在一些实施方案中，X1包含腺嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含腺嘌呤核碱基；X1包含腺嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基；X1包含腺嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基；X1包含腺嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基；X1包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含腺嘌呤核碱基；X1包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基；X1包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基；X1包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基；X1包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含腺嘌呤核碱基；X1包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基；X1包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基；X1包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基；X1包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含腺嘌呤核碱基；X1包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基；X1包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基；或者X1包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸具有式XII-XV中任一者的结构：
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸具有式XII中任一者的结构，例如具有以下结构：
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸具有式XIII中任一者的结构，例如具有以下结构：
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸具有式XIV中任一者的结构，例如具有以下结构：
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸具有式XV中任一者的结构。
在本发明的某些实施方案中，本发明的寡核苷酸的基本上所有核苷酸都是替代性核苷酸。在本发明的其他实施方案中，本发明的寡核苷酸的所有核苷酸都是替代性核苷酸。本发明的寡核苷酸(其中“基本上所有的核苷酸都是替代性核苷酸”)被大量但不完全修饰，并且可以包含不超过5、4、3、2或1个天然存在的核苷酸。在本发明的其他实施方案中，本发明的寡核苷酸可以包含不超过5、4、3、2或1个替代性核苷酸。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含以下结构：
[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
其中A和B各自是核苷酸；m和n各自独立地是5至40的整数；X1、X2和X3中的至少一个具有式XII-XV中任一者的结构。在一些实施方案中，X1、X2和X3中的至少一个具有式XIII的结构，其中R8和R9各自是氢，并且不具有式XIII的结构的X1、X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；[Am]和[Bn]各自包含至少五个末端2’-O-甲基-核苷酸和至少四个末端硫代磷酸酯键；并且组合的[Am]和[Bn]的至少20％的核苷酸是2’-O-甲基-核苷酸。
在一些实施方案中，X1包含腺嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含腺嘌呤核碱基；X1包含腺嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基；X1包含腺嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基；X1包含腺嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基；X1包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含腺嘌呤核碱基；X1包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基；X1包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基；X1包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基；X1包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含腺嘌呤核碱基；X1包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基；X1包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基；X1包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基；X1包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含腺嘌呤核碱基；X1包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含鸟嘌呤或次黄嘌呤核碱基；X1包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基；或者X1包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基，X2包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基或不包含核碱基，并且X3包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸能够实现作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变或靶RNA，其中寡核苷酸包含以下结构：
[Am]-X1-X2-X3-X4-[Bn]
其中A和B各自是核苷酸，m和n各自独立地是1至50的整数；X1、X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸，并且X4是2’-氟核苷酸；并且其中当寡核苷酸与靶RNA杂交时，X2与待脱氨基为肌苷的腺苷相反。
在一些实施方案中，用于本发明的方法中的寡核苷酸包含ADAR酶的募集结构域(例如，ADAR募集结构域)。在一些实施方案中，ADAR募集结构域是茎环结构。此类寡核苷酸可以被称为“axiomer AON”或“自环AON”募集部分用于将细胞中存在的天然ADAR酶募集到通过使靶序列与靶向部分杂交而形成的dsRNA上。募集部分可以是模拟天然底物的茎环结构(例如谷氨酸离子型受体AMPA型亚基2(GluR2)受体；例如GluR2 ADAR募集结构域)或已知被ADAR酶的dsRNA结合区识别的Z-DNA结构(例如，Z-DNAADAR募集结构域)。由于GluR2和Z-DNA ADAR募集结构域是ADAR的高亲和力结合配偶体，因此不需要缀合实体或不需要存在修饰的重组ADAR酶。茎环结构可以是由两条分开的核酸链形成的分子间茎环结构，或者是在单个核酸链内形成的分子内茎环结构。募集部分的茎环结构可以是以下文献中描述的茎环结构：WO 2016/097212；US 2018/0208924；Merkle等人Nature Biotechnology，37：133-8(2019)；Katrekar等人Nature Methods，16(3)：239-42(2019)；Fukuda等人ScientificReports，7：41478(2017)，所述文献的ADAR募集部分的茎环结构以引用方式并入本文。在一些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个ADAR募集结构域(例如，1个或2个ADAR募集结构域)。在一些实施方案中，ADAR募集结构域位于寡核苷酸的5’末端。在其他实施方案中，ADAR募集结构域位于寡核苷酸的3’末端。在一些实施方案中，寡核苷酸包含第一ADAR募集结构域和第二ADAR募集结构域。第一ADAR募集结构域位于寡核苷酸的5’末端，并且第二ADAR募集结构域位于所述寡核苷酸的3’末端。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含式XVI的结构：
C-L1-D-L2-[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
式XVI，
其中[Am]-X1-X2-X3-[Bn]是式I-XV中任一者的寡核苷酸；C是长度为10-50个连接的核苷的单链寡核苷酸；L1是环区；并且D是长度为10-50个连接的核苷的单链寡核苷酸；L2是任选的接头；其中所述寡核苷酸包含由长度在10-50个连接的核苷之间的C和D形成的双链体结构，其中所述双链体结构在C的核苷酸与D的核苷酸之间包含至少一个错配，并且其中C或D包含至少一个替代性核碱基。
在一些实施方案中，C和D包含至少一个替代性核碱基。在其他实施方案中，L1包含连接的核苷。在另一个实施方案中，L1由连接的核苷组成。在一些实施方案中，L1包含至少一个替代性核碱基、至少一个替代性核苷间键和/或至少一个替代性糖部分。在一些实施方案中，C或D包含至少一个替代性核苷间键和/或至少一个替代性糖部分。在一些实施方案中，C和D各自独立地包含至少一个替代性核苷间键和/或至少一个替代性糖部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含式XVII的结构：
C-L1-D-L2-[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
式XVII，
其中[Am]-X1-X2-X3-[Bn]是式I-XV中任一者的寡核苷酸；C是长度为10-50个连接的核苷的单链寡核苷酸；L1是并不由连接的核苷组成的环区；并且D是长度为10-50个连接的核苷的单链寡核苷酸；L2是任选的接头，其中寡核苷酸包含由长度在10-50个连接的核苷之间的C和D形成的双链体结构，并且其中双链体结构在C的核苷酸与D的核苷酸之间包含至少一个错配。
在一些实施方案中，L1具有式XVIII的结构：
F1-(G1)j-(H1)k-(G2)m-(I)-(G3)n-(H2)p-(G4)q-F2
式XVIII，
其中F1是环区与C之间的键；F2是D与[Am]之间或D与任选的接头之间的键；G1、G2、G3和G4各自独立地选自任选取代的C1-C2烷基、任选取代的C1-C3杂烷基、O、S和NRN；RN是氢、任选取代的C1-4烷基、任选取代的C2-4烯基、任选取代的C2-4炔基、任选取代的C2-6杂环基、任选取代的C6-12芳基或任选取代的C1-7杂烷基；C1和C2各自独立地选自羰基、硫代羰基、磺酰基或磷酰基；j、k、m、n、p和q各自独立地是0或1；并且I是任选取代的C1-10烷基、任选取代的C2-10烯基、任选取代的C2-10炔基、任选取代的C2-6杂环基、任选取代的C6-12芳基、任选取代的C2-C10聚乙二醇或C1-10杂烷基或者连接F1-(G1)j-(H1)k-(G2)m-(I)-(G3)n-(H2)p-(G4)q-F2的化学键。
在一些实施方案中，L1包含含碳水化合物的连接部分。
在一些实施方案中，C或D各自包含至少一个替代性核碱基、至少一个替代性核苷间键和/或至少一个替代性糖部分。在一些实施方案中，C和D各自包含至少一个替代性核碱基、至少一个替代性核苷间键和/或至少一个替代性糖部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含式XIX的结构：
C-L1-D-L2-[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
式XIX，
其中[Am]-X1-X2-X3-[Bn]是式I至XV中任一者的寡核苷酸；C是长度为10-50个连接的核苷的单链寡核苷酸；L1是包含至少一个替代性核碱基或至少一个替代性核苷间键的环区；D是长度为10-50个连接的核苷的单链寡核苷酸；L2是任选的接头，其中寡核苷酸包含由长度在10-50个连接的核苷之间的C和D形成的双链体结构，并且其中双链体结构在C的核苷酸与D的核苷酸之间包含至少一个错配。
在一些实施方案中，L1包含至少一个替代性核碱基和至少一个替代性核苷间键。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含式XX的结构：
C-L1-D-L2-[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
式XX，
其中[Am]-X1-X2-X3-[Bn]是式I至XV中任一者的寡核苷酸；C是长度为10-50个连接的核苷的单链寡核苷酸；L1是包含至少一个替代性糖部分的环区，其中所述替代性糖部分选自由以下组成的组：2′-O-C1-C6烷基糖部分、2′-氨基糖部分、2′-氟代糖部分、2′-O-MOE糖部分、阿拉伯核酸(ANA)糖部分、脱氧核糖糖部分和双环核酸；D是长度为10-50个连接的核苷的单链寡核苷酸；并且L2是任选的接头，其中寡核苷酸包含由长度在10-50个连接的核苷之间的C和D形成的双链体结构，并且其中双链体结构在C的核苷酸与D的核苷酸之间包含至少一个错配。
在一些实施方案中，双环糖部分选自氧基-LNA糖部分(也称为“LNA糖部分”)、硫代-LNA糖部分、氨基-LNA糖部分、cEt糖部分和亚乙基桥(ENA)糖部分。在一些实施方案中，ANA糖部分是2’-氟-ANA糖部分。
在一些实施方案中，C或D包含至少一个替代性核碱基、至少一个替代性核苷间键和/或至少一个替代性糖部分。在一些实施方案中，C和D各自包含至少一个替代性核碱基、至少一个替代性核苷间键和/或至少一个替代性糖部分。在一些实施方案中，C与D的至少5个连续核碱基互补。在一些实施方案中，C的至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％)核碱基与D的核碱基互补。
在一些实施方案中，C包含与SEQ ID NO.1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31和34中任一者所示的核碱基序列具有至少80％序列同一性的核碱基序列。
在一些实施方案中，D包含与SEQ ID NO.2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32和35中任一者所示的核碱基序列具有至少80％序列同一性的核碱基序列。
在一些实施方案中，C-L1-D包含与SEQ ID NO.3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和36中任一者所示的核碱基序列具有至少80％序列同一性的核碱基序列。
在一些实施方案中，至少一个替代性核碱基选自由以下组成的组：5-甲基胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、N4-甲基胞嘧啶、N3-甲基胞嘧啶、N4-乙基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-氨基胞嘧啶、5-乙炔基胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、吡咯胞嘧啶、5-氨基甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、萘啶、5-甲氧基尿嘧啶、假尿嘧啶、二氢尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、4-硫代胸腺嘧啶、5，6-二氢胸腺嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-氨基甲基尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、次黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂-7-脱氮鸟嘌呤、7-氮杂-2，6-二氨基嘌呤、噻吩并鸟嘌呤、N1-甲基鸟嘌呤、N2-甲基鸟嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、8-甲氧基鸟嘌呤、8-烯丙氧基鸟嘌呤、7-氨基甲基-7-脱氮鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、咪唑并吡啶并嘧啶、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤、8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤、N1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-甲基腺嘌呤或8-叠氮基腺嘌呤。
在一些实施方案中，至少一个替代性核碱基选自由以下组成的组：2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-叠氮基腺嘌呤、8-甲基腺嘌呤、5-羟甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、吡咯并胞嘧啶、7-氨基甲基-7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、8-氮杂-7-脱氮-鸟嘌呤、噻吩并鸟嘌呤、次黄嘌呤、4-硫代-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、二氢-尿嘧啶或假尿嘧啶。
在一些实施方案中，至少一个替代性核苷间键选自由以下组成的组：硫代磷酸酯核苷间键、2’-烷氧基核苷间键和烷基磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，至少一个替代性核苷间键是至少一个硫代磷酸酯核苷间键。
在一些实施方案中，至少一个替代性糖部分选自由以下组成的组：2′-O-烷基糖部分、2′-O-甲基糖部分、2′-氨基糖部分、2′-氟代糖部分、2′-O-MOE糖部分、ANA糖部分、脱氧核糖糖部分和双环核酸。在一些实施方案中，双环糖部分选自氧基-LNA糖部分、硫代-LNA糖部分、氨基-LNA糖部分、cEt糖部分和亚乙基桥(ENA)糖部分。在一些实施方案中，ANA糖部分是2’-氟-ANA糖部分。在一些实施方案中，至少一个替代性糖部分是2′-O-甲基-糖部分、2′-氟-糖部分或2′-O-MOE糖部分。
在一些实施方案中，至少一个错配是配对的A到C错配、配对的G到G错配或配对的C到A错配。在一些实施方案中，寡核苷酸在C核苷酸与D核苷酸之间包含至少两个错配。
在一些实施方案中，至少两个错配被至少三个连接的核苷分开。在一些实施方案中，至少两个错配被三个连接的核苷分开。
在一些实施方案中，至少一个错配包含具有替代性核碱基的核苷。在一些实施方案中，替代性核碱基具有以下结构：
其中R1是氢、三氟甲基、任选取代的氨基、羟基或任选取代的C1-C6烷氧基；R2是氢、任选取代的氨基或任选取代的C1-C6烷基；并且R3和R4独立地是氢、卤素或任选取代的C1-C6烷基，或其盐。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸包括包含具有式XXXIV结构的ADAR募集结构域的那些寡核苷酸：
C-L1-D，
式XXXIV，
其中C是长度为约10-50个连接的核苷的单链寡核苷酸(例如，长度为约10、15、20、25、30、35、40、45、46、47、48、49或50个连接的核苷)，L1是环区，并且D是长度为约10-50个连接的核苷的单链寡核苷酸(例如，长度为约10、15、20、25、30、35、40、45、46、47、48、49或50个连接的核苷)。
