CN117004582A - 一种利用大肠杆菌生物降解黄体酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用大肠杆菌生物降解激素类药物黄体酮的方法，属于生物技术领域。本发明通过构建大肠杆菌基因工程菌株，在表达P450s CYP260A1S276I的基因上，引入异源的氧化还原伙伴。该全细胞系统在静息细胞时可以对黄体酮进行羟基化反应，首先进行黄体酮到17ɑ‑羟基黄体酮的羟基化反应，之后降解17ɑ‑羟基黄体酮并生成新物质，并在22～60h内就可以达到0～50mM黄体酮完全降解的效果，具有较高的降解速率，该菌株具有的能催化黄体酮完全降解的应用为国内外首次报道，可较高效地应用于含黄体酮污水的微生物处理工艺中，具有较好的应用前景。
Description
技术领域：
本发明涉及一种利用大肠杆菌生物降解激素类药物黄体酮的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
黄体酮(progesterone)及其衍生物是一类重要的类固醇药物，临床医学上黄体酮用于先兆性流产、习惯性流产等闭经或闭经原因的反应性诊断等。它对子宫内膜的分泌转化、蜕膜化过程、维持性周期及保持妊娠等起重要的作用，也是女用口服避孕药的主要成分，但大剂量使用时会抑制垂体促性腺激素的分泌，产生抑制排卵作用。近年来研究表明，黄体酮的作用已远超出生殖功能的范畴，它不仅可在神经系统中合成分泌，又能影响神经系统的结构和功能，可以用于治疗顽固性腹水、睡眠暂停综合征、慢性呼吸衰竭和输尿管结石等，在临床上起着越来越重要的作用。而且，由于黄体酮对雀斑美容的良好疗效，所以也被广泛的应用于化妆品中。
随着黄体酮的广泛应用，其生产应用过程中所产生的废水对环境污染也日益加剧，给人类健康带来了严重威胁。药物中的黄体酮经过人体或动物体吸收代谢后排入污水系统或环境水体，个人护理品中的黄体酮使用后直接进入污水管网中。而且由于医药业和化妆品行业大量而频繁地使用，导致黄体酮形成以痕量浓度长期存在于水环境之中的假性持续性现象，在地表水体和地下水体中，都有一定数量的黄体酮存在，且具有很强的持久性和潜在的生物累积性，可能转化、生物降解、吸附在污泥上，最终出现在河流、湖泊。随着对类固醇激素研究的深入和检测技术的发展，在畜禽粪污、污水处理厂出水、土壤、河水、河流底泥，甚至地下水等环境介质中不断有各种类固醇激素的检出报道。黄体酮没有特异性，对所有的生命有机体均可产生生物效应，即便是在低于浓度级也会产生内分泌效应，它能稳定地吸附在微小颗粒的表面且有较高的生物累积潜能，如影响到其他生物体的生理结构、导致出现药物抗性等，给生态环境和人类健康带来了一定的潜在风险。
目前污水处理厂在处理医院废水和生活污水时一般都是采用的常规处理技术和工艺，无法彻底清除水中的黄体酮，当自来水厂采用地下水作为饮用水源时，通常不能把黄体酮减少到可以接受的浓度，通过间接可饮用水的回用、城市污水处理厂的排放，黄体酮可能暴露于环境并最终存在于饮用水中。
国内外处理黄体酮废水的方法主要是物化法。研究表明上述处理方法存在一定的局限性。物化法处理过程受到pH值、氧化剂投加量、反应温度、反应时间等因素的影响，这种方法过程复杂繁琐所需时间长、易引起二次污染、而且处理效果差。综合考虑环境和经济因素，微生物降解被认为是目前去除环境中类固醇激素物质的一种重要途径，亦是最为经济绿色的方法之一。一直以来，环境中的研究主要集中在雌激素，对于孕激素物质的研究尤其是其降解去除方面的研究较少，养殖场周边受纳环境及地下水中频繁检出黄体酮酮等类固醇激素物质，表明现有污水处理工艺对该类化合物的去除能力有限，有必要研发高效的、有针对性的和高适用性的微生物降解去除方法。
细胞色素P450单加氧酶是生物技术应用中非常有用的生物催化剂，因为它们可以对广泛的有机分子进行多种反应。P450酶存在于大多数生物体中，能够催化黄体酮的羟基化反应，以高度区域选择性和立体选择性，在温和条件下，利用分子氧和通过适当的氧化还原伙伴蛋白(如铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶)从氢化物供体NAD(P)H的双电子转移进行催化反应，将氧插入黄体酮的非活化CH键中。
本申请研究利用纤维素假单胞菌菌株So ce56的其中一个P450s CYP260A1S276I，发现其不但具有转化黄体酮的17位羟基化活性，而且还具有将黄体酮全部水解的活性。具体方式为构建大肠杆菌基因工程菌株，在表达P450s CYP260A1S276I的基因的基础上，引入异源的氧化还原伙伴。该全细胞系统在静息细胞时可以对黄体酮进行羟基化反应，转化黄体酮为17ɑ-羟基黄体酮，之后该系统可以降解17ɑ-羟基黄体酮并生成新物质，并在22～60h内就可以达到完全降解的效果，具有较高的降解速率，该菌株具有的能催化黄体酮完全降解的应用为国内外首次报道，可较高效地应用于含黄体酮污水的微生物处理工艺中，具有较好的应用前景。
发明内容：
本发明要解决的的技术问题是提供一种高效的降解黄体酮的全细胞系统，实现对黄体酮的微生物降解，大幅降低处理成本，对于黄体酮的污染治理具有重要意义。
