CN116973436A - 组织中含邻二酚羟基官能团化合物的质谱成像检测方法 - Google Patents

组织中含邻二酚羟基官能团化合物的质谱成像检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种组织中含邻二酚羟基官能团化合物的质谱成像检测方法及其应用，属于质谱检测技术领域。所述方法至少包括：溶液中合成衍生化试剂，将衍生化试剂溶液喷涂到制备的组织切片表面，得到邻二酚羟基官能团化合物的衍生化产物；将衍生化后的组织切片进行基质喷涂，然后进行MALDI质谱成像分析。本发明能够有效提高组织中含邻二酚羟基官能团化合物的检测灵敏度，实现生物组织中含邻二酚羟基官能团化合物，如内源代谢物和外源药物的可视化分析，因此具有良好的实际推广应用价值。

Description

组织中含邻二酚羟基官能团化合物的质谱成像检测方法
技术领域
本发明属于质谱检测技术领域，涉及一种可在正离子模式下高灵敏检测生物组织中含邻二酚羟基官能团化合物的MALDI质谱成像方法及其应用
技术背景
酚羟基是药物小分子中最常见的官能团之一，传统中药活性成分黄酮类化合物、多酚类化合物大多含有多个酚羟基基团。近年来的大量的体内和体外研究表明这些化合物具有较强的抗氧化活性，由于它们同时具有其他药理作用且毒副作用很小，表现出极强的抗氧化药物发展潜力。
如绿原酸多酚类的一种，被大家公认为天然抗氧化神物，一些抗氧化的保健品主要成分的就是绿原酸。经研究人员发现，绿原酸可以减少视网膜神经细胞因缺氧或过多的一氧化碳所引起的细胞凋零。由于绿原酸可以减少视网膜细胞死亡，因此绿原酸具有预防因视网膜退化而引起的病变。槲皮素是黄酮类化合物的代表，被证明具有促进海马前提细胞的增值和神经发生的能力。又如，丹参素是丹参中水溶性有效成份，具有明显的药理活性，包括心肌保护、抑制血栓形成、降血脂、降尿酸、神经保护、防治肝纤维化及抗肿瘤、抗炎和增强免疫等作用。丹参素异丙酯是从复方丹参方的众多代谢产物中筛选出的效应成分,具有显著的抗脑缺氧和脑缺血作用。这些含酚羟基官能团化合物通过酚羟基与氧自由基反应生成较稳定的半醌式自由基，起到抗氧化作用。对这种机制的结构-活性关系研究发现，邻位酚羟基结构的抗氧化活性最强。邻位酚羟基被抽氢产生自由基后可借助形成分子内氢键得到稳定。
另一类重要的含邻二酚羟基基团的内源性小分子是单胺类神经递质，它们是一类内源性中枢神经递质，在神经元胞体内由芳香族氨基酸羟化而生成，分子结构中含有邻二酚羟基基团。沿微管或微丝在轴突内向神经末梢传输，存贮在神经末梢的囊泡中。神经元兴奋时，神经冲动传至神经末梢，囊泡破裂，它就被释放到突触间隙。其中大部分扩散到突触后膜，与那里的受体结合，产生神经信息细胞间传递的生物效应。
目前组织匀浆后结合LC-MS分析已证实这些药效化合物和内源性神经递质在脑脊液和脑组织中有分布。目前，我们对这类药效化合物和内源性神经递质组织定位的大部分知识来自全身放射自显影或组织匀浆后的LC-MS分析。然而大多数药效化合物和内源性神经递质在组织中分布不均匀，表征药效化合物的组织分布是药物开发的关键。
基于激光解吸附电离(matrix-assisted laser desorption/ionization,MALDI)质谱成像技术可以生成具有近细胞分辨率的像素化质谱数据，并根据组织切片上的XY位置提供代谢物和药物的空间映射，已被用于测量和可视化代谢物和药物的组织空间分布。然而，羟基基团的反应活性较低，在组织样品中对这类低丰度和/或难以电离的小分子药物进行质谱成像分析仍具有挑战性。通过化学衍生化引入特异性识别基团与质谱增敏基团可以实现含邻二酚羟基化合物识别和有效提升质谱检测灵敏度。目前尚无用于邻二酚羟基化合物组织原位质谱成像分析的商品化的衍生化试剂。