CN116997663A - 类风湿性关节炎发作的标志物和细胞前因 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了类风湿性关节炎(RA)发作的分子和细胞前因的生物标志物。本发明提供了可以在发作前一或两周预测RA发作的RNA和蛋白质标志物。本发明进一步提供了血液循环细胞，具体是炎症前间充质细胞，它们是细胞前体和即将发生的RA发作的指标。本发明进一步提供了用于识别和监测RA患者发作的方法、试剂盒和标志物，以及它们作为标志物和标靶在类风湿性关节炎和类风湿性关节炎所诱发或相关病症中的应用和治疗。

Description

类风湿性关节炎发作的标志物和细胞前因
政府权益声明
本发明是在政府支持下由国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的编号NS034389、NS081706、NS097404和1UM1HG008901资助完成。政府对本发明享有一定权利。
技术领域
本发明一般涉及类风湿性关节炎(RA)发作的分子前因的生物标志物的鉴定和表征。本发明进一步涉及可以在发作前一或两周预测RA发作的RNA和蛋白质标志物。本发明进一步涉及血液循环细胞，具体是炎症前间充质细胞，它们是即将发生的RA发作的细胞前体和指标。本发明涉及了用于识别和监测RA患者发作的方法、试剂盒和标志物，以及它们作为标志物和标靶用于和供于类风湿性关节炎和类风湿性关节炎所诱发或相关病症的治疗的应用。
背景技术
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性炎症性病症并且是最常见的自身免疫性关节炎，影响了超过130万美国人。大约75％的RA患者是女性并且有1％到3％的女性一生中可能会患上类风湿性关节炎。RA是一种影响关节内膜的慢性疾病，会导致关节疼痛、僵硬、肿胀和关节运动减少，并最终导致骨侵蚀和关节畸形。
RA的治疗可以停止关节疼痛和肿胀，并防止关节损伤。早期治疗会带来更好的长期结果，接受早期治疗的患者不太可能出现导致关节置换的关节损伤类型。类风湿性关节炎的主要治疗目标是控制炎症、减轻疼痛和减少与RA相关的残疾。治疗通常包括药物治疗、作业治疗或物理治疗以及定期锻炼，尽管有些患者最终需要手术，包括滑膜切除术(synovectomy)、肌腱修复、关节融合或全关节置换术以纠正关节损伤。非甾体类抗炎药(NSAID)是缓解疼痛和减轻炎症的一线摂类风湿性关节炎药物。NSAID包括非处方药乙酰水杨酸盐(阿司匹林)、布洛芬(Advil，Motrin IB)和萘普生钠(Aleve，Naprosyn)和处方NSAID例如依托度酸(Lodine)和双氯芬酸(Voltaren)。类固醇是抗炎或免疫抑制剂，用于更严重的RA或当RA症状发作时以缓解关节疼痛和僵硬。公认的类固醇的示例包括糖皮质激素或皮质类固醇，例如强的松(prednisone)、可的松(cortisone)和甲基强的松龙(methylprednisolone)。疾病修正抗风湿药物(DMARD)是处方并用于减缓RA的进程并保护关节和其他组织免受永久性损伤。常见的DMARD包括甲氨蝶呤(Trexall，Otrexup))、来氟米特(Arava)、羟氯喹(Plaquenil)和柳氮磺胺吡啶(Azulfidine)。DMARD抑制RA中过度活跃的免疫系统，但在它们的标靶中没有选择性。副作用各不相同，但可能包括肝损伤、骨髓抑制和严重的肺部感染。生物制剂--靶向免疫系统具体方面或部分的遗传工程改造蛋白，并作为免疫抑制剂发挥作用--是RA治疗中的一个越来越重要的组分。公认的RA生物制剂包括肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂和非TNF抑制剂(例如细胞因子抑制剂、T或B细胞抑制剂)。生物制剂包括阿巴西普(Orencia)、阿达木单抗(Humira)、阿那白滞素(Kineret)、巴利替尼(Olumiant)、赛妥珠单抗(Cimzia)、依那西普(Enbrel)、戈利木单抗(Simponi)、英夫利昔单抗(Remicade)、利妥昔单抗(Rituxan)、萨里单抗(Kevzara)、托珠单抗(Actemra)和托法替尼(Xeljanz)。靶向TNF的阿达木单抗、依那西普、英夫利昔单抗、戈利木单抗和赛妥珠单抗(Lis K等(2014)Arch Med Sci 10(6):1175-1185)。利妥昔单抗耗竭B细胞。阿那白滞素阻断主要细胞因子白介素1(IL-1)的作用。阿巴西普靶向T细胞。这些类型的药物也会增加感染的风险。生物DMARD通常与非生物DMARD(例如甲氨蝶呤)配对使用时最有效。靶向特异性但非生物制剂的新药包括经口小分子Janus激酶(JAK)抑制剂，例如托法替尼(Xeljanz和Xeljanz XR)、巴利替尼(Olumiant)和阿帕西替尼(Rinvoq)。抗代谢物甲氨蝶呤也常用于治疗RA，包括与其他DMARD药物(包括生物DMARD)联合使用。
最近的患者调查结果报道四分之三的RA患者对治疗不满意，并且患者继续经历影响他们日常活动和生活的令人烦恼的症状(Radawaski C等(2019)Rheumatol Ther 6(3):461-471)。与许多炎性疾病类似，RA以会出现静止期和恶化期(发作)为表征。发作是症状的严重时期，并反映了疾病活动度的增加，在此期间关节疼痛、肿胀和僵硬更加严重。发作的持续时间和强度各不相同，发作是不可预测的，并且导致发作的分子事件是未知的。此类起伏不定的临床病程是许多自身免疫性疾病的特征，包括多发性硬化症(MS)(Steinman L.(2014)Annu Rev Immunol 32:257-81)、系统性红斑狼疮(SLE)(Fava A、Petri M.(2019)JAutoimmun 96:1-13)，以及炎症性肠病(IBD)(Braun J,Wei B(2007)Annu Rev Pathol 2:401-29；Braun J等(2007)Arthritis Rheum 57:639-47.)。
像RA一样，如果可以更有效地评估临床病程并且可以预测或识别发作和疾病恶化并且可以更快地开始治疗或治疗干预，那么所有这些常见的自身免疫性疾病都将得到更适当的管控和有效的治疗，并取得更好的短期和长期结果。需要开发方法以了解是什么触发了自身免疫性疾病从静止状态到发作的转变。在目前接受治疗的RA和其他自身免性疫疾病患者中，仍然需要改进疾病管控。本发明解决了该领域中未满足的需求，具体是关于类风湿性关节炎(RA)的需求。
本文引用的参考文献不应被解释为承认这是本发明的现有技术。
发明内容
在总的方面，本发明提供了RA发作的前因。已经识别出在RA患者中在RA发作之前差异性表达或优先表达的RNA标志物和蛋白质标志物。这些RNA转录物提供了可以预测即将发生的发作的标志物，并且可以利用针对它们的测定和它们的存在来对患者实施和制定治疗和疗法。
本发明提供一种用于监测和预测患者中类风湿性关节炎(RA)发作或增加的RA疾病活动的方法，包括：
(a)从所述患者分离血液样品；
(b)评估血液样品中一组或多组先行(antecedent)RNA标志物、蛋白质标志物或细胞标志物的表达或定量增量，标志物选自：
(i)AC2标志物或蛋白质，如表7所提供；
(ii)AC3标志物和蛋白质，如表8所提供；
(iii)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物或蛋白质，如表5所示；
(iv)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物和蛋白质，如表9所示；
(v)细胞标志物CD45-CD31-PDPN+；
(c)其中RNA标志物或蛋白质的表达或定量增量或细胞标志物的存在预示即将发生RA发作。
本发明提供一种用于监测和预测患者中类风湿性关节炎(RA)发作或增加的RA疾病活动的方法，包括：
(a)从所述患者分离血液样品；
(b)评估血液样品中一组或多组先行RNA标志物、蛋白质标志物或细胞标志物的表达或定量增量，标志物选自：
(i)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物或蛋白质，如表5所列；
(ii)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物或蛋白质，如表9所列；
(iii)AC2标志物或蛋白质，如表7所提供；
(iv)AC3标志物或蛋白质，如表8所提供；以及
(v)细胞标志物CD45-CD31-PDPN+；
(c)其中RNA标志物或蛋白质的表达或定量增量或细胞标志物的存在预示着即将发生的RA发作。
在所述方法的一个实施方式中，其中AC2 RNA标志物或蛋白质的表达或定量增量预测约2周或约12-14天内的RA发作。在所述方法的一个实施方式中，AC2 RNA标志物或蛋白质的表达或定量增量预测约2周内的RA发作，误差范围为约一周或另外7天，因此为7-21天，或最多或大约三周，最多21天左右。
在所述方法的一个实施方式中，其中AC3 RNA标志物或蛋白质的表达或定量增量预测约1周或约5-7天内的RA发作。在所述方法的一个实施方式中，AC3 RNA标志物或蛋白质的表达或定量增量预测约1周内的RA发作，误差范围为约一周或另外7天，因此为0-14天，或最多或大约两周，最多14天左右。
在所述方法的一个实施方式中，评估了具有至少20个AC2或AC3标志物的子集。在一个实施方式中，评估了具有至少10个AC2或AC3标志物的子集。至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16、至少17、至少18个、至少9个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个AC2或AC3标志物可被评估。
在所述方法的一个实施方式中，评估了具有至少20个AC2或至少20个AC3标志物的子集。在一个实施方式中，评估了具有至少10个AC2和AC3标志物的子集。至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16、至少17、至少18个、至少9个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个AC2和AC3标志物可被评估。
在一个实施方式中，评估选自AC3标志物或蛋白质的下层成纤维细胞标志物。在一个实施方式中，评估由CD34+，HLADR+和DKK3+细胞表达的AC3标志物或蛋白质。在一个实施方式中，评估由CD45-，CD34+，HLADR+和DKK3+细胞表达的AC3标志物或蛋白质。
该方法包括，其中也评估细胞标志物IL17RD。
本发明进一步提供了方法，其中所述先行RNA标志物或蛋白质标志物或选自以下的那些：
(a)AC3标志物和蛋白质如表8所提供的；
(b)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物或蛋白质，如表5所示；以及
(c)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物和蛋白质，如表9所示；
在RA发作或一旦患者表现出RA发作的症状时，在外周血中减少、显著减少、几乎不存在或不存在。
本发明进一步提供了方法，其中所述先行RNA标志物或蛋白质标志物或选自以下的那些：
(a)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物或蛋白质，如表5所列；
(b)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物或蛋白质，如表9所列；以及
(c)AC3标志物或蛋白质，如表8所提供；
在RA发作或一旦患者表现出RA发作的症状时，在外周血中减少、显著减少、几乎不存在或不存在。
本发明提供了一种用于预测即将发生的RA发作和治疗患者发作的方法，该方法包括：
a)从患者分离血液样品；
b)使血液样品与对选自一组RNA或蛋白质标志物的标志物具有特异性的试剂接触，以评估RNA或蛋白质标志物的表达，其中该组RNA或蛋白质标志物选自：
(i)AC2标志物或蛋白质，如表7所提供；
(ii)AC3标志物和蛋白质，如表8所提供的；
(iii)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物或蛋白质，如表5所示；以及
(iv)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物和蛋白质，如表9所示；
c)将血液样品中选自一组RNA或蛋白质标志物的标志物的表达与对照血液样品中该标志物的表达进行比较，以确定选自一组RNA或蛋白质标志物的标志物在血液样品中的表达相对于对照血液样品中的表达是否增加，其中增加的表达的检测用于预测患者中即将发生的RA发作；
并通过给予治疗有效量的一种或多种治疗RA的疾病调控剂来治疗由此诊断为即将发生RA发作的患者。
本发明提供了一种用于预测即将发生的RA发作和治疗患者发作的方法，该方法包括：
a)从患者分离血液样品；
b)使血液样品与对选自一组RNA或蛋白质标志物的标志物具有特异性的试剂接触，以评估RNA或蛋白质标志物的表达，其中该组RNA或蛋白质标志物选自：
(i)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物或蛋白质，如表5所列；
(ii)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物或蛋白质，如表9所列；
(iii)AC2标志物或蛋白质，如表7所提供；以及
(iv)AC3标志物或蛋白质，如表8所提供；
c)将血液样品中选自一组RNA或蛋白质标志物的标志物的表达与对照血液样品中该标志物的表达进行比较，以确定选自一组RNA或蛋白质标志物的标志物在血液样品中的表达相对于对照血液样品中的表达是否增加，其中增加的表达的检测用于预测患者中即将发生的RA发作；
并通过给予治疗有效量的用于治疗RA的一种或多种疾病调控剂来治疗由此诊断为即将发生RA发作的患者。
在所述方法的一个实施方式中，其中AC2 RNA标志物或蛋白质的表达、差异性表达或定量增量预测约2周、约14天或约12-14天内的RA发作。
在所述方法的一个实施方式中，其中AC3 RNA标志物或蛋白质的表达或定量增量预测约一周、约7天或约5-7天内的RA发作。在所述方法的一个实施方式中，选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6 COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物或蛋白质的表达、差异性表达或定量增量预测约一周内，约7天，或约5-7天内的RA发作。
在所述方法的一个实施方式中，选自以下的RNA或蛋白质标志物的表达或定量增量：
(a)AC3 RNA标志物或蛋白质；
(b)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物或蛋白质；以及
(c)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物或蛋白质；
预测在约1周或约5-7天出现的RA发作。
在所述方法的一个实施方式中，选自以下的RNA或蛋白质标志物的表达或定量增量：
(a)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物或蛋白质；
(b)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物或蛋白质；以及
(c)AC3 RNA标志物或蛋白质；
预测在约1周或约5-7天内出现的RA发作。
可以使用本领域已知的任何方法评估或评价RNA或蛋白质表达的评价。因此，根据本发明的方法，可以通过RT PCR评估RNA表达。根据该方法，可以使用特异性抗体评估蛋白质表达。
根据本发明的方法，可以使用标准和已知方法确定血液中细胞标志物在细胞表面的表达或存在。细胞标志物可使用抗体评估。细胞标志物可使用荧光活化细胞分选(FACS)分析评估。细胞或细胞标志物可使用细胞分选或单细胞评估进行评估。
在本发明方法所述的实施方式中，用于治疗RA的疾病调控剂可以选自用于RA或关节炎病症或炎性疾病和病症的标准或临床认可的药剂或疗法。在本发明所述的实施方式中，用于治疗RA的疾病调控剂可能是一种或多种选自非甾体抗炎药(NSAID)、类固醇、甲氨蝶呤、疾病修正抗风湿药物(DMARDs)、生物DMARD和经口janus激酶(JAK)抑制剂的试剂。在实施方式中，DMARD选自甲氨蝶呤(Trexall，Otrexup)、来氟米特(Arava)、羟氯喹(Plaquenil)和柳氮磺胺吡啶(Azulfidine)。有多种已知的生物DMARD药物，包括正在评估或应用于RA和/或其他关节炎和/或炎症病症的多种药物。在一个方面中，其中生物DMARD可选自阿巴西普(Orencia)、阿达木单抗(Humira)、阿那白滞素(Kineret)、巴利替尼(Olumiant)、赛妥珠单抗(Cimzia)、依那西普(Enbrel)、戈利木单抗(Simponi)、英夫利昔单抗(Remicade)、利妥昔单抗(Rituxan)、萨里单抗(Kevzara)、托珠单抗(Actemra)和托法替尼(Xeljanz)。生物DMARD可以是肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂。在一个方面中，生物DMARD可以是抗炎抗体或针对炎症或免疫调控分子的抗体。在一个方面中，抗体可以是白介素抗体。抗体可以是IL-17特异性抗体或IL-17RD特异性或IL-17RD阻遏性或中和抗体。