在一些实施方案中，C包含与D互补，使得两条链在合适的条件下杂交并形成双链体的区域。通常，双链体结构的长度在5与50个连接的核苷之间，例如长度为5-49、5-45、5-40、5-35、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、5-6、8-50、8-45、8-40、8-35、8-30、8-25、8-20、8-15、8-10、15-50、15-45、15-40、15-35、15-30、15-25、15-20、15-16、20-50、20-45、20-40、20-35、20-30、20-25、25-50、25-45、25-40、25-35或25-30个连接的核苷之间。预期介于上述范围和长度之间的范围和长度也是本发明的一部分。在一些实施方案中，C与D的至少5个连续核碱基(例如5、10、15、20、25、30或更多连续核碱基)互补，并且寡核苷酸形成长度为10-50个连接的核苷之间(例如长度为至少10、15、20、25、30、35、40、45、46、47、48、49或50个连接的核苷)的双链体结构。
在一些实施方案中，双链体结构在C的核苷酸与D的核苷酸之间包含至少一个错配(例如至少1、2、3、4或5个错配)。在一些实施方案中，错配是配对的A到C错配。在一些实施方案中，A到C错配的A核苷是在C链上，并且A到C错配的C核苷是在D链上。在一些实施方案中，A到C错配的A核苷是在D链上，并且A到C错配的C核苷是在C链上。在其他实施方案中，错配是配对的G到G错配。在其他实施方案中，错配是配对的C到A错配。在一些实施方案中，C到A错配的C核苷是在C链上，并且C到A错配的A核苷是在D链上。在一些实施方案中，C到A错配的C核苷是在D链上，并且C到A错配的A核苷是在C链上。在一些实施方案中，错配是配对的I到I错配。在一些实施方案中，错配是配对的I到G错配。在一些实施方案中，I到G错配的I核苷是在C链上，并且I到G错配的G核苷是在D链上。在一些实施方案中，I到G错配的I核苷是在D链上，并且I到G错配的G核苷是在C链上。在一些实施方案中，错配是配对的G到I错配。在一些实施方案中，G到I错配的G核苷是在C链上，并且G到I错配的I核苷是在D链上。在一些实施方案中，G到I错配的G核苷是在D链上，并且G到I错配的I核苷是在C链上。在一些实施方案中，错配包含具有替代性核碱基的核苷。在一些实施方案中，替代性核碱基具有以下结构：
其中R1是氢、三氟甲基、任选取代的氨基、羟基或任选取代的C1-C6烷氧基；R2是氢、任选取代的氨基或任选取代的C1-C6烷基；并且R3和R4独立地是氢、卤素或任选取代的C1-C6烷基，或其盐。在一些实施方案中，R1是氢键供体基团(例如，羟基、氨基)。在一些实施方案中，R1是氢键接受基团(例如，烷氧基)。
在一些实施方案中，双链体结构包含两个错配。在一些实施方案中，错配相隔至少三个连接的核苷。例如，当错配“被3个核苷酸分开”时，寡核苷酸包含结构M1-N1-N2-N3-M2，其中M1是第一个错配，N1、N2和N3是配对的核碱基，并且M2是第二个错配。在一些实施方案中，M1是配对的A到C错配，并且M2是配对的G到G错配。
在一些实施方案中，环区L1包含连接的核苷。在一些实施方案中，L1包含至少一个替代性核碱基、至少一个替代性核苷间键和/或至少一个替代性糖部分。
在其他实施方案中，环区具有式XVIII的结构：
F1-(G1)j-(H1)k-(G2)m-(I)-(G3)n-(H2)p-(G4)q-F2
式XVIII，
其中F1是环区与C之间的键；F2是D与核苷酸之间或D与任选的接头之间的键；G1、G2、G3和G4各自独立地选自任选取代的C1-C2烷基、任选取代的C1-C3杂烷基、O、S和NRN；RN是氢、任选取代的C1-4烷基、任选取代的C2-4烯基、任选取代的C2-4炔基、任选取代的C2-6杂环基、任选取代的C6-12芳基或任选取代的C1-7杂烷基；C1和C2各自独立地选自羰基、硫代羰基、磺酰基或磷酰基；j、k、m、n、p和q各自独立地是0或1；并且I是任选取代的C1-10烷基、任选取代的C2-10烯基、任选取代的C2-10炔基、任选取代的C2-6杂环基、任选取代的C6-12芳基、任选取代的C2-C10聚乙二醇或任选取代的C1-10杂烷基或者连接F1-(G1)j-(H1)k-(G2)m-(I)-(G3)n-(H2)p-(G4)q-F2的化学键。在一些实施方案中，接头是任选的。
在一些实施方案中，环区L1包含含碳水化合物的连接部分。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸是天然存在的，并且不包含例如本领域已知的和本文描述的化学修饰和/或缀合。在另一个实施方案中，本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸被化学修饰，以增强稳定性或其他有益特征(例如，替代性核苷酸)。不受理论的束缚，据信某些修饰可增加核酸酶抗性和/或血清稳定性，或降低免疫原性。例如，本发明的多核苷酸可以含有发现天然存在于DNA或RNA中的核苷酸(例如，腺嘌呤、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷或肌苷)，或者可以含有对核苷酸的一个或多个组分(例如，核碱基、糖或磷酸-接头部分)具有一种或多种化学修饰的核苷酸。本发明的寡核苷酸可以通过天然存在的磷酸二酯键彼此连接，或者可以被修饰以通过硫代磷酸酯、3’-亚甲基膦酸酯、5’-亚甲基膦酸酯、3’-磷酸酰胺酯、2’-5’磷酸二酯、胍盐、S-甲基硫脲或肽键进行共价连接。
在一些实施方案中，C包含至少一个替代性核碱基、至少一个替代性核苷间键和/或至少一个替代性糖部分。在其他实施方案中，D包含至少一个替代性核碱基、至少一个替代性核苷间键和/或至少一个替代性糖部分。在一些实施方案中，C和D均包含至少一个替代性核碱基、至少一个替代性核苷间键和/或至少一个替代性糖部分。
在本发明的某些实施方案中，本发明的寡核苷酸的基本上所有核苷酸都是替代性核苷酸。在本发明的其他实施方案中，本发明的寡核苷酸的所有核苷酸都是替代性核苷酸。本发明的寡核苷酸(其中“基本上所有的核苷酸都是替代性核苷酸”)被大量但不完全修饰，并且可以包含不超过5、4、3、2或1个天然存在的核苷酸。在本发明的其他实施方案中，本发明的寡核苷酸可以包含不超过5、4、3、2或1个替代性核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸包含具有式XXXIV的结构的ADAR募集结构域，其中C是长度为10-50个连接的核苷的单链寡核苷酸，L1是环区，并且D是长度为10-50个连接的核苷的单链寡核苷酸。在一些实施方案中，C与D的至少5个连续核碱基互补，并且寡核苷酸包含由长度在10-50个连接的核苷之间的C和D形成的双链体结构。在一些实施方案中，双链体结构包含至少一个错配。在一些实施方案中，C或D包含至少一个替代性核碱基。在一些实施方案中，C和D各自包含至少一个替代性核碱基。在一些实施方案中，C和/或D独立地还包含至少一个替代性核苷间键和/或至少一个替代性糖部分。在一些实施方案中，L1包含连接的核苷酸。在其他实施方案中，L1由连接的核苷组成。在一些实施方案中，L1包含至少一个替代性核碱基、至少一个替代性核苷间键和/或至少一个替代性糖部分。
在另一个实施方案中，本发明的寡核苷酸包含具有式XXXIV的结构的ADAR募集结构域，其中C是长度为10-50个连接的核苷的单链寡核苷酸，L1是不包含连接的核苷的环区，并且D是长度为10-50个连接的核苷的单链寡核苷酸。在一些实施方案中，C与D的至少5个连续核碱基互补，并且寡核苷酸包含由长度在10-50个连接的核苷之间的C和D形成的双链体结构。在一些实施方案中，双链体结构包含至少一个错配。在一些实施方案中，L1具有如本文所述的式VIII的结构。在一些实施方案中，L1包含含碳水化合物的连接部分。在一些实施方案中，C和/或D独立地包含至少一个替代性核碱基、至少一个替代性核苷间键和/或至少一个替代性糖部分。
在另一个实施方案中，本发明的寡核苷酸包含具有式XXXIV的结构的ADAR募集结构域，其中C是长度为10-50个连接的核苷的单链寡核苷酸，L1是包含至少一个替代性核碱基或至少一个替代性核苷间键的环区，并且D是长度为10-50个连接的核苷的单链寡核苷酸。在一些实施方案中，C与D的至少5个连续核碱基互补，并且寡核苷酸包含由长度在10-50个连接的核苷之间的C和D形成的双链体结构。在一些实施方案中，双链体结构包含至少一个错配。在一些实施方案中，L1包含至少一个替代性核碱基和至少一个替代性核苷间键。
在另一个实施方案中，本发明的寡核苷酸包含具有式XXXIV的结构的ADAR募集结构域，其中C是长度为10-50个连接的核苷的单链寡核苷酸，L1是包含至少一个不是2′-O-甲基糖部分的替代性糖部分的环区(例如，所述替代性糖部分选自由以下组成的组：2′-O-C1-C6烷基糖部分、2′-氨基-糖部分、2′-氟-糖部分、2′-O-MOE糖部分、LNA糖部分、阿拉伯核酸(ANA)糖部分、2′-氟-ANA糖部分、脱氧核糖糖部分和双环核酸)，并且D是长度为10-50个连接的核苷的单链寡核苷酸。在一些实施方案中，C与D的至少5个连续核碱基互补，并且寡核苷酸包含由长度在10-50个连接的核苷之间的C和D形成的双链体结构。在一些实施方案中，双链体结构包含至少一个错配。在一些实施方案中，C和/或D独立地包含至少一个替代性核碱基、至少一个替代性核苷间键和/或至少一个替代性糖部分。
在一些实施方案中，C包含与SEQ ID NO.1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31和34中任一者所示的核碱基序列具有至少50％序列同一性(例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性)的核碱基序列，并且D包含与C的核碱基序列互补的核碱基序列，其中所述序列包含至少一个如本文所述的错配。在其他实施方案中，D包含与任一SEQ ID NO.2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32和35中任一者所示的核碱基序列具有至少50％序列同一性(例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性)的核碱基序列，并且C包含与C的核碱基序列互补的核碱基序列，其中所述序列包含至少一个如本文所述的错配。在一些实施方案中，C-L1-D包含与SEQ ID No.3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和36中任一者所示的核碱基序列具有至少50％序列同一性(例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性)的核碱基序列，其中所述序列包含至少一个如本文所述的错配。
SEQ ID No.1-36的核碱基序列在表3中提供：
表3
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应当理解，尽管SEQ ID NO.1-36中的序列被描述为未修饰的和/或未缀合的序列，但本发明的寡核苷酸的RNA可以包含作为替代性核苷的SEQ ID NO.1-36中所示序列中的任一种，和/或是如下文详细描述地缀合的。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸可以还包含5’帽结构。在一些实施方案中，5’帽结构是2，2，7-三甲基鸟苷帽。
本发明的寡核苷酸可以通过本领域已知的如下文讨论的标准方法合成，例如通过使用自动化DNA合成仪，例如可从例如Biosearch，Applied Biosystems，Inc.商购获得的合成仪来合成。
寡核苷酸化合物可以使用溶液相或固相有机合成或两者来制备。有机合成的优点在于，可以容易地制备包含非天然或替代性核苷酸的寡核苷酸。本发明的单链寡核苷酸可以使用溶液相或固相有机合成或两者来制备。
此外，预期对于本文鉴定的任何序列，可以通过系统地添加或去除连接的核苷以产生更长或更短的序列来实现进一步的优化。此外，可以通过例如引入如本文所述或本领域已知的替代性核苷、替代性糖部分和/或替代性核苷间键，包括如本领域已知和/或本文讨论的替代性核苷、替代性糖部分和/或替代性核苷间键来调整此类优化的序列，以进一步优化分子(例如，增加血清稳定性或循环半衰期，增加热稳定性，增强跨膜递送，靶向特定位置或细胞类型，和/或增加与RNA编辑酶(例如ADAR)的相互作用)。
在一些实施方案中，一个或多个ADAR募集结构域是GluR2ADAR募集结构域。在一些实施方案中，GluR2 ADAR募集结构域具有SEQ ID NO.37的核苷酸序列，如下以5’至3’方向所示：
GGUGAAUAGUAUAACAAUAUGCUAAAUGUUGUUAUAGUAUC
CACC
(SEQ ID NO.37)
在一些实施方案中，寡核苷酸包含如下所示的式XXI的结构：
其中[ASO]包含本发明的任何寡核苷酸，其中m表示错配的核苷酸。在一些实施方案中，GluR2 ADAR募集结构域具有SEQ ID NO.38的核苷酸序列，如下以5′到3′方向所示：
GGUGAAGAGGAGAACAAUAUGCUAAAUGUUGUUCUCGUCUCCACC
(SEQ ID NO.38)
在一些实施方案中，寡核苷酸包含如下所示的式XXII的结构：
其中[ASO]包含本发明的任何寡核苷酸，其中m表示错配的核苷酸。在一些实施方案中，GluR2 ADAR募集结构域具有SEQ ID NO.39的核苷酸序列，如下以5′到3′方向所示：
GGUGUCGAGAAGAGGAGAACAAUAUGCUAAAUGUUGUUCUCGUCUCCUCGACACC
(SEQ ID NO.39)
在一些实施方案中，寡核苷酸包含如下所示的式XXIII的结构：
其中[ASO]包含本发明的任何寡核苷酸，其中m表示错配的核苷酸。
在一些实施方案中，GluR2 ADAR募集结构域具有SEQ ID NO.40的核苷酸序列，如下以5′到3′方向所示：
*s*s*G**GAGAAGAGGAGAA*AA*A*G**AAA*G**G*****G*******GA*A**(SEQ IDNO.40)
其中*是2’-O-甲基核苷酸，并且s是两个连接的核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，寡核苷酸包含如下所示的式XXIV的结构：
其中[ASO]包含本文呈现的任一种寡核苷酸，其中*是2’-O-甲基核苷酸，其中s是硫代磷酸酯核苷间键，其中m表示错配的核苷酸。在一些实施方案中，ADAR募集结构域还包含至少一个核酸酶抗性核苷酸(例如，2’-O-甲基核苷酸)。在一些实施方案中，ADAR募集结构域包含至少一个替代性核苷间键(例如，硫代磷酸酯核苷间键)。在一些实施方案中，GluR2 ADAR募集结构域具有SEQ ID NO.41的核苷酸序列，如下以5′到3′方向所示：
GGGUGGAAUAGUAUAACAAUAUGCUAAAUGUUGUUAUAGUAUCCCACCU
(SEQ ID NO.41)
在一些实施方案中，寡核苷酸包含如下所示的式XXV的结构：
式XXV，
其中[ASO]包含本发明的任何寡核苷酸，其中m表示错配的核苷酸。在一些实施方案中，GluR2 ADAR募集结构域具有SEQ ID NO.42的核苷酸序列，如下以5′到3′方向所示：
GUGGAAUAGUAUAACAAUAUGCUAAAUGUUGUUAUAGUAUCCCAC
(SEQ ID NO.42)
在一些实施方案中，寡核苷酸包含如下所示的式XXVI的结构：
其中[ASO]包含本发明的任何寡核苷酸，其中m表示错配的核苷酸。在一些实施方案中，GluR2 ADAR募集结构域具有SEQ ID NO.43的核苷酸序列，如下以5′到3′方向所示：
GGUGUCGAGAAUAGUAUAACAAUAUGCUAAAUGUUGUUAUAGUAUCCUCGACACC
(SEQ ID NO.43)
在一些实施方案中，寡核苷酸包含如下所示的式XXVII的结构：
其中[ASO]包含本发明的任何寡核苷酸，其中m表示错配的核苷酸。在一些实施方案中，GluR2 ADAR募集结构域具有SEQ ID NO.44的核苷酸序列，如下以5′到3′方向所示：
GGGUGGAAUAGUAUAACAAUAUGCUAAAUGUUGUUAUAGUAUCCCACCU
(SEQ ID NO.44)
在一些实施方案中，寡核苷酸包含如下所示的式XXVIII的结构：
其中[ASO]包含本发明的任何寡核苷酸，其中m表示错配的核苷酸。在一些实施方案中，GluR2 ADAR募集结构域具有SEQ ID NO.45的核苷酸序列，如下以5′到3′方向所示：
GGGUGGAA UAGUAUACCAUUCGUGGUAUAGUAUCCCACCU(SEQ ID NO.45)
在一些实施方案中，寡核苷酸包含如下所示的式XXIX的结构：
其中[ASO]包含本发明的任何寡核苷酸，其中m表示错配的核苷酸。在一些实施方案中，GluR2 ADAR募集结构域具有SEQ ID NO.46的核苷酸序列，如下以5′到3′方向所示：
GUGGGUGGAAUAGUAUACCAUUCGUGGUA UAGUAUCCCACCUAC
(SEQ ID NO.46)
在一些实施方案中，寡核苷酸包含如下所示的式XXX的结构：
其中[ASO]包含本发明的任何寡核苷酸，其中m表示错配的核苷酸。在一些实施方案中，GluR2 ADAR募集结构域具有SEQ ID NO.47的核苷酸序列，如下以5′到3′方向所示：
UGGGUGGAAUAGUA UACCAUUCGUGGUAUAGUAUCCCACCUA
(SEQ ID NO.47)
在一些实施方案中，寡核苷酸包含如下所示的式XXXI的结构：
其中[ASO]包含本发明的任何寡核苷酸，其中m表示错配的核苷酸。在一些实施方案中，GluR2 ADAR募集结构域具有SEQ ID NO.48的核苷酸序列，如下以5′到3′方向所示：
GGUGGAAUAGUAUACCAUUCGUGGUA UAGUAUCCCACC
(SEQ ID NO.48)
在一些实施方案中，寡核苷酸包含如下所示的式XXXII的结构：
其中[ASO]包含本发明的任何寡核苷酸，其中m表示错配的核苷酸。在一些实施方案中，GluR2 ADAR募集结构域具有SEQ ID NO.49的核苷酸序列，如下以5′到3′方向所示：
GUGGAAUAGUAUACCAUUCGUGGUAUAGUAUCCCAC(SEQ ID NO.49)
在一些实施方案中，寡核苷酸包含如下所示的式XXXIII的结构：
其中[ASO]包含本发明的任何寡核苷酸，其中m表示错配的核苷酸。
在一些实施方案中，ADAR募集结构域是Z-DNA ADAR募集结构域。在一些实施方案中，ADAR募集结构域是MS2 ADAR募集结构域。在一些实施方案中，MS2噬菌体茎环结构可以用作ADAR募集结构域(例如，以及MS2 ADAR募集结构域)。已知MS2茎环结合MS2噬菌体外壳蛋白，其当融合到ADAR的脱氨酶结构域(例如ADAR融合蛋白)时，可用于靶特异性脱氨基。在一些实施方案中，MS2 ADAR募集结构域具有SEQ ID NO.50的核苷酸序列，如下以5′到3′方向所示：
ACATGAGGATCACCCATGT(SEQ ID NO.50)
在一些实施方案中，使用包含编码ADAR融合蛋白的多核苷酸的表达载体构建体向细胞或受试者施用ADAR融合蛋白。在一些实施方案中，ADAR融合蛋白包含ADAR脱氨酶结构域与MS2噬菌体外壳蛋白的融合物。在一些实施方案中，ADAR的脱氨酶结构域是ADAR1的脱氨酶结构域。在一些实施方案中，ADAR的脱氨酶结构域是ADAR2的脱氨酶结构域。ADAR融合蛋白可以是Katrekar等人Nature Methods，16(3)：239-42(2019)中描述的融合蛋白，所述文献的ADAR融合蛋白以引用方式并入本文
本发明的核酸可以通过本领域中已建立的方法来合成和/或修饰，所述方法例如″Current protocols in nucleic acid chemistry，″Beaucage，S.L.等人(编者)，JohnWiley&Sons，Inc.，New York，N.Y.，USA中描述的那些方法，所述文献特此以引用方式并入本文。替代性核苷酸和核苷包含具有修饰的那些，所述修饰包括例如末端修饰，例如5’-末端修饰(磷酸化、缀合、反向键)或3’-末端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向键等)；碱基修饰，例如用稳定碱基、去稳定碱基或与扩大的配偶体库发生碱基配对的碱基置换，去除碱基(无碱基核苷酸)或缀合碱基；糖修饰(例如，在2’-位置或4’-位置)或糖的置换；和/或主链修饰，包括磷酸二酯键的修饰或置换。核碱基也可以是异核苷，其中核碱基从糖部分的C1位置移动到不同的位置(例如C2、C3、C4或C5)。可用于本文所述的实施方案的寡核苷酸化合物的具体实例包括但不限于含有修饰主链或不含天然核苷间键的替代性核苷。具有修饰主链的核苷酸和核苷尤其包括主链中没有磷原子的那些。出于本说明书的目的，并且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的替代性RNA也可以被认为是寡核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸在其核苷间主链中将具有磷原子。