Kaya等人合成了一种含吡啶鎓的硼酸分子，4-(N-Methyl)pyridinium Boronic Acid，通过硼酸酯形成(硼酸-二醇反应)衍生化含邻二酚羟基的单胺类神经递质。具体合成步骤：首先，在惰性氮气气氛下，将155mg 4-吡啶基硼酸频哪醇酯(0.81mmol)溶解在15mL无水乙腈中；加入0.26mL甲基碘(4.1mmol)，将溶液加热至80℃保持6h。减压除去乙腈。将黄色中间体溶解在10mL水中，加入1M盐酸(2mL)，并在室温下搅拌1h。1小时后，用四氢呋喃洗涤水相以除去频哪醇。该衍生化试剂分子合成步骤较多，用时较长，合成后需从合成体系中分离纯化4-(N-Methyl)pyridinium BoronicAcid，用于衍生化。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明目的在于提供一种组织中含邻二酚羟基官能团化合物的质谱成像检测方法。本发明合成了一种衍生化试剂，可应用于原位衍生化含邻二酚羟基团的化合物的MALDI质谱成像，显著提高了组织中含邻二酚羟基团化合物的检测灵敏度，实现生物组织中含邻二酚羟基官能团的内源代谢物和外源药物的可视化分析。衍生化试剂合成方法：利用吡喃鎓盐的氧鎓离子与氨甲基苯硼酸盐酸盐的伯胺反应合成N-烷基吡啶鎓衍生物吡啶鎓-甲基苯硼酸，合成在甲醇水溶液中进行，反应立即完成，无需加热和长时间搅拌，只需加入少量有机碱作为氧化剂。且无需将合成的吡啶鎓-甲基苯硼酸从合成溶液体系中分离纯化，可直接讲合成溶液体系喷洒在组织切片表面，用于含邻二酚羟基官能团化合物的质谱成像检测。
本发明的技术方案：
本发明第一部分，提供一种组织中含邻二酚羟基官能团化合物的质谱成像检测方法，所述方法至少包括：
(a)在溶液中通过吡喃鎓盐的氧鎓离子与氨甲基苯硼酸盐酸盐的伯胺反应生成N-烷基吡啶鎓衍生物吡啶鎓-甲基苯硼酸；
(b)将衍生化试剂喷涂到组织切片表面，进行衍生化反应，通过含邻二酚羟基官能团化合物的邻二酚羟基与硼酸形成硼酸酯五元环，将吡啶鎓-甲基苯硼酸的永久正电荷转移到含邻二酚羟基官能团化合物上，得到含邻二酚羟基官能团化合物的衍生化产物；
(c)将上述衍生化处理后的组织切片进行基质喷涂，得到可用于质谱成像的组织切片样品；
(d)采用激光解吸附离子源(MALDI)采集衍生化产物的质谱信号，对组织中含邻二酚羟基官能团化合物进行定性，提取衍生化产物的质荷比信息获得质谱成像图。
作为本发明再进一步的方案：所述的溶液中衍生化试剂合成是将吡喃鎓盐溶液和氨甲基苯硼酸盐酸盐溶液混合，加入有机碱催化剂，充分混合，得到衍生化试剂吡啶鎓-甲基苯硼酸溶液；
作为本发明再进一步的方案：吡喃鎓盐的R1到R5可以是氢和取代基甲基、苯基、苯甲基中的一种、两种或三种，取代基数量可以是一个、两个、三个、四个或五个，阴离子为BF4；
作为本发明再进一步的方案：氨甲基苯硼酸盐酸盐可以是3-氨甲基苯硼酸盐酸盐和4-氨甲基苯硼酸盐酸盐中的一种；
作为本发明再进一步的方案：吡喃鎓盐溶液和氨甲基苯硼酸盐酸盐溶液的浓度分别为10～50mM，优选20～30mM，更优选25mM和10～50mM，优选20～30mM，更优选25mM；在混合后的溶液合成体系中吡喃鎓盐和氨甲基苯硼酸盐酸盐的摩尔比为10:1～1:1，优选8:1～2:1，更优选2:1；
作为本发明再进一步的方案：吡喃鎓盐和氨甲基苯基硼酸盐酸盐的溶剂为甲醇的水溶液，优选地，水溶液中甲醇体积浓度为25～100％，进一步优选为甲醇50～75％；
作为本发明再进一步的方案：有机碱催化剂为三乙胺或N，N-二异丙基乙胺中的一种或二种；
作为本发明再进一步的方案：有机碱与溶液合成体系的体积比为1:1000～4:1000；
作为本发明再进一步的方案：衍生化试剂吡啶鎓-甲基苯硼酸溶液于组织切片一侧表面的喷涂量按衍生化试剂溶液中氨甲基苯基硼酸盐酸盐浓度计100～500nmol/cm2，优选150～300nmol/cm2；