在一个实施方式中，生物DMARD与NSAID和/或甲氨蝶呤结合。在一个实施方式中，所述JAK抑制剂选自托法替尼(Xeljanz和Xeljanz XR)、巴利替尼(Olumiant)和阿帕西替尼(Rinvoq)。
在一个实施方式中，生物DMARD与NSAID和/或甲氨蝶呤结合。在一个实施方式中，所述JAK抑制剂选自托法替尼(Xeljanz和Xeljanz XR)、巴利替尼(Olumiant)和阿帕西替尼(Rinvoq)。
本发明进一步提供了一种预测即将发生的RA发作的方法，包括评估来自患者的血液样品中是否存在表征为CD45-CD31-PDPN+细胞的PRIME细胞，其中患者外周血中可检测的PRIME细胞的存在预测在患者体内即将发生的RA发作。在其一个实施方式中，该方法包括进一步评估CD45-CD31-PDPN+细胞上IL17RD的存在。
提供一种评估和治疗RA患者中即将发生的发作的方法，包括评估患者外周血中是否存在表征为CD45-CD31-PDPN+IL17RD+细胞的PRIME细胞，并对外周血中PRIME细胞呈阳性的患者用治疗RA的疾病调控剂进行治疗。提供一种评估和治疗RA患者中即将发生的发作的方法，包括评估患者外周血中是否存在表征为CD45-CD31-PDPN+IL17RD+细胞的PRIME细胞，并对外周血中PRIME细胞呈阳性的患者用用于治疗RA的疾病调控剂进行治疗。
在方法所述的另一个实施方式中，患者用IL-17或IL-17RD抗体治疗。在另一个实施方式中，患者进一步用抗炎剂和/或免疫调控剂治疗。
提供一种评估和治疗RA患者中即将发生的发作的方法，包括评估患者外周血中是否存在表征为CD45-CD31-PDPN+IL17RD+细胞的PRIME细胞所表达、特异性表达或具体表达的RNA或蛋白质，并对外周血中PRIME细胞的表达、特异性表达或具体表达呈阳性的患者用用于治疗RA的疾病调控剂进行治疗。提供了评估和治疗RA患者中即将发生的发作的方法，包括评估患者外周血中RNA的存在或表达、特异性表达或具体由表征为CD45-CD31-PDPN+IL17RD+细胞的表达的蛋白质，并对外周血中RNA或蛋白质的表达、特异性表达或具体表征为CD45-CD31-PDPN+IL17RD+细胞呈阳性的患者用用于治疗RA的疾病调控剂进行治疗。
本发明包括一组用于评估和预测患者即将发生的RA发作的RNA或蛋白质标志物，包括选自以下的标志物：
(i)具有表7中提供的AC2标志物中的至少20个标志物的子集；
(ii)具有表8中提供的AC3标志物中的至少20个标志物的子集；
(iii)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物，如表5所列；
(iv)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物，如表9所列；
在所述方法的一个方面中，提供了具有至少20个AC2或AC3标志物的子集。在一个方面中，提供了具有至少10个AC2或AC3标志物的子集。至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16、至少17、至少18个、至少9个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个AC2或AC3标志物可被提供。
在一个实施方式中，具有AC2标志物的子集包括原初B细胞基因标志物以及原初B细胞和白细胞发育途径的标志物。在一个实施方式中，具有AC3标志物的子集包括软骨形态发生、软骨内骨生长、胞外基质组织和下层成纤维细胞的标志物。
在本发明的另一个实施方式中，根据本文的方法提供和/或使用具有选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6中一个或多个标志物的组。在一个方面中，根据本文的方法提供和/或使用选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4中一个或多个标志物的组。在一个方面，根据本文的方法提供和/或使用选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6中两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、数十个、至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个，至少十个的组，5-10个的组，3-5个的组，5-7个的组、3-7个的组、5-8个的组。在一个方面，根据本文的方法提供和/或使用选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、数十个、至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个，至少十个的组，5-10个的组，3-5个的组，5-7个的组、3-7个的组、5-8个的组。
本发明还提供了用于预测即将发生的RA发作的系统或试剂盒，包括本文描述和提供的一组标志物或用于评估本文描述和提供的一组标志物的一组探针和/或抗体。例如，试剂盒或系统可以包括一组标志物或一组探针和/或抗体，用于评估选自以下的一组标志物或用于以下各项或其任何组合：
(i)具有表7中提供的AC2标志物中的至少20个标志物的子集；
(ii)具有表8中提供的AC3标志物中的至少20个标志物的子集；
(iii)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物，如表5所列；
(iv)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物，如表9所列；
系统或试剂盒可进一步包括用于通过指刺采血来采集患者血液的器具。
通过阅读随后的发明详述，其他目的和优点对于本领域技术人员而言将变得显而易见，该发明详述参考以下说明性附图和所附权利要求进行。
附图简要说明
专利或专利申请含有至少一幅彩色绘图。在美国专利商标局请求并支付必要的费用后，将提供带彩色附图的本专利或专利申请出版物副本。
图1描述了疾病活动和基因表达的家庭评估的研究概述和验证。A.随时间推移临床数据收集和RNA分析。随时间推移临床数据和样品收集的研究概述。B.疾病活动的临床和患者报告评估。在诊所(DAS28)和在家中(RAPID3问卷)测量的疾病活动分数之间的相关性来自索引患者。局部加权回归平滑散点图显示了索引患者中RAPID3分数变化与DAS28之间的关系。实线代表点估计，并未灰色区域代表95％置信区间。C.临床血细胞计数和RNASeq推断的血细胞计数。从静脉穿刺采血的配对临床全血细胞计数和从指刺采血的RNAseq数据的CIBERSORTx推断的血细胞计数中测得的中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞计数(N＝38个配对样品)。
图2提供了索引患者中RA发作的临床和转录特征。A.随时间推移的索引患者疾病活动。索引患者四年内的疾病活动(RAPID3问卷，N＝356)。根据疾病活动类别给时间点上色。B.发作时基因的差异性表达。发作(N＝46)对比基线(N＝33)差异性基因表达的火山图，绘制了对倍数变化(log2(FC))的统计显著性(-log10(FDR))(灰色点为非显著基因，即FDR>0.1，红色表示FDR<0.1，log2倍数变化>0，蓝色表示FDR<0.01，log2倍变化<0)。相对于基线，发作时富集的途径显著增加(C.)(发作时途径增加)或减少的基因(D.)(发作时途径减少)。
图3提供了RA发作时症状出现前免疫活化的转录特征。A.随着时间的推移到发作的疾病活动分数(以天数计算)。方框表示从第-56天到+28天随时间推移到发作的疾病活动。垂直箭头(在A-D中)表示发作的开始。B.2791个显著差异性表达基因随时间推移到发作的z分数的层次聚类。具有统计学显著性的聚类用颜色标志物。AC2和AC3指的是先行改变到发作的聚类。C.图3B中随时间推移到发作，聚类1、前置聚类2(AC2)和前置聚类3(AC3)基因的具体示意。D.随时间推移到发作的平均标准化聚类基因表达。浅灰色的线表示聚类中个体基因的表达。水平虚线表示平均基线基因表达(第-8至第-4周)。垂直虚线代表发作的开始。E.在聚类1、AC2和AC3中富集的途径。
图4.PRIME细胞表达AC3基因。A.在血液中鉴定的滑膜细胞亚型标志物基因聚类(图3A)。来自18种滑膜亚细胞类型的200个单细胞RNAseq标志物基因的富集分数。虚线表示显著性阈值(FDR<0.05或-log10 FDR>1.3)。B.随时间推移到发作，滑膜下层成纤维细胞(CD34+、DKK+和HLA-DRA+成纤维细胞)和血液中AC3常见基因的平均标准化基因表达和95％置信区间(虚线垂直线表示发作的开始)。误差线表示置信区间。C.4名患者在发作期间减少的AC3基因的维恩图。D.来自19名RA患者和18名健康志愿者(HV)的血液样品的流式细胞术。显示了TOPRO-(活)/CD31-细胞的PDPN+/CD45-细胞的百分比。P值表示双侧t检验的结果。E.PRIME细胞(流式分选的CD45-/CD31-/PDPN+细胞)相对于造血细胞(流式分选的CD45+)表达的AC3基因的Log2倍数变化和输入细胞(染色的PBMC但未流式分选)相对于造血细胞(流式分选的CD45+)的Log2倍数变化作为流式分选压力的技术控制。
图5提供了RA发作之前和RA发作期间血液和滑膜基因表达变化的模型。炎症信号活化原初B细胞(AC2；图3C-E)，进而活化具有滑膜下层成纤维细胞基因特征(图4A)的PRIME细胞(AC3；图3C-E)。该模型提出，PRIME细胞在发作前去着边化并在血液中增加，然后在症状发生后立即减少(图4B)；这些细胞或其后代在炎性RA滑膜中增加，在那里它们有助于并可足以引起关节炎症。
图6按固定剂体积描述了RNA的质量和数量。用21号刺针采集的3滴血液被添加到预先装有250、500或750μl PAX基因固定剂的microtainer采血管中。样品在室温下储存3天，然后使用PAX基因RNA试剂盒提取RNA，并使用Agilent 2100生物分析仪picochip评估RIN评分和RNA的数量。Padj＝ANOVA，随后进行邓尼特多重比较检验(Dunnett’s multiplecomparisons test)，以250μl作为参照组。
图7描述了室温下随时间变化的RNA质量和数量。将100μ1全血添加到预先装有250μ1PAX基因固定剂的microtainer采血管中，并在室温下孵育2小时、3天或7天后冷冻。用PAX基因RNA试剂盒提取RNA，并按比例减少清洗和洗脱，使用Agilent 2100BioAnalyzer RNApicochip评估RNA的RIN分数和数量。Padj＝ANOVA，随后进行邓尼特多重比较检验(Dunnett’s multiple comparisons test)，以第0天作为参照组。
图8描述了新鲜和邮寄样品的RNA质量和数量。将100μ1全血添加到预先装有250μ1PAX基因固定剂的microtainer采血管中，并在室温下孵育2小时或邮寄后冷冻。用PAX基因RNA试剂盒提取RNA，使用Agilent 2100生物分析仪RNA picochip评估RNA的RIN分数和数量。
图9按提取和洗涤体积描述了RNA的质量和数量。用21号刺针采集的3滴血液被添加到预先装有250μl PAX基因固定剂的microtainer采血管中。样品在室温下储存3天，然后根据制造商的指示使用PAXgeneRNA试剂盒或PAX方案按比例缩减的形式提取RNA，使用推荐体积的25％进行所有清洗和洗脱。使用Agilent 2100生物分析仪RNA picochip评估RIN分数和RNA的数量。P＝未配对的双侧t检验。
图10描述了使用和不使用TriZol试剂提取步骤的RNA质量和数量。邮寄的患者指刺样品在-80℃下储存在PAXgeneRNA缓冲液中。142个样品用PAXgeneRNA提取法提取RNA并进行低体积清洗，13个样品被解冻并与700μlTrizol-LS和250μl氯仿混合。离心后，顶层用异丙醇和糖原沉淀，并用80％冷乙醇清洗，离心并将沉淀干燥，重悬于PBS中，然后使用罗氏高纯分离试剂盒纯化。P值代表未配对T检验的显著性。
图11描述了GlobinZero耗竭后HbgA2、18S RNA和TNFα的循环时间。由于核糖体和血红蛋白RNA分别代表全血中约98％和70％的RNA，我们测试了在RNAseq之前去除这些RNA的标准商业试剂盒。将4ml肝素化血液在37℃下用1ug/ml LPS处理1小时，并将250ul血液放入250μl的PAXgene固定剂中，装入重复的microtainer采血管中。RNA提取后，样品留置未耗竭或用GlobinZero试剂盒处理，然后进行定量PCR以检测血红蛋白A2、18S RNA或TNFαmRNA的表达。GlobinZero试剂盒耗竭了血红蛋白A2和18S核糖体RNA(平均循环时间分别从11增加到28和10增加到30)，同时保留了TNFαmRNA。P值代表普通单向方差分析与Tukey多重比较检验的结果。
图12提供了用Illumina TruSeq或Kapa Hyper Prep试剂盒制备的具有不同质量分数的RNA的RNASeq QC指标。A.(左图)：映射、独特映射和重复读数的分布。B.(右图)：分配给全血RNA样品的UTR(非翻译区)、基因间区、内含子和CDS(编码序列)的标签分布，该样品用Illumina TruSeq或Kapa Hyper Prep试剂盒制备，具有多种输入RNA质量和数量。Illumina TruSeq文库制备显示了编码序列增加的映射和更少的基因间区读数，并最终用于下游实验。
图13提供了4名患者的患者报告(RAPID3)和临床(DAS28)疾病活动评分的比较。从4名RA患者的91次门诊中收集配对的RAPID3分数和DAS28-CRP分数。在所有4名患者中，患者报告的RAPID3问卷与临床医生生成的DAS28分数显著相关。
图14描述了基线、发作和类固醇治疗的临床特征。RAPID3问卷应答自360个时间点和来自一名患者4年间的43次门诊的DAS28 ESR、TJC、SJC、ESR、DAS28 CRP、血小板计数和绝对中性粒细胞计数。根据疾病活动类别对时间点进行定位和着色：每张图中的第一(左)组是基线，每张图中的中间组是发作，并且每张图中的第三(右)组是类固醇。类固醇治疗被定义为患者当天服用任何剂量类固醇的任何时间点，或者如果使用清除动力学计算的剂量为大于0.01mg/ml。在满足发作标准但不符合发作标准的两个时间点之间采集的样品仍被归类为发作，直到用类固醇治疗。TJC表示压痛关节计数。SJC表示肿胀关节计数。P值代表三个疾病类别的ANOVA。发作与RAPID3、DAS28 ESR、TJC、SJC、ESR、DAS28CRP、血小板和中性粒细胞的显著增加有关。
图15描绘了差异性表达的发作基因在重复的发作中可再现地改变。A.随时间推移的指数患者疾病活动(RAPID3)。上图的点按疾病活动分配着色。下图的点根据临床发作事件编号着色。B.基线和发作之间的基因差异性表达的无监督层次聚类。上柱表示根据疾病活动分配着色的样品。下柱表示根据临床发作事件编号着色的样品。数据显示差异性表达的发作基因由多个临床事件表示。
图16提供了随时间推移到发作时血细胞类型的去卷积。绘制了A.ABIS推断的细胞类型和B.CIBERSORTx推断的细胞类型随时间推移到发作的平均细胞类型轨迹(不包括始终为0的)，显示平均得分和平均值的标准误差作为带。这些数据独立证实了主图4A中的数据，确定了AC2中B细胞的活化。
图17描绘了不同的分析方法在发作前2周时确定血液中原初B细胞的活化情况。A.CIBERSORTx按到发作的周数推断原初B细胞。B.ABIS按到发作的周数推断原初B细胞。C.按到发作的周数，190个滑膜单细胞RNAseq原初B细胞标志物基因的平均表达。D.按到发作的周数，IGHM(蓝色/顶部)和IGHD(红色/底部)基因表达。虚线表示RA发作症状的第一天，红色箭头表示发作前2周B细胞特征的峰值。
图18提供了随时间推移到发作滑膜下层成纤维细胞(CD34+、DKK+和HLA-DR+成纤维细胞)和血液中AC3常见基因的平均标准化基因表达。浅灰色线代表随时间推移到发作，在患者1中所有发作的个体基因的表达。
图19描述了血液样品中PRIME细胞用于定量的门选策略。先前冷冻的外周血单核细胞被解冻并用CD31、PDPN和CD45抗体以及TOPRO染色。对活CD31-细胞进行门选，并对PDPN+、CD45-细胞进行计数。
图20表明PRIME细胞是有核的。RA供体的PBMC用CD45/CD31/PDPN和TOPRO(未透化)或透化和TOPRO(透化)染色，并通过流式细胞术进行评估。PRIME细胞被门选为CD45-/CD31-/PDPN+细胞，并呈现透化和未透化细胞的TOPRO染色。透化的PRIME细胞中TOPRO荧光的增加表明双链核酸的存在。