替代性核苷间键包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯和其他烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基磷酰胺酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3’-5’键的二羟硼基磷酸酯、这些的2’-5’-连接的类似物以及具有相反极性的那些，其中相邻成对核苷单元是连接的3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。
教导上述含磷键的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；以及美国专利RE39464，每篇专利的全部内容特此以引用方式并入本文。
其中不包含磷原子的替代性核苷间键具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些主链包括具有吗啉代键的那些(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其他主链。
教导上述寡核苷的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439，每篇专利的全部内容特此以引用方式并入本文。
在其他实施方案中，合适的寡核苷酸包括其中核苷酸单元的糖和核苷间键(即主链)都被置换的那些寡核苷酸。保持碱基单元以用于与适当的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物是已显示具有优异杂交性质的模拟物，被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，核苷的糖被含酰胺的主链，特别是氨乙基甘氨酸主链置换。核碱基被保留并直接或间接与主链酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262，每篇专利的全部内容特此以引用方式并入本文。适用于本发明的寡核苷酸的其他PNA化合物描述于例如Nielsen等人，Science，1991，254，1497-1500中。
本发明的一些实施方案包括具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的寡核苷酸，所述杂原子主链特别是上文引用的美国专利号5,489,677的-CH2-NH-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-N(CH3)-CH2-CH2-[其中天然磷酸二酯主链被表示为-O-P-O-CH2-]，以及上文引用的美国专利号5,602,240的酰胺主链。在一些实施方案中，本文描述的寡核苷酸具有上文引用的美国专利号5,034,506的吗啉代主链结构。在其他实施方案中，本文所述的寡核苷酸包含磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(PMO)，其中脱氧核糖部分被吗啉环置换，并且带电荷的磷酸二酯亚基间键被不带电荷的磷酸二酰胺键置换，如Summerton等人，AntisenseNucleic Acid Drug Dev.1997，7：63-70中所述的。
替代性核苷和核苷酸也可以含有一个或多个取代的糖部分。寡核苷酸例如本文描述的寡核苷酸可以在2’-位置处包含以下之一：OH；F；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性的合适修饰包括-O[(CH2)nO]mCH3、-O(CH2)nOCH3、-O(CH2)n-NH2、-O(CH2)nCH3、-O(CH2)n-ONH2和-O(CH2)n-ON[(CH2)nCH3]2，其中n和m为1至约10。在其他实施方案中，寡核苷酸在2’位置处包含以下之一：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团或用于改善寡核苷酸的药效动力学性质的基团，以及具有类似性质的其他取代基。在一些实施方案中，修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O-CH2CH2OCH3，也称为2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-O-MOE)(Martin等人，Helv.Chin.Acta，1995，78：486-504)，即烷氧基-烷氧基。2’-O-MOE核苷赋予寡核苷酸几种有益的性质，包括但不限于与未修饰的寡核苷酸相比，增加的核酸酶抗性、改善的药代动力学性质、减少的非特异性蛋白结合、降低的毒性、减少的免疫刺激性质和增强的靶亲和力。
另一个示例性替代物含有2’-二甲氨基氧基乙氧基，即-O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2’-DMAOE，如本文以下实施例中所述，以及2’-二甲氨基乙氧基乙氧基(本领域也称为2’-O-二甲氨基乙氧基乙基或2′-DMAEOE)，即′-O-(CH2)2-O-(CH2)2-N(CH3)2。其他示例性替代物包括：5’-Me-2’-F核苷酸、5'-Me-2’-OMe核苷酸、5'-Me-2’-脱氧核苷酸(这三个家族中的R和S异构体)；2’-烷氧基烷基；以及2’-NMA(N-甲基乙酰胺)。
其他替代物包括2′-甲氧基(2′-OCH3)、2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2′-氟代(2′-F)。类似修饰也可以在寡核苷酸的核苷和核苷酸的其他位置进行，特别是在3’末端核苷酸上或在2’-5’连接的寡核苷酸中糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸也可以具有糖模拟物，例如环丁基部分代替戊呋喃糖基糖。教导此类修饰的糖结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；以及5,700,920。前述每篇专利的全部内容特此以引用方式并入本文。
用于本发明的方法中的寡核苷酸也可以包含核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)替代物(例如修饰或取代)。未修饰或天然的核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。替代性核碱基包括其他合成和天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶、5-羧基胞嘧啶、吡咯胞嘧啶、双脱氧胞嘧啶、尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-羟基脱氧尿嘧啶、二氢尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、脱氧尿嘧啶、5-羟基丁炔-2’-脱氧尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、7-脱氮-黄嘌呤、噻吩并鸟嘌呤、8-氮杂-7-脱氮鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、6-氨基甲基-7-脱氮鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、2，2，7-三甲基鸟嘌呤、8-甲基腺嘌呤、8-叠氮基腺嘌呤、7-甲基腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、8-氨基-腺嘌呤、胸腺嘧啶、二脱氧胸腺嘧啶、5-硝基吲哚、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-氮杂尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代、具体地5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤。其他核碱基包括美国专利号3,687,808中公开的那些；Modified Nucleosides inBiochemistry，Biotechnology and Medicine，Herdewijn，P.编Wiley-VCH，2008中公开的那些；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，第858-859页，Kroschwitz，J.L编John Wiley&Sons，1990中公开的那些；Englisch等人，(1991)Angewandte Chemie，International Edition，30：613中公开的那些；以及Sanghvi，Y S.，第15章，Antisense Research and Applications，第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，CRC Press，1993中公开的那些。这些核碱基中的某些核碱基特别可用于增加本发明的寡聚化合物的结合亲和力。这些核碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示将核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃。(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，Antisense Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，第276-278页)，并且是示例性的碱基取代，甚至更具体地当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
教导某些上述替代性核碱基以及其他替代性核碱基的制备的代表性美国专利包括但不限于上述美国专利号3,687,808；4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；以及7,495,088，每篇专利的全部内容特此以引用方式并入本文。
在其他实施方案中，核苷酸中的糖部分可以是核糖分子，任选地具有2'-O-甲基、2’-O-MOE、2'-F、2’-氨基、2’-O-丙基、2’-氨基丙基或2’-OH修饰。
用于本发明的方法中的寡核苷酸可以包含一个或多个双环糖部分。“双环糖”是通过桥接两个原子而修饰的呋喃糖基环。“双环核苷”(“BNA”)是具有糖部分的核苷，所述糖部分包含连接糖环的两个碳原子的桥，从而形成双环系统。在某些实施方案中，桥连接糖环的4’-碳和2’-碳。因此，在一些实施方案中，本发明的剂可以包含一个或多个锁定核苷。锁定核苷是具有修饰的核糖部分的核苷，其中核糖部分包含连接2’和4’碳的额外桥。换句话说，锁定核苷是包含双环糖部分的核苷，所述双环糖部分包含4’-CH2-O-2’桥。这种结构有效地将核糖“锁定”在3’-内结构构象中。向寡核苷酸中添加锁定核苷已显示出增加血清中的寡核苷酸稳定性，并减少脱靶效应(Grunweller，A.等人，(2003)NucleicAcids Research 31(12)：3185-3193)。用于本发明的多核苷酸中的双环核苷的实例包括但不限于在4’和2’核糖基环原子之间包含桥的核苷。在某些实施方案中，本发明的多核苷酸剂包含一个或多个双环核苷，其包含4’至2’桥。此类4’至2’桥接双环核苷的实例包括但不限于4’-(CH2)-O-2’(LNA)；4’-(CH2)-S-2’；4’-(CH2)2-O-2’(ENA)；4′-CH(CH3)-O-2′(也称为“限制性乙基”或“cEt”)和4′-CH(CH2OCH3)-O-2′(及其类似物；参见例如美国专利号7,399,845)；4’-C(CH3)(CH3)-O-2’(及其类似物；参见例如美国专利号8,278,283)；4’-CH2-N(OCH3)-2’(及其类似物；参见例如美国专利号8,278,425)；4′-CH2-O-N(CH3)2-2′(参见例如美国专利公开号2004/0171570)；4’-CH2-N(R)-O-2’，其中R是H、C1-C12烷基或保护基团(参见例如美国专利号7,427,672)；4′-CH2-C(H)(CH3)-2′(参见例如Chattopadhyaya等人，J.Org.Chem.，2009，74，118-134)；和4’-CH2-C(＝CH2)-2’(及其类似物；参见例如美国专利号8,278,426)。前述每篇专利的全部内容特此以引用方式并入本文。
教导锁定核酸核苷酸的制备的其他代表性美国专利和美国专利公开包括但不限于以下：美国专利号6,268,490；6,525,191；6,670,461；6,770,748；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,034,133；7,084,125；7,399,845；7,427,672；7,569,686；7,741,457；8,022,193；8,030,467；8,278,425；8,278,426；8,278,283；US 2008/0039618；以及US 2009/0012281，每篇专利的全部内容特此以引用方式并入本文。
可以制备具有一种或多种立体化学糖构型的任何前述双环核苷，所述糖构型包括例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见WO 99/14226)。
用于本发明的方法中的寡核苷酸也可以被修饰以包含一个或多个限制性乙基-核苷酸。如本文所用，“限制性乙基-核苷酸”或“cEt”是包含双环糖部分的锁定核酸，所述双环糖部分包含4’-CH(CH3)-O-2’桥。在一个实施方案中，限制性乙基-核苷酸呈S构象，在本文中称为“S-cEt”
用于本发明的方法中的寡核苷酸也可以包含一个或多个“构象限制性核苷酸”(“CRN”)。CRN是核苷酸类似物，其具有连接核糖的C2’和C4’碳或核糖的C3和-C5’碳的接头。CRN将核糖环锁定成稳定的构象，并增加对mRNA的杂交亲和力。接头的长度足以将氧置于稳定性和亲和力的最佳位置，从而减少核糖环折叠。
教导某些上述CRN的制备的代表性公开包括但不限于美国专利公开号2013/0190383；和PCT公开WO 2013/036868，每篇专利的全部内容特此以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，用于本发明的方法中的寡核苷酸包含一种或多种为UNA(未锁定核酸)核苷酸的单体。UNA是未锁定的无环核酸，其中糖的任何键已被去除，从而形成未锁定“糖”残基。在一个实例中，UNA还包括C1’-C4’之间的键(即C1’与C4’碳之间的共价碳-氧-碳键)已被去除的单体。在另一个实例中，糖的C2′-C3′键(即C2′与C3′碳之间的共价碳-碳键)已被去除(参见Nuc.Acids Symp.Series，52，133-134(2008)以及Fluiter等人，Mol.Biosyst.，2009，10，1039，所述文献以引用方式并入本文)。
教导UNA的制备的代表性美国公开包括但不限于美国专利号8,314,227；和美国专利公开号2013/0096289；2013/0011922；以及2011/0313020，每篇公开的全部内容特此以引用方式并入本文。
核糖分子也可以用环丙烷环修饰，以产生三环脱氧核酸(三环DNA)。核糖部分可以取代另一种糖例如1，5-脱水己糖醇、苏糖(以产生苏糖核苷(TNA))或阿拉伯糖(以产生阿拉伯糖核苷)。核糖分子也可以被非糖诸如环己烯置换以产生环己烯核苷，或者被乙二醇置换以产生乙二醇核苷。
核糖分子也可以被非糖诸如环己烯置换以产生环己烯核酸(CeNA)，或被乙二醇置换以产生乙二醇核酸(GNA)。对核苷酸分子末端的潜在稳定修饰可以包括N-(乙酰氨基己酰基)-4-羟基脯氨酸(Hyp-C6-NHAc)、N-(己酰基-4-羟基脯氨酸(Hyp-C6)、N-(乙酰基-4-羟基脯氨酸(Hyp-NHAc)、胸苷-2’-O-脱氧胸苷(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟基脯氨酸(Hyp-C6-氨基)、2-二十二碳酰尿苷-3″-磷酸、反向碱基dT(idT)等。这种修饰的公开可以在PCT公开号WO 201I/005861中找到。
本发明的寡核苷酸的其他化学替代物包括5’磷酸酯或5’磷酸酯模拟物，例如寡核苷酸的5’-末端磷酸酯或磷酸酯模拟物。合适的磷酸酯模拟物在例如美国专利公开号2012/0157511中公开，所述专利公开的全部内容以引用方式并入本文。
用于本发明的方法中的示例性寡核苷酸包含糖修饰的核苷，并且也可以包含DNA或RNA核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含糖修饰的核苷和DNA核苷。向本发明的寡核苷酸中掺入替代性核苷可以增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力。在这种情况下，替代性核苷可以被称为增强亲和力的替代性核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少1个替代性核苷，例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个替代性核苷。在其他实施方案中，寡核苷酸包含1至10个替代性核苷，例如2至9个替代性核苷，例如3至8个替代性核苷，例如4至7个替代性核苷，例如6或7个替代性核苷。在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸可以包含替代物，其独立地选自这三种类型的替代物(替代性糖部分、替代性核碱基和替代性核苷间键)或其组合。优选地，寡核苷酸包含一个或多个包含替代性糖部分的核苷，例如2’糖替代性核苷。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含一种或多种2′糖替代性核苷，其独立地选自由以下组成的组：2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、ANA、2′-氟-ANA和BNA(例如LNA)核苷。在一些实施方案中，一个或多个替代性核苷是BNA。
在一些实施方案中，至少1个替代性核苷是BNA(例如，LNA)，例如至少2个，例如至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个替代性核苷是BNA。在又一个实施方案中，所有替代性核苷都是BNA。
在另一个实施方案中，寡核苷酸包含至少一个替代性核苷间键。在一些实施方案中，连续核苷酸序列内的核苷间键是硫代磷酸酯或硼代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，寡核苷酸连续序列中的所有核苷酸间键都是硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，硫代磷酸酯键是立体化学纯的硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，硫代磷酸酯键是Sp硫代磷酸酯键。在其他实施方案中，硫代磷酸酯键是Rp硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中，用于本发明的方法中的寡核苷酸包含至少一个替代性核苷，其为2′-O-MOE-RNA，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个2′-O-MOE-RNA核苷单元。在一些实施方案中，2’-O-MOE-RNA核苷单元是通过硫代磷酸酯键连接的。在一些实施方案中，至少一个所述替代性核苷是2′-氟-DNA，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个2′-氟-DNA核苷单元。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含至少一个BNA单元和至少一个2’取代的替代性核苷。在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸包含2’糖修饰的核苷和DNA单元。