本发明提供的技术方案之一，是一种黄体酮羟化酶CYP260A1的突变体S276I(以下简称CYP260A1 S276I)在降解黄体酮中的应用，该酶能够实现黄体酮的完全降解，所述黄体酮羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步地，所述降解黄体酮的反应体系采用异源多酶催化的人工电子传递系统，包括来源于牛的肾上腺素Adx4-108和来源大肠杆菌(Escherichia coli str.K-12substr.MG1655)的铁氧还蛋白酶Fpr；
进一步地，所述肾上腺素Adx4-108，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，基因序列如SEQ ID NO：4所示；
进一步地，所述铁氧还蛋白酶Fpr，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，基因序列SEQ ID NO：6所示，Gene ID:948414。
本发明提供的技术方案之二，是一种能够生物降解黄体酮的基因工程菌株，所述基因工程菌株是在宿主细胞中对CYP260A1 S276I、Adx4-108和Fpr的编码基因进行表达获得的；
进一步地，将CYP260A1 S276I、Adx4-108和Fpr的编码基因按照Fpr-CYP-Adx的顺序(5’-3’的顺序)进行表达；
进一步地，所述宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌；
优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21；
进一步地，通过将CYP260A1 S276I、Adx4-108和Fpr的编码基因构建重组表达载体进行表达；
所述重组表达载体使用的表达质粒包括但不限于pCDFDuet-1、pET17b、pET22b、pET28a；
优选地，所述重组表达载体使用的表达质粒为pCDFDuet-1质粒；
更优选地，所述重组表达载体使用的表达质粒为pET17b质粒；
优选地，将CYP260A1 S276I、Adx4-108和Fpr的编码基因按照Fpr-CYP-Adx的顺序(5’-3’的顺序)在pCDFDuet-1质粒上构建重组表达载体pCDFDuet-P2，并在大肠杆菌BL21中进行异源表达，获得重组菌株BL21-pCDFDuet-P2；
优选地，将CYP260A1 S276I、Adx4-108和Fpr的编码基因按照Fpr-CYP-Adx的顺序(5’-3’的顺序)在pET17b质粒上构建重组表达载体pET17b-P2，并在大肠杆菌BL21中进行异源表达，获得重组菌株BL21-pET17b-P2。
本发明提供的技术方案之三，是上述基因工程菌株在生物降解黄体酮中的应用；
进一步地，通过将上述基因工程菌进行诱导表达后制备静息细胞，将静息细胞投入含有黄体酮的待处理水中进行生物降解；
更进一步地，所述静息细胞的制备方法如下：发酵培养基采用适合异源蛋白表达的TB培养基，加入链霉素抗性或氨苄霉素抗性，发酵条件：按1～5％的接种量，在20～40℃，100～300r/min条件下培养2～3h，当OD600＝0.6～0.8时加入0.1～5mM IPTG诱导剂诱导，在20～40℃，100～300r/min条件下诱导2～24h，其中需添加0.1～5mM ALA促进P450酶中的血红素的生物合成；培养完成后将发酵液离心收集细胞，洗涤后获得静息细胞；
更进一步地，采用上述静息细胞处理含有黄体酮的待处理水的方法如下：该催化体系包括2～65g/L静息细胞；0～50mM黄体酮；0.1～50μg/mL多粘菌素B，20～40℃，100～300r/min条件下反应2～60h，乙酸乙酯终止反应，可实现黄体酮的完全降解。
有益效果：
本发明基于CYP基因和两个氧化还原伙伴基因在一个载体上验证了3种表达顺序，得到了可以稳定降解黄体酮的基因顺序，即Fpr-CYP-Adx，实现了黄体酮的完全降解。
本发明提供了一种将黄体酮成功降解的全细胞系统，成功构建重组表达载体pCDFDuet-P2、pET17b-P2，并将其成功用于大肠杆菌的全细胞催化。为微生物治理类固醇激素污染提供了新的思路。
本发明通过构建大肠杆菌基因工程菌株，在表达P450s CYP260A1 S276I的基因上，引入异源的氧化还原伙伴。该全细胞系统可以对黄体酮进行羟基化反应，首先进行黄体酮到17ɑ-羟基黄体酮的羟基化反应，之后降解17ɑ-羟基黄体酮并生成新物质，并在22～60h内就可以达到0～50mM黄体酮完全降解的效果，具有较高的降解速率，该菌株具有的能催化黄体酮完全降解的应用为国内外首次报道，可较高效地应用于含黄体酮污水的微生物处理工艺中，具有较好的应用前景。
附图说明：
图1为pCDFDuet-P2的质粒图谱；
图2为pET17b-P2的质粒图谱；
图3为BL21-pET17b-P2全细胞催化薄层层析
其中，(a)6h样品的TLC分析；(b)18-22h样品的TLC分析；