图21描述了分选的PRIME细胞表达滑膜成纤维细胞基因PRIME细胞(流式分选的CD45-/CD31-/PDPN+细胞)中多种滑膜单细胞RNAseq标志物基因相对于造血细胞(流式分选的CD45+)的Log2倍数变化和输入细胞(染色的PBMC但未流式分选)相对于造血细胞(流式分选的CD45+)的Log2倍数变化作为流式分选压力的技术控制。这些数据显示成纤维细胞(SC-F1、SC-F2、SC-F3、SC-F4)而不是B细胞(SC-B1-4)、巨噬细胞(SC-M1-4)或T细胞(SC-T1-6)的单细胞标志物基因在分选的PRIME细胞中被富集。成纤维细胞基因(如标志物)是唯一一组在PRIME细胞中富集的滑膜细胞标志物基因。
图22描述了分选的PRIME细胞表达经典滑膜成纤维细胞基因。PRIME细胞(流式分选的CD45-/CD31-/PDPN+细胞)相对于造血细胞(流式分选的CD45+)的Log10(-padj)对比Log2倍数变化的火山图。相对于造血细胞，经典成纤维细胞基因在PRIME细胞中显著增加。
具体实施方式
根据本发明，可以使用本领域技术范围内常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中已有充分描述。例如，参见Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(1989)；《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)卷I-III[Ausubel，R.M.编(1994)]；《细胞生物学：实验室手册》(Cell Biology:A Laboratory Handbook)卷I-III[J.E.Celis编(1994)]；《新编免疫学实验指南》(Current Protocols in Immunology)卷I-III[Coligan，J.E.编(1994)]；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait编，1984)；《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization)[B.D.Hames和S.J.Higgins编(1985)]；《转录和翻译》(Transcription And Translation)[B.D.Hames和S.J.Higgins编(1984)]；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture)[R.I.Freshney编(1986)]；《固定的细胞和酶》(ImmobilizedCells And Enzymes)[IRL出版社(1986)]；B.erbal，《分子克隆实践指南》(A PracticalGuide To Molecular Cloning)(1984)。
因此，如果出现在本文，以下术语应具有以下定义。
A.术语
术语“类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)”或“RA”是指一种慢性疾病，它是免疫介导的和炎症性的，是一种自身免疫性疾病，影响关节内膜，导致关节疼痛、僵硬、肿胀和关节活动减少，并且可以最终导致骨侵蚀和关节畸形(joint deformity)。RA是一种系统性的自身免疫性疾病，其特征在于多个关节的滑膜同时发炎。
“RA发作”或“发作”是指有RA的患者周期性经历的免疫介导的和/或炎症活性的激增。在发作期间，疲劳程度和关节症状(如疼痛、肿胀和僵硬)临时性增加。发作是疾病活动增加的时期，在此期间人们的关节炎症状，通常包括关节疼痛、肿胀和僵硬会更加严重。RA发作可以涉及任何疾病症状的恶化，但最常见的包括关节的强烈僵硬。患有RA的人报告了这些发作的常见症状：关节僵硬增加，全身疼痛，完成日常任务的难度增加，肿胀(如导致鞋子不合脚)，强烈的疲劳，流感样症状。
术语“抗体”描述了天然或部分或完全合成产生的免疫球蛋白。该术语还涵盖具有结合域的任何多肽或蛋白质，该结合域是抗体结合域或与抗体结合域同源。CDR移植抗体也涵盖在该术语中。“抗体”是结合具体表位的任何免疫球蛋白，包括抗体及其片段。该术语涵盖多克隆抗体、单克隆抗体和嵌合抗体。术语“抗体”包括野生型免疫球蛋白(Ig)分子，通常包含四个全长多肽链、两条重链(H)和两条轻链(L)，或其等同的Ig同源物(例如，骆驼科纳米抗体，仅包含一条重链)；包括全长功能性突变体、变体或衍生物，其保留了Ig分子的基本表位结合特征，并且包括双重特异性(dual specific)、双特异性(bispecific)、多特异性和双重可变结构域抗体；免疫球蛋白分子可以属于任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。也包括在术语“抗体”含义内的是任何“抗体片段”。
“抗体片段”是指包含至少一条非全长多肽链的分子，包括(i)Fab片段，它是由可变轻链(VL))、可变重链(VH)、恒定轻链(CL)和恒定重链1(CH1)结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，它是包含两个在铰链区通过二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)Fab(Fd)片段的重链部分，由VH和CH1结构域组成；(iv)可变片段(Fv)，它由抗体单臂的VL和VH结构域组成，(v)结构域抗体(dAb)片段，它包含单个可变结构域(Ward，E.S.等,Nature341,544-546(1989))；(vi))骆驼科抗体；(vii)分离的互补决定区(CDR)；(viii)单链Fv片段，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，允许两个结构域结合形成抗原结合位点(Bird等，Science,242,423-426,1988；Huston等，PNAS USA，85，5879-5883，1988)；(ix)双抗体，这是一种二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在一条多肽链上表达，但使用的接头太短而无法在同一链上的两个结构域之间配对，从而迫使与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点的结构域(WO94/13804；P.Holliger等Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448，(1993))；(x)线性抗体，其包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区；(xi)多价抗体片段(scFv二聚体、三聚体和/或四聚体(Power and Hudson,J Immunol.Methods 242:193-204 9(2000))；(xii)微型抗体，它是由融合的scFv组成的二价分子恒定免疫球蛋白结构域，CH3或CH4，其中恒定CH3或CH4结构域用作二聚化结构域(Olafsen T等(2004)Prot Eng Des Sel 17(4)：315-323；Hollinger P和Hudson PJ(2005)Nature Biotech 23(9):1126-1136)；和(xiii)重链和/或轻链的其他非全长部分，或其突变体、变体或衍生物，单独或以任何组合形式存在。
由于可以用多种方式修饰抗体，因此术语“抗体”应解释为涵盖任何具体结合成员或具有具有所需特异性的结合域的物质。因此，该术语涵盖抗体片段、衍生物、功能性等同物和抗体同源物，包括包含免疫球蛋白结合域的任何多肽，无论是天然的还是完全或部分合成的。因此，包括由免疫球蛋白结合域或等同物与另一多肽融合的嵌合分子。
术语“佐剂”描述可用于改善免疫反应或免疫细胞或组分刺激性的物质、化合物、试剂或材料，并且在某些情况下可以与免疫学、药物或疫苗组合物中的任何具体抗原组合。佐剂可用于增加产生的抗体和效应T细胞的量，并减少抗原或免疫刺激剂或调控剂的量和注射频率。佐剂可以作为缓慢释放抗原的组织储库，并且也可以作为非特异性增强免疫反应的淋巴系统激活子。在一个优选的方面，佐剂在哺乳动物，具体在人类中是生理上和/或药学上可接受的。
术语“特异性”可用于指特异性结合对中的一个成员不会对其特异性结合伴侣以外的分子显示出任何显著结合的情况。该术语也适用于例如抗原结合域对许多抗原携带的具体表位具有特异性，在这种情况下，携带抗原结合域的特异性结合成员将能够结合携带该表位的多种抗原。
术语“包含”一般用于包括的含义，也就是说允许一个或多个特征或组分的存在。术语“基本上由……组成”是指一个产物，例如肽序列，其具有未共价连接至较大产物的限定数目的残基。
本文所用术语“寡核苷酸”指本发明使用的探针，被定义为由两个或多个核糖核苷酸组成的分子，优选多于三个。其确切大小取决于许多因素，而该因素又取决于寡核苷酸的最终功能和用途。本文所用术语“引物”是指寡核苷酸，当置于诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下时，即在核苷酸和诱导剂(例如DNA聚合酶)存在以及在合适的温度和pH值下，能够作为合成的起始点。引物可以是单链或是双链的，并且必须足够长以在诱导剂存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。例如，对于诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常包含15-25个或更多核苷酸，尽管它可能包含更少的核苷酸。
术语“试剂”是指任何分子，包括多肽、抗体、多核苷酸、化合物和小分子。具体地，术语试剂包括例如测试化合物或药物候选化合物的化合物。
术语“分析”是指用于测量化合物的具体性质的任何过程。“筛选分析”是指用于根据化合物的活性从化合物集合中表征或选择化合物的过程。
本文使用的术语“蛋白质”是指蛋白质、多肽、寡肽或肽。术语“蛋白质标志物”、“生物标志物”或“即将发生的发作的蛋白质标志物”在本文中用于指与具体疾病或病症或症状相关或预测或先于具体疾病或病症或症状的蛋白质，包括来自或与被疾病或病症或症状影响的方面、细胞或组织有关的蛋白质。根据本发明，相对于没有明显器质性的RA疾病或明显的关节或疼痛症状或没有即将发作的对象或正常、健康的对象(对照组/控制组)所检测或具有特征的标志物表达的增加，与患者即将出现或发作的疾病或病症或其症状具体是疾病或症状的加重，如类风湿性关节炎，具体是RA发作，有正相关的指示或诊断作用。
如本文所用，标志物表达中的术语“增加”或标志物的“差异性表达”是指统计学上的显著增加或存在。术语“统计学显著性”在本领域中用于指由除了随机机会外的其他事物造成的结果或关系的可能性。传统上采用统计学假设检验来确定结果是否具有统计学意义。此类测试提供了一个“p值”，表示随机机会可以解释结果的概率。通常，5％或更低的p值被认为具有统计学显著性。
此外，本领域技术人员会理解，如果作为单一的决定因素，样品中具体蛋白质(蛋白质标志物)或具体RNA(RNA标志物)自身的相对增加或减少对疾病可能具有较弱的指示或预测性，但本身可能不具有诊断性。然而，如果在生物样品中注意到多个此类单一决定因素，那么几个，甚至是弱指示性的决定因素的联合检测可作为识别即将发生的疾病或有症状的疾病方面(例如即将发生的RA发作)的强组合诊断指标。此外，单一蛋白质/决定因素本身不必接近弱诊断的阈值，但与另一种或多种蛋白质或RNA或RNA(其他标志物)检测的增加相结合时，可作为即将发生的疾病状态的强组合诊断指标。因此，本文还包括与具体疾病或即将发生的疾病有关以及在健康对象或有其他疾病的患者中观察不到的组合诊断指标或组合标志物。
因此，本发明选定的一组标志物的一个、两个、三个、几个、至少10个、约10个、十几个、10-15个、约20个、至少20个、25个、30个、约30个和更多等等(最多相当于所有标志物的数量，或一组标志物中的所有标志物，包括任何中间的数字，以整数递增，例如1、2、3、4、5、6......)可作为本发明所述方法和/或试剂盒中即将发生的发作的诊断指标和预测因素。在一个实施方式中，在本发明的方法或试剂盒中使用本文确定的更大数量的标志物，因为随着筛选的标志物数量的增加，该方法或试剂盒的准确性可能会提高。关于本发明与评价治疗效果有关的方面，本发明的方法和试剂盒包括评估给予治疗性组合物是否导致一种或多种标志物的表达、两种或更多种标志物的表达、三种或更多种生物标志物的表达、四种或更多种生物标志物的表达、五种或更多种生物标志物的表达、六种或更多种生物标志物的表达等发生变化，无论是瞬时变化还是长期变化。
例如，蛋白质标志物或RNA标志物的直接识别是指与即将发生的疾病或病症相关的蛋白质或RNA的存在，而不是与临床上所考虑的疾病相混淆的其他状况相关。这种情况的变化包括与其他条件或对照相比，标志物以数量增加的情况存在。虽然不是蛋白质标志物，但一个示例是相比正常个体血液中有葡萄糖但不以升高的数量存在，糖尿病患者血液中存在大量的葡萄糖。变体是，功能性标志物不只是一个蛋白质，而是可以有数量上的不同的两个或更多的组合，其中整体定义了它的标志物潜力。
在一些实施方式中，本发明的标志物是生物学途径的一个成员。如本文所用，术语“前体”或“接替者”是指在生物学途径中先于或后于标志物的分子。因此，一旦标志物被鉴定为一个或多个生物学途径的成员，本发明可以包括在该标志物之前(在其上游或前体)或在其之后(在其下游)的生物学途径的其它成员。生物学途径及其成员的此类鉴定在本领域技术人员的技能范围内。
本文还包括对此处呈现的表中识别和列出的标志物的分析，以识别与疾病或即将发生的疾病或系统或发作的发病机制、维持和/或进程有关的代谢途径。此类分析可以利用技术人员已知和可用的多种软件程序或方法。具体代谢途径中的多次命中强调了该途径对疾病的潜在重要性，并直接进行治疗干预以对其进行适当调控。因此，本方法包括此类在具体疾病或即将发生的疾病方面或症状中具有潜在意义的代谢途径的分析和鉴定。例如，了解代谢途径的激活似乎与具体疾病或即将出现的症状有关，就有机会测试该途径的药物调控剂(即抑制剂)以确定此类调控剂是否可用作治疗该疾病或即将出现的疾病或症状的患者的疗法。这方面和这些方面在本文，包括在示例中进行了说明和描述
可以通过本领域已知的任何合适的方法分离或评估多肽或蛋白质标志物和RNA或RNA标志物。蛋白质或RNA可以通过本领域已知的标准方法纯化或分析，例如通过免疫分析、ELISA、核酸探针、引物、寡核苷酸、抗体亲和法、RNA测序等。在一个实施方式中，可以使用本领域已知的标准技术从生物样品中分离多肽和代谢物标志物，例如，使用特异性结合标志物的底物结合抗体的亲和纯化。如本文所述，丰富的RNA或蛋白质(具有掩蔽潜力)的免疫亲和耗竭增强了低丰度蛋白质或RNA的覆盖率和检测。
本文提供的任何一种标志物的免疫特异性抗体可以是已知的并可供公众使用，并且可以通过科学界获取或从商业供应商处购买。易于搜索的数据库或网络浏览器可用于例如识别此类抗体的潜在供应商。
根据本公开，表格提供了信息，普通技术人员可以利用这些信息获得本文识别为标志物的蛋白质和RNA的氨基酸序列，以及编码它们的核酸序列。用于识别本文列出的表中序列的逐步方案或手段可包括技术人员访问公开可用的数据库之一，并输入ensembl编号或基因名称或符号以识别序列和相关标志物信息。此类信息可用于设计探针用于检测其中所列的任何蛋白质、基因、RNA，或用于识别商业上可获得的探针或抗体。还设想用于检测编码本文呈现的表中列出的任何蛋白质的核酸序列的引物，以及用于PCR，包括RT PCR的引物。此类引物可用于检测与本发明相关的标志物的RNA表达水平(包括与对照组相比的相对增加或减少)。设计用于检测本文列出的一个或多个标志物的RNA(例如，mRNA)表达水平的引物是常规实践的问题，手头有核酸序列是由可公开访问的网站提供的，例如上述所提及的那些。此类探针和引物可用于本文描述的试剂盒
术语“防止”或“预防”是指在可能暴露于致病剂或在疾病发作前易患疾病的对象中降低获得或发展疾病或病症的风险(即导致该疾病的至少一种临床症状不发展)。术语“防御”与术语“预防”相关并涵盖在其中，是指目的在预防而非治疗或治愈疾病的措施或程序。预防性措施的非限制性示例可包括疫苗的给予；对因例如固定化而有血栓形成风险的医院患者给予低分子量肝素；以及在前往疟疾流行或感染疟疾风险高的地理区域之前，给予抗疟疾药物(例如氯喹)。
“治疗有效量”是指能够引起医生或其他临床工作人员所寻求的对象的生物或医学反应的药物、化合物、抗体或药剂的量。具体地，对于革兰氏阳性细菌感染和革兰氏阳性细菌的生长，术语“有效量”旨在包括有效量的化合物或制剂，该化合物或制剂将带来有生物学意义的疾病量或疾病程度或无发作时间段的减少，或增加对象的生存或无疾病或缓解或无发作期的长度。短语“治疗有效量”是指足以预防，并优选减少至少约30％，更优选至少50％，最优选至少90％的临床显著变化的量，或使生存期或无病期增强至少约30％，更优选至少50％，最优选至少90％的量。