B.与配体缀合的寡核苷酸
用于本发明的方法中的寡核苷酸可以化学连接到一个或多个配体、部分或缀合物上，以增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。此类部分包括但不限于脂质部分，例如胆固醇部分(Letsinger等人，(1989)Proc.Natl.Acid.Sci.USA，86：6553-6556)、胆酸(Manoharan等人，(1994)Biorg.Med.Chem.Let.，4：1053-1060)、硫醚例如绿柱石-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.，660：306-309；Manoharan等人，(1993)Biorg.Med.Chem.Let.，3：2765-2770)、硫代胆固醇(Oberhauser等人，(1992)Nucl.AcidsRes.，20：533-538)、脂族链例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人，(1991)EMBO J，10：1111-1118；Kabanov等人，(1990)FEBS Lett.，259：327-330；Svinarchuk等人，(1993)Biochimie，75：49-54)、磷脂例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-铵1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-膦酸酯(Manoharan等人，(1995)Tetrahedron Lett.，36：3651-3654；Shea等人，(1990)Nucl.Acids Res.，1 8：3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人，(1995)Nucleosides&Nucleotides，14：969-973)或金刚烷乙酸(Manoharan等人，(1995)Tetrahedron Lett.，36：3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等人，(1995)Biochim.Biophys.Acta，1264：229-237)、或或十八胺或己胺基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等人，(1996)J.Pharmacol.Exp.Ther.，277：923-937)。
在一个实施方案中，配体改变掺入其中的寡核苷酸剂的分布、靶向或寿命。在一些实施方案中，例如与缺乏这种配体的种类相比，配体提供了对所选靶(例如分子、细胞或细胞类型)、区室(例如细胞或器官区室)、组织、器官或身体区域的增强的亲和力。
配体可以包括天然存在的物质，例如蛋白质(例如人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如葡聚糖、普鲁兰多糖、甲壳质、壳聚糖、菊粉、环糊精、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组或合成分子，例如合成聚合物，例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括聚氨基酸，是聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚膦嗪。多胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模拟聚胺、树枝状聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子可电离脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐或α螺旋肽。
配体还可以包括靶向基团，例如细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如结合特定细胞类型例如肾细胞的抗体。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性剂蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-古洛糖胺(gulucosamine)多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸盐、维生素B12、维生素A、生物素或RGD肽或RGD肽模拟物。
配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德州卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如EDTA)、亲脂性分子(例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1，3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)和肽缀合物(例如黑腹果蝇触足肽、Tat肽)、烷基化剂、膦酸酯、氨基、巯基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标记物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+复合物)、二硝基苯、HRP或AP。
配体可以是蛋白质(例如糖蛋白)或肽(例如对共配体具有特异性亲和力的分子)或抗体(例如结合特定细胞类型例如肝细胞的抗体)。配体也可包括激素和激素受体。它们还可以包括非肽类物质，例如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-古洛糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。
配体可以是可以例如通过破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间丝来增加细胞对寡核苷酸剂的摄取的物质，例如药物。所述药物可以是例如紫杉烷、长春新碱、长春碱、细胞松弛素、诺考达唑(nocodazole)、促微丝聚合剂(japlakinolide)、拉春库林(latrunculin)A、鬼笔环肽、隋氏内酯(swinholide)A、茚达诺辛(indanocine)或肌基质蛋白(myoservin)。
在一些实施方案中，连接于本文所述的寡核苷酸的配体充当药物药代动力学调节剂(PK调节剂)。PK调节剂包括亲脂性物质、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包括但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、维生素E、生物素等。还已知包含许多硫代磷酸酯键的寡核苷酸结合血清蛋白，因此在主链中包含多个硫代磷酸酯键的短寡核苷酸，例如约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸，作为配体(例如作为PK调节配体)也适合本发明。此外，结合血清组分的适体(例如血清蛋白)也适合用作本文所述的实施方案中的PK调节配体。
本发明的配体缀合的寡核苷酸可以通过使用携带侧链反应性官能团的寡核苷酸来合成，例如衍生自将连接分子附接到寡核苷酸上的寡核苷酸(如下所述)。这种反应性寡核苷酸可以直接与可商购获得的配体、合成的携带各种保护基团的配体或者具有连接到其上的连接部分的配体反应。
本发明的缀合物中使用的寡核苷酸可以通过熟知的固相合成技术方便地常规地制备。用于这种合成的设备由几家供应商出售，包括例如Applied Biosystems(FosterCity，Calif.)。可以额外或替代地使用本领域已知用于这种合成的任何其他方式。还已知使用类似的技术来制备其他寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。
在本发明的配体-缀合的寡核苷酸，例如本发明的携带序列特异性连接的核苷的配体-分子中，寡核苷酸和寡核苷可以利用标准核苷酸或核苷前体、或者已经携带连接部分的核苷酸或核苷缀合物前体、已经携带配体分子的配体-核苷酸或核苷缀合物前体、或者携带非核苷配体的构建嵌段，在合适的DNA合成仪上组装。
当使用已经携带连接部分的核苷酸-缀合物前体时，通常完成序列特异性连接的核苷的合成，并且然后使配体分子与连接部分反应以形成配体缀合的寡核苷酸。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或连接的核苷是通过自动合成仪，使用衍生自配体-核苷缀合物的亚磷酰胺以及可商购获得的并常规用于寡核苷酸合成的标准亚磷酰胺和非标准亚磷酰胺来合成的。
i.脂质缀合物
在一个实施方案中，配体或缀合物是脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子优选地结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。HSA结合配体允许缀合物分布到身体的靶组织，例如非肾靶组织。例如，靶组织可以是肝脏，包括肝脏的实质细胞。可以结合HSA的其他分子也可以用作配体。例如，可以用奈普乐欣(neproxin)或者阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加对缀合物降解的抗性，(b)增加向靶细胞或细胞膜中的靶向或转运，和/或(c)可以用于调节与血清蛋白，例如HSA的结合。
基于脂质的配体可用于抑制，例如控制缀合物与靶组织的结合。例如，与HSA结合更强的脂质或基于脂质的配体不太可能靶向肾脏，并且因此不太可能从体内清除。与HSA结合较弱的脂质或基于脂质的配体可用于将缀合物靶向至肾脏。
在另一个方面，配体是被靶细胞例如增殖细胞吸收的部分，例如维生素。示例性维生素包括维生素A、E和K。
ii.细胞渗透剂
另一方面，配体是细胞渗透剂，优选螺旋细胞渗透剂。优选地，所述剂是两亲性的。示例性剂是肽，例如tat肽或触角足蛋白(antennapedia)。如果剂是肽，则可以对其进行修饰，包括肽模拟物、反演体、非肽或假肽键以及使用D-氨基酸。螺旋剂优选地为α-螺旋剂，其优选地具有亲脂相和疏脂相。
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(本文也称为寡肽模拟物)是能够折叠成与天然肽相似的确定的三维结构的分子。肽和肽模拟物与寡核苷酸剂的结合可以影响寡核苷酸的药物药代动力学分布，例如通过增强细胞识别和吸收。肽或肽模拟物部分可以是约5-50个氨基酸长，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
肽或肽模拟物可以是例如细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水性肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状体肽、限制性肽或交联肽。在另一个替代方案中，肽部分可以包含疏水性膜易位序列(MTS)。示例性的含MTS的疏水性肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO.87)的RFGF。含有疏水MTS的RFGF类似物(例如，氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO.88))也可以是靶向部分。肽部分可以是“递送”肽，其可以携带大的极性分子穿过细胞膜，所述分子包括肽、寡核苷酸和蛋白质。例如，已发现来自HIV Tat蛋白的序列(GRKKRRQRRRPPQ；SEQ ID NO.89)和果蝇触角足蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK；SEQID NO.90)能够起到递送肽的作用。肽或肽模拟物可以由DNA的随机序列编码，例如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(Lam等人，Nature，354：82-84，1991)。为了细胞靶向的目的，通过掺入的单体单元与寡核苷酸剂连接的肽或肽模拟物的实例是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽或RGD模拟物。肽部分的长度范围可以为约5个氨基酸到约40个氨基酸。肽部分可以具有结构修饰，例如以增加稳定性或直接构象性质。可以利用下文所述的任何结构修饰。
用于本发明的组合物和方法中的RGD肽可以是线性的或环状的，并且可以被修饰，例如糖基化或甲基化，以促进靶向特定组织。含RGD的肽和肽模拟物可包括D-氨基酸，以及合成的RGD模拟物。除了RGD，还可以使用靶向整联蛋白配体的其他部分。这种配体的一些缀合物靶向PECAM-1或VEGF。
细胞渗透肽能够渗透细胞，例如微生物细胞诸如细菌或真菌细胞，或哺乳动物细胞诸如人细胞。微生物细胞渗透肽可以是例如α-螺旋线性肽(例如，LL-37或CeropinP1)、含二硫键的肽(例如，α-防御素、β-防御素或牛抗菌肽)或仅含一个或两个主要氨基酸的肽(例如，PR-39或吲哚菌素)。细胞渗透肽也可以包含核定位信号(NLS)。例如，细胞渗透肽可以是两部分两亲性肽，诸如MPG，其来源于HIV-1 gp41的融合肽结构域和SV40大T抗原的NLS(Simeoni等人，Nucl.Acids Res.31：2717-2724，2003)。
iii.碳水化合物缀合物
在本发明的组合物和方法的一些实施方案中，寡核苷酸还包含碳水化合物。碳水化合物缀合的寡核苷酸有利于体内递送核酸以及适用于体内治疗用途的组合物，如本文所述。如本文所用，“碳水化合物”是指如下化合物，其本身是由一个或多个单糖单元组成的碳水化合物，所述单糖单元具有至少6个碳原子(可以是直链、支链或环状的)，每个碳原子键合有氧、氮或硫原子；或者具有作为其一部分的碳水化合物部分的化合物，所述碳水化合物部分由一个或多个单糖单元组成，每个单糖单元具有至少六个碳原子(可以是直链、支链或环状的)，每个碳原子键合有氧、氮或硫原子。代表性碳水化合物包括糖(含有约4、5、6、7、8或9个单糖单元的单糖、二糖、三糖和低聚糖)和多糖，诸如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。特定的单糖包括C5及以上(例如C5、C6、C7或C8)糖；二糖和三糖包括具有两个或三个单糖单元的糖(例如C5、C6、C7或C8)。
在一个实施方案中，用于本发明的组合物和方法中的碳水化合物缀合物是单糖。
在一些实施方案中，碳水化合物缀合物还包含一种或多种如上所述的额外配体，例如但不限于PK调节剂和/或细胞渗透肽。
适用于本发明的其他碳水化合物缀合物(和接头)包括PCT公开号WO 2014/179620和WO 2014/179627中描述的那些，每篇专利的全部内容以引用方式并入本文。
iv.接头
在一些实施方案中，本文所述的缀合物或配体可以用各种可裂解或不可裂解的接头附接到寡核苷酸。
接头通常包括直接键或原子诸如氧或硫、单元诸如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子链，例如但不限于取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其一个或多个亚甲基可以被O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环间断或终止；其中R8为氢、酰基、脂族或取代的脂族。在一个实施方案中，接头在约1-24个原子、2-24个、3-24个、4-24个、5-24个、6-24个、6-18个、7-18个、8-18个原子、7-17个、8-17个、6-16个、7-17个或8-16个原子之间。
可裂解的连接基团是在细胞外足够稳定，但在进入靶细胞时被裂解以释放出通过接头保持在一起的两部分的连接基团。在一个优选的实施方案中，可裂解的连接基团在靶细胞中或在第一参考条件下(其可以例如被选择来模拟或代表细胞内条件)的裂解比在受试者血液中或在第二参考条件(其可以例如被选择来模拟或代表在血液或血清中发现的条件)下快至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多或至少约100倍。
可裂解的连接基团对裂解因素，例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在敏感。通常，裂解因素在细胞内的普遍或发现水平或活性高于在血清或血液中。此类降解剂的实例包括：对特定底物具有选择性或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如细胞中存在的氧化或还原酶或还原剂例如硫醇，它们可以通过还原降解可氧化还原裂解的连接基团；酯酶；能够产生酸性环境的核内体或试剂，例如导致pH为五或更低的那些；通过充当一般酸来水解或降解酸可裂解的连接基团的酶类、肽酶类(可以是底物特异性的)和磷酸酶类。
可裂解的连接基团诸如二硫键对pH敏感。人血清的pH为7.4，而平均细胞内pH略低，范围为约7.1-7.3。核内体具有更酸性的pH，在5.5-6.0的范围内，并且溶酶体具有甚至更酸性的pH，在5.0左右。一些接头将具有可裂解的连接基团，所述基团在优选的pH下被裂解，从而从细胞内的配体中释放阳离子脂质，或者释放到细胞的期望区室中。
接头可以包括可被特定酶裂解的可裂解的连接基团。掺入接头中的可裂解的连接基团的类型可取决于所靶向的细胞。例如，肝靶向配体可以通过包含酯基的接头连接到阳离子脂质。肝细胞富含酯酶，因此与不富含酯酶的细胞类型相比，在肝细胞中接头将被更有效地裂解。其他富含酯酶的细胞类型包括肺、肾皮质和睾丸的细胞。
当靶向富含肽酶的细胞类型，例如肝细胞和滑膜细胞时，可以使用包含肽键的接头。
通常，候选的可裂解的连接基团的适合性可以通过测试降解剂(或条件)裂解候选连接基团的能力来评估。还将需要测试候选的可裂解的连接基团在血液中或与其他非靶组织接触时抵抗裂解的能力。因此，可以确定在第一条件与第二条件之间对裂解的相对敏感性，其中选择第一条件指示靶细胞中的裂解，并且选择第二条件指示其他组织或生物流体，例如血液或血清中的裂解。评估可以在无细胞系统、细胞、细胞培养物、器官或组织培养物或整个动物中进行。在无细胞或培养条件下进行初步评估并通过在整个动物中进一步评估来确认可能是有用的。在优选的实施方案中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择来模拟细胞内条件的体外条件下)的裂解比在血液或血清中(或在被选择来模拟细胞外条件的体外条件下)快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100倍。
a.氧化还原可裂解的连接基团
在一个实施方案中，可裂解的连接基团是在还原或氧化时裂解的氧化还原可裂解的连接基团。可还原性裂解的连接基团的实例是二硫化物连接基团(--S--S--)。为了确定候选的可裂解的连接基团是否是合适的“可还原性裂解的连接基团”或者例如是否适合用于特定寡核苷酸部分和特定靶向剂，可以参考本文所述的方法。例如，可以通过使用本领域已知的试剂与二硫苏糖醇(DTT)或其他还原剂一起孵育来评估候选物，所述试剂模拟在细胞(例如靶细胞)中将观察到的裂解速率。也可以在被选择来模拟血液或血清条件的条件下评估候选物。在一个实施方案中，候选化合物在血液中被裂解最多约10％。在其他实施方案中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择来模拟细胞内条件的体外条件下)的降解与在血液中(或在被选择来模拟细胞外条件的体外条件下)相比快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100倍。在被选择来模拟细胞内培养基的条件下，使用标准酶动力学测定法可以确定候选化合物的裂解速率，并将其与被选择来模拟细胞外培养基的条件相比较。
b.基于磷酸酯的可裂解的连接基团