作为本发明再进一步的方案：基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)，质量浓度为7～10mg/mL，溶剂为40～60％乙腈水溶液，含有0.1～0.2％三氟乙酸；于组织切片一侧表面的喷涂量0.07～0.35mg/cm2，优选为0.15～0.25mg/cm2；
作为本发明再进一步的方案：选用组织切片为动物组织切片，包括小鼠脑组织切片或大鼠脑组织切片；
作为本发明再进一步的方案：含邻二酚羟基官能团化合物为组织中的含邻二酚羟基内源代谢物和外源药物中的一种或二种以上，包括儿茶酚类神经递质和酚酸、黄酮类药物中的一种或二种以上。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
(1)上述技术方案中所用衍生化试剂合成在溶液体系中完成，操作简单，无需加热和孵育，合成的衍生化试剂无需分离制备，衍生化试剂混合液即可用于衍生化。
(2)衍生化条件温和，反应步骤简单，该反应在非常温和的条件下进行，并在环境温度和压力下迅速发生，无需任何搅拌或搅动，适合于组织原位的含邻二酚羟基官能团化合物衍生化分析，避免组织溶解和目标化合物的离域。
(3)上述技术方法中通过对含邻二酚羟基官能团化合物进行衍生化处理，在其结构中引入永久正电荷，提高含邻二酚羟基官能团化合物MALDI质谱检测灵敏度，实现组织中含邻二酚羟基官能团化合物的原位MALDI质谱成像分析。
(4)上述技术方案有效实现了在正离子条件下，含邻二酚羟基官能团化合物如内源代谢物和外源药物的同时质谱成像可视化分析，具有良好的实际应用价值。
本发明能够有效提高组织中含邻二酚羟基官能团化合物的检测灵敏度，实现生物组织中含邻二酚羟基官能团化合物，如内源代谢物和外源药物的可视化分析，因此具有良好的实际推广应用价值。
说明书附图
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍
图1是本发明实施例1中2,4,6-三甲基吡啶鎓-4-甲基苯硼酸的质谱表征图；
图2是本发明实施例2中多巴胺(A)、丹参素异丙酯(B)、槲皮素(C)和绿原酸(D)的衍生化反应式；
图3a是本发明实施例2中在ITO载玻片上多巴胺(A)、丹参素异丙酯(B)、槲皮素(C)和绿原酸(D)衍生化产物的MALDI质谱数据；
图3b是本发明实施例3中在ITO载玻片上多巴胺(A)、丹参素异丙酯(B)、槲皮素(C)和绿原酸(D)的MALDI质谱数据；
图4是本发明实施例4中小鼠脑组织切片内源性多巴胺质谱成像图；
图5是本发明实施例5中小鼠脑组织切片表面丹参素异丙酯质谱成像图；
图6是本发明实施例6中小鼠脑组织切片表面槲皮素质谱成像图；
图7是本发明实施例7中小鼠脑组织切片表面绿原酸质谱成像图；
具体实施方式
实施例1：2,4,6-三甲基吡啶鎓-4-甲基苯基硼酸合成(1)精密称量21mg的2,4,6-三甲基吡喃鎓四氟硼酸盐，加甲醇水(50:50，v/v)溶液2mL，涡旋混匀，超声5分钟，得到2,4,6-三甲基吡喃鎓四氟硼酸盐(50mM)溶液，备用；
(2)精密称量37.2mg的4-氨甲基苯基硼酸盐酸盐，加甲醇：水(50:50，v/v)溶液4mL，涡旋混匀，超声5分钟，得到4-氨甲基苯基硼酸盐酸盐(50mM)溶液，备用；