在一个实施方式中，任何疾病、病症或感染的术语“处理”或“治疗”是指改善疾病或感染(即阻止疾病或传染原或细菌的生长或减少表现、程度或其至少一种临床症状的严重程度)。在其它实施方式中，“处理”或“治疗”指改善至少一个物理参数，其可能无法被对象辨识。在另一个实施方式中，“处理”或“治疗”指从身体(例如一个可辨识症状的稳定)或者生理(例如一个物理参数的稳定)方面调控疾病或感染，又或两者兼而有之。在进一步的实施方式中，“处理”或“治疗”与减缓疾病的进程或减少感染有关。
短语“药学上可接受的”指生理上可耐受的分子实体和组合物，并且当给予人时通常不会产生过敏或类似的不良反应，例如胃部不适、头晕等。
如本文所用，“pg”表示皮克，“ng”表示纳克，“ug”或“μg”表示微克，“mg”表示毫克，“ul”或“μl”表示微升，“ml”表示毫升，“l”表示升。
B.具体实施方式
本发明涉及并提供先前未鉴定和未识别的标志物，具体是RNA标志物和蛋白质标志物，它们是即将发生的类风湿性关节炎(RA)发作的指标和前因。标志物在RA患者的RA发作之前差异性表达或优先表达，并提供可预测即将发生的发作并可用于对患者实施和处方治疗和疗法的标志物。
关节炎是一种可能对健康的关节软骨造成损害，导致退行性变化、功能丧失和关节不稳定的疾病。炎症性关节炎描述的症状以关节疼痛、肿胀、压痛和发热，以及持续多于一小时的晨僵为表征。细胞因子的增加导致关节软骨的退化以及在炎症性关节炎中诱导软骨形成的生长因子的减少。最常见的炎症性关节炎相关病症是类风湿性关节炎(RA)、银屑病关节炎(PsA)、系统性红斑狼疮(SLE，狼疮)、强直性脊柱炎(AS)和痛风性关节炎(gout)。关节炎会损害关节内的软骨，导致退行性变化，包括功能丧失和关节不稳定。强直性脊柱炎(AS)是一种慢性炎性疾病，影响脊柱和骶髂关节内的骨与肌腱附着区域，导致背痛和进行性脊柱僵硬。类风湿性关节炎是一种慢性、全身性自身免疫性疾病，以多个关节的滑膜同时发炎，导致关节损伤(例如，破坏、变形和残疾)为表征。痛风是一种慢性炎性疾病，会造成关节改变，导致剧烈疼痛，并与嘌呤代谢失调导致的体内尿酸蓄积有关，造成关节中反复的阵发性炎症。别嘌呤醇和非布司他(febuxostat)是患有痛风的个体的主要治疗选择。
用于治疗或改善RA，包括用于管理和减轻RA发作的多种疾病调控剂是已知的并且使用于临床。非甾体类抗炎药(NSAIDs)或常规疾病修正抗风湿药(DMARDs)已用于治疗这些炎性疾病，具体是RA。最近，生物DMARDs被引入并取得了很好的效果。NSAIDs包括非处方药乙酰水杨酸盐(阿司匹林)、布洛芬(Advil，Motrin IB)和萘普生钠(Aleve，Naprosyn)和处方NSAIDs例如依托度酸(Lodine)和双氯芬酸(Voltaren)。类固醇是抗炎或免疫抑制剂，用于更严重的RA或当RA症状发作时以缓解关节疼痛和僵硬。示例包括糖皮质激素或皮质类固醇，例如强的松(prednisone)、可的松(cortisone)和甲基强的松龙(methylprednisolone)。DMARD是处方并用于减缓RA的进程并保护关节和其他组织免受永久性损伤。常见的DMARD包括甲氨蝶呤(Trexall，Otrexup))、来氟米特(Arava)、羟氯喹(Plaquenil)和柳氮磺胺吡啶(Azulfidine)。DMARDs抑制RA中过度活跃的免疫系统，但在它们的标靶中没有选择性。生物制剂--靶向免疫系统具体方面或部分的基因工程改造蛋白，并作为免疫抑制剂发挥作用--是治疗RA的一个越来越重要的组分，并且通常表示为生物DMARD或bDMARD。生物制剂包括阿巴西普(Orencia)、阿达木单抗(Humira)、阿那白滞素(Kineret)、巴利替尼(Olumiant)、赛妥珠单抗(Cimzia)、依那西普(Enbrel)、戈利木单抗(Simponi)、英夫利昔单抗(Remicade)、利妥昔单抗(Rituxan)、萨里单抗(Kevzara)、托珠单抗(Actemra)和托法替尼(Xeljanz)。阿达木单抗、依那西普、英夫利昔单抗、戈利木单抗和赛妥珠单抗靶向肿瘤坏死因子(TNF)。利妥昔单抗对B细胞有效。阿那白滞素阻断主要细胞因子白介素1(IL-1)的作用。阿巴西普靶向T细胞。生物DMARD通常与非生物DMARD(例如甲氨蝶呤)配对使用时最有效。靶向特异性但非生物制剂的新DMARD药物包括经口小分子Janus激酶(JAK)抑制剂，例如托法替尼(Xeljanz和Xeljanz XR)、巴利替尼(Olumiant)和阿帕西替尼(Rinvoq)。
美国风湿病学会(ACR)对RA患者的治疗建议考虑了多种疾病参数(例如，Singh J等(2016)Arthritis Rheumatolo 68:1-26)。疾病活动量表用于管理RA患者和选择适当的治疗方式，包括患者索引数据常规评估3(RAPID3)和疾病活动评分28(DAS28)的常规评估(Fransen,J等(2003)Arthritis Rheum 49Suppl:S214–24)，其中包括28个关节的压痛和肿胀、红细胞沉降率(ESR)和对患者疾病活动的全面评估，这两者都已用于本文描述的研究中。其他评估工具包括患者活动量表(PAS)或PASII(Wolfe,F等(2005)J Rheumatol 32:2410–5)、临床疾病活动指数(CDAI)(Aletaha,D等(2005)Arthritis Res Ther 7:R796–806)和简化疾病活动指数(SDAI)(Smolen,JS等(2003)Rheumatology 42:244–57)。这些量表和评估中的每一个都适用于患者一旦出现症状方面或发作或疾病的指标时的治疗。这些量表不能预测发作，它们是发作或疾病恶化的指标。
RA患者无法预测发作，并且因此会遭受不可预测的疾病恶化和疾病相关症状以及持续、进行性关节损伤。如果有可靠的即将发作的标志物，可以很容易和可靠地评估，具体是在没有重大临床干预的情况下，将显著影响RA患者的治疗和管理，减少疾病的影响和长期影响。
为此，本发明提供了在RA发作前两周或大约两周表达的第一组标志物。发作之前的时间可能有大约一周或7天的误差范围。参考本文提供的研究，患者的症状是使用调查问卷进行评估的，该问卷询问他们在过去一周的表现如何，因此时间上可能存在7天的误差范围。例如，考虑到调查问卷，研究员不一定能区分当天(或第1天)开始的症状与6天前、大约一周或最多7天前开始的症状。因此，第一组标志物的时间约为两周，误差范围最多可达另外7天，因此最多可达3周或一周可达三周或7-21天。可以在患者样品中识别和表征第一组标志物，具体是血液样品，包括在RA发作之前两周或大约两周、大约14天、大约14天、超过一周、超过12天、超过10天、大约10-14天、大约12-14天的指刺血液样品，每个示例的误差范围最多为一周或7天，因此，误差范围最多为RA发作前三周，至少为一周，大约两三周，两三周，大约7-21天，最多21天，至少7-10天，大约两到三周。表7中提供了这些先行标志物，具体表示为AC2标志物。
提供了另一组和第二组标志物，它们在RA发作前一周或约一周，或约7天，约7天表达。发作之前的时间可能有大约一周或7天的误差范围。参考本文提供的研究，患者的症状是使用调查问卷进行评估的，该问卷询问他们在过去一周的表现如何，因此时间上可能存在7天的误差范围。例如，考虑到调查问卷，研究员不一定能区分当天(或第1天)开始的症状与6天前、大约一周或最多7天前开始的症状。第二组标志物可以在患者样品中识别和表征，具体是血液样品，包括在RA发作前约一周，或7天，约7天，约5-7天的指刺血液样品，每个示例的误差范围最多为一周或7天，因此，误差范围最多为发作前两周，最多14天，0-14天，大约一到两周，至少一周，大约一周到10天、7-14天、5-14天。表8中提供了这些先行标志物，具体表示为AC3标志物。AC2标志物组或第一组标志物从发作时进一步表达，并且在发作前多于一周时表达，最多在RA发作前三周时表达，而AC3标志物组或第二组标志物在其后或更接近发作时，在发作之前大约一周或最多两周时表达。
一方面，AC3标志物，或一种或多种AC3标志物，或下层成纤维细胞基因的AC3标志物，在发作期间或发作开始后或一旦患者经历发作的身体指标或症状时减少。发作的身体指标或症状可以选自关节僵硬、全身疼痛、完成日常任务的难度增加、肿胀、疲劳和流感样症状。一方面，选择AC3标志物和表8中的滑膜细胞标志物基因或蛋白质。可以通过识别患者的症状和/或利用任何公认的疾病活动量表，包括本文所述和提供的，来评估发作。
表9中提供了即将发生的发作的RNA标志物和蛋白质标志物，其具体选择用于确定和预测即将发生的RA发作。标志物COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4。选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的RNA或其编码的蛋白质在RA发作前一周或约一周，或约7天、约7天、约5-7天、至少5天表达。选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物。选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的RNA或其编码的蛋白质在RA发作前一周或约一周，或约7天、约7天、约5-7天、至少5天表达。具体地，发作前标志物在患者中差异性表达。标志物选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4。选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的RNA或其编码的蛋白质差异性表达，它们的表达相对于其他标志物或蛋白质来说是增加或提高的，或它们的表达相对于正常样品或没有RA或任何其他公认的炎症或自身免疫性疾病的个体的样品，在RA发作前一周或大约一周，或大约7天，大约7天，大约5-7天，至少5天的表达明显增加。如上所述，时间上的误差范围可能至多为一周或7天。因此这些标志物的表达选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4。选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的RNA或其编码的蛋白质可能在发作前一最多两周或0-14天，或大约一到两周增加。选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的RNA或其编码蛋白的表达在RA发作期间在外周血中减少、明显减少、几乎没有或没有。在RA发作期间，选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的RNA或其编码蛋白的表达与发作前在外周血中的表达相比减少、显著减少或几乎不存在，尤其是它们在发作前约一周或最多两周的表达。
表5中列出了滑膜下层成纤维细胞常见的RNA标志物和转录物或蛋白质标志物，这些标志物是即将发作的标志，能够预测或确定即将发作的情况。标志物包括COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6。标志物为COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6。标志物选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6。选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的RNA或其编码的蛋白质在RA发作前一周或约一周，或约7天、约7天、约5-7天、至少5天表达。如上所述，时间上的误差范围可能长达一周或7天。因此，这些即将发作的标志物的表达可能在发作前一周或最多两周、至少约一周、约0-14天、最多两周、5-14天被发现或明显。选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的RNA或其编码蛋白的表达在RA发作期间在外周血中减少、明显减少、几乎没有或没有。
根据本发明，识别外周血中的独特标志物已导致在发作前在患者或个体的血液中循环的独特和具体的细胞或细胞类型的鉴定和表征。这种独特和具体的血液循环细胞是即将发生的RA发作的一个新指标。本发明包括一种独特的血液循环细胞，表示为炎症前间充质(PRIME)细胞，该细胞已被鉴定和表征为在RA发作前的患者(具体是RA患者，具体是人类)的外周血中循环。该细胞在外周血中的存在表明RA发作通过一种或多种患者症状将发生或变得明显。该细胞可在RA发作前约一周、一周、约7天、约5-8天、约5-7天、5-8天、5-7天、约4-7天、4-7天、约3-7天、3-7天，在患者外周血中被识别。该细胞可在病人的一个或多个关节出现炎症或一个或多个关节出现疼痛之前的约一周、一周、约7天、约5-8天、约5-7天、5-8天、5-7天、约4-7天、4-7天、约3-7天、3-7天，在患者外周血中被识别。如上所述，时间上的误差范围可能长达一周或约7天。因此，该细胞可在RA发作前约一周至约2周、约7-14天、至多14天、0-14天、约3-14天、约5-14天在患者外周血中被识别。在一个实施方式中，PRIME细胞可被识别和表征为CD45-CD31-PDPN+细胞，具体是外周血中的CD45-CD31-PDPN+细胞在另一个实施方式中，PRIME细胞可被识别和表征为CD45-CD31-PDPN+IL-17RD+细胞，具体是外周血中的CD45-CD31-PDPN+IL-17RD+细胞。
在一个实施方式中，识别和表征外周血中存在的CD45-CD31-PDPN+细胞或CD45-CD31-PDPN+IL-17RD+细胞提供了一种可以预测RA患者中即将发生的发作的诊断方法。在一个实施方式中，识别和表征外周血中CD45-CD31-PDPN+细胞或CD45-CD31-PDPN+IL-17RD+细胞的存在提供了一种诊断方法，该诊断方法可以预测即将发作的疾病，或关节僵硬、全身疼痛、完成日常工作难度增加、肿胀、疲劳和/或流感症状的患者，包括RA患者，或怀疑患有RA或关节炎或炎症疾病的患者。
本发明因此提供一种用于监测和预测患者中类风湿性关节炎(RA)发作或增加的RA疾病活动的方法，包括：
(a)从所述患者分离血液样品；
(b)评估血液样品中一组或多组先行RNA标志物、蛋白质标志物或细胞标志物的表达或定量增量，标志物选自：
(i)AC2标志物或蛋白质，如表7所提供；
(ii)AC3标志物和蛋白质，如表8所提供的；
(iii)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物或蛋白质，如表5所示；
(iv)选自COL1A2,COL5A1,COL16A1,COL14A1,COL4A2,PXDN,ST5,DCLK1,SCARA5,EGFR,EGR1和ZFHX4的标志物和蛋白质，如表9所示；
(v)细胞标志物CD45-CD31-PDPN+；
(c)其中RNA标志物或蛋白质的表达或定量增量或细胞标志物的存在预示着即将发生的RA发作。
AC2 RNA标志物或蛋白质的表达或定量增量可预测约2周或约12-14天内的RA发作，误差范围可达约1周或7天，因此在约7-21天内。已在RA患者中识别和表征AC2标志物的差异性表达，大约在患者出现指示RA发作的症状前两周。AC3 RNA标志物或蛋白质的表达或定量增量预测RA发作在大约1周或大约5-7天内，误差范围为大约一周或7天，因此大约一周或最多2天周，或最多14天。已在RA患者中识别和表征AC3标志物的差异性表达，大约在患者出现指示RA发作的症状前一周或约5-7天。在识别发作症状之前的一段时间可能会从一周前或两周前的一天、几天或几天不等。该变化可能是用于评估标志物的血液采集或样品采集时间的结果。该变化可能是患者对RA发作症状的敏感性或患者识别或识别发作症状或任何临床参数的能力的结果。发作的身体指标或症状可选自关节僵硬、全身疼痛、完成日常工作难度增加、肿胀、疲劳和流感样症状，这些可能会由患者立即或在短期内或可能会在一天或两天或几天出现症状后被识别出来。
可以在患者中评估任何适用的和足够数量的标志物以确定或预测即将发生的发作。因此，标志物应该足以可靠地预测即将发生的发作。本领域的技术人员将能够利用本文的数据和可获得的数据来提供需要或足以预测发作的一组标志物。具体地，例如，可以选择与某些途径或反应相关的标志物可以选择参与骨髓、嗜中性粒细胞、Fc受体信号传导和血小板活化的途径。与原初B细胞和白细胞的发育途径相关的基因或标志物可从AC2基因中选择。原初B细胞基因可从AC2基因中选择。可以选择与胞外基质、胶原蛋白和结缔组织发育有关的途径，并且具体可以从AC3基因中选择。本发明描述了AC3富集于血液样品中不典型的途径，包括软骨形态发生、软骨内骨生长和胞外基质组织。这些途径的基因或与之相关的基因可以从AC3基因中选择，作为预测RA发作的标志物。AC3被描述为富含下层成纤维细胞基因，具体方面是下层成纤维细胞基因CD34+，HLA-DR+，和DKK3+。AC3被描述为富含下层成纤维细胞基因，具体方面是下层成纤维细胞基因CD45-CD34+，CD45-HLA-DR+和CD45-DKK3+。在一个方面中，这些可以具体地选自或包括在选自AC3基因的标志物中。在一个实施方式中，选择或评估选自AC3标志物或蛋白质的下层成纤维细胞标志物。在一个实施方式中，评估由CD34+，HLADR+和DKK3+细胞表达的AC3标志物或蛋白质。在一个实施方式中，评估由CD45-CD34+,CD45-HLADR+和CD45-DKK3+细胞表达的AC3标志物或蛋白质。该方法包括，其中也评估了细胞标志物IL17RD。在一个实施方式中，评估由PRIME细胞、CD45-CD31-PDPN+细胞或CD45-CD31-PDPN+IL17RD+细胞表达的AC3标志物或蛋白质。