图4为BL21-pET17b-P2全细胞催化体系的HPLC色谱分析图其中，(a)18h样品的HPLC色谱分析；(b)20h样品的HPLC色谱分析；(c)22h样品的HPLC色谱分析。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细的叙述，以便于本领域的研究人员更好的理解和运用本发明。
本发明及实施例中涉及使用的培养基如下：
LB液体培养基(g/L)：酵母浸粉0.5g，氯化钠1g,胰蛋白胨1g；
TB液体培养基(g/L)：酵母浸粉24g，胰蛋白胨12g，甘油4g，加入900mL去离子水，121℃高压灭菌20min，使用前加入100mL的1.3M磷酸钾缓冲液。
本发明及实施例中所涉及的溶液如下：
1.3M磷酸钾缓冲液(g/L)：磷酸氢二钾23g，磷酸二氢钾164g，加入1000mL去离子水，121℃高压灭菌20min。
20mM磷酸钾缓冲液(g/L)：磷酸氢二钾18.25g，磷酸二氢钾2.72g，加入1000mL去离子水，121℃高压灭菌20min。
10mM黄体酮溶液(g/L)：2-羟丙基-β-环糊精2250g，加入1000mL 20mM磷酸钾缓冲液，加入3.14g黄体酮。
500mM黄体酮溶液(g/L)：2-羟丙基-β-环糊精2250g，加入1000mL 20mM磷酸钾缓冲液，加入157g黄体酮。
多粘菌素B溶液(g/L)：多粘菌素B 3g，加入1000mL 20mM磷酸钾缓冲液。
本发明及实施例中所涉及试剂如下：
质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒均购自Omega Bio-Tek公司。黄体酮、17α-羟基黄体酮购自aladdin阿拉丁公司。多粘菌素B购自Solarbio公司。2-羟丙基-β-环糊精购自MACKLIN麦克林公司。
黄体酮全细胞催化反应产物的薄层色谱法检测分析条件如下：
标准品制备：标准品黄体酮和17α-羟基黄体酮用100μL乙酸乙酯溶解。
样品制备：1mL全细胞转化样品用乙酸乙酯等体积萃取，终止反应。萃取的样品经氮气吹干后用100μL乙酸乙酯复溶，即样品制备完成。
展开剂选择：氯仿：乙酸乙酯＝3：1。
薄层点样：用毛细管(0.5mm以下)进行点样，样点位置距离底边1-1.5cm处，点样量适当，样点直径小于2-3mm，间隔反复点样，多个样点间隔2cm且处于同一条直线上。
展开：当样点上的溶剂充分挥干后，将薄层放置在密闭容器中，使用上述确定的展开剂从薄层的一端向另一端进行浸润展开。
显色：溶剂向上展开约90％的薄板长度，用镊子小心取出薄层板，待溶剂吹干，在紫外灯下观察有无暗斑或荧光斑点。
本发明及实施例中所涉及的检测方法如下：
黄体酮含量的检测：
样品处理：首先，将保存在-20℃冰箱的样品取出置于冰上融化，然后取1mL样品于干净的5mL离心管内；加入等体积的乙酸乙酯进行萃取(振荡器上处理30-50s)；吸取1mL萃取液于干净的2mL离心管内，用氮吹仪将乙酸乙酯在通风橱内吹干，然后用60％乙腈复溶；样品全部用0.22μm的有机滤膜过滤至液相小瓶内衬管内，直接进行HPLC检测或暂放于4℃冰箱内备用。
HPLC检测：实验用的C18柱子(Diamonsil C18,5μm,250×4.6mm)；流动相：60％乙腈。一个样品检测需要15min；流速：1mL/min；样品进样量为10μL；温度为30℃，检测波长为241nm。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明及实施例所涉及的黄体酮羟化酶CYP260A1的突变体S276I，氨基酸序列SEQID NO:1所示：
MDFPLANLFFVPSEDATAFGRRLRAAAQQAPIVFDTAFGMPILLRKSHITTAYRDTATFSTRMFQAGILNGGLAAMQGDEHARMRRVYNMFFLPRAVSQYEERFVRPISEQVVDRLAGKPRVDLLEDFAMELPRRVIGELFGFPAEKLHETDERVRAMLRGLVRMHDPAAVAESQRAYGETLGLITEVVERESRDTSDTLLGEILRTLKAEHMDTIEASRQIVLSLILGGYETTSWLVANTIHALLAHPDTLARVRQDPSLLPAAIEEGMRWCPSIFGVLRMVERDVRLDDQALSAGTVVCLAGIAGNYDETAYPSPEVYDIDRKPLPAANVFGGGAHFCVGAPLARMEARVGLQALLARFPGLRAVPEERPSFMYGAKDSVAHGPDKLPVLLHKL*
本发明及实施例所涉及的黄体酮羟化酶CYP260A1的突变体S276I，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示：