在另一个实施方案中，可裂解接头包括基于磷酸酯的可裂解的连接基团。基于磷酸酯的可裂解的连接基团被降解或水解磷酸酯基团的试剂裂解。裂解细胞中磷酸酯基团的试剂的实例是酶，例如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。可以使用类似于上述方法的方法评估这些候选物。
c.酸可裂解的连接基团
在另一个实施方案中，可裂解的接头包括酸可裂解的连接基团。酸可裂解的连接基团是在酸性条件下裂解的连接基团。在优选的实施方案中，酸可裂解的连接基团在pH为约6.5或更低(例如，约6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的酸性环境中被裂解，或者通过试剂诸如可充当一般酸的酶被裂解。在细胞中，特定的低pH细胞器诸如核内体和溶酶体可以为酸可裂解的连接基团提供裂解环境。酸可裂解的连接基团的实例包括但不限于腙、酯和氨基酸酯。酸可裂解基团可以具有通式-C＝NN--、C(O)O或--OC(O)。优选的实施方案是当连接到酯的氧(烷氧基)上的碳是芳基、取代的烷基或叔烷基诸如二甲基戊基或叔丁基时。可以使用类似于上述方法的方法评估这些候选物。
d.基于酯的连接基团
在另一个实施方案中，可裂解接头包括基于酯的可裂解的连接基团。基于酯的可裂解的连接基团被细胞中的酶诸如酯酶和酰胺酶裂解。基于酯的可裂解的连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可裂解的连接基团具有通式--C(O)O--或--OC(O)--。可以使用类似于上述方法的方法评估这些候选物。
e.基于肽的裂解基团
在另一个实施方案中，可裂解接头包括基于肽的可裂解的连接基团。基于肽的可裂解的连接基团被细胞中的酶诸如肽酶和蛋白酶裂解。基于肽的可裂解的连接基团是在氨基酸之间形成的肽键，产生寡肽(例如二肽、三肽等)和多肽。基于肽的可裂解基团不包括酰胺基团(--C(O)NH--)。酰胺基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以产生肽和蛋白质的特殊类型的酰胺键。基于肽的裂解基团通常限于产生肽和蛋白质的氨基酸之间形成的肽键(即，酰胺键)，并且不包括整个酰胺官能团。基于肽的可裂解的连接基团具有通式--NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)--，其中RA和RB是两个相邻氨基酸的R基团。可以使用类似于上述方法的方法评估这些候选物。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸通过接头缀合至碳水化合物。接头包括二价和三价支链接头基团。本发明的组合物和方法的具有接头的示例性寡核苷酸碳水化合物缀合物包括但不限于PCT公开号WO 2018/195165的式24-35中描述的那些。
教导寡核苷酸缀合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717、5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241、5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；8,106,022，每篇专利的全部内容特此以引用方式并入本文。
在某些情况下，寡核苷酸的核苷酸可以被非配体基团修饰。为了增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取，许多非配体分子已缀合至寡核苷酸，并且用于进行此类缀合的方法可在科学文献中获得。此类非配体部分包括脂质部分，诸如胆固醇(Kubo，T.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm，2007，365(1)：54-61；Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86：6553)、胆酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994，4：1053)、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660：306；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3：2765)、硫代胆固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.，1992，20：533)、脂族链例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J.，1991，10：111；Kabanov等人，FEBSLett.，1990，259：327；Svinarchuk等人，Biochimie，1993，75：49)、磷脂例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651；Shea等人，Nucl.Acids Res.，1990，18：3777)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人，Nucleosides&Nucleotides，1995，14：969)或金刚烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651)、棕榈基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264：229)或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277：923)。上文已列出了教导此类寡核苷酸缀合物的制备的代表性美国专利。典型的缀合方案包括在序列的一个或多个位置上携带氨基接头的寡核苷酸的合成。然后使氨基与使用合适的偶联或活化试剂缀合的分子反应。缀合反应可以在寡核苷酸仍结合到固体支持物上的情况下进行，或者在溶液相中裂解寡核苷酸之后进行。通过HPLC纯化寡核苷酸缀合物通常得到纯的缀合物。
IV.药物组合物
本公开还包括包含本公开的寡核苷酸的药物组合物和制剂。在一个实施方案中，本文提供了药物组合物，其含有寡核苷酸(例如如本文所述的指导寡核苷酸)和药学上可接受的载体。含有寡核苷酸的药物组合物可用于治疗将受益于编辑靶基因，例如具有与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的SERPINA1多核苷酸的受试者。
根据是否需要局部或全身治疗以及待治疗的区域，本公开的药物组合物可以多种方式施用。施用可以是口服、胃肠外、局部(例如，通过透皮贴剂)、鼻内、气管内、表皮和透皮施用。
肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；皮下，例如通过植入装置；或颅内，例如通过脑实质内、鞘内或心室内施用。肠胃外施用可以通过在选定的时间段内连续输注来进行。
用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必需的或期望的。涂层避孕套、手套等也是有用的。合适的局部制剂包括如下制剂，其中本公开中的寡核苷酸与局部递送剂诸如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合。合适的脂质和脂质体包括中性的(例如，二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性的(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子的(例如，二油酰四甲氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本公开中的寡核苷酸可以被包封在脂质体中，或者可以与其形成复合物，特别是与阳离子脂质体形成复合物。替代地，寡核苷酸可以与脂质复合，特别是与阳离子脂质复合。合适的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、油酸单甘油酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱或C1-20烷基酯(例如，异丙基肉豆蔻酸酯IPM)、单甘油酯、二甘油酯或其药学上可接受的盐。局部制剂在US 6,747,014中详细描述，所述专利特此以引用方式并入本文。
用于肠胃外、脑实质内(进入大脑)、鞘内、心室内或肝内施用的组合物和制剂可以包括无菌水溶液，其还可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂，例如但不限于渗透促进剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。
用于口服或肠胃外施用的有用溶液可以通过制药领域熟知的任何方法制备，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(MackPublishing Company，1990)中所述的方法。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。制剂还可以包含例如聚亚烷基二醇诸如聚乙二醇、植物来源的油和氢化萘。这些药物的其他潜在有用的肠胃外载体包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。
适用于口服施用的本公开的制剂可以是以下形式：离散单元，例如胶囊、明胶胶囊、小药囊、片剂、锭剂或糖锭，其各自含有预定量的药物；粉末或颗粒组合物；水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或水包油乳液或油包水乳液。所述药物也可以以丸剂、膏剂或糊剂的形式施用。片剂可以通过将药物任选地与一种或多种辅助成分压片或模制来制备。压制片剂可以通过在合适的机器中压片自由流动形式诸如粉末或颗粒的药物来制备，所述药物任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合。模制片剂可以通过在合适的机器中对以惰性液体稀释剂润湿的粉末药物和适当载体的混合物模制来制备。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。为了口服治疗性施用的目的，活性化合物可以掺入赋形剂。药物相容性结合剂和/或辅助材料可以作为组合物的一部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有任何下列成分或类似性质的化合物：粘合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味剂。
适用于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性)或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。它在生产和储存条件下应该是稳定的，并且应该防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有以下的溶剂或分散介质：例如水；乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)，及其合适的混合物。例如，通过使用例如卵磷脂的包衣，在分散体的情况下通过保持所需的颗粒大小，和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)和/或氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的吸收延长。
可以通过将所需量的活性化合物与一种上文列举的成分或其组合掺入适当的溶剂中，按照需要，接着进行过滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中制备分散体，所述媒介物含有碱性分散介质和上文列举的所需要的其他成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下；制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，所述方法从先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何额外的所需成分的粉末。
适用于关节内施用的制剂可以是药物的无菌水性制剂的形式，其可以是微晶线形式，例如水性微晶悬浮液的形式。脂质体制剂或可生物降解的聚合物系统也可用于提供药物以用于关节内和眼内施用。
全身施用也可以通过透粘膜或透皮方式进行。对于透粘膜或透皮施用，在制剂中使用适于渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的，并且例如对于透粘膜施用，包括洗涤剂和胆汁盐。透粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现。对于透皮施用，活性化合物通常被配制成本领域通常已知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或霜剂。
活性化合物可与将保护化合物免于从体内快速消除的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物；例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。脂质体悬浮液也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法，例如如美国专利号4，522，811中所述的方法制备。
口服或肠胃外组合物可以配制成剂量单位形式，以便于施用和剂量的均匀性。剂量单位形式是指适合作为用于待治疗受试者的单一剂量的物理离散单位；每个单位含有经计算与所需的药物载体结合产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本公开的剂量单位形式的规格由以下规定并且直接取决于以下情况：活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果以及配制用于个体治疗的这种活性化合物的技术中固有的限制。此外，可以通过周期性大剂量注射来施用，或者可以通过从外部贮库(例如，静脉注射袋)静脉内、肌肉内或腹膜内施用来更连续地施用。
当活性化合物将用作移植程序的一部分时，可以在从供体中取出组织或器官之前将其提供给待移植的活组织或器官。所述化合物可以提供给供体宿主。替代地或另外地，一旦从供体中取出，器官或活组织可被置于含有活性化合物的保存溶液中。在所有情况下，活性化合物可以通过注射到组织而直接施用到所需组织，或者可以使用本文所述和/或本领域已知的任何方法和制剂通过口服或肠胃外施用来全身性施用。当药物包含组织或器官保存溶液的一部分时，可以有利地使用任何可商购获得的保存溶液。例如，本领域已知的有用溶液包括Collins溶液、Wisconsin溶液、Belzer溶液、Eurocollins溶液和乳酸林格氏溶液。
本公开的药物制剂可以方便地以单位剂型呈现，可以根据制药工业中熟知的常规技术制备。此类技术包括将活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。一般来说，制剂是通过将活性成分与液体载体或细分的固体载体或两者均匀紧密地结合，并且然后在需要时将产品成型来制备的。
本公开的组合物可以配制成许多可能的剂型中的任一种，例如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软胶囊、栓剂和灌肠剂。本公开的组合物也可以配制成在水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以还含有增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。悬浮液也可以含有稳定剂。
本公开的组合物还可以制备并配制成另外的制剂，例如乳液或微乳液，或者掺入到颗粒，例如微粒中，其可以通过喷雾干燥或其他方法生产，所述其他方法包括冻干、蒸发、流化床干燥、真空干燥或这些技术的组合。可以添加渗透增强剂，例如表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合的非表面活性剂，以便实现本公开的组合物的有效递送，例如寡核苷酸向受试者的递送。还可以将在细胞水平上增强寡核苷酸剂摄取的剂添加到本公开的药物和其他组合物中，例如阳离子脂质(例如lipofectin)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子(例如聚赖氨酸)。
本公开的药物组合物还可以包含药物载体或赋形剂。药物载体或赋形剂是用于向动物递送一种或多种核酸的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或任何其他药理学惰性媒介物。赋形剂可以是液体或固体，并根据所考虑的计划的施用方式进行选择，以便当与核酸和给定药物组合物的其他组分组合时提供所需的体积、稠度等。典型的药物载体包括但不限于粘合剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如淀粉、淀粉羟乙酸钠等)；和润湿剂(例如十二烷基硫酸钠等)。
用于核酸局部施用的制剂可以包括无菌和非无菌的水溶液、在普通溶剂诸如醇中的非水溶液或者在液体或固体油基中的核酸溶液。溶液还可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。可以使用不与核酸发生有害反应的适用于非肠胃外施用的药学上可接受的有机或无机赋形剂。合适的药学上可接受的赋形剂包括但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
组合物的毒性和治疗效果可以通过在细胞培养物或实验动物中例如用于确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(对50％的群体治疗有效的剂量)的标准药学程序来确定。优选表现出高治疗指数的化合物。从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于配制一系列用于人的剂量。
本文所述的组合物(例如，包含寡核苷酸的组合物)的剂量可以根据许多因素而变化，这些因素例如化合物的药效动力学性质；施用方式；接受者的年龄、健康状况和体重；症状的性质和程度；治疗的频率和同时治疗的类型(如果有的话)；以及化合物在待治疗动物体内的清除率。本领域技术人员可以确定是否施用所述组合物，并基于上述因素调整所述组合物的合适剂量和/或治疗方案。本文所述的组合物可最初以合适的剂量施用，所述剂量可在需要时根据临床反应调整。在一些实施方案中，组合物(例如，包含寡核苷酸的组合物)的剂量是预防或治疗有效量。在一些实施方案中，用治疗有效量的组合物治疗受试者可以包括单次治疗或一系列治疗。此外，应当理解的是，为了快速达到所需的血液水平或组织水平，施用的初始剂量可以增加到超过上述上限，或者初始剂量可以小于最佳剂量，并且日剂量可以根据具体情况在治疗过程期间逐渐增加。需要时，日剂量也可以分成多次施用，例如每天两次到四次。
本公开的药物组合物可以足以编辑靶基因例如SERPINA1多核苷酸和/或治疗α1抗胰蛋白酶缺乏症的剂量施用。在用于治疗、预防或对抗受试者的α1抗胰蛋白酶缺乏症的治疗用途中，所述化合物或其药物组合物将以在接受治疗的动物中获得并维持活性组分的有效浓度(即量、血液水平或组织水平)的剂量口服或胃肠外施用。术语“有效量”应理解为意指本公开的化合物以足以引发生物活性的量存在于接受者体内或体表。通常，活性组分的有效剂量范围为每天约1μg/kg至约100mg/kg、优选地约10μg/kg至约10mg/kg、更优选地约100μg/kg至约1mg/kg体重。
V.药盒
在某些方面，本公开提供了药盒，其包括药物制剂和包装插页，所述药物制剂包含能够实现与疾病例如α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变的寡核苷酸剂，所述包装插页具有进行本文所述的任何方法的说明书。
在一些实施方案中，药盒包括使用药盒编辑包含与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的SERPINA1多核苷酸的说明书。在其他实施方案中，药盒包括使用药盒编辑包含与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的SERPINA1多核苷酸并治疗α1抗胰蛋白酶缺乏症的说明书。说明书通常将包括关于使用药盒编辑核酸分子的信息。在其他实施方案中，说明书包括以下至少一项：注意事项；警告；临床研究；和/或引用。说明书可以直接印在容器上(当存在时)，或者作为贴在容器上的标签，或者作为容器中提供的单独的薄片、小册子、卡片或文件夹。在另一个实施方案中，药盒可以包括呈合适操作参数的标签或独立插页(包装插页)形式的说明书。