值得注意的是，本文提供的许多相关和最特别的标志物在外周血中是不常见的和/或不需要或具体与炎症或炎症病症本身相关。这有利于它们的特异性、相关性和重要性，具体是或特别地预测或暗示即将发生的RA发作和/或关节症状的恶化。一些先前的标志物研究已经鉴定了炎症基因，例如炎症基因表达组，其中基因与RA或RA的炎症类型病症相关，例如于美国专利7,935,482中所描述的。这些炎症基因提供了与本文所提供的那些不同的谱特征(profile)和谱析(profiling)，并且具体是偏向以及与炎症相关，并且不能预测即将发生的发作。
可以评估具有至少20个AC2或AC3标志物的子集。在一个方面中，评估了具有至少10个AC2或AC3标志物的子集。至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16、至少17、至少18个、至少9个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个AC2或AC3标志物可被评估。可以评估具有至少20个AC2和至少20个AC3标志物的子集。在一个方面中，评估了具有至少10个AC2和AC3标志物的子集。至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16、至少17、至少18个、至少9个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个AC2和AC3标志物可被评估。
本发明具体涉及预测患者即将发生的RA发作并治疗即将发生的发作，从而使患者经历减轻的发作、更少的与发作相关的病理和/或症状，或者使得发作及其相关的疾病恶化减少、持续时间得到限制或避免。本文提供该方法用于预测即将发生的发作和治疗发作，包括由此预防发作，从而可实现预防。这有助于显著减少RA患者的疾病和相关困难，并提供临床上更稳定的RA情况。
提供一种用于预测即将发生的RA发作和治疗患者发作的方法，该方法包括：
a)从患者分离血液样品；
b)使血液样品与对选自一组RNA或蛋白质标志物的标志物具有特异性的试剂接触，以评估RNA或蛋白质标志物的表达，其中该组RNA或蛋白质标志物选自：
(i)AC2标志物或蛋白质如表7所提供；
(ii)AC3标志物和蛋白质如表8所提供的；
(iii)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物或蛋白质，如表5所示；
(iv)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物或蛋白质，如表9所列；以及
c)将血液样品中选自一组RNA或蛋白质标志物的标志物的表达与对照血液样品中该标志物的表达进行比较，以确定选自一组RNA或蛋白质标志物的标志物在血液样品中的表达相对于对照血液样品中的表达是否增加，其中增加的表达的检测用于预测患者中即将发生的RA发作；
并通过给予治疗有效量的一种或多种治疗RA的疾病调控剂来治疗由此诊断为即将发生RA发作的患者。
AC2 RNA标志物或蛋白质的表达、差异性表达或定量增量可预测或可用于预测约2周、约14天或约12-14天、长达约3周内或大约21天内(给定误差范围)的RA发作。AC3 RNA标志物或蛋白质的表达、差异性表达或定量增量可预测或可用于预测约一周、约7天、或约5-7天、长达约2周内或大约14天内(给定误差范围)的RA发作。在所述方法的一个方面中，选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物或蛋白质的表达、差异性表达或定量增量预测约一周内，约7天、或约5-7天、长达约两周或14天内(给定误差范围)的RA发作。
可以使用本领域已知的任何方法进行RNA或蛋白质表达的评估。因此，根据本发明的方法，可以通过RT PCR评估RNA表达。RNA表达可以通过RNA测序来确定。根据该方法，可以使用特异性抗体评估蛋白质表达，评估蛋白质活性，利用蛋白质配体。
根据本发明的方法，可以使用标准和已知方法确定血液中在细胞表面或表达或存在的细胞标志物。细胞标志物可使用抗体评估。细胞标志物可使用FACs分析评估。细胞或细胞标志物可使用细胞分选或单细胞评估进行评估。细胞，包括本发明的PRIME细胞可使用细胞表面标志物抗体进行分离。因此，在本发明的一个实施方式中提供了使用或通过细胞表面标志物分离表征为CD45-CD31-PDPN+细胞的PRIME细胞的方法。
用于治疗RA的疾病调控剂可以选自用于RA或关节炎病症或炎性疾病和病症的标准或临床认可的药剂或疗法。在方面中，用于治疗RA的疾病调控剂可能是一种或多种选自非甾体抗炎药(NSAID)、类固醇、甲氨蝶呤、疾病修正抗风湿药物(DMARDs)、生物DMARD和经口janus激酶(JAK)抑制剂的试剂。DMARD可能是包括甲氨蝶呤(Trexall，Otrexup))、来氟米特(Arava)、羟氯喹(Plaquenil)和柳氮磺胺吡啶(Azulfidine)的一个或多个。生物DMARD可能是阿巴西普(Orencia)、阿达木单抗(Humira)、阿那白滞素(Kineret)、巴利替尼(Olumiant)、赛妥珠单抗(Cimzia)、依那西普(Enbrel)、戈利木单抗(Simponi)、英夫利昔单抗(Remicade)、利妥昔单抗(Rituxan)、萨里单抗(Kevzara)、托珠单抗(Actemra)和托法替尼(Xeljanz)的一个或多个。示例性JAK抑制剂包括托法替尼(Xeljanz和Xeljanz XR)、巴利替尼(Olumiant)和阿帕西替尼(Rinvoq)。生物DMARD可以是肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂。在一个方面中，生物DMARD可以是抗炎抗体或针对炎症或免疫调控分子的抗体。在一个方面中，抗体可以是白介素抗体。抗体可以是IL-17特异性抗体或IL-17RD特异性或IL-17RD阻遏性或中和抗体。抗体可以是平足蛋白(PDPN)抗体。抗体可以是双特异性平足蛋白(PDPN)抗体，例如双特异性PDPN IL17RD抗体。
一种新颖独特的循环细胞已被识别为即将发生的发作的细胞指标，并且具体有助于即将发生的发作。因此，被表征为CD45-CD31-PDPN+细胞循环的炎症前间充质(PRIME)细胞已被识别并在本文中提供，其中该细胞在外周血中的存在指示或预示即将发生的RA发作。在一个方面中，PRIME细胞另外表达IL17RD并且为IL17RD+。在一个方面中，具有PRIME细胞的子集另外表达IL17RD并且为IL17RD+。作为本发明的一个实施方式，提供了用于分离PRIME细胞、CD45-CD31-PDPN+细胞和另外的IL17RD+细胞的方法，包括用于分析和/或评估潜在治疗剂或细胞调控剂的方法。可以通过它们的细胞表面标志物选择或分离细胞，包括CD45-CD31-PDPN+，此外还包括IL17RD+。提供了评估调控或抑制CD45-CD31-PDPN+细胞以及IL17RD+细胞的试剂的方法。
本文提供一种预测即将发生的RA发作的方法，包括评估来自患者的血液样品中是否存在表征为CD45-CD31-PDPN+细胞的PRIME细胞，其中患者外周血中可检测的PRIME细胞的存在预测在患者体内即将发生的RA发作。在其一个实施方式中，该方法包括进一步评估CD45-CD31-PDPN+细胞上IL17RD的存在。提供一种评估和治疗RA患者中即将发生的发作的方法，包括评估患者外周血中是否存在表征为CD45-CD31-PDPN+细胞的PRIME细胞，并对外周血中PRIME细胞呈阳性的患者用治疗RA的疾病调控剂进行治疗。提供一种评估和治疗RA患者中即将发生的发作的方法，包括评估患者外周血中是否存在表征为CD45-CD31-PDPN+IL17RD+细胞的PRIME细胞，并对外周血中PRIME细胞呈阳性的患者用治疗RA的疾病调控剂进行治疗。
提供一种评估和治疗RA患者中即将发生的发作的方法，包括评估患者外周血中是否存在表征为CD45-CD31-PDPN+细胞的PRIME细胞所表达、特异性表达或具体表达的RNA或蛋白质，并对外周血中PRIME细胞的表达、特异性表达或具体表达呈阳性的患者用治疗RA的疾病调控剂进行治疗。提供了评估和治疗RA患者中即将发生的发作的方法，包括评估患者外周血中RNA的存在或表达、特异性表达或具体由表征为CD45-CD31-PDPN+IL17RD+细胞的表达的蛋白质，并对外周血中RNA或蛋白质的表达、特异性表达或具体表征为CD45-CD31-PDPN+IL17RD+细胞呈阳性的患者用用于治疗RA的疾病调控剂进行治疗。该规范详述了在表征为CD45-CD31-PDPN+细胞的PRIME细胞中，多种和大量具体的AC3标志物基因与基因表达(例如通过RNA存在检测)的重叠表达。
疾病调控剂可以选自本文描述和提供的或临床医生或医师已知和公认的那些。可以选择导向免疫调控剂或炎症调控剂的抗体。在一个方面中，患者用IL-17或IL-17RD抗体治疗。在另一个方面中，患者进一步用抗炎剂和/或免疫调控剂治疗。在一个方面中，患者用平足蛋白(PDPN)抗体治疗。在一个方面中，用导向PRIME细胞上表面标志物的一种或多种抗体治疗患者，例如来自在细胞表面上表达的AC3基因标志物的标志物。在一个方面中，用导向表面标志物的一种或多种抗体治疗患者，该表面标志物选自标志物或蛋白质COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6。
两种靶向IL-17A的单克隆抗体(赛库克单抗(AIN457,Novartis)、伊克珠单抗(LY2439821,EliLilly)和一种针对IL-17受体的单克隆抗体(Brodalumab(KHK4827,AMG827,Kyowa/Amgen))被批准用于治疗中度至重度斑块型银屑病(Silfvast-Kaiser A等(2019)Expert Opin Biol Ther 19(1):45-54；doi:10.1080/14712598.2019.1555235)。其他IL-17A抗体包括壬托鲁单抗(ABT-122，Abbvie)、ALX-0761(MSB0010841，Ablynx/Merck)、BCD-085(Biocad)、COVA322(Covagen)、LY3114062(EliLilly)、排乐珠单抗(RG4934,RO5310074,Hoffman-LaRoche)、伏那吉珠单抗(SHR-1314,Jiangsu Hengrui)、CNTO 6785(Morphosys/Janssen)、CJM112(Novartis)和拜莫克珠单抗(UCB4940,UCB)(Ibrahim S etal(2017)Clin Colorectal Cancer 17(1):e109 -13)。据报道IL-17A特异性抗体苏金单抗和其他抗IL-17试剂对强直性脊柱炎有效(Wendling D等(2019)Expert Opin Biol Ther19(1):55-64.doi:10.1080/14712598.2019.1554053)。这些抗体是根据本发明使用和应用的。
平足蛋白(PDPN)抗体也已被描述。这些包括抗平足蛋白抗体克隆8.1.1(Lax S等(2017)BMJ Open Respiratory Res4:e000257.doi:10.11361/bmjresp-2017-000257)，嵌合小鼠-人平足蛋白抗体chLpMab-7(Kato Y(2015)Oncotarget 6(34):36003-36018)以及抗人平足蛋白大鼠抗体NZ-1及其衍生的嵌合大鼠-人抗体(NZ-8)Abe S et al(2013)JImmunol 190(12):6239-6249)。
免疫调控剂可与抗体或试剂，包括靶向本发明标志物或蛋白质的抗体或药剂一起包含在组合物中，或在不同时间给予以加强免疫调控和/或RA治疗，包括针对RA或RA发作的免疫疗法。免疫调控剂可能是一种佐剂。适用的免疫调控剂包括IDO、TDO(Platten M(2012)Cancer Research 72(21):5435-40)、-半乳糖基神经酰胺及其类似物例如苏糖醇神经酰胺(ThrCer)和ThrCer 6、TLR配体如多聚I:C(TLR3)、MPL(TLR4)、咪喹莫特(TLR7)、R848(TLR8)或CpG(TLR9)、iCOS、CTLA-4、PD1、PD1配体、OX40和OX40配体、Lag3、GITR、GITR配体白介素、肿瘤坏死因子(TNF)或其他生长因子、集落刺激因子、T细胞调控剂，包括CD8+T细胞调控剂、细胞因子或刺激免疫反应或减少或消除癌细胞或肿瘤的激素(Mellman I(2011)Nature(480):480–489)。其他免疫调控剂是针对适用免疫调控剂的小分子、拮抗剂抗体或激动剂抗体，包括IDO、TDO、Toll样受体家族或iCOS、CTLA-4、PD1、PD1配体、OX40和OX40配体、白介素、肿瘤坏死因子(TNF)或其他生长因子、集落刺激因子、T细胞调控剂(包括CD8+T细胞调控剂)、刺激免疫反应或减少或消除癌细胞或肿瘤的细胞因子。其他免疫调控剂，包括TLR配体，例如多聚I:C(TLR3)、MPL(TLR4)、咪喹莫特(TLR7)、R848(TLR8)或CpG(TLR9)，包括与其他调控剂、试剂或抗体的组合。
本发明标志物的独特特异性提供了诊断和治疗用途，以识别、表征和靶向与关节炎和/或炎性病症相关的RA发作或病症和症状，具体是在出现临床症状之前。具体地，本发明的标志物可用于调控关节炎或炎性疾病，具体是RA。本发明的标志物可用于炎症性关节炎相关病症，具体是类风湿性关节炎(RA)。标志物还可用于炎症性关节炎的其他病症，具体是银屑病关节炎(PsA)、系统性红斑狼疮(SLE，狼疮)、强直性脊柱炎(AS)和痛风性关节炎(痛风)。在其一个方面中，靶向RNA标志物或蛋白质标志物的抗体或试剂可用于调控RA发作或关节炎症或RA发作的其他物理指标和症状。抗体或试剂在RA的治疗性处理或管理中具有适用性。抗体或试剂在其他常见的炎症性关节炎相关病症中可进一步具有适用性，具体是例如银屑病关节炎(PsA)、系统性红斑狼疮(SLE，狼疮)、强直性脊柱炎(AS)和痛风性关节炎(痛风)。靶向RNA标志物或蛋白质的抗体或试剂可用于增强治疗效果，包括传统RA疾病调控剂或疗法的抗风湿效果。
本发明包括一组用于评估和预测患者即将发生的RA发作的RNA或蛋白质标志物，包括选自以下的标志物：
(i)具有表7中提供的AC2标志物中的至少20个标志物的子集；
(ii)具有表8中提供的AC3标志物中的至少20个标志物的子集；
(iii)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物，如表5所列；
(iv)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物，如表9所列；
标志物可以是具有至少20个AC2或AC3标志物的子集，具有至少10个AC2或AC3标志物的子集。至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16、至少17、至少18个、至少9个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个AC2或AC3标志物可被包括。可以选择和使用具体的标志物。AC2标志物子集可包含原初B细胞基因标志物和原初B细胞和白细胞发育途径的标志物。具有AC3标志物的子集可包含软骨形态发生、软骨内骨生长、胞外基质组织和下层成纤维细胞的标志物。具有AC3标志物的子集可包含由PRIME细胞，CD45-CD31-PDPN+或CD45-CD31-PDPN+IL17RD+细胞，下层成纤维细胞，具体是RA下层成纤维细胞的前体细胞表达或差异性表达的标志物。
根据本文方法所提供和/或使用的一组标志物可选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的一种或多种。在一个方面中，根据本文的方法提供和/或使用选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的一个或多个标志物的组。根据本文的方法提供和/或使用选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、十二个、至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个，至少十个的组，或一组或多组，5-10个的组，3-5个的组，5-7个的组、3-7个的组、5-8个的组。根据本文的方法提供和/或使用选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、十二个、至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个，至少十个的组，或一组或多组，5-10个的组，3-5个的组，5-7个的组、3-7个的组、5-8个的组。可以利用多组标志物，例如一种类型或代谢途径的一组标志物，与另一种类型或代谢或细胞途径或细胞的一组不同标志物相结合。