(3)取2,4,6-三甲基吡喃鎓盐酸盐溶液和4-氨甲基苯基硼酸盐酸盐溶液各1mL混合，加入2μL三乙胺，涡旋混匀，得到2,4,6-三甲基吡啶鎓-4-甲基苯基硼酸溶液；高效制备液相色谱分离，色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18(100mm×3.0mm,2.7μm)，流动相A水(含体积浓度0.5％甲酸)，流动相B乙腈(含体积浓度0.5％甲酸)，洗脱梯度0～8分钟，2％B～100％B，收集保留时间1.75分钟处色谱峰，得到2,4,6-三甲基吡啶鎓-4-甲基苯基硼酸峰，冻干成粉末，备用；通过LC-ESI-QTOF-MS和MALDI-TOF-MS表征产物，如图1所述，2,4,6-三甲基吡啶鎓-4-甲基苯基硼酸的m/z为256.1531，与理论比率和模式一致。m/z 135.0627的碎片离子由m/z 256.1531离子中性丢失三甲基吡啶鎓产生。
实施例2：多巴胺、丹参素异丙酯、槲皮素和绿原酸的衍生化及MALDI质谱分析
(1)精密称量21mg的2,4,6-三甲基吡喃鎓四氟硼酸盐，加甲醇水(50:50，v/v)溶液2mL，涡旋混匀，超声5分钟，得到2,4,6-三甲基吡喃鎓四氟硼酸盐(50mM)溶液，备用；
(2)精密称量37.2mg的4-氨甲基苯基硼酸盐酸盐，加甲醇：水(50:50，v/v)溶液4mL，涡旋混匀，超声5分钟，得到4-氨甲基苯基硼酸盐酸盐(50mM)溶液，备用；
(3)取2,4,6-三甲基吡喃鎓盐酸盐溶液和4-氨甲基苯基硼酸盐酸盐溶液各1mL混合，加入2μL三乙胺，涡旋混匀，得到2,4,6-三甲基吡啶鎓4-甲基苯基硼酸溶液，备用；
(4)精密称量35mg的CHCA，加乙腈：水(60:40，v/v)溶液5mL，其中含有体积浓度的0.2％三氟乙酸，涡旋混匀，超声5分钟，得到CHCA(7mg/mL)溶液，备用；
(5)分别精密称量1mg多巴胺、丹参素异丙酯、槲皮素和绿原酸标准品，分别用体积浓度50％甲醇水溶液配置成标准品溶液，浓度为1mg/mL，备用。
(6)分别采用干滴法将1uL的多巴胺、丹参素异丙酯、槲皮素和绿原酸标准品溶液(1mg/mL)滴加到ITO载玻片表面约3mm2，间隔1mm，置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(7)使用布鲁克全自动基质喷雾仪ImagePrep，喷雾仓面积约100cm2，将ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面朝上置于喷雾仓正中间，将步骤(3)得到的2,4,6-三甲基吡啶鎓4-甲基苯基硼酸合成溶液喷洒到喷雾仓中，共使用溶液1mL，共分12次喷涂，以合成溶液体系中2,4,6-三甲基吡啶鎓4-甲基苯基硼酸溶液最终喷涂量为500nmol/cm2，每层喷涂后室温自然干燥，最后一层喷涂后，将ITO载玻片置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(8)使用布鲁克全自动基质喷雾仪ImagePrep，喷雾仓面积约100cm2，将ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面朝上置于喷雾仓正中间，将步骤(4)制备的CHCACHCA溶液喷洒到喷雾仓中，共使用溶液5mL，共分20次喷涂，最终CHCA的喷涂量为0.35mg/cm2，每层喷涂后室温自然干燥，最后一层喷涂后，将ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面朝上置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(9)利用布鲁克UltraFlexⅢMALDI-TOF/TOF型质谱仪，在正离子、反射模式下，质荷比检测范围140～1000，对ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面进行质谱分析；