ATGGATTTTCCGCTGGCCAATCTGTTTTTTGTTCCGTCTGAAGATGCCACCGCCTTCGGCCGTCGCCTGCGTGCTGCCGCTCAGCAAGCCCCGATTGTTTTTGATACCGCCTTTGGCATGCCGATTCTGCTGCGTAAATCTCATATTACCACCGCCTATCGTGATACCGCCACCTTTTCTACCCGTATGTTTCAAGCCGGTATTCTGAATGGTGGTCTGGCCGCCATGCAAGGTGATGAACATGCCCGTATGCGTCGTGTTTACAATATGTTTTTTCTGCCGCGTGCCGTTTCTCAGTATGAAGAACGTTTTGTTCGTCCGATTTCTGAACAAGTTGTTGATCGTCTGGCCGGTAAACCGCGTGTTGATCTGCTGGAAGATTTTGCCATGGAACTGCCGCGTCGTGTTATTGGTGAACTGTTTGGTTTTCCGGCCGAAAAACTGCATGAAACCGATGAACGTGTTCGTGCCATGCTGCGTGGTCTGGTTCGTATGCATGATCCGGCCGCCGTTGCCGAATCTCAGCGTGCCTATGGTGAAACCCTGGGTCTGATTACCGAAGTTGTTGAACGTGAATCTCGTGATACCTCTGATACCCTGCTGGGTGAAATTCTGCGTACCCTGAAAGCCGAACACATGGATACCATTGAAGCCTCTCGTCAGATTGTTCTGTCTCTGATTCTGGGTGGTTATGAAACCACCTCTTGGCTGGTTGCCAATACCATTCATGCTCTGCTGGCCCATCCGGATACCCTGGCCCGTGTTCGTCAAGATCCGTCTCTGCTGCCGGCCGCCATCGAGGAAGGTATGCGTTGGTGTCCGTCTATTTTTGGTGTTCTGCGTATGGTTGAACGTGATGTTCGTCTGGATGATCAAGCCCTGTCTGCCGGCACCGTTGTTTGCCTGGCCGGTATTGCCGGTAATTATGATGAAACCGCCTATCCGTCTCCGGAAGTTTATGATATTGATCGTAAACCGCTGCCGGCCGCTAATGTTTTTGGTGGCGGTGCCCATTTTTGTGTTGGTGCCCCGCTGGCCCGTATGGAAGCCCGTGTTGGTCTGCAAGCCCTGCTGGCCCGTTTTCCGGGCCTGCGTGCCGTTCCGGAAGAACGTCCGTCTTTTATGTATGGTGCCAAAGATTCTGTTGCCCATGGTCCGGATAAACTGCCGGTTCTGCTGCATAAGCTTTAA
本发明及实施例所涉及的肾上腺素Adx4-108，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示：
MEDKITVHFINRDGETLTTKGKIGDSLLDVVVQNNLDIDGFGACEGTLACSTCHLIFE QHIFEKLEAITDEENDMLDLAYGLTDRSRLGCQICLTKAMDNMTVRVP*
本发明及实施例所涉及的肾上腺素Adx4-108，基因序列如SEQ ID NO：4所示：
ATGGAAGATAAAATTACCGTTCATTTTATTAATCGTGATGGTGAAACCCTGACCACCAAAGGTAAAATTGGTGATTCTCTGCTGGATGTTGTGGTTCAGAATAATCTGGATATTGATGGTTTTGGTGCCTGTGAAGGCACCCTGGCCTGTTCTACCTGTCATCTGATTTTTGAACAGCATATTTTTGAAAAACTGGAAGCCATTACCGATGAAGAAAATGATATGCTGGATCTGGCCTATGGTCTGACCGATCGTTCTCGTCTGGGTTGTCAGATTTGTCTGACCAAAGCCATGGATAATATGACCGTTCGTGTTCCGTAA
本发明及实施例所涉及的铁氧还蛋白酶Fpr，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示：
MADWVTGKVTKVQNWTDALFSLTVHAPVLPFTAGQFTKLGLEIDGERVQRAYSYVNSPDNPDLEFYLVTVPDGKLSPRLAALKPGDEVQVVSEAAGFFVLDEVPHCETLWMLATGTAIGPYLSILQLGKDLDRFKNLVLVHAARYAADLSYLPLMQELEKRYEGKLRIQTVVSRETAAGSLTGRIPALIESGELESTIGLPMNKETSHVMLCGNPQMVRDTQQLLKETRQMTKHLRRRPGHMTAEHYW*
本发明及实施例所涉及的铁氧还蛋白酶Fpr，基因序列SEQ ID NO：6所示：