本发明也涉及多种诊断应用，包括用于检测本发明的任何标志物的表达或升高的存在的方法，具体是本文描述和提供的RNA标志物或蛋白质标志物。因此，评估了RNA或蛋白质的存在或数量。蛋白质可以通过参考它们被导向其的特异性抗体识别的能力进行评估。肽复合物可以在细胞(包括外周血中的细胞)上被识别、靶向、标记和/或定量。诊断应用包括本领域技术人员公认的和标准的，基于本说明书现有描述的体外和体内应用。用于标志物状态或标志物量的体外评价和评估的诊断分析和试剂盒可用于诊断、评估和监测患者样品，包括那些已知患有或疑似患有关节炎、炎性关节炎或RA的患者样品。RA疾病状态的评价和评估有助于确定患者对药物临床试验或具体疗法或疾病调控剂(包括DMARD或抗体，包括本文所描述的，包括其组合)对比于不同试剂或治疗的适用性。这种类型的诊断监测和评估已经在实践中使用针对乳腺癌HER2蛋白的抗体(Hercep测试，Dako公司)，其中该分析还用于评估患者使用赫赛汀进行抗体治疗。体内应用可包括关节的成像，包括放射成像。
在另一个实施方式中，可以准备适合医学专家使用的商业测试试剂盒，以确定是否存在本文所述的具有一种或多种标志物或标志物的子集的异常、差异或增加的表达。一类试剂盒将至少包含标记的标志物或其结合伴侣，例如对其特异的抗体，以及说明书，当然，这取决于所选择的方法。试剂盒还可能包含外周试剂，例如缓冲液、稳定剂等。
因此，可以制备用于证明即将发生的RA发作的一种或多种标志物或蛋白质标志物的存在或升高的水平的检测试剂盒，其包括：
(a)预定量的至少一种标记的免疫化学反应成分，其获自将蛋白质标志物或特异性结合伴侣或抗体直接或间接连接到可检测标记物上；
(b)其他试剂；以及
(c)所述试剂盒的说明书。
根据上文，可以制备用于筛选有效调控RA发作或预防RA发作和/或本发明的标志物或蛋白质标志物活性的潜在药物的分析系统。可以将标志物肽或其抗体可被引入测试系统，也可以将预期药物引入所得细胞培养系统，然后检查培养物以观察细胞的活性、抗体的结合或标志物的数量和程度是否因单独添加预期药物或因添加一定数量的已知试剂的影响而发生变化。
本发明提供了用于预测即将发生的RA发作的系统或试剂盒，包括本文描述和提供的一组标志物或用于评估本文描述和提供的一组标志物的一组探针和/或抗体。
例如，试剂盒或系统可以包括一组标志物或一组探针和/或抗体，用于评估选自以下的一组标志物或用于以下各项或其任何组合：
(i)具有表7中提供的AC2标志物中的至少20个标志物的子集；
(ii)具有表8中提供的AC3标志物中的至少20个标志物的子集；
(iii)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物，如表5所列；
(iv)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物，如表9所列；
系统或试剂盒可进一步包括用于通过指刺采血来采集患者血液的器具。
参考以下非限制性实施例可以更好地理解本发明，这些实施例作为本发明的示例提供。提供以下实施例是为了更全面地说明本发明的优选实施方式，但绝不应解释为对本发明的广泛范围的限制。
实施例1
纵向基因组学识别PRIME细胞为类风湿性关节炎发作的前因
与许多炎性疾病类似，类风湿性关节炎(RA)以出现静止期和恶化期(发作)为表征。导致发作的分子事件尚不清楚。我们建立了用于对RA患者进行重复的家庭采血以便进行纵向RNA测序(RNAseq)的临床和技术方案。样品获取自我们的索引患者在四年中八次发作的364个时间点，以及另外三位患者发作的235个时间点。我们确定了在发作之前差异性表达的转录物，并将它们与滑膜单细胞RNAseq(scRNAseq)进行了比较。在其他RA患者中使用流式细胞术和分选的血细胞RNAseq来验证该发现结果。
在RA发作前一到两周，在血液转录谱特征(profiles)中观察到一致的变化。B细胞活化之后是RA患者血液中先前未探索的循环CD45-/CD31-/PDPN+、炎症前间充质(“PRIME”)细胞的扩增，它们共有炎症性滑膜成纤维细胞的特征。在全部四名患者的发作期间，循环PRIME细胞减少，流式细胞术和分选的细胞RNAseq证实了另外19名RA患者中PRIME细胞的存在。
RA发作的纵向基因组分析揭示了RA血液中的PRIME细胞，并提出了一种模型，在该模型中，它们在RA发作前几周被B细胞活化，然后从血液向外迁移到滑膜。纵向RNAseq分析可用于揭示导致慢性炎症性疾病发作的动态变化。
类风湿性关节炎(RA)症状是高度动态的，稳定期被疾病活动不可预测的发作打断。此类起伏的临床过程是许多自身免疫性疾病的特征，包括多发性硬化症(1)、系统性红斑狼疮(2)和炎性肠病(3,4)，强调需要开发用以了解是什么触发了从静止状态到自身免疫性疾病发作的转变的方法。
本研究通过对个体RA患者随时间推移的血液转录谱特征进行纵向的前瞻性分析，来探索疾病的病理生理学。先前对RA血液样品的微阵列研究(来自相对稀疏的时间序列数据)几乎没有识别出与疾病活动相关的显著基因变化(5-8)。在此我们提供了第一个RA研究以寻找血液中预示临床发作的分子变化。为此，我们优化了方法，让RA患者自己可以采集高质量的指刺血液样品进行RNA测序(RNAseq)，便于每周采血持续数月至数年。
我们分析了来自4名患者横跨多个临床发作期的临床疾病活动和RNAseq数据的患者报告。在我们研究最深入的索引案例中，我们通过RAPID3评估了4年中8次发作的364个时间点，并分析了RNAseq评估的84个时间点。纵向收集样品使我们能够寻找在临床症状之前的转录特征。将这些血液RNA谱特征与滑膜单细胞RNAseq(scRNAseq)数据进行比较(9)提供的证据表明，在症状出现之前，血液中一组生物学相关的转录物显著增加，并且随着患者开始出现症状，其中一个子集会减少。后者这些转录物与使用scRNAseq在发炎的RA滑膜中检测到的滑膜下层成纤维细胞类型的新子集重叠并可能与细胞前体区分开来。对另外19名RA患者的分析证实了我们的发现结果。我们的数据表明了一个模型，其中先前未探索的循环间充质细胞类型，在RA发作前几周可检测到，变得被B细胞活化，随后离开血液，进入滑膜，并导致疾病活动。
方法
患者数据
所有患者均符合美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟2010(10,11)的RA标准，并且环瓜氨酸蛋白抗体(CCP)血清反应呈阳性。使用患者索引数据3(RAPID3)问卷的常规评估(12)，每周在家中评估疾病活动，或在疾病发作升级期间每天最多评估4次。还使用RAPID3和疾病活动评分28(DAS28)在门诊、每月和发作期间评估疾病活动，其纳入来自28个关节的压痛和肿胀、红细胞沉降速率(ESR)和患者疾病活动的全面评估。包括白细胞(WBC)、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和血小板的全血细胞计数(CBC)，由纪念斯隆-凯特琳癌症中心的临床实验室进行。我们收集了索引患者的43次门诊，以及其他三名患者的25次、14次和12次门诊，进行了纵向研究。通过FACS和RNAseq分析，还研究了其外周血单核细胞(PBMC)可用的另外19名血清阳性RA患者和18名年龄和性别匹配的非RA患者中PRIME细胞的存在与否。
从指刺血制备RNA
患者在家中自行进行手指刺血以将三滴血液收集到预先装有固定剂的microtainer采血管中，每周将样品邮寄过夜。使用PAXgene RNA试剂盒提取RNA并按照制造商的方案进行纯化，不同之处在于所有清洗和洗脱的体积减少到制造商推荐体积的25％。使用安捷伦生物分析仪(Agilent BioAnalyzer)评估RNA的数量和质量。对于文库制备，我们使用了GlobinZero试剂盒(EpiCentre#GZG1224)和Illumina的Truseq mRNA链式文库试剂盒，使用11-12个PCR循环进行5-8nM输入，并用150个碱基配对末端读出在HiSeq2500上测序。使用STAR将读数与Gencodev18进行比对，并使用featureCounts(v1.5.0-p2)进行量化。样品有至少四百万个配对末端读数被保留用于分析。
数据分析：
疾病活动测量的比较
为了描述疾病活动与RAPID3的双变量关系，我们使用了局部加权回归散点平滑(LOWESS)技术。计算R2以评估从CIBERSORTx推断的CBC计数与临床实验室测量的计数之间的相关性。推断的CIBERSORTx淋巴细胞计数是初始B细胞+记忆B细胞+CD8 T细胞+CD4初始T细胞+CD4记忆静息T细胞+CD4记忆活化T细胞的总和。将单核细胞、巨噬细胞M0、巨噬细胞M1和巨噬细胞M2相加和以推断CIBERSORTx单核细胞计数。单向ANOVA用于根据疾病活动状态测试多种临床特征之间的显著差异。
跨患者的差异性表达分析
样品被标记为“基线(稳定的RAPID3)”、“发作”(RAPID3评分上升超过基线平均值两个标准差)或“类固醇”。EdgeR(v3.24.3)(13)用于分析发作相对于基线的差异性基因表达。置换检验(n＝1x106)用于检验索引患者和患者2、3和4中发作时减少的基因之间重叠的显著性。GO富集(goana，来自limma v3.38.3)(14)用于鉴定索引患者(FDR<0.1)中显著差异性表达基因的富集途径，并且索引和重复患者的表达方向一致(即，log倍数变化既可以是正的也可以是负的)。
索引患者的时间序列分析
我们使用ImpulseDE2(v1.8.0)(15)对索引患者进行了纵向数据分析。发作开始是临床定义的(如上所述)，分析发作前8周至发作后4周的样品(不包括患者服用类固醇期间的任何样品，n＝65个样品)。文库制备日期纳入模型进行批次校正，并使用genefilter(v1.64.0)包(16)筛除低表达基因。
共表达基因模块的识别与表征
我们对ImpulseDE2分析中发现的显著差异性表达基因的平均表达进行层次聚类，按照到发作起始的周数(使用edgeR计算批次校正的logrpkm表达值)，并确定了五个共表达基因模块(聚类1-5)。我们分析了这五个模块的GO术语富集(goana)。
为了比较差异性表达的基因模块，并进一步表征随时间推移基因模块的表达模式，对于每个模块，计算每个基因在每周发作时的平均表达水平，然后进行周标准化。ABIS(17)和CIBERSORTx(18)用于对基因表达数据进行去卷积。为了用基因标志物聚集给定的基因簇或细胞类型，分别绘制了每周内标准化基因表达分数或去卷积细胞类型分数的平均值。为了识别滑膜scRNAseq聚类特异性标志物基因特征，我们使用先前发布的数据集(18)，使用单细胞RNA-seq log2(CPM+1)矩阵将来自一个scRNAseq聚类的细胞与来自所有其他scRNAseq聚类的细胞进行比较。我们使用1)log2FC大于1、2)auc大于0.6和3)表达细胞百分比大于0.4的标准为每个聚类生成了前200个标志物基因的列表。我们使用费舍尔精确检验来评估滑膜细胞亚型标志物基因在5个共同表达的基因模块中的富集程度。使用Benjamini-Hochberg程序对P值进行多重假设检验校正。
流式细胞术和分选
为了评估外周血单个核细胞中PRIME细胞的百分比，来自PBMC的样品用以下抗体染色：CD31-APC、(WM59)、小鼠IgG1-APC(MOPC-21)、PDPN-PerCP(NZ1.3))、大鼠IgG2a(eBR2a)-PerCP、CD45-PE(HI30)、小鼠IgG1-PE(MOPC-21)和-3，并使用FlowJo10.6.1在BD-FACSCalibur上进行分析。为了对PRIME细胞进行流式分选和测序，使用CD31-APC(WM59)、小鼠IgG1-APC(MOPC-21)、PDPN-PerCP(NZ1.3)、大鼠IgG2a-PerCP(eBR2a)、CD45-FITC(HI30)、小鼠IgG1-FITC(MOPC-21)和DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐)对CD14耗竭的白细胞分离液中的2000万-1亿个细胞进行染色并在BD FACSAria II上分选。Illumina Stranded TruSeq文库试剂盒用于生成在MiSeq上测序的cDNA文库。DESeq2(v1.24.0)(19)用于差异性表达分析。
统计学
计算R2和皮尔森相关系数以评估由RAPID3和DAS28测量的疾病活动的双变量线性拟合以及从CIBERSORT细胞计数和临床实验室测量的计数推断的CBC计数。推断的CIBERSORTx淋巴细胞计数是初始B细胞+记忆B细胞+CD8 T细胞+CD4初始T细胞+CD4记忆静息T细胞+CD4记忆活化T细胞的总和。单向ANOVA用于根据疾病活动状态测试多种临床特征之间的显著差异。将单核细胞、巨噬细胞M0、巨噬细胞M1和巨噬细胞M2相加和以推断CIBERSORTx单核细胞。
结果
临床方案发展
我们制定了家庭采血策略，允许高质量和高数量的RNA用于测序(图6-12；15-50ngRNA；RNA完整性(RIN)分数(平均值6.9+/-标准差1.7)。研究患者还记录了疾病活动(RAPID3问卷)。对四名RA患者进行了为期一到四年的随访，每周在家中收集指刺血液样品，并完成RAPID3和每月门诊，其中收集了DAS28(图1A)。对来自4名患者的总共189份指刺血液样品中提取RNA进行测序，其中162份(87％)通过了质量控制筛选。
为了评估患者报告的疾病活动的有效性，我们将他们的RAPID3评分与临床医生收集的DAS28进行了比较。四名患者的RAPID3和DAS28之间存在显著相关性(图1B和图13)。为了评估指刺血液数据的有效性，我们比较了RNAseq推断的白细胞计数与全血细胞计数的临床实验室测量值，并再次观察到显著的相关性(图1C)，表明指刺血液的RNAseq有足够的质量以提供与血液计数的金标准临床测量相关的信息。综上所述，这些数据表明疾病活动的患者报告与指刺血液样品配对，为个人参与纵向临床研究提供了高质量和强有力的手段。
与基线相比，RA发作的临床和分子特征
发作与索引患者中RA相关疾病活动的客观临床和实验室测量的增加有关联(图2A和图14)。指刺RNAseq确定了2613个基因在发作时相对于基线的差异性表达(FDR<0.1)，其中1437个在发作期间增加(logFC>0；图2B和表1)。
表1
与基线相比发作时差异性表达的基因 FDR<0.1 2613个基因
发作期间增加的基因 logFC>0 1437个基因
途径分析确定了骨髓、中性粒细胞、Fc受体信号传导和血小板活化的富集(图2C和表2)，与发作期间的临床血细胞计数测量一致(图14)。有趣的是，1176个基因在发作期间显著减少，这些基因的途径分析富集在胞外基质、胶原蛋白和结缔组织的发育上(图2D和表2)。
导致RA发作的分子事件的时间序列分析
为了分析基因表达随时间推移的轨迹并确定发作的潜在前因，我们对RNAseq数据进行了时间序列分析(图3A)值得注意的是，发作前几周的疾病活动分数与发作前两个月的基线分数相同，强调了识别发作前的时间框架和基因表达特征的挑战。我们聚焦于发作前8周和发作开始后4周采集的65个样品的分析，根据抽取样品的周数对样品进行分类。这确定了2791个基因随时间推移到发作具有显著差异性表达(FDR<0.05)，并且基因表达的层次聚类确定了五个簇(图3B和表3)。
表3
差异性表达的基因
分析了27,775个基因 随着时间推移到发作2,791个基因具有显著差异性表达(FDR<0.5)
聚类1代表在症状出现后增加的一组基因(图3C和10D)并且与在发作相对于基线分析中增加(图2B)的基因高度重叠(图3E)。这些基因表达聚类在5个独立的临床发作事件中发生了可重复的改变(图15)。
我们进一步关注在发作之前差异性表达的两个聚类(图3C-D)。前因聚类2(AC2)转录物在发作前两周增加，并富集于原初B细胞和白细胞的发育途径。对RNAseq数据进行去卷积的另外两种手段CIBERSORTx和ABIS独立证实了B细胞和T细胞群先于发作的证据，并且所有分析都显示了发作期间先天炎症特征(中性粒细胞和单核细胞)的证据(图16-17)。
前因聚类3(AC3)转录物在发作前一周增加，然后在发作期间减少(图3C和D)。AC3富集在血液样品中不典型的途径，包括软骨形态发生、软骨内骨生长和胞外基质组织(图3E和表4)，表明存在未表征的细胞类型，间充质细胞。
表4
RA发作中滑膜细胞标志物基因的时间序列分析
为了更好地表征时间序列分析确定的聚类与滑膜炎的相关性(图3C)，我们检查了它们在scRNAseq表征的滑膜细胞亚型中的富集。对5265个单个RA和骨关节炎患者滑膜细胞的分析确定了四个成纤维细胞、四个B细胞、六个T细胞和四个单核细胞亚群(图4A)。我们确定了最能区分18种滑膜细胞类型的大约200个标志物基因。AC2与原初B细胞基因富集(图4A和图17)，以及AC3与三种下层成纤维细胞基因富集(CD34+、HLA-DR+和DKK3+)(图4A)。其中两个成纤维细胞亚群，CD34+和HLA-DR+，在发炎的滑膜中有更大丰度(20)。我们绘制了随时间推移滑膜下成纤维细胞和AC3共有的转录物的表达，并再次注意到它们在发作前一周在血液中增加的表达，而在发作期间减少的表达(图4B，图18和表5)。