(10)根据多巴胺、丹参素异丙酯、槲皮素和绿原酸的衍生化反应式(图2)，利用布鲁克DataAnalysis提取衍生化产物的质谱信号，m/z分别为373.21、460.23、574.22和522.17。结果如图3a所示，可见当以2,4,6-三甲基吡啶鎓-3-甲基苯基硼酸合成溶液为衍生化试剂、CHCA为基质时，能够得到多巴胺、丹参素异丙酯、槲皮素和绿原酸衍生化产物的质谱信号。
实施例3：多巴胺、丹参素异丙酯、槲皮素和绿原酸的MALDI质谱分析
(1)精密称量35mg的CHCA，加乙腈：水(60:40，v/v)溶液5mL，其中含有体积浓度的0.2％三氟乙酸，涡旋混匀，超声5分钟，得到CHCA(7mg/mL)溶液，备用；
(2)分别精密称量1mg多巴胺、丹参素异丙酯、槲皮素和绿原酸标准品，分别用体积浓度50％甲醇水溶液配置成标准品溶液，浓度为1mg/mL，备用。
(3)分别采用干滴法将1uL的多巴胺、丹参素异丙酯、槲皮素和绿原酸标准品溶液(1mg/mL)滴加到ITO载玻片表面约3mm2，间隔1mm，置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(4)使用布鲁克全自动基质喷雾仪ImagePrep，喷雾仓面积约100cm2，将ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面朝上置于喷雾仓正中间，将步骤(1)制备的CHCA溶液喷洒到喷雾仓中，共使用溶液5mL，分20次喷涂，最终CHCA的喷涂量为0.35mg/cm2，每层喷涂后室温自然干燥，最后一层喷涂后，将ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面朝上置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(5)利用布鲁克UltraFlexⅢMALDI-TOF/TOF型质谱仪，在正离子、反射模式下，质荷比检测范围140～1000，对ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面进行质谱分析；
(10)根据多巴胺、丹参素异丙酯、槲皮素和绿原酸的精确分子量，分别为153.、240.、302.和，利用布鲁克DataAnalysis提取衍生化产物的质谱信号。结果如图3b所示，在不使用衍生化试剂情况下，无多巴胺、丹参素异丙酯、槲皮素和绿原酸的衍生物峰(m/z373.21、460.23、574.22和522.17)，且无多巴胺、丹参素异丙酯、槲皮素和绿原酸的离子峰及其失水峰的响应信号。
实施例4：小鼠脑组织切片内源性多巴胺的衍生化及MALDI质谱成像分析
(1)取冰冻小鼠脑组织，利用切片机制备厚度为14μm的脑组织冠状切片；
(2)将脑组织切片转移到氧化铟锡(ITO)载玻片上，置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(3)精密称量21mg的2,4,6-三甲基吡喃鎓四氟硼酸盐，加甲醇水(50:50，v/v)溶液2mL，涡旋混匀，超声5分钟，得到2,4,6-三甲基吡喃鎓四氟硼酸盐(50mM)溶液，备用；
(4)精密称量18.6mg的4-氨甲基苯基硼酸盐酸盐，加甲醇：水(50:50，v/v)溶液4mL，涡旋混匀，超声5分钟，得到4-氨甲基苯基硼酸盐酸盐(25mM)溶液，备用；
(5)取2,4,6-三甲基吡喃鎓盐酸盐溶液和4-氨甲基苯基硼酸盐酸盐溶液各1mL混合，加入2μL三乙胺，涡旋混匀，得到2,4,6-三甲基吡啶鎓4-甲基苯基硼酸溶液，备用；
(6)精密称量35mg的CHCA，加乙腈：水(60:40，v/v)溶液5mL，其中含有体积浓度的0.2％三氟乙酸，涡旋混匀，超声5分钟，得到CHCA(7mg/mL)溶液，备用；