在一些实施方案中，所述药盒包括药物制剂、另外的治疗剂和包装插页，所述药物制剂包含能够实现与疾病例如α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的ADAR介导的腺苷到肌苷的改变的寡核苷酸剂，所述包装插页具有进行本文所述的任何方法的说明书。
药盒可以以多种不同的构型包装，例如在单个盒子中的一个或多个容器。例如根据药盒中提供的说明书，可以组合不同的组分。可以根据本文所述的方法组合这些组分，例如以制备和施用药物组合物。
在一些实施方案中，药盒可以包括一个或多个容器，其具有合适的阳性和阴性对照或对照样品，以用作检测、校准或标准化的标准。
药盒可还包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如(无菌)磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或葡萄糖溶液；和其他合适的添加剂，诸如如本文所述的渗透促进剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。它还可以包括从商业和用户角度来看所期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器和具有使用说明书的包装插页。药盒还可以包括药物递送系统，诸如如本文所述的脂质体、胶束、纳米颗粒和微球体。药盒可还包括用于递送至[中枢神经系统]的递送装置，例如例如针、注射器、泵和具有使用说明书的包装插页。
本发明通过以下实施例进一步说明，这些实施例不应被解释为限制性的。在本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的全部内容以及附图和序列表特此以引用方式并入本文。
实施例
实施例1.通过靶向的A到I的编辑逆转SERPINA1转录物中的氨基酸取代突变E342K，以用于治疗α1抗胰蛋白酶缺乏症
使用BamHI和XbaI限制性位点(Quintara Bio，Berkeley，CA)将人ADAR2序列(NM_001112.4)、人ADAR1p110(NM_001111.5)和突变SERPINA1序列(仅ORF)克隆到受CMV启动子控制的pcDNA3.1质粒中，并对正确的插入物进行序列验证。质粒被称为ADAR2/pcD NA3.1、ADAR1p110/pcDNA3.1或SERPINA1/pcDNA 3.1。对于编辑实验，每10cm培养皿使用25μLLipofectamine 3000和24μL P3000(Life Technologies)将2μg ADAR2/pcDNA3.1或ADAR1p110/p cDNA3.1质粒和10ug SERPINA1/pcDNA3.1质粒转染到5x106HEK293T细胞(ATCc)中。4小时后，向培养基中补充新鲜的温热培养基(高葡萄糖DMEM；LifeTechnologies)。转染后12-16小时，用指导寡核苷酸转染所转染的HEK293T细胞，使得每个孔中的终浓度为100nM。所有的转染都是用Lipofectamine 3000(0.4μL/每孔)根据制造商说明书在96孔格式中进行的。在第二次转染后12-16小时，用冰冷的PBS洗涤细胞一次，并使用适于KingFisher Flex Purification(Life Technologies)的Dyna Beads mRNA DirectKit(LifeTechnolo gies)根据制造商的说明书进行总mRNA分离。在洗脱之前，用TUR BODNA酶(Life Technologies)处理样品。根据制造商的说明书(Life Technologies)，使用SuperScript IV Vilo将所得的分离的mRNA用于cDNA合成。使用1μl cDNA作为模板，使用基因特异性引物进行PCR(Platinum II Hot-Start PCR主混合物；Life Technologies)，产生用于Sanger测序的扩增子(表4)。通过Quintara Biosciences(Be rkeley，CA)进行Sanger测序。通过测量腺苷和鸟苷的峰高并将鸟苷峰高除以腺苷和鸟苷组合的总峰高测量值来定量腺苷到肌苷的编辑产量。
表4：引物列表
名称 序列5′-3′
SERPINA1 fwd AGCACCTGGAAAATGAACTC
SERPINA1 rvs TTTTTTTGCGATGCAATTTCC
所测试的指导寡核苷酸序列示出在表5-19中。这些表还示出了用ADAR1或ADAR2或两者共转染的某些指导寡核苷酸的编辑结果。
使用以下缩写来表示寡核苷酸序列中的修饰。
修饰 缩写
RNA rN
DNA dN
2′-O-甲基(2′-OMe) mN
2′-F-阿拉伯糖(FANA) fN
2′-F-RNA FN
2′-O-甲氧基乙基(MOE) MN
锁核酸(LNA) LN
无碱基 dS
RNA-无碱基 rS
2′-OMe-无碱基 mS
5-甲基-rC rmC
5-甲基-dC dmC
5-甲基-2′-OMe-C mmC
(S)-乙二醇核酸(S-GNA) sgN
(R)-乙二醇核酸(R-GNA) rgN
DNAα-异头物 αN
阿拉伯糖 aN
2′-OMe-阿拉伯糖 amN
柔性核酸(FNA) fxN
丝氨酸醇核酸 sN
β-D-同源DNA hdN
β-D-HNA hN
硫代磷酸核苷间键 *
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实施例2.指导寡核苷酸的+2位置对某些核苷酸修饰敏感
基于实施例1中的数据，发现在指导寡核苷酸的三联体的+2位置(即传统三联体3’的第一位置，其由结构[Am]-X1-X2-X3-X4-[Bn]中的X4表示，其中X2是编辑位点)处的核苷酸的选择可以影响靶标的编辑率。化合物KB-018-001、KB-018-724、KB-018-697、KB-018-725、KB-018-440和KB-018-486各自在+2位置处具有不同的修饰核苷酸(分别为2’-OMe、DNA、FANA、SGNA、2'-F和MOE)。
如图1所示，与2'-OMe核苷酸相比，在+2位置处存在DNA、FANA、S-GNA或MOE核苷酸(各自如本文所定义)导致编辑率较低。此外，与2’-OMe核苷酸相比，用2’-氟核苷酸观察到改善的编辑。
相反，指导寡核苷酸的-2位置(即传统三联体5’的第一位置)似乎对相同的核苷酸修饰并不特别敏感。如图1所示，与2’-OMe相比，在-2位置处存在DNA、FANA、S-GNA、2'-F或MOE核苷酸(各自如本文所定义)并不显著影响编辑率。在-2位置具有2’-OMe、DNA、FANA、SGNA、2’-F和MOE的指导寡核苷酸分别是KB-018-001、KB-018-726、KB-018-698、KB-018-728、KB-018-436和KB-018-485。
等效方案
本领域技术人员仅仅使用常规实验将认识到或者能够确定本文所述的具体实施方案和方法的许多等效方案。这些等效方案旨在由以下权利要求书的范围所涵盖。

Claims (257)

1.一种编辑SERPINA1多核苷酸的方法，所述SERPINA1多核苷酸包含与可能导致肝衰竭或肺气肿的α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的单核苷酸多态性(SNP)，所述方法包括使所述SERPINA1多核苷酸与指导寡核苷酸接触，从而编辑所述SERPINA1多核苷酸，所述指导寡核苷酸能够实现与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述SERPINA1多核苷酸与所述指导寡核苷酸在细胞中接触。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述细胞内源性表达ADAR。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述ADAR是人ADAR。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述ADAR是人ADAR1。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述ADAR是人ADAR2。
7.如权利要求2-6中任一项所述的方法，其中所述细胞选自真核细胞、哺乳动物细胞和人细胞。
8.如权利要求2-7中任一项所述的方法，其中所述细胞是体内的。
9.如权利要求2-7中任一项所述的方法，其中所述细胞是离体的。
10.一种治疗有需要的受试者的α1抗胰蛋白酶缺乏症的方法，所述方法包括
鉴定在SERPINA1多核苷酸中具有与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的单核苷酸多态性(SNP)的受试者；
使所述受试者的细胞中的所述SERPINA1多核苷酸与指导寡核苷酸接触，从而治疗所述受试者，所述指导寡核苷酸能够实现与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变。
11.一种治疗有需要的受试者的α1抗胰蛋白酶缺乏症的方法，所述方法包括
鉴定在SERPINA1多核苷酸中具有与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的单核苷酸多态性(SNP)的受试者；
使细胞中的所述SERPINA1多核苷酸与指导寡核苷酸接触，所述指导寡核苷酸能够实现与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变，以及
向所述受试者施用所述细胞，从而治疗所述受试者。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述细胞对于所述受试者是自体的、同种异体的或异种的。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述指导寡核苷酸包含与SERPINA1mRNA序列互补的核酸序列，所述SERPINA1mRNA序列包含与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的所述SNP。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸还包含一种或多种作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)-募集结构域。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述SERPINA1多核苷酸编码包含致病性氨基酸的SERPINA1蛋白，所述致病性氨基酸包含由所述SNP导致的位置342处的赖氨酸。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述腺苷到肌苷的改变用野生型氨基酸取代所述致病性氨基酸。
18.如权利要求17所述的方法，其中位置342处的所述野生型氨基酸包含谷氨酸。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述指导寡核苷酸包含以下结构：
[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
其中A和B各自是核苷酸；
m和n各自独立地是1至50的整数；
X1、X2和X3各自独立地是核苷酸，其中X1、X2或X3中的至少一个是替代性核苷酸。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述指导寡核苷酸包含以下结构：
[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
其中A和B各自是核苷酸；
m和n各自独立地是1至50的整数；
X1、X2和X3各自独立地是核苷酸，其中X1、X2或X3中的至少一个具有式I-V中任一者的结构：
其中N1是氢或核碱基；
R1是羟基、卤素或C1-C6烷氧基；
R2是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基；
R3是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基；
R4是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基；并且
R5是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基。
21.如权利要求20所述的方法，其中R4是氢并且R5不是氢或羟基，R5是氢并且R4不是氢，或者R5是羟基并且R4不是氢。
22.如权利要求20或权利要求21所述的方法，其中[Am]和/或[Bn]的至少80％的核苷酸包括核碱基、糖和核苷间键。
23.如权利要求20至22中任一项所述的方法，其中R1是羟基、卤素或OCH3。
24.如权利要求20至23中任一项所述的方法，其中R2是氢。
25.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中X1、X2或X3中的至少一个具有式I、式II或式V的结构；并且X1、X2或X3均不具有式IV或式III的结构。
26.如权利要求20至25中任一项所述的方法，其中X1、X2或X3中的至少一个具有式I或式II的结构；并且X1、X2或X3均不具有式III、式IV或式V的结构。
27.如权利要求20至26中任一项所述的方法，其中所述卤素是氟。
28.如权利要求20至27中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式I的结构，其中R1是氟，并且N1是核碱基。
29.如权利要求28所述的方法，其中X1具有式I的结构，其中R1是氟，并且N1是核碱基。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中X2具有式I的结构，其中R1是氟，并且N1是核碱基。
31.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中X3具有式I的结构，其中R1是氟，并且N1是核碱基。
32.如权利要求20至27中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式I的结构，其中R1是羟基，并且N1是核碱基。
33.如权利要求32所述的方法，其中X1具有式I的结构，其中R1是羟基，并且N1是核碱基。
34.如权利要求32或33所述的方法，其中X2具有式I的结构，其中R1是羟基，并且N1是核碱基。
35.如权利要求32至34中任一项所述的方法，其中X3具有式I的结构，其中R1是羟基，并且N1是核碱基。
36.如权利要求20至27中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式I的结构，其中R1是甲氧基，并且N1是核碱基。
37.如权利要求36所述的方法，其中X1具有式I的结构，其中R1是甲氧基，并且N1是核碱基；并且X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
38.如权利要求36或37所述的方法，其中X2具有式I的结构，其中R1是甲氧基，并且N1是核碱基。
39.如权利要求36至38中任一项所述的方法，其中X3具有式I的结构，其中R1是甲氧基，并且N1是核碱基。
40.如权利要求20至27中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式II的结构，其中R2是氢，并且N1是核碱基。
41.如权利要求40所述的方法，其中X2具有式II的结构，其中R2是氢，并且N1是核碱基。
42.如权利要求20至25中任一项所述的方法，其中X1和X2中的至少一个具有式V的结构。
43.如权利要求42所述的方法，其中X2具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是氢。
44.如权利要求42所述的方法，其中X2具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是羟基。
45.如权利要求42所述的方法，其中X1具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是氢。
46.如权利要求42所述的方法，其中X1具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是羟基。
47.如权利要求42所述的方法，其中X2具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是甲氧基。
48.如权利要求20至47中任一项所述的方法，其中当X1具有式I至V中任一者的结构时，X2和X3各自独立地是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X2具有式I至V中任一者的结构时，X1和X3各自独立地是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X3具有式I至V中任一者的结构时，X1和X2各自独立地是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X2各自具有式I至V中任一者的结构时，X3是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X3各自具有式I至V中任一者的结构时，X2是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；并且当X2和X3各自具有式I至V中任一者的结构时，X1是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
49.如权利要求48所述的方法，其中当X1具有式I至V中任一者的结构时，X2和X3各自独立地是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X2具有式I至V中任一者的结构时，X1和X3各自独立地是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X3具有式I至V中任一者的结构时，X1和X2各自独立地是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X2各自具有式I至V中任一者的结构时，X3是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X3各自具有式I至V中任一者的结构时，X2是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；并且当X2和X3各自具有式I至V中任一者的结构时，X1是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
50.如权利要求49所述的方法，其中当X1具有式I至V中任一者的结构时，X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X2具有式I至V中任一者的结构时，X1和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X3具有式I至V中任一者的结构时，X1和X2各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X1和X2各自具有式I至V中任一者的结构时，X3是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X1和X3各自具有式I至V中任一者的结构时，X2是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；并且当X2和X3各自具有式I至V中任一者的结构时，X1是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
51.如权利要求20至40和42至50中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3均不具有式II的结构，其中N1是核碱基。