总体而言，625个AC3基因中的622个在患者1的发作期间减少，并且一个子集(194个基因)在4名RA患者中至少3名的发作中也减少(4名患者中的4名22个基因；图4C和表6)，以及置换测试表明这种重叠的偶然大于预期(p＝0.0001)。具有194个重叠基因的子集的途径分析再次富集了胞外基质和分泌的糖蛋白。
我们通过流式细胞术进一步测试了在RA血液中是否可检测到表达滑膜成纤维细胞表面标志物的细胞(图19和20)。相对于健康对照，CD45-/CD31-/PDPN+细胞在另19个RA患者血液中增加(图4D)。这些细胞的RNAseq证实它们富含AC3聚类基因(图4E)、滑膜成纤维细胞基因(图21)，并表达经典的滑膜成纤维细胞基因(如FAP、DKK3、CDH11)以及胶原蛋白和层粘连蛋白(图22)。考虑到它们对经典间充质表面标志物和基因的表达，我们将它们称为炎症前间充质细胞(PRIME细胞)。综上所述，我们的观察结果表明了一个模型，其中B细胞的连续活化会在发作前即刻活化PRIME细胞，然后在发炎的滑膜中作为炎性下层成纤维细胞在发作时是很明显的(图5)。
讨论
我们将纵向基因组学作为一种策略来研究RA发作的前因，该策略可以推广到与欺负的临床病程相关联的自身免疫性疾病。多年来，我们为患者开发了易于使用的工具，以在家中获取可量化的临床症状和分子数据。这使我们能够在临床发作发生前捕获数据并对其进行回顾性分析，识别在发作发生前1-2周外周血中明显的不同的RNA特征(AC2和AC3)。
AC3和分选的CD45-/CD31-/PDPN+循环细胞的RNA特征揭示了包括软骨形态发生、软骨内骨生长和胞外基质组织在内的途径的富集(图3E)，并与滑膜下层成纤维细胞强烈重叠。因此，我们提出先行PRIME细胞是炎症下层成纤维细胞的前体，其先前在发炎的RA滑膜中的血管附近被发现(21)。
重要的是，发炎的下层成纤维细胞在关节炎动物模型中具有致病性(22)。我们发现人类AC3基因具有下层成纤维细胞的分子特征，以及观察到这些细胞在发作前出现峰值但在发作期间在血液中不易检测到(图2和4)，这支持了一个模型，其中PRIME细胞从血液中急性迁移到滑膜，它们在此处促进炎症过程(图5)。该模型与RA滑膜成纤维细胞可以运输到软骨植入物并且足以被动转移滑膜炎症(小鼠中)的观察结果一致(23)。我们的数据共同表明，发作之前在AC3中检测到的间充质信号代表了一种先前未表征的在血液中循环的运输成纤维细胞类型。
此外，我们观察到第二个RNA特征，AC2，在AC3峰值之前在血液中被活化。AC2具有原初B细胞的RNA特征。这一发现让人想起最近的研究，证明自身反应性原初B细胞在RA患者中被特异性活化(24)。虽然这些触发因素未知，但传染性(例如细菌或病毒抗原)、环境或内源性毒素(25-27)可以提供特异性抗原或活化模式识别受体的来源。
总之，我们展示了密集收集纵向临床和基因表达数据的方法，这些数据可用于发现症状发作前几周血液中转录谱特征的变化。这种方法导致了PRIME细胞的发现，它带有滑膜成纤维细胞的特征，在RA患者中更常见，并在疾病发作前在血液中增加。在对我们的所有数据进行建模时(图5)，我们提出在临床发作之前，全身B细胞免疫激活(检测为AC2)作用于PRIME细胞，这些细胞进入血液(检测为AC3)，随后在疾病活动发作期间进入滑膜下层.。更一般的，RA中的这项工作提供了一个起伏不定的炎症性疾病方法的示例，提出了与狼疮、多发性硬化症和血管炎等其他疾病相关的一般策略。
上文所引用的表2、5和6提供如下：
表2
对比基线在发作时差异性表达基因的途径分析
参考文献
1.Steinman L.多发性硬化症的复发和缓解的免疫学(Immunology of relapseand remission in multiple sclerosis).Annu Rev Immunol 2014；32:257-81.
2.Fava A,Petri M.系统性红斑狼疮：诊断和临床管理(Systemic lupuserythematosus:Diagnosis and clinical management).J Autoimmun 2019；96：1-13。
3.Braun J,Wei B.身体的交通：炎性肠病的生态学、遗传学和免疫学(Bodytraffic:ecology,genetics,and immunity in inflammatory bowel disease).Annu RevPathol 2007；2:401-29。
4.Braun J、Baraliakos X、Listing J等。暴露于抗肿瘤坏死因子α药物治疗的强直性脊柱炎患者的发作或新发炎性肠病发生率的差异(Differences in the incidenceof flares or new onset of inflammatory bowel diseases in patients withankylosing spondylitis exposed to therapy with anti-tumor necrosis factoralpha agents).Arthritis Rheum 2007；57:639-47.
5.Sellam J，Marion-Thore S，Dumont F等.使用全血转录组学概况来突出与类风湿性关节炎患者对利妥昔单抗的反应相关的几种病理生理途径：来自随机、对照、开放标签试验的数据(Use of whole-blood transcriptomic profiling to highlight severalpathophysiologic pathways associated with response to rituximab in patientswith rheumatoid arthritis:data from a randomized,controlled,open-labeltrial).Arthritis Rheumatol 2014；66:2015-25
6.Sanayama Y,Ikeda K,Saito Y,等.预测类风湿性关节炎患者对托珠单抗的治疗反应：通过使用全基因组DNA微阵列分析外周血单个核细胞中的基因表达鉴定的生物标志物(Prediction of therapeutic responses to tocilizumab in patients withrheumatoid arthritis:biomarkers identified by analysis of gene expression inperipheral blood mononuclear cells using genome-wide DNA microarray).Arthritis Rheumatol 2014；66:1421-31.
7.Tanino M,Matoba R,Nakamura S,等.使用白细胞的综合转录组分析预测抗TNF生物制剂英夫利昔单抗对类风湿性关节炎患者的疗效(Prediction of efficacy ofanti-TNF biologic agent,infliximab,for rheumatoid arthritis patients using acomprehensive transcriptome analysis of white blood cells).Biochem BiophysRes Commun 2009；387:261-5.
8.Teixeira VH,Olaso R,Martin-Magniette ML,等.描述类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞中新免疫和防御基因的转录组分析(Transcriptome analysisdescribing new immunity and defense genes in peripheral blood mononuclearcells of rheumatoid arthritis patients).PLoS One 2009；4:e6803.
9.Zhang YJ,Ioerger TR,Huttenhower C,等.结核分枝杆菌生长所需基因组区域的全面评估(Global assessment of genomic regions required for growth inMycobacterium tuberculosis).PLoS Pathog 2012；8:e1002946.
10.Aletaha D,Neogi T,Silman AJ,等.类风湿关节炎分类标准：美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟2010合作倡议(2010Rheumatoid arthritis classificationcriteria:an American College of Rheumatology/European League AgainstRheumatism collaborative initiative).Arthritis Rheum 2010；62:2569-81.
11.Aletaha D,Neogi T,Silman AJ,等.类风湿关节炎分类标准：美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟2010合作倡议(2010Rheumatoid arthritis classificationcriteria:an American College of Rheumatology/European League AgainstRheumatism collaborative initiative).Ann Rheum 2010；69:1580-8.
12.Pincus T,Swearingen CJ,Bergman M,Yazici Y.RAPID3(患者索引数据常规评估3)，一种类风湿性关节炎指标，没有用于常规护理的正式关节计数：建议的严重程度类别与疾病活动分数和临床疾病活动指数类别相比(RAPID3(Routine Assessment ofPatient Index Data 3),a rheumatoid arthritis index without formal jointcounts for routine care:proposed severity categories compared to diseaseactivity score and clinical disease activity index categories).JRheumatol2008；35:2136-47.
13.Robison EH,Mondala TS,Williams AR,Head SR,Salomon DR,Kurian SM.指尖血液样品的全基因组转录物分析：比较和可行性研究(Whole genome transcriptprofiling from fingerstick blood samples:a comparison and feasibility study).BMC Genomics 2009；10:617.
14.Ritchie ME,Phipson B,Wu D等.limma为RNA测序和芯片研究提供差异性表达分析的能力(limma powers differential expression analyses for RNA-sequencingand microarray studies).Nucleic Acids Res 2015；43:e47.
15.Fischer DS,Theis FJ,Yosef N.基于脉冲模型的时间历程测序数据差异性表达分析(Impulse model-based differential expression analysis of time coursesequencing data).Nucleic Acids Res 2018；46:e119.
16.Bourgon R,Gentleman R,Huber W.独立过滤提高了高通量实验的检测能力(Independent filtering increases detection power for high-throughputexperiments).Proc Natl Acad Sci U S A 2010；107:9546-51.
17.Monaco G,Lee B,Xu W,等.以mRNA丰度为标准的RNA-Seq特征允许对人类免疫细胞类型进行绝对去卷积(RNA-Seq Signatures Normalized by mRNA Abundance AllowAbsolute Deconvolution of Human Immune Cell Types).Cell Rep 2019；26:1627-40e7.
18.Newman AM,Steen CB,Liu CL等.用数字细胞仪确定大量组织中细胞类型的丰度和表达(Determining cell type abundance and expression from bulk tissueswith digital cytometry).Nat Biotechnol 2019；37:773-82.
19.Love MI,Huber W,Anders S.用DESeq2对RNA-seq数据的倍数变化和离散度进行适度估计.Genome Biol 2014；15:550.
20.Zhang F,Wei K,Slowikowski K等.通过整合单细胞转录组学和质量细胞学定义类风湿性关节炎关节滑膜组织中的炎症细胞状态(Defining inflammatory cellstates in rheumatoid arthritis joint synovial tissues by integrating single-cell transcriptomics and mass cytometry).Nat Immunol 2019；20:928-42.
21.Mizoguchi F,Slowikowski K,Wei K等.类风湿性关节炎中功能不同的疾病相关成纤维细胞亚群(Functionally distinct disease-associated fibroblast subsetsin rheumatoid arthritis).Nat Commun 2018；9:789.
22.Croft AP,Campos J,Jansen K等.不同的成纤维细胞亚群驱动关节炎的炎症和损害(Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage inarthritis).Nature 2019；570:246-51.
23.Lefevre S,Knedla A,Tennie C,等.滑膜成纤维细胞将类风湿性关节炎扩散到未受影响的关节(Synovial fibroblasts spread rheumatoid arthritis tounaffected joints).Nat Med 2009；15:1414-20。
24.Lu DR,McDavid AN,Kongpachith S等.T细胞依赖性亲和力成熟和先天免疫途径不同程度地驱动类风湿性关节炎的自体B细胞反应(T Cell-Dependent AffinityMaturation and Innate Immune Pathways Differentially Drive Autoreactive BCell Responses in Rheumatoid Arthritis).Arthritis Rheumatol 2018；70:1732-44.
25.Mikuls TR,Payne JB,Yu F等.类风湿性关节炎患者的牙周炎和齿龈卟啉单胞菌(Periodontitis and Porphyromonas gingivalis in patients with rheumatoidarthritis).Arthritis Rheumatol 2014；66:1090-100.
26.Konig MF,Abusleme L,Reinholdt J等.放线菌诱导的高钙化将牙周感染与类风湿性关节炎的自身免疫联系起来(Aggregatibacter actinomycetemcomitans-inducedhypercitrullination links periodontal infection to autoimmunity in rheumatoidarthritis).Sci Transl Med 2016；8:369ra176.
27.Eriksson K,Nise L,Alfredsson L,等.血清阳性合并吸烟与类风湿性关节炎患者的牙周炎患病率增加有关(Seropositivity combined with smoking is associatedwith increased prevalence of periodontitis in patients with rheumatoidarthritis).Ann Rheum Dis 2018；77:1236-8.