(7)使用布鲁克全自动基质喷雾仪ImagePrep，喷雾仓面积约100cm2，将ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面朝上置于喷雾仓正中间，步骤(5)得到的2,4,6-三甲基吡啶鎓4-甲基苯基硼酸的合成溶液喷洒到喷雾仓中，共使用溶液1mL，分12次喷涂，以合成溶液体系中2,4,6-三甲基吡啶鎓4-甲基苯基硼酸溶液最终喷涂量为250nmol/cm2，每层喷涂后室温自然干燥，最后一层喷涂后，将ITO载玻片置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(8)使用布鲁克全自动基质喷雾仪ImagePrep，喷雾仓面积约100cm2，将ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面朝上置于喷雾仓正中间，将步骤(6)制备的CHCA溶液喷洒到喷雾仓中，共使用溶液3mL，分12次喷涂，最终喷涂量为0.21mg/cm2，每层喷涂后室温自然干燥，最后一层喷涂后，将ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面朝上置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(9)利用布鲁克UltraFlexⅢMALDI-TOF/TOF型质谱仪，在正离子、反射模式下，质荷比检测范围140～1000，对ITO载玻片上贴附小鼠脑组织切片表面进行质谱分析；
(10)利用布鲁克DataAnalysis提取多巴胺衍生化产物的质谱信号m/z373.21。结果如图4所示，可见当以2,4,6-三甲基吡啶鎓-3-甲基苯基硼酸合成溶液为衍生化试剂、CHCA为基质时，能够得到小鼠脑组织切片中内源性多巴胺衍生化产物的质谱信号(m/z373.21)，小鼠纹状体多巴胺能神经元区域多巴胺衍生物信号较强，无多巴胺能神经元的皮层区无多巴胺衍生物信号。
实施例5：小鼠脑组织切片表面衍生化丹参素异丙酯的质谱成像分析
(1)取冰冻小鼠脑组织，利用切片机制备厚度为14μm的脑组织冠状切片；
(2)将脑组织切片转移到氧化铟锡(ITO)载玻片上，置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(3)精密称量12.8mg的2,4-二苯基吡喃鎓四氟硼酸盐，加甲醇水(50:50，v/v)溶液2mL，涡旋混匀，超声5分钟，得到2,4-二甲基吡喃鎓四氟硼酸盐(20mM)溶液，备用；
(4)精密称量14.9mg的4-氨甲基苯基硼酸盐酸盐，加甲醇：水(50:50，v/v)溶液4mL，涡旋混匀，超声5分钟，得到4-氨甲基苯基硼酸盐酸盐(20mM)溶液，备用；
(5)取2,4-二甲基吡喃鎓四氟硼酸盐溶液和4-氨甲基苯基硼酸盐酸盐溶液各1mL混合，加入2μL三乙胺，涡旋混匀，得到衍生化试剂2,4-二苯基吡啶鎓-4-甲基苯硼酸溶液，备用；
(6)精密称量35mg的CHCA，加乙腈：水(60:40，v/v)溶液5mL，其中含有体积浓度的0.2％三氟乙酸，涡旋混匀，超声5分钟，得到CHCA(7mg/mL)溶液，备用；
(7)精密称量丹参素异丙酯标准品，用50％甲醇水溶液配置成系列浓度标准品溶液，浓度为1.08、0.27、0.055mg/mL，备用；
(8)采用干滴法将0.2uL的丹参素异丙酯系列浓度标准品溶液滴加在同一小鼠脑组织切片表面，每个标准品溶液点占的面积3mm2，间隔1mm，置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(9)(7)使用布鲁克全自动基质喷雾仪ImagePrep，喷雾仓面积约100cm2，将ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面朝上置于喷雾仓正中间，将步骤(5)得到的2,4,6-三甲基吡啶鎓4-甲基苯基硼