ATGGCTGATTGGGTAACAGGCAAAGTCACTAAAGTGCAGAACTGGACCGACGCCCTGTTTAGTCTCACCGTTCACGCCCCCGTGCTTCCGTTTACCGCCGGGCAATTTACCAAGCTTGGCCTTGAAATCGACGGCGAACGCGTCCAGCGCGCCTACTCCTATGTAAACTCGCCCGATAATCCCGATCTGGAGTTTTACCTGGTCACCGTCCCCGATGGCAAATTAAGCCCACGACTGGCGGCACTGAAACCAGGCGATGAAGTGCAGGTGGTTAGCGAAGCGGCAGGATTCTTTGTGCTCGATGAAGTGCCGCACTGCGAAACGCTATGGATGCTGGCAACCGGTACAGCGATTGGCCCTTATTTATCGATTCTGCAACTAGGTAAAGATTTAGATCGCTTCAAAAATCTGGTCCTGGTGCACGCCGCACGTTATGCCGCCGACTTAAGCTATTTGCCACTGATGCAGGAACTGGAAAAACGCTACGAAGGAAAACTGCGCATTCAGACGGTGGTCAGTCGGGAAACGGCAGCGGGGTCGCTCACCGGACGGATACCGGCATTAATTGAAAGTGGGGAACTGGAAAGCACGATTGGCCTGCCGATGAATAAAGAAACCAGCCATGTGATGCTGTGCGGCAATCCACAGATGGTGCGCGATACACAACAGTTGCTGAAAGAGACCCGGCAGATGACGAAACATTTACGTCGCCGACCGGGCCATATGACAGCGGAGCATTACTGGTAA
本发明实施例涉及引物如下表1-4：
表1.pCDFDuet-Adx-CYP-Fpr(pCDFDuet-P1)质粒构建引物表
表2.pCDFDuet-Fpr-CYP-Adx(pCDFDuet-P2)质粒构建引物表
表3.pCDFDuet-Adx-Fpr-CYP(pCDFDuet-P3)质粒构建引物表
表4.pET17b-Fpr-CYP-Adx(pET17b-P1)质粒构建引物表
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1P450羟化酶基因的选择
基于已报道的来自纤维素假单胞菌So ce56的P450基因CYP260A1，其突变体S276I对黄体酮具有羟基化活性未发现完全降解黄体酮活性，且将其在大肠杆菌中异源表达时缺少合适的氧化还原伙伴。因此本发明引入异源的氧化还原伙伴，并使其在大肠杆菌中异源表达，获得全新的全细胞系统并用以降解黄体酮。实施例2分别含质粒pCDFDuet-P1、pCDFDuet-P2、pCDFDuet-P3的大肠杆菌BL21重组菌株的构建
(1)重组表达质粒pCDFDuet-P1、pCDFDuet-P2、pCDFDuet-P3的构建
本实施例中的CYP260A1 S276I羟化酶基因(SEQ ID NO：2所示)、来源于牛的肾上腺素Adx编码基因(SEQ ID NO：4所示)和来源于大肠杆菌K12的黄素氧还蛋白还原酶Fpr编码基因(SEQ ID NO：6所示)由金唯智生物公司合成。本实施例中用到的表达载体为pCDFDuet-1。
pCDFDuet-P1构建流程：设计引物3、4(表1)将质粒pCDFDuet-1反向PCR得到线性化载体，设计引物1、2(表1)扩增Adx基因，使用同源重组酶(诺维赞公司)将所得线性化载体与Adx基因于37℃培养箱30min连接，连接产物热击化转到E.coli JM109感受态细胞中。在含链霉素抗性(100mg/mL)的LB平板37℃培养过夜，筛选阳性转化子，经富集培养后提取质粒，采用PCR验证转化子中是否含有外源片段Adx，将含有外源片段的阳性转化子送至测序公司进行序列验证，得到正确的重组表达质粒pCDFDuet-Adx。再设计引物7、8(表1)以质粒pCDFDuet-Adx为模板反向PCR得到线性化载体，设计引物5、6(表1)扩增Fpr基因，使用同源重组酶将所得线性化载体与Fpr基因于37℃培养箱30min连接，重复上述化转验证操作得到正确的重组表达质粒pCDFDuet-Adx-Fpr。再设计引物11、12(表1)以pCDFDuet-Adx-Fpr为模板反向PCR得到线性化载体，设计引物9、10(表1)扩增CYP260A1 S276I基因，使用同源重组酶将所得线性化载体与CYP260A1 S276I基因于37℃培养箱30min连接，重复上述化转验证操作得到正确的重组表达质粒pCDFDuet-Adx-CYP-Fpr，即pCDFDuet-P1。
pCDFDuet-P2构建流程：设计引物15、16(表2)将质粒pCDFDuet-1反向PCR得到线性化载体，设计引物13、14(表2)扩增Adx基因，使用同源重组酶(诺维赞公司)将所得线性化载体与Adx基因于37℃培养箱30min连接，连接产物热击化转到E.coli JM109感受态细胞中，在含链霉素抗性(100mg/mL)的LB平板37℃培养过夜，筛选阳性转化子，经富集培养后提取质粒，采用PCR验证转化子中是否含有外源片段Adx，将含有外源片段的阳性转化子送至测序公司进行序列验证，得到正确的重组表达质粒pCDFDuet-Adx。再设计引物19、20(表2)以质粒pCDFDuet-Adx为模板反向PCR得到线性化载体，设计引物17、18(表2)扩增Fpr基因，使用同源重组酶将所得线性化载体与Fpr基因于37℃培养箱30min连接，重复上述化转验证操作得到正确的重组表达质粒pCDFDuet-Fpr-Adx。再设计引物23、24(表2)以pCDFDuet-Fpr-Adx为模板反向PCR得到线性化载体，设计引物21、22(表2)扩增CYP260A1 S276I基因，使用同源重组酶将所得线性化载体与CYP260A1 S276I基因于37℃培养箱30min连接，重复上述化转验证操作得到正确的重组表达质粒pCDFDuet-Fpr-CYP-Adx，即pCDFDuet-P2。