实施例2
AC2和AC3基因和PRIME细胞标志物
RNA和标志物
如上所述，对来自RA患者的指刺血样品进行RNA分析已经确定了适合作为RA发作标志物的RNA。第一组标志物和RNA，表示为AC2，在发作前2周增加。AC2 RNA富集于原初B细胞和白细胞的发育途径。第二组标志物，表示为AC3，在发作前一周增加，然后在发作期间降低。AC3富集于血液样品中不典型的途径，具体是软骨形态发生、软骨内骨生长、胞外基质组织。AC3富集于下层成纤维细胞基因(CD34+HLADR+DKK3+)。AC2标志物列于下文表7中。AC3标志物列于下文表8中。
表7
AC2基因
表8AC3基因
下文的表9中列出了选定的和优选的即将发生的发作的AC3 RNA标志物，基于它们的分数和与下层成纤维细胞的相关性。这些标志物具体是为确定和预测即将发生的RA发作而选择的。标志物选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4。
这些标志物包括几个胶原蛋白α链亚基的基因，包括COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1和COL4A2，具体如下：COL1A2胶原蛋白α-2(I)链。该基因编码I型胶原蛋白的α2(pro-a2(1))链成分，是大多数结缔组织中发现的纤维状胶原蛋白；COL5A1 V型胶原蛋白α1链是V型胶原蛋白的成分，是一种低丰度的纤维状胶原蛋白；COL16A1胶原蛋白α-1(XVI)链。该基因编码XVI型胶原蛋白的α链，是FACIT胶原蛋白家族(具有中断螺旋的纤维相关的胶原蛋白)的成员。XVI型胶原蛋白是一种形成纤维的胶原蛋白，能维持细胞外基质的完整性；COL14A1胶原蛋白α-1(XIV)链是在人类中由COL14A1基因编码的一种蛋白质。它可能在胶原蛋白结合和细胞-细胞粘附中起作用；COL4A2 COL4A2基因编码IV型胶原蛋白的α-2链。IV型胶原蛋白与层粘连蛋白、巢蛋白和硫酸类肝素蛋白多糖相关联，形成将上皮与结缔组织分开的片状基底膜。
其他标志物是PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4。PXDN(过氧化物酶)是一种含血红素的过氧化物酶，分泌到胞外基质中，参与胞外基质的形成。ST5(致瘤性5蛋白的抑制)，也叫含DENN结构域2B。这个基因是通过其抑制Hela细胞在裸鼠体内的致瘤性的能力来确定的。该基因编码的蛋白含有一个C端区域，与Rab 3家族的小GTP结合蛋白有相似性。该蛋白质优先与c-Abl激酶的SH3结构域结合，并作为MAPK1/ERK2激酶的调节剂，这可能有助于其降低细胞的致瘤表型的能力。可能参与细胞骨架组织和致瘤性。DCLK1(双肾上腺皮质激素样激酶1(Doublecortin Like Kinase 1))是一种微管相关的蛋白激酶--一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。双肾上腺皮质激素样激酶1已被确定为小肠中的簇状细胞标志物，并被报道为肠道和胰腺中肿瘤干细胞的标志物。SCARA5(清道夫受体A类，成员5)参与间充质干细胞向脂肪细胞的细胞系定型和分化。EGFR对应于表皮生长因子受体，是一种诱导细胞分化和增殖的细胞跨膜蛋白。改变和过度表达与多种癌症相关。已经开发了许多EGFR抗体，包括特异性中和抗体，并且正处于癌症应用的临床开发或临床实践中。EGR1(早期生长反应蛋白1)——也称为ZNF268(锌指蛋白268)或NGFI-A(神经生长因子诱导蛋白A)。EGR-1是一种哺乳动物转录因子。EGR-1是一种机械敏感的转录因子，可刺激IGF-1R转录，导致静脉移植物的血管重塑。早期生长反应蛋白1是一种转录因子，可由生长因子、细胞因子和胁迫信号(如辐射、损伤或机械胁迫)快速诱导。ZFHX4(锌指同源框4)预测具有RNA聚合酶II近端启动子序列特异性DNA结合活性。RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子的活性。
值得注意的是，表9中提供的所有标志物也列在上面的表5中，该表提供了滑膜下层成纤维细胞和AC3的共同转录物。表5还包括α胶原链基因COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6。COL3A2对应的是III型胶原蛋白α1链。COMP(软骨低聚物基质蛋白)可以介导软骨细胞与软骨细胞基质的相互作用，并可能通过与其他细胞基质蛋白如胶原蛋白和纤连蛋白的相互作用在软骨的结构完整性中起作用。FNDC1(含纤连蛋白III型结构域1)有替代名称激活化相关的cDNA蛋白和表达于滑膜蛋白，是G蛋白信号的激活剂。GALNT15(多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶15)是一种膜结合的多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶，在高尔基体中催化多肽的粘蛋白型O-糖基化的第一个步骤。SULF1(硫酸酯酶1)是一种细胞外硫酸肝素内切酶。该酶通过高尔基体分泌，随后定位于细胞表面，并选择性地去除硫酸肝素蛋白多糖链上的6-O-硫酸盐基团。GPX8(谷胱甘肽过氧化物酶8)是一种蛋白质二硫化物异构酶，参与细胞对氧化应激的反应，减少H2O2含量和ER的氧化应激。IGFBP6(胰岛素样生长因子结合蛋白6)能与胰岛素样生长因子和纤维蛋白结合，并被证明能调节IGF对细胞培养的生长促进作用。
PRIME细胞
这些在血液中被确定为RA发作指标的不寻常的RNA，具体是AC3的RNA，在血液样品中确定了一种独特的细胞，称为炎症前间充质细胞(PRIME细胞)。这些细胞的RNA测序证实它们富含AC3聚类基因、滑膜成纤维细胞基因，并表达经典的滑膜成纤维细胞基因(如FAP、DKK3、CDH11)以及胶原蛋白和层粘连蛋白。PRIME细胞在发作前即刻被活化，然后在发作时在发炎的滑膜中作为炎症下层纤维细胞变得明显。
本文确定和描述的PRIME细胞的细胞表面标志物是PDPN+、CD45-和CD31-。PRIME细胞可以被分类或表征为CD45-,CD31-PDPN+细胞。另外，细胞表面受体和标志物IL17RD+也可以用来区分、识别和表征PRIME细胞。IL17RD是一个AC3基因标志物(见上文表3)。CD45和CD31经常出现在血液中的细胞上，因此缺乏这两个特异性标志物的血细胞是不正常的。CD45是一种具有酪氨酸磷酸酶活性的泛白细胞蛋白，参与调节造血的信号转导。CD45也被称为蛋白酪氨酸磷酸酶，受体类型，C(PTPRC)。CD45最初被命名为白细胞共同抗原，反映了它在白细胞上的普遍表达。CD31代表血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1)。这种分子在清除体内老化的中性粒细胞方面起着关键作用，它存在于血小板、单核细胞、中性粒细胞和某些类型的T细胞表面。
相反，PDPN-以及IL17RD在在细胞群(尤其是血液中的CD45-和CD31-细胞)表面的出现是不寻常的。PDPN(平足蛋白(Podaplanin))是一种保守的粘液蛋白型跨膜蛋白，并在人体组织中具有重度的O型糖基化，分布广泛。平足蛋白与C型凝集素受体-2(CLEC-2)结合，与几种类型的癌症的恶性进展和肿瘤转移有关。抗平足蛋白抗体已被评估并显示对LPS诱导的肺损伤有效(Lax S等(2017)BMJ Open Respiratory Res 4:e000257.doi:10.11361/bmjresp-2017-000257)。平足蛋白抗体已在肺转移和恶性间皮瘤中被研究(Kato Y(2015)Oncotarget 6(34)：36003-36018；Abe S等人(2013)J Immunol 190(12)：6239-6249)。
IL17RD(IL-17受体D)是IL-17受体家族的一个膜蛋白，是成纤维细胞生长因子介导的Ras-MAPK信号传导和ERK活化的反馈回路抑制剂。IL17RD与IL-17A结合，介导IL-17A下游的促炎症基因表达。
针对IL-17细胞因子及其受体的抗体正被用于治疗一些自身免疫性疾病。在RA中，IL-17A局部作用于滑膜细胞和成骨细胞，导致滑膜炎和关节破坏，虽然在银屑病和银屑病关节炎中出现了一些积极的结果，但在RA中以IL-17为靶点的生物制剂的结果参差不齐，强调需要确定IL-17生物制剂等疗法有效的患者或临床/生物场景(Robert M和Miossec P(2019)Front Med 5：364；doi：10.3389/fmed.2018.00364；Fragoulis GE等(2016)Ann RevMed 67:337-353)。基于RNA标志物和/或PRIME细胞分析，靶向IL-17或IL17D可能是治疗RA的一个更有效的方法，具体是如果在识别到即将发作的时候可以实施给药。
在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明可以以其他形式体现或以其他方式实施。因此，本公开内容应被视为在所有方面的说明，而不是限制性的，本发明的范围由所附的权利要求书指明，所有同等意义和范围内的变化都包含在其中。
本说明书中引用了各种参考文献，其中每一条都通过引用其全文的形式纳入本文。

Claims (38)

1.一种用于监测和预测患者中类风湿性关节炎(RA)发作或增加的RA疾病活动的方法，包括：
(a)从所述患者分离血液样品；
(b)评估血液样品中一组或多组先行RNA标志物、蛋白质标志物或细胞标志物的表达或定量增量，所述标志物选自：
(i)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物或蛋白质，如表5所列；
(ii)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物或蛋白质，如表9所列；
(iii)AC2标志物或蛋白质，如表7所提供；
(iv)AC3标志物或蛋白质，如表8所提供；以及
(v)细胞标志物CD45-CD31-PDPN+；
(c)其中RNA标志物或蛋白质的表达或定量增量或细胞标志物的存在预示着即将发生的RA发作。
2.根据权利要求1所述的方法，其中AC2 RNA标志物或蛋白质的表达或定量增量预示约2周或约12-14天或最多3周内的RA发作。
3.根据权利要求1所述的方法，其中AC3 RNA标志物或蛋白质的表达或定量增量预示约1周或约5-7天或最多2周内的RA发作。
4.根据权利要求1所述的方法，其中评估具有至少20个AC2或AC3标志物的子集。
5.根据权利要求1所述的方法，其中评估具有至少20个AC2和至少20个AC3标志物的子集。
6.根据权利要求1所述的方法，其中评估具有至少10个AC2或AC3标志物的子集。
7.根据权利要求1所述的方法，其中评估了具有至少10个AC2和至少10个AC3标志物的子集。
8.根据权利要求1所述的方法，其中评估选自AC3标志物或蛋白质的下层成纤维细胞标志物。
9.根据权利要求1所述的方法，其中评估由CD34+，HLADR+和DKK3+细胞表达的AC3标志物或蛋白质。
10.根据权利要求1所述的方法，其中也评估细胞标志物IL17RD。
11.根据权利要求1所述的方法，其中通过RT PCR评估RNA表达。
12.根据权利要求1所述的方法，其中使用特异性抗体评估蛋白质表达。
13.根据权利要求1所述的方法，其中使用FAC分析评估细胞标志物。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述先行RNA标志物或蛋白质标志物或选自以下的那些：
(a)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物或蛋白质，如表5所列；
(b)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物或蛋白质，如表9所列；以及
(c)AC3标志物或蛋白质，如表8所提供；以及
在RA发作或一旦患者表现出RA发作的症状时，在外周血中减少、显著减少、几乎不存在或不存在。
15.一种用于预测即将发生的RA发作和治疗患者发作的方法，该方法包括：
a)从患者分离血液样品；
b)使血液样品与对选自一组RNA或蛋白质标志物的标志物具有特异性的试剂接触，以评估RNA或蛋白质标志物的表达，其中该组RNA或蛋白质标志物选自：
(i)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物或蛋白质，如表5所列；
(ii)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物或蛋白质，如表9所列；
(iii)AC2标志物或蛋白质，如表7所提供；以及
(iv)AC3标志物或蛋白质，如表8所提供；
c)将血液样品中选自一组RNA或蛋白质标志物的标志物的表达与对照血液样品中该标志物的表达进行比较，以确定选自一组RNA或蛋白质标志物的标志物在血液样品中的表达相对于对照血液样品中的表达是否增加，其中增加的表达的检测用于预测患者中即将发生的RA发作；
并通过给予治疗有效量的一种或多种治疗RA的疾病调控剂来治疗由此诊断为即将发生RA发作的患者。
16.根据权利要求15所述的方法，其中通过RT PCR评估RNA表达。
17.根据权利要求15所述的方法，其中使用特异性抗体评估蛋白质表达。
18.根据权利要求15所述的方法，其中AC2 RNA标志物或蛋白质的表达或定量增量预测约2周或约12-14天或最多3周内的RA发作。
19.根据权利要求15所述的方法，其中选自以下的RNA或蛋白质标志物的表达或定量增量：
(a)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物或蛋白质；
(b)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物或蛋白质；以及
(c)AC3 RNA标志物或蛋白质；
预测在约1周或约5-7天或约2周内出现RA发作。
20.根据权利要求15所述的方法，其中用于治疗RA的疾病调控剂是选自非甾体抗炎药(NSAID)、类固醇、甲氨蝶呤、疾病调控抗风湿药物(DMARD)、生物DMARD和经口janus激酶(JAK)抑制剂的一种或多种试剂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中DMARD选自甲氨蝶呤(Trexall，Otrexup)、来氟米特(Arava)、羟氯喹(Plaquenil)和柳氮磺胺吡啶(Azulfidine)。
22.根据权利要求20所述的方法，其中生物DMARD选自阿巴西普(Orencia)、阿达木单抗(Humira)、阿那白滞素(Kineret)、巴利替尼(Olumiant)、赛妥珠单抗(Cimzia)、依那西普(Enbrel)、戈利木单抗(Simponi)、英夫利昔单抗(Remicade)、利妥昔单抗(Rituxan)、萨里单抗(Kevzara)、托珠单抗(Actemra)和托法替尼(Xeljanz)。
23.根据权利要求20所述的方法，其中生物DMARD是肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂。
24.根据权利要求20所述的方法，其中生物DMARD与NSAID和/或甲氨蝶呤组合。
25.根据权利要求20所述的方法，其中所述JAK抑制剂选自托法替尼(Xeljanz和Xeljanz XR)、巴利替尼(Olumiant)和阿帕西替尼(Rinvoq)。
26.根据权利要求15所述的方法，其中用于治疗RA的疾病调控剂是IL-17抗体或IL17RD阻断性抗体。
27.一种被表征为CD45-CD31-PDPN+细胞的循环的炎症前间充质(PRIME)细胞，其中该细胞在外周血中的存在指示或预示即将发生的RA发作。
28.根据权利要求27所述的PRIME细胞，其另外表达IL17RD并且是IL17RD+。
29.一种预测即将发生的RA发作的方法，包括评估来自患者的血液样品中是否存在表征为CD45-CD31-PDPN+细胞的PRIME细胞，其中患者外周血中可检测的PRIME细胞的存在预测在患者体内即将发生的RA发作。
30.根据权利要求29所述的方法，进一步评估CD45-CD31-PDPN+细胞上IL17RD的存在。
31.一种评估和治疗RA患者中即将发生的发作的方法，包括评估患者外周血中是否存在表征为CD45-CD31-PDPN+IL17RD+细胞的PRIME细胞，并对外周血中PRIME细胞呈阳性的患者用治疗RA的疾病调控剂进行治疗。
32.根据权利要求31所述的方法，其中患者用IL-17或IL-17RD抗体治疗。
33.根据权利要求32所述的方法，其中患者进一步用抗炎剂和/或免疫调控剂治疗。
34.一组用于评估和预测患者即将发生的RA发作的RNA或蛋白质标志物，包括选自以下的标志物：
(i)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1、ZFHX4、COL3A1、COMP、FNDC1、GALNT15、SULF1、GPX8和IGFBP6的标志物，如表5所列；
(ii)选自COL1A2、COL5A1、COL16A1、COL14A1、COL4A2、PXDN、ST5、DCLK1、SCARA5、EGFR、EGR1和ZFHX4的标志物，如表9所列；
(iii)具有表7中提供的AC2标志物中的至少20个标志物的子集；以及
(iv)具有表8中提供的AC3标志物中的至少20个标志物的子集。
35.根据权利要求34所述的标志物组，其中具有AC2标志物的子集包括原初B细胞基因标志物以及原初B细胞和白细胞发育途径的标志物。
36.根据权利要求34所述的标志物组，其中具有AC3标志物的子集包括软骨形态发生、软骨内骨生长、胞外基质组织和下层成纤维细胞的标志物。
37.用于预测即将发生的RA发作的系统或试剂盒，其包括权利要求34的一组标志物或用于评估权利要求34的一组标志物的一组探针和/或抗体。
38.根据权利要求37所述的系统或试剂盒，其进一步包括用于通过指刺采血来采集患者血液的器具。
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