酸合成溶液喷洒到喷雾仓中，共使用溶液1mL，共分12次喷涂，以合成溶液体系中2,4,6-三甲基吡啶鎓4-甲基苯基硼酸溶液最终喷涂量为200nmol/cm2，每层喷涂后室温自然干燥，最后一层喷涂后，将ITO载玻片置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(10)使用布鲁克全自动基质喷雾仪ImagePrep，喷雾仓面积约100cm2，将ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面朝上置于喷雾仓正中间，将步骤(6)制备的CHCA溶液喷洒到喷雾仓中，共使用溶液1mL，共分4次喷涂，最终喷涂量为0.07mg/cm2，每层喷涂后室温自然干燥，最后一层喷涂后，将ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面朝上置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(11)利用布鲁克UltraFlexⅢMALDI-TOF/TOF型质谱仪，在正离子、反射模式下，质荷比检测范围140～1000，对ITO载玻片上小鼠脑组织切片表面进行质谱分析；
(12)利用布鲁克DataAnalysis提取丹参素异丙酯衍生化产物的质谱信号m/z460.23。结果如图5所示，可见当以2,4,6-三甲基吡啶鎓-3-甲基苯基硼酸合成溶液为衍生化试剂、CHCA为基质时，能够得到丹参素异丙酯衍生化产物的质谱信号m/z460.23，检测限为15pmol/mm2。
实施例6：小鼠脑组织切片表面衍生化槲皮素的质谱成像分析
(1)取冰冻小鼠脑组织，利用切片机制备厚度为14μm的脑组织冠状切片；
(2)将脑组织切片转移到氧化铟锡(ITO)载玻片上，置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(3)精密称量15.8mg的2,4，6-三苯基吡喃鎓四氟硼酸盐，加甲醇水(50:50，v/v)溶液2mL，涡旋混匀，超声5分钟，得到2,4，6-三苯基吡喃鎓四氟硼酸盐(20mM)溶液，备用；
(4)精密称量7.44mg的3-氨甲基苯基硼酸盐酸盐，加甲醇：水(50:50，v/v)溶液4mL，涡旋混匀，超声5分钟，得到3-氨甲基苯基硼酸盐酸盐(10mM)溶液，备用；
(5)取2,4，6-三苯基吡喃鎓四氟硼酸盐溶液和4-氨甲基苯基硼酸盐酸盐溶液各1mL混合，加入2μL三乙胺，涡旋混匀，得到衍生化试剂2,4，6-三苯基吡啶鎓-3-甲基苯硼酸溶液，备用；
(6)精密称量35mg的CHCA，加乙腈：水(60:40，v/v)溶液5mL，其中含有体积浓度的0.2％三氟乙酸，涡旋混匀，超声5分钟，得到CHCA(7mg/mL)溶液，备用；
(7)精密称量槲皮素标准品，用50％甲醇水溶液配置成系列浓度标准品溶液，浓度为1.08、0.27、0.055mg/mL，备用；
(8)采用干滴法将0.2uL的槲皮素标准品溶液滴加在ITO载玻片上同一小鼠脑组织切片表面，每个标准品溶液点占3mm2，间隔1mm，置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(9)使用布鲁克全自动基质喷雾仪ImagePrep，喷雾仓面积约100cm2，将ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面朝上置于喷雾仓正中间，将步骤(5)得到的2,4,6-三甲基吡啶鎓4-甲基苯基硼酸合成溶液喷洒到喷雾仓中，共使用溶液1mL，共分12次喷涂，以合成溶液体系中2,4,6-三甲基吡啶鎓4-甲基苯基硼酸溶液最终喷涂量为100nmol/cm2，每层喷涂后室温自然干燥，最后一层喷涂后，将ITO载玻片置