52.如权利要求51所述的方法，其中X1、X2和X3均不具有式II的结构，其中N1是胞嘧啶核碱基。
53.如权利要求20至44和47至52中任一项所述的方法，其中X1包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基。
54.如权利要求53所述的方法，其中X1包含尿嘧啶核碱基。
55.如20至44和47至52中任一项所述的方法，其中X1包含次黄嘌呤核碱基。
56.如权利要求20至44和47至52中任一项所述的方法，其中X1包含胞嘧啶核碱基。
57.如权利要求20至56中任一项所述的方法，其中X3包含鸟嘌呤核碱基。
58.如权利要求20至56中任一项所述的方法，其中X3包含次黄嘌呤核碱基。
59.如权利要求20至56中任一项所述的方法，其中X3包含腺嘌呤核碱基。
60.如权利要求20至42、46、47和48至59中任一项所述的方法，其中X2包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基。
61.如权利要求60所述的方法，其中X2包含胞嘧啶核碱基。
62.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中X2具有式I-V中任一者的结构。
63.如权利要求20至62中任一项所述的方法，其中X2不是2’-O-甲基-核苷酸。
64.如权利要求63所述的方法，其中X1、X2和X3不是2’-O-甲基-核苷酸。
65.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述指导寡核苷酸包含以下结构：
[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
其中A和B各自是核苷酸；
m和n各自独立地是1至50的整数；
X1、X2和X3各自独立地是核苷酸，其中X1、X2或X3中的至少一个具有式VI-XI中任一者的结构：
其中N1是氢或核碱基；
R12是氢、羟基、氟、卤素、C1-C6烷基、C1-C6杂烷基或C1-C6烷氧基；
R13是氢或C1-C6烷基，
其中X1、X2或X3中的至少一个具有式VI-IX中任一者的结构。
66.如权利要求65所述的方法，其中[Am]和/或[Bn]的至少80％的核苷酸包括核碱基、糖和核苷间键。
67.如权利要求65或66所述的方法，其中R12是氢、卤素、C1-C6烷基或C1-C6杂烷基。
68.如权利要求65至67中任一项所述的方法，其中所述卤素是氟。
69.如权利要求65至68中任一项所述的方法，其中R12是氢或C1-C6烷基。
70.如权利要求65至69中任一项所述的方法，其中R12是氢。
71.如权利要求65至70中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式VI的结构，并且N1是核碱基。
72.如权利要求71所述的方法，其中X1具有式VI的结构，并且N1是核碱基。
73.如权利要求71或72所述的方法，其中X2具有式VI的结构，并且N1是核碱基。
74.如权利要求65至70中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式VII的结构，并且N1是核碱基。
75.如权利要求74所述的方法，其中X1具有式VII的结构，并且N1是核碱基。
76.如权利要求74或75所述的方法，其中X2具有式VII的结构，并且N1是核碱基。
77.如权利要求65至70中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式IX的结构，并且N1是核碱基。
78.如权利要求77所述的方法，其中X1具有式IX的结构，并且N1是核碱基。
79.如权利要求77或78所述的方法，其中X2具有式IX的结构，并且N1是核碱基。
80.如权利要求65至70中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式VIII的结构，并且N1是核碱基。
81.如权利要求80所述的方法，其中X1具有式VIII的结构，并且N1是核碱基。
82.如权利要求80或81所述的方法，其中X2具有式VIII的结构，并且N1是核碱基。
83.如权利要求65至72和74至82中任一项所述的方法，其中X2不具有式VI的结构。
84.如权利要求65至83中任一项所述的方法，其中X3不具有式VI的结构。
85.如权利要求65至75和77至84中任一项所述的方法，其中X2不具有式VII的结构。
86.如权利要求65至85中任一项所述的方法，其中X3不具有式VII的结构。
87.如权利要求65至78和80至86中任一项所述的方法，其中X2不具有式IX的结构。
88.如权利要求65至70中任一项所述的方法，其中X2具有式VI或式VII的结构。
89.如权利要求65至88中任一项所述的方法，其中当X1具有式VI至XI中任一者的结构时，X2和X3各自独立地是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X2具有式VI至XI中任一者的结构时，X1和X3各自独立地是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X3具有式VI至XI中任一者的结构时，X1和X2各自独立地是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X2各自具有式VI至XI中任一者的结构时，X3是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X3各自具有式VI至XI中任一者的结构时，X2是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；并且当X2和X3各自具有式VI至XI中任一者的结构时，X1是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
90.如权利要求89所述的方法，其中当X1具有式VI至XI中任一者的结构时，X2和X3各自独立地是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X2具有式VI至XI中任一者的结构时，X1和X3各自独立地是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X3具有式VI至XI中任一者的结构时，X1和X2各自独立地是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X2各自具有式VI至XI中任一者的结构时，X3是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X3各自具有式VI至XI中任一者的结构时，X2是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；并且当X2和X3各自具有式VI至XI中任一者的结构时，X1是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
91.如权利要求90所述的方法，其中当X1具有式VI至XI中任一者的结构时，X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X2具有式VI至XI中任一者的结构时，X1和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X3具有式VI至XI中任一者的结构时，X1和X2各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X1和X2各自具有式VI至XI中任一者的结构时，X3是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X1和X3各自具有式VI至XI中任一者的结构时，X2是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；并且当X2和X3各自具有式VI至XI中任一者的结构时，X1是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
92.如权利要求65至91中任一项所述的方法，其中X1包含次黄嘌呤核碱基。
93.如权利要求65至91中任一项所述的方法，其中X1包含尿嘧啶核碱基。
94.如权利要求65至91中任一项所述的方法，其中X1包含胞嘧啶核碱基。
95.如权利要求65至94中任一项所述的方法，其中X3包含次黄嘌呤核碱基。
96.如权利要求65至94中任一项所述的方法，其中X3包含鸟嘌呤核碱基。
97.如权利要求65至94中任一项所述的方法，其中X3包含腺嘌呤核碱基。
98.如权利要求65至97中任一项所述的方法，其中X2包含胞嘧啶核碱基。
99.如权利要求65至97中任一项所述的方法，其中X2包含尿嘧啶核碱基。
100.如权利要求65至97中任一项所述的方法，其中X2不包括核碱基。
101.如权利要求65至100中任一项所述的方法，其中X2不是2’-O-甲基-核苷酸。
102.如权利要求65至101中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3不是2’-O-甲基-核苷酸。
103.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述指导寡核苷酸包含以下结构：
[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
其中A和B各自是核苷酸；
m和n各自独立地是1至50的整数；
X1、X2和X3各自独立地是核苷酸，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式XII-XV中任一者的结构：
其中N1是氢或核碱基；
R6是氢、羟基或卤素；
R7是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基；
R8为氢或卤素；
R9是氢或羟基、卤素或C1-C6烷氧基；
R10是氢或卤素；并且
R11是氢或羟基、卤素或C1-C6烷氧基。
104.如权利要求103所述的方法，其中[Am]和/或[Bn]的至少80％的核苷酸包括核碱基、糖和核苷间键。
105.如权利要求103或104所述的方法，其中卤素是氟。
106.如权利要求103至105中任一项所述的方法，其中C1-C6烷氧基是OCH3。
107.如权利要求103至106中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式XIII的结构，其中R8和R9各自是氢。
108.如权利要求107所述的方法，其中X1具有式XIII的结构，其中R8和R9各自是氢。
109.如权利要求107或108所述的方法，其中X2具有式XIII的结构，其中R8和R9各自是氢。
110.如权利要求103至106中任一项所述的方法，其中X2具有式XII-XV中任一者的结构。
111.如权利要求103至110中任一项所述的方法，其中当X1具有式XII-XV中任一者的结构时，X2和X3各自独立地是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2’-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X2具有式XII-XV中任一者的结构时，X1和X3各自独立地是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X3具有式XII-XV中任一者的结构时，X1和X2各自独立地是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X2各自具有式XII-XV中任一者的结构时，X3是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X3各自具有式XII-XV中任一者的结构时，X2是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；并且当X2和X3各自具有式XII-XV中任一者的结构时，X1是核糖核苷酸、2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、2′-氨基-核苷酸、阿拉伯核酸-核苷酸、双环-核苷酸、2′-F-核苷酸、2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、限制性乙基-核苷酸、LNA-核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
112.如权利要求111所述的方法，其中当X1具有式XII-XV中任一者的结构时，X2和X3各自独立地是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X2具有式XII-XV中任一者的结构时，X1和X3各自独立地是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X3具有式XII-XV中任一者的结构时，X1和X2各自独立地是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X2各自具有式XII-XV中任一者的结构时，X3是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；当X1和X3各自具有式XII-XV中任一者的结构时，X2是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸；并且当X2和X3各自具有式XII-XV中任一者的结构时，X1是核糖核苷酸、2’-F-核苷酸、2’-O-甲氧基乙基-核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
113.如权利要求112所述的方法，其中当X1具有式XII-XV中任一者的结构时，X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X2具有式XII-XV中任一者的结构时，X1和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X3具有式XII-XV中任一者的结构时，X1和X2各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X1和X2各自具有式XII-XV中任一者的结构时，X3是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；当X1和X3各自具有式XII-XV中任一者的结构时，X2是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；并且当X2和X3各自具有式XII-XV中任一者的结构时，X1是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
114.如权利要求103至113中任一项所述的方法，其中X1包括次黄嘌呤核碱基。
115.如权利要求103至113中任一项所述的方法，其中X1包括尿嘧啶核碱基。
116.如权利要求103至113中任一项所述的方法，其中X1包括胞嘧啶核碱基。
117.如权利要求103至116中任一项所述的方法，其中X3包括次黄嘌呤核碱基。
118.如权利要求103至116中任一项所述的方法，其中X3包括腺嘌呤核碱基。
119.如权利要求103至118中任一项所述的方法，其中X2包括胞嘧啶核碱基。
120.如权利要求103至118中任一项所述的方法，其中X2包括尿嘧啶核碱基。
121.如权利要求103至118中任一项所述的方法，其中X2不包括核碱基。
122.如权利要求103至121中任一项所述的方法，其中X2不是2’-O-甲基-核苷酸。
123.如权利要求103至122中任一项所述的方法，其中X1、X2和X3不是2’-O-甲基-核苷酸。
124.如权利要求19至123中任一项所述的方法，其中[Am]包含至少一个核酸酶抗性核苷酸。
125.如权利要求19至124中任一项所述的方法，其中[Am]包含至少一个2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、至少一个2′-氨基-核苷酸、至少一个阿拉伯核酸-核苷酸、至少一个双环-核苷酸、至少一个2′-F-核苷酸、至少一个2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、至少一个限制性乙基(cEt)-核苷酸、至少一个LNA-核苷酸和/或至少一个脱氧核糖核苷酸。
126.如权利要求125所述的方法，其中[Am]包含至少一个2’-O-甲基-核苷酸、至少一个2’-F-核苷酸、至少一个2’-O-甲氧基乙基-核苷酸、至少一个cEt-核苷酸、至少一个LNA-核苷酸和/或至少一个脱氧核糖核苷酸。
127.如权利要求20至126中任一项所述的方法，其中[Am]包含至少五个末端2’-O-甲基-核苷酸。
128.如权利要求20至127中任一项所述的方法，其中[Am]包含至少一个硫代磷酸酯键。
129.如权利要求20至128中任一项所述的方法，其中[Am]包含至少四个末端硫代磷酸酯键。
130.如权利要求128或129所述的方法，其中至少一个硫代磷酸酯键是立体纯的。
131.如权利要求20至130中任一项所述的方法，其中[Bn]包含至少一个核酸酶抗性核苷酸。
132.如权利要求20至131中任一项所述的方法，其中[Bn]包含至少一个至少一个2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、至少一个2′-氨基-核苷酸、至少一个阿拉伯核酸-核苷酸、至少一个双环-核苷酸、至少一个2′-F-核苷酸、至少一个2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、至少一个cEt-核苷酸、至少一个LNA-核苷酸和/或至少一个脱氧核糖核苷酸。
133.如权利要求132所述的方法，其中[Bn]包含至少一个2’-O-甲基-核苷酸、至少一个2’-F-核苷酸、至少一个2’-O-甲氧基乙基-核苷酸、至少一个cEt-核苷酸、至少一个LNA-核苷酸和/或至少一个脱氧核糖核苷酸。
134.如权利要求20至132中任一项所述的方法，其中[Bn]包含至少五个末端2’-O-甲基-核苷酸。
135.如权利要求20至134中任一项所述的方法，其中[Bn]包含至少一个硫代磷酸酯键。
136.如权利要求20至135中任一项所述的方法，其中[Bn]包含至少四个末端硫代磷酸酯键。
137.如权利要求135或权利要求136所述的方法，其中至少一个硫代磷酸酯键是立体纯的。
138.如权利要求20至137中任一项所述的方法，其中组合的[Am]和[Bn]的至少20％的核苷酸是2’-O-甲基-核苷酸。
139.如权利要求20至138中任一项所述的方法，其中寡核苷酸还包含5’-帽结构。
140.如权利要求20至139中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含至少一个替代性核碱基。
141.如权利要求20至140中任一项所述的方法，其中5’-末端核苷酸是2’-氨基-核苷酸。
142.如权利要求20至141中任一项所述的方法，其中组合的A和B由18至80个核苷酸组成。
143.如权利要求20至142中任一项所述的方法，其中m为5至40。
144.如权利要求20至143中任一项所述的方法，其中n为5至40。
145.如权利要求20所述的方法，其中m和n各自独立地是5至40的整数；X1、X2和X3中的至少一个具有式I的结构，其中R1是氟、羟基或甲氧基，并且N1是核碱基，或者具有式V的结构，其中R4是氢并且R5是氢；不具有式I或式V的结构的X1、X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；[Am]和[Bn]各自包含至少五个末端2’-O-甲基-核苷酸和至少四个末端硫代磷酸酯键；并且组合的[Am]和[Bn]的至少20％的核苷酸是2’-O-甲基-核苷酸。
146.如权利要求65所述的方法，其中m和n各自独立地是5至40的整数；X1、X2和X3中的至少一个具有式VI、式VII、式VIII或式IX的结构，其中N1是核碱基，并且不具有式VI、式VII、式VIII、式IX的结构的X1、X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；[Am]和[Bn]各自包括至少五个末端2’-O-甲基-核苷酸和至少四个末端硫代磷酸酯键；并且组合的[Am]和[Bn]的至少20％的核苷酸是2’-O-甲基-核苷酸。