pCDFDuet-P3构建流程：设计引物27、28(表3)将质粒pCDFDuet-1反向PCR得到线性化载体，设计引物25、26(表3)扩增Adx基因，使用同源重组酶(诺维赞公司)将所得线性化载体与Adx基因于37℃培养箱30min连接，连接产物热击化转到E.coli JM109感受态细胞中。在含链霉素抗性(100mg/mL)的LB平板37℃培养过夜，筛选阳性转化子，经富集培养后提取质粒，采用PCR验证转化子中是否含有外源片段Adx，将含有外源片段的阳性转化子送至测序公司进行序列验证，得到正确的重组表达质粒pCDFDuet-Adx。再设计引物31、32(表3)以质粒pCDFDuet-Adx为模板反向PCR得到线性化载体，设计引物29、30(表3)扩增Fpr基因，使用同源重组酶将所得线性化载体与Fpr基因于37℃培养箱30min连接，重复上述化转验证操作得到正确的重组表达质粒pCDFDuet-Adx-Fpr。再设计引物35、36(表3)以pCDFDuet-Adx-Fpr为模板反向PCR得到线性化载体，设计引物33、34(表3)扩增CYP260A1 S276I基因，使用同源重组酶将所得线性化载体与CYP260A1 S276I基因于37℃培养箱30min连接，重复上述化转验证操作得到正确的重组表达质粒pCDFDuet-Adx-Fpr-CYP，即pCDFDuet-P3。
(2)大肠杆菌重组菌株BL21-pCDFDuet-P1、pCDFDuet-P2、pCDFDuet-P3的构建及诱导表达
取上述构建好的重组表达质粒pCDFDuet-P1、pCDFDuet-P2、pCDFDuet-P3分别热击化转到大肠杆菌BL21感受态中，在含链霉素抗性(100mg/mL)的LB平板37℃培养过夜，筛选阳性转化子获得大肠杆菌重组菌株BL21-pCDFDuet-P1、BL21-pCDFDuet-P2、BL21-pCDFDuet-P3。
分别挑取阳性转化子于5mL液体LB试管中，加入终浓度100μg/mL的链霉素抗性，37℃，220r/min培养12h作为一级种子液，然后以2％的接种量转接到100mL TB培养基的摇瓶中，加入终浓度50μg/mL的链霉素抗性，37℃，220r/min条件下培养2～3h，当OD600＝0.6-0.8时加入1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，0.5mM 5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)，30℃，180r/min诱导24h。
诱导结束后，8000r/min，10min离心收集菌体，用Lysis Buffer重悬，加入1％溶菌酶，1％PMSF，冰浴条件下磁力搅拌25min。
在冰水混和物上超声破碎20min，超声破碎条件：功率300W，破碎2s，暂停4s，破碎后12000r/min后获得沉淀溶液，低温离心30min分离上清获得上清液。对目的蛋白进行SDS-PAGE分析。
结果如表5所示。目的蛋白CYP260A1 S276I、Adx、Fpr在pCDFDuet-P2均正常表达，而pCDFDuet-P1、pCDFDuet-P3表达量不足或没有表达，不具备后续用于降解黄体酮的能力，同时将上述3株重组菌用于黄体酮的降解，结果如表5所示，仅BL21-pCDFDuet-P2具有降解能力。因此采用pCDFDuet-P2(质粒图谱见图1)进行后续重组菌的构建及黄体酮的降解。
表5pCDFDuet-P1、pCDFDuet-P2、pCDFDuet-P3中蛋白的表达及黄体酮转化情况
“+”表示蛋白表达量正常或可以转化黄体酮；“-”表示蛋白的表达量不足或不能转化黄体酮实施例3大肠杆菌BL21含质粒pET17b-P2的菌株构建
(1)重组表达质粒pET17b-P2的构建(质粒图谱见图2)
pCDFDuet-1质粒为双启动子质粒，为进一步探究全细胞系统是否也适用于单启动子的质粒，因此将质粒更换为pET17b进行验证。
本实施例中用到的表达质粒为pET17b。设计引物39、40(表4)以质粒pET17b为模板反向PCR得到线性化载体，设计引物37、38(表4)以pCDFDuet-P2为模板PCR得到含有RBS序列的目的基因Fpr-CYP，使用同源重组酶将所得线性化载体与Fpr-CYP基因于37℃培养箱30min连接，连接产物热击化转到E.coli JM109感受态细胞中。在含氨苄霉素抗性(100mg/mL)的LB平板37℃培养过夜，筛选阳性转化子，经富集培养后提取质粒，采用PCR验证转化子中是否含有外源片段Fpr-CYP，将含有外源片段的阳性转化子送至测序公司进行序列验证，得到正确的重组表达质粒pET17b-Fpr-CYP。再设计引物43、44(表4)以质粒pET17b-Fpr-CYP为模板反向PCR得到线性化载体，设计引物41、42(表4)以pCDFDuet-P2为模板PCR得到目的基因Adx，重复上述连接划转操作将线性化的pET17b-Fpr-CYP质粒和Adx基因连接、化转验证得到正确的重组表达质粒pET17b-Fpr-CYP-Adx，即pET17b-P2。