147.如权利要求103所述的方法，其中m和n各自独立地是5至40的整数；X1、X2和X3中的至少一个具有式XIII的结构，其中R8和R9各自是氢，并且不具有式XII的结构的X1、X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；[Am]和[Bn]各自包括至少五个末端2’-O-甲基-核苷酸和至少四个末端硫代磷酸酯键；并且组合的[Am]和[Bn]的至少20％的核苷酸是2’-O-甲基-核苷酸。
148.如权利要求19-147中任一项所述的方法，其中当寡核苷酸与SERPINA1 mRNA杂交时，X2与SNP rs28929474处的A对齐。
149.如权利要求1-148中任一项所述的方法，其中所述指导寡核苷酸能够实现SNPrs28929474处A的ADAR介导的腺苷到肌苷的改变。
150.如权利要求10-149中任一项所述的方法，其中所述治疗包括预防、逆转或减缓选自肝损伤、肝衰竭、肝硬化、黄疸、肺中弹性蛋白过度分解、肺气肿和COPD的至少一种A1AD症状。
151.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述指导寡核苷酸包含选自表5-19的寡核苷酸或由所述寡核苷酸组成。
152.一种寡核苷酸，其能够实现作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变或靶RNA，其中所述寡核苷酸包含以下结构：
[Am]-X1-X2-X3-X4-[Bn]
其中A和B各自是核苷酸；
m和n各自独立地是1至50的整数；
X1、X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸，并且X4是2’-氟核苷酸，其中当寡核苷酸与靶RNA杂交时，X2与待脱氨基为肌苷的腺苷相反。
153.一种寡核苷酸，其包含以下结构：
[Am]-X1-X2-X3-X4-[Bn]
其中A和B各自是核苷酸；
m和n各自独立地是1至50的整数；
X1、X2和X3各自独立地是核苷酸，并且X4选自2’-O-甲基核苷酸和2’-氟核苷酸；
其中X1、X2或X3中的至少一个具有式I-V中任一者的结构：
其中N1是氢或核碱基；
R1是羟基、卤素或C1-C6烷氧基；
R2是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基；
R3是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基；
R4是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基；并且
R5是氢、羟基、卤素或C1-C6烷氧基。
154.如权利要求153所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够实现作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变或靶RNA。
155.如权利要求153或154所述的寡核苷酸，其中X2与待脱氨基为肌苷的腺苷相反。
156.如权利要求153至155中任一项所述的寡核苷酸，其中R4是氢并且R5不是氢或羟基，R5是氢并且R4不是氢，或者R5是羟基并且R4不是氢。
157.如权利要求153至156中任一项所述的寡核苷酸，其中R1是羟基、卤素或OCH3。
158.如权利要求153至157中任一项所述的寡核苷酸，其中R2是氢。
159.如权利要求153至158中任一项所述的寡核苷酸，其中X1、X2或X3中的至少一个具有式I、式II或式V的结构；并且X1、X2或X3均不具有式IV或式III的结构。
160.如权利要求153至159中任一项所述的寡核苷酸，其中X1、X2或X3中的至少一个具有式I或式II的结构；并且X1、X2或X3均不具有式III、式IV或式V的结构。
161.如权利要求153至160中任一项所述的寡核苷酸，其中所述卤素是氟。
162.如权利要求153至161中任一项所述的寡核苷酸，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式I的结构，其中R1是氟，并且N1是核碱基。
163.如权利要求162所述的寡核苷酸，其中X1具有式I的结构，其中R1是氟，并且N1是核碱基。
164.如权利要求162或163所述的寡核苷酸，其中X2具有式I的结构，其中R1是氟，并且N1是核碱基。
165.如权利要求162至164中任一项所述的寡核苷酸，其中X3具有式I的结构，其中R1是氟，并且N1是核碱基。
166.如权利要求153至161中任一项所述的寡核苷酸，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式I的结构，其中R1是羟基，并且N1是核碱基。
167.如权利要求166所述的寡核苷酸，其中X1具有式I的结构，其中R1是羟基，并且N1是核碱基。
168.如权利要求166或167所述的寡核苷酸，其中X2具有式I的结构，其中R1是羟基，并且N1是核碱基。
169.如权利要求166至168中任一项所述的寡核苷酸，其中X3具有式I的结构，其中R1是羟基，并且N1是核碱基。
170.如权利要求153至161中任一项所述的寡核苷酸，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式I的结构，其中R1是甲氧基，并且N1是核碱基。
171.如权利要求170所述的寡核苷酸，其中X1具有式I的结构，其中R1是甲氧基，并且N1是核碱基；并且X2和X3各自是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
172.如权利要求170或171所述的寡核苷酸，其中X2具有式I的结构，其中R1是甲氧基，并且N1是核碱基。
173.如权利要求170至172中任一项所述的寡核苷酸，其中X3具有式I的结构，其中R1是甲氧基，并且N1是核碱基。
174.如权利要求153至161中任一项所述的寡核苷酸，其中X1、X2和X3中的至少一个具有式II的结构，其中R2是氢，并且N1是核碱基。
175.如权利要求174所述的寡核苷酸，其中X2具有式II的结构，其中R2是氢，并且N1是核碱基。
176.如权利要求153至159中任一项所述的寡核苷酸，其中X1和X2中的至少一个具有式V的结构。
177.如权利要求176所述的寡核苷酸，其中X2具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是氢。
178.如权利要求176所述的寡核苷酸，其中X2具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是羟基。
179.如权利要求176所述的寡核苷酸，其中X1具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是氢。
180.如权利要求176所述的寡核苷酸，其中X1具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是羟基。
181.如权利要求176所述的寡核苷酸，其中X2具有式V的结构，其中R4是氢，并且R5是甲氧基。
182.如权利要求153-181中任一项所述的寡核苷酸，其中不具有式I-V中任一者的结构的X1、X2或X3各自是脱氧核糖核苷酸。
183.如权利要求153至173和176至182中任一项所述的寡核苷酸，其中X1、X2和X3均不具有式II的结构，其中N1是核碱基。
184.如权利要求183所述的寡核苷酸，其中X1、X2和X3均不具有式II的结构，其中N1是胞嘧啶核碱基。
185.如权利要求153至178和181至184中任一项所述的寡核苷酸，其中X1包含尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基。
186.如权利要求185所述的寡核苷酸，其中X1包含尿嘧啶核碱基。
187.如153至178和181至184中任一项所述的寡核苷酸，其中X1包含次黄嘌呤核碱基。
188.如权利要求153至178和181至184中任一项所述的寡核苷酸，其中X1包含胞嘧啶核碱基。
189.如权利要求153至188中任一项所述的寡核苷酸，其中X3包含鸟嘌呤核碱基。
190.如权利要求153至188中任一项所述的寡核苷酸，其中X3包含次黄嘌呤核碱基。
191.如权利要求153至188中任一项所述的寡核苷酸，其中X3包含腺嘌呤核碱基。
192.如权利要求153至176、179、180和182至191中任一项所述的寡核苷酸，其中X2包含胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶核碱基。
193.如权利要求192所述的寡核苷酸，其中X2包含胞嘧啶核碱基。
194.如权利要求153至158中任一项所述的寡核苷酸，其中X2具有式I-V中任一者的结构。
195.如权利要求153至194中任一项所述的寡核苷酸，其中X2不是2’-O-甲基-核苷酸。
196.如权利要求196所述的寡核苷酸，其中X1、X2和X3不是2’-O-甲基-核苷酸。
197.如权利要求152至196中任一项所述的寡核苷酸，其中[Am]和/或[Bn]的至少80％的核苷酸包括核碱基、糖和核苷间键。
198.如权利要求152至197中任一项所述的寡核苷酸，其中[Am]包含至少一个核酸酶抗性核苷酸。
199.如权利要求152至198中任一项所述的寡核苷酸，其中[Am]包含至少一个2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、至少一个2′-氨基-核苷酸、至少一个阿拉伯核酸-核苷酸、至少一个双环-核苷酸、至少一个2′-F-核苷酸、至少一个2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、至少一个限制性乙基(cEt)-核苷酸、至少一个LNA-核苷酸和/或至少一个脱氧核糖核苷酸。
200.如权利要求199所述的寡核苷酸，其中[Am]包含至少一个2’-O-甲基-核苷酸、至少一个2’-F-核苷酸、至少一个2’-O-甲氧基乙基-核苷酸、至少一个cEt-核苷酸、至少一个LNA-核苷酸和/或至少一个脱氧核糖核苷酸。
201.如权利要求152至200中任一项所述的寡核苷酸，其中[Am]包含至少五个末端2’-O-甲基-核苷酸。
202.如权利要求152至201中任一项所述的寡核苷酸，其中[Am]包含至少一个硫代磷酸酯键。
203.如权利要求152至202中任一项所述的寡核苷酸，其中[Am]包含至少四个末端硫代磷酸酯键。
204.如权利要求202或权利要求203所述的寡核苷酸，其中至少一个硫代磷酸酯键是立体纯的。
205.如权利要求152至204中任一项所述的寡核苷酸，其中[Bn]包含至少一个核酸酶抗性核苷酸。
206.如权利要求152至205中任一项所述的寡核苷酸，其中[Bn]包含至少一个2′-O-C1-C6烷基-核苷酸、至少一个2′-氨基-核苷酸、至少一个阿拉伯核酸-核苷酸、至少一个双环-核苷酸、至少一个2′-F-核苷酸、至少一个2′-O-甲氧基乙基-核苷酸、至少一个cEt-核苷酸、至少一个LNA-核苷酸和/或至少一个脱氧核糖核苷酸。
207.如权利要求206所述的寡核苷酸，其中[Bn]包含至少一个2’-O-甲基-核苷酸、至少一个2’-F-核苷酸、至少一个2’-O-甲氧基乙基-核苷酸、至少一个cEt-核苷酸、至少一个LNA-核苷酸和/或至少一个脱氧核糖核苷酸。
208.如权利要求152至207中任一项所述的寡核苷酸，其中[Bn]包含至少五个末端2’-O-甲基-核苷酸。
209.如权利要求152至208中任一项所述的寡核苷酸，其中[Bn]包含至少一个硫代磷酸酯键。
210.如权利要求152至209中任一项所述的寡核苷酸，其中[Bn]包含至少四个末端硫代磷酸酯键。
211.如权利要求209或权利要求210所述的寡核苷酸，其中至少一个硫代磷酸酯键是立体纯的。
212.如权利要求152至208中任一项所述的寡核苷酸，其中组合的[Am]和[Bn]的至少20％的核苷酸是2’-O-甲基-核苷酸。
213.如权利要求152至212中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸还包含5’-帽结构。
214.如权利要求152至213中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个替代性核碱基。
215.如权利要求152至214中任一项所述的寡核苷酸，其中所述5’-末端核苷酸是2’-氨基-核苷酸。
216.如权利要求152至215中任一项所述的寡核苷酸，其中组合的A和B由18至80个核苷酸组成。
217.如权利要求152至216中任一项所述的寡核苷酸，其中m是5至40。
218.如权利要求152至217中任一项所述的寡核苷酸，其中n是5至40。
219.如权利要求152至218中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸还包含一种或多种作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)-募集结构域。
220.如权利要求152至219中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够实现与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP的作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)介导的腺苷到肌苷的改变。
221.如权利要求220所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含与SERPINA1 mRNA序列互补的核酸序列，所述SERPINA1 mRNA序列包含与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP。
222.如权利要求221所述的寡核苷酸，其中所述SNP是rs28929474(A)。
223.如权利要求222所述的寡核苷酸，其中所述SERPINA1mRNA编码包含致病性氨基酸的SERPINA1蛋白，所述致病性氨基酸包含由所述SNP导致的位置342处的赖氨酸。
224.如权利要求222或权利要求223所述的寡核苷酸，其中当所述寡核苷酸与SERPINA1mRNA杂交时，X2与SNP rs28929474处的A对齐。
225.如权利要求220至224中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够实现SNPrs28929474处A的ADAR介导的腺苷到肌苷的改变。
226.一种缀合物，其包含与靶向部分缀合的如权利要求152至225中任一项所述的寡核苷酸。
227.如权利要求226所述的缀合物，其中所述靶向部分是脂质、甾醇、碳水化合物和/或肽。
228.一种复合物，其包含：
如权利要求152至225中任一项所述的寡核苷酸或如权利要求226或227所述的缀合物；和
mRNA，
其中所述寡核苷酸或缀合物和mRNA彼此杂交，并且所述复合物在所述mRNA的腺苷处包含第一个错配。
229.如权利要求228所述的复合物，其中所述复合物包括第二个错配，所述第二个错配是第一个错配的5’的四个核苷酸。
230.如权利要求228或229所述的复合物，其中所述复合物包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个错配。
231.如权利要求228至230中任一项所述的复合物，其中所述mRNA包含可被脱氨基以产生治疗结果的腺苷。
232.如权利要求228至230中任一项所述的复合物，其中与相应的天然mRNA相比，所述mRNA包括鸟苷到腺苷的突变。
233.如权利要求232所述的复合物，其中所述鸟苷到腺苷的突变是错义或无义突变。
234.如权利要求228至233中任一项所述的复合物，其中所述第一个错配位于所述mRNA的起始密码子中的腺苷处。
235.如权利要求228至233中任一项所述的复合物，其中所述第一个错配位于所述mRNA的终止密码子中的腺苷处。
236.如权利要求235所述的复合物，其中所述终止密码子是提前终止密码子。
237.一种产生如权利要求228至236中任一项所述的复合物的方法，所述方法包括使细胞与如权利要求152至225中任一项所述的寡核苷酸或如权利要求226或227所述的缀合物接触。
238.一种用于使mRNA中的腺苷脱氨基的方法，所述方法包括使细胞与如权利要求152至225中任一项所述的寡核苷酸或如权利要求226或227所述的缀合物接触。
239.一种治疗有需要的受试者的病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如权利要求152至226中任一项所述的寡核苷酸或如权利要求226或227所述的缀合物。
240.一种编辑SERPINA1多核苷酸的方法，所述SERPINA1多核苷酸包含与可能导致肝衰竭或肺气肿的α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的单核苷酸多态性(SNP)，所述方法包括使所述SERPINA1多核苷酸与如权利要求220至225中任一项所述的寡核苷酸或如权利要求226或权利要求227所述的缀合物接触，从而编辑所述SERPINA1多核苷酸。
241.如权利要求240所述的方法，其中所述SERPINA1多核苷酸与所述指导寡核苷酸在细胞中接触。
242.如权利要求241所述的方法，其中所述细胞内源性表达ADAR。
243.如权利要求242所述的方法，其中所述ADAR是人ADAR。
244.如权利要求243所述的方法，其中所述ADAR是人ADAR1。
245.如权利要求243所述的方法，其中所述ADAR是人ADAR2。
246.如权利要求241-245中任一项所述的方法，其中所述细胞选自真核细胞、哺乳动物细胞和人细胞。
247.如权利要求241-246中任一项所述的方法，其中所述细胞是体内的。
248.如权利要求241-246中任一项所述的方法，其中所述细胞是离体的。
249.一种治疗有需要的受试者的α1抗胰蛋白酶缺乏症的方法，所述方法包括
鉴定在SERPINA1多核苷酸中具有与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的单核苷酸多态性(SNP)的受试者；
使所述受试者的细胞中的所述SERPINA1多核苷酸与如权利要求220至225中任一项所述的寡核苷酸或如权利要求226或权利要求227所述的缀合物接触，从而治疗所述受试者。
250.一种治疗有需要的受试者的α1抗胰蛋白酶缺乏症的方法，所述方法包括
鉴定在SERPINA1多核苷酸中具有与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的单核苷酸多态性(SNP)的受试者；
使细胞中的所述SERPINA1多核苷酸与如权利要求220至225中任一项所述的寡核苷酸或如权利要求226或权利要求227所述的缀合物接触，以及
向所述受试者施用所述细胞，从而治疗所述受试者。
251.如权利要求250所述的方法，其中所述细胞对于所述受试者是自体的、同种异体的或异种的。
252.如权利要求249-251中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
253.如权利要求240-252中任一项所述的方法，其中所述指导寡核苷酸包含与SERPINA1 mRNA序列互补的核酸序列，所述SERPINA1 mRNA序列包含与α1抗胰蛋白酶缺乏症相关的SNP。
254.如权利要求240-253中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸还包含一种或多种作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)-募集结构域。
255.如权利要求240-254中任一项所述的方法，其中所述SERPINA1多核苷酸编码包含致病性氨基酸的SERPINA1蛋白，所述致病性氨基酸包含由所述SNP导致的位置342处的赖氨酸。
256.如权利要求255所述的方法，其中所述腺苷到肌苷的改变用野生型氨基酸取代所述致病性氨基酸。
257.如权利要求256所述的方法，其中位置342处的所述野生型氨基酸包含谷氨酸。
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