(2)大肠杆菌重组菌株BL21-pET17b-P2的诱导表达
取上述构建好的重组表达质粒pET17b-P2热击化转到大肠杆菌BL21感受态中，在含氨苄霉素抗性(100mg/mL)的LB平板37℃培养过夜，筛选阳性转化子大肠杆菌重组菌株BL21-pET17b-P2。挑取阳性转化子于5mL液体LB试管中，加入终浓度100μg/mL的氨苄霉素抗性，37℃，220r/min培养12h作为一级种子液，然后以2％的接种量转接到100mL TB培养基的摇瓶中，加入终浓度50μg/mL的氨苄霉素抗性，37℃，220r/min条件下培养2h，当OD600＝0.6-0.8时加入1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，0.5mM 5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)，30℃，180r/min诱导24h。
实施例4重组大肠杆菌对黄体酮的全细胞催化
(1)大肠杆菌重组菌株BL21-pCDFDuet-P2的静息细胞催化
在含链霉素抗性(100mg/mL)的LB平板37℃培养过夜，筛选阳性转化子大肠杆菌重组菌株BL21-pCDFDuet-P2。挑取阳性转化子于5mL液体LB试管中，加入终浓度100μg/mL的链霉素抗性，37℃，220r/min培养12h作为一级种子液，然后以2％的接种量转接到100mL TB培养基的摇瓶中，加入终浓度50μg/mL的链霉素抗性，37℃，220r/min条件下培养2h，当OD600＝0.6-0.8时加入1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，0.5mM 5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)，30℃，180r/min诱导24h。
诱导结束后，8000r/min，10min离心收集菌体，用20mM磷酸钾缓冲液重悬，使静息细胞的浓度为33g/L。转接30mL重悬液于250mL锥形瓶中，添加450μL的10mM黄体酮溶液，300μL的3mg/mL多粘菌素B溶液，30℃，120r/min转化24h。
转化期间定时取全细胞转化液加入等体积的乙酸乙酯萃取，吸取上清用于HPLC色谱分析，转化结果如表6所示。在8h时检测到了17ɑ-羟基黄体酮，之后开始降解17ɑ-羟基黄体酮并生成新物质，在6h内完全降解，整个0.15mM黄体酮完全降解的时间为24h。
表6大肠杆菌重组菌株BL21-pCDFDuet-P2静息细胞转化结果
(2)大肠杆菌重组菌株BL21-pET17b-P2的静息细胞催化
在含氨苄霉素抗性(100mg/mL)的LB平板37℃培养过夜，筛选阳性转化子大肠杆菌重组菌株pET17b-P2。挑取阳性转化子于5mL液体LB试管中，加入终浓度50μg/mL的氨苄霉素抗性，37℃，220r/min培养12h作为一级种子液，然后以2％的接种量转接到100mL TB培养基的摇瓶中,加入终浓度100μg/mL的氨苄霉素抗性，37℃，220r/min条件下培养2h，当OD600＝0.6-0.8时加入1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，0.5mM 5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)，30℃，180r/min诱导24h。
诱导结束后，8000r/min，10min离心收集菌体，用20mM磷酸钾缓冲液重悬，使静息细胞的浓度为33g/L。转接30mL重悬液于250mL锥形瓶中，添加450μL的10mM黄体酮溶液，300μL的3mg/mL多粘菌素B溶液，30℃，120r/min转化22h。
转化期间定时取全细胞转化液加入等体积的乙酸乙酯萃取，吸取上清用于薄层色谱分析，如图3所示，在6h时检测到了17ɑ-羟基黄体酮的生成，在18h之后检测到了17ɑ-羟基黄体酮转化生成新物质并逐渐消失，并在22h以后完全消失实现黄体酮的完全降解。
之后再进行HPLC色谱分析(样品处理方法：细胞转化液加入等体积的乙酸乙酯萃取，氮气吹干后，加入200μL 60％的乙腈复溶)，结果如图4和表7所示，进一步印证了BL21-pET17b-P2全细胞系统在降解黄体酮的过程中生成了17ɑ-羟基黄体酮，之后降解17ɑ-羟基黄体酮并生成新物质(图4a，18h；图4b，20h)，并在22h(图4c，22h)内达到完全降解0.15mM黄体酮的效果。降解黄体酮的效率高于BL21-pCDFDuet-P2。
表7大肠杆菌重组菌株BL21-pET17b-P2静息细胞转化结果
(3)大肠杆菌重组菌株BL21-pET17b-P2在高浓高度底物下的静息细胞催化
在含氨苄霉素抗性(100mg/mL)的LB平板37℃培养过夜，筛选阳性转化子大肠杆菌重组菌株pET17b-P2。挑取阳性转化子于5mL液体LB试管中，加入终浓度50μg/mL的氨苄霉素抗性，37℃，220r/min培养12h作为一级种子液，然后以2％的接种量转接到100mL TB培养基的摇瓶中，加入终浓度100μg/mL的氨苄霉素抗性，37℃，220r/min条件下培养2h，当OD600＝0.6-0.8时加入1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，0.5mM 5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)，30℃，180r/min诱导24h。
诱导结束后，8000r/min，10min离心收集菌体，用20mM磷酸钾缓冲液重悬，使静息细胞的浓度为60g/L。转接30mL重悬液于250mL锥形瓶中，添加1.8mL的500mM黄体酮溶液，300μL的3mg/mL多粘菌素B溶液，30℃，120r/min转化60h。
转化期间定时取全细胞转化液加入等体积的乙酸乙酯萃取，吸取上清用于薄层色谱分析，如表8所示，在8h时检测到了17ɑ-羟基黄体酮，之后17ɑ-羟基黄体酮生成其他物质并逐渐消失，在60h时完全消失。证明了BL21-pET17b-P2全细胞系统可以在60h内达到完全降解30mM黄体酮的效果。
表8大肠杆菌重组菌株BL21-pET17b-P2静息细胞转化结果
虽然本发明已以较佳实施公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的为准。
Claims (10)
1.黄体酮羟化酶CYP260A1的突变体S276I在降解黄体酮中的应用，其特征在于，该酶能够实现黄体酮的完全降解，所述黄体酮羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述降解黄体酮的反应体系采用异源多酶催化的人工电子传递系统，包括来源于牛的肾上腺素Adx4-108和来源大肠杆菌的铁氧还蛋白酶Fpr；
所述肾上腺素Adx4-108，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述铁氧还蛋白酶Fpr，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
3.一种能够生物降解黄体酮的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株是在宿主细胞中对CYP260A1 S276I、Adx4-108和Fpr的编码基因进行表达获得的。
4.如权利要求3所述的基因工程菌株，其特征在于，将CYP260A1 S276I、Adx4-108和Fpr的编码基因按照Fpr-CYP-Adx的顺序进行表达。
5.如权利要求3所述的基因工程菌株，其特征在于，所述宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。
6.如权利要求3所述的基因工程菌株，其特征在于，通过将CYP260A1 S276I、Adx4-108和Fpr的编码基因构建重组表达载体进行表达；
所述重组表达载体使用的表达质粒包括但不限于pCDFDuet-1、pET17b、pET22b、pET28a。
7.如权利要求3所述的基因工程菌株，其特征在于，将CYP260A1 S276I、Adx4-108和Fpr的编码基因按照Fpr-CYP-Adx的顺序在pCDFDuet-1质粒上构建重组表达载体pCDFDuet-P2，并在大肠杆菌BL21中进行异源表达，获得重组菌株BL21-pCDFDuet-P2；或者将CYP260A1S276I、Adx4-108和Fpr的编码基因按照Fpr-CYP-Adx的顺序在pET17b质粒上构建重组表达载体pET17b-P2，并在大肠杆菌BL21中进行异源表达，获得重组菌株BL21-pET17b-P2。
8.权利要求3-7任意一项所述基因工程菌株在生物降解黄体酮中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，通过将上述基因工程菌进行诱导表达后制备静息细胞，将静息细胞投入含有黄体酮的待处理水中进行生物降解；催化体系包括：2～65g/L静息细胞；0～50mM黄体酮；0.1～50μg/mL多粘菌素B，20～40℃，100～300r/min条件下反应2～60h，乙酸乙酯终止反应，可实现黄体酮的完全降解。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述静息细胞的制备方法如下：发酵培养基采用TB培养基，加入链霉素抗性或氨苄霉素抗性，发酵条件：按1～5％的接种量，在20～40℃，100～300r/min条件下培养2～3h，当OD600＝0.6～0.8时加入0.1～5mM IPTG诱导剂，0.1～5mM ALA，在20～40℃，100～300r/min条件下诱导2～24h；培养完成后将发酵液离心收集细胞，洗涤后获得静息细胞。
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