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(10)使用布鲁克全自动基质喷雾仪ImagePrep，喷雾仓面积约100cm2，将ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面朝上置于喷雾仓正中间，将步骤(6)制备的CHCA溶液喷洒到喷雾仓中，共使用溶液3mL，分12次喷涂，最终喷涂量为0.21mg/cm2，每层喷涂后室温自然干燥，最后一层喷涂后，将ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面朝上置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(11)利用布鲁克UltraFlexⅢMALDI-TOF/TOF型质谱仪，在正离子、反射模式下，质荷比检测范围140～1000，对ITO载玻片上小鼠脑组织切片表面进行质谱分析；
(12)利用布鲁克DataAnalysis提取槲皮素衍生化产物的质谱信号m/z522.17。结果如图6所示，可见当以2,4,6-三甲基吡啶鎓-3-甲基苯基硼酸合成溶液为衍生化试剂、CHCA为基质时，能够得到槲皮素衍生化产物的质谱信号m/z522.17，检测限为1.1pmol/mm2。
实施例7：小鼠脑组织切片表面衍生化绿原酸的质谱成像分析
(1)取冰冻小鼠脑组织，利用切片机制备厚度为14μm的脑组织冠状切片；
(2)将脑组织切片转移到氧化铟锡(ITO)载玻片上，置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(3)精密称量15.8mg的2,4，6-三甲基吡喃鎓四氟硼酸盐，加甲醇水(50:50，v/v)溶液2mL，涡旋混匀，超声5分钟，得到2,4，6-三苯基吡喃鎓四氟硼酸盐(50mM)溶液，备用；
(4)精密称量7.44mg的4-氨甲基苯基硼酸盐酸盐，加甲醇：水(50:50，v/v)溶液4mL，涡旋混匀，超声5分钟，得到4-氨甲基苯基硼酸盐酸盐(10mM)溶液，备用；
(5)取2,4，6-三苯基吡喃鎓四氟硼酸盐溶液和4-氨甲基苯基硼酸盐酸盐溶液各1mL混合，加入2μLN，N-二异丙基乙胺，涡旋混匀，得到衍生化试剂2,4，6-三苯基吡啶鎓-4-甲基苯硼酸溶液，备用；
(6)精密称量35mg的CHCA，加乙腈：水(60:40，v/v)溶液5mL，其中含有体积浓度的0.2％三氟乙酸，涡旋混匀，超声5分钟，得到CHCA(7mg/mL)溶液，备用；
(7)精密称量绿原酸标准品，用50％甲醇水溶液配置成系列浓度标准品溶液，浓度为1、0.2、0.05、0.01和0.005mg/mL，备用；
(8)采用干滴法将0.2uL的绿原酸系列浓度标准品溶液滴加在ITO载玻片上同一小鼠脑组织切片表面，每个标准品溶液点占3mm2，间隔1mm，置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(9)使用布鲁克全自动基质喷雾仪ImagePrep，喷雾仓面积约100cm2，将ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面朝上置于喷雾仓正中间，将步骤(5)得到的2,4,6-三甲基吡啶鎓4-甲基苯基硼酸合成溶液喷洒到喷雾仓中，共使用溶液1mL，共分12次喷涂，以合成溶液体系中2,4,6-三甲基吡啶鎓4-甲基苯基硼酸溶液最终喷涂量为100nmol/cm2，每层喷涂后室温自然干燥，最后一层喷涂后，将ITO载玻片置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(10)使用布鲁克全自动基质喷雾仪ImagePrep，喷雾仓面积约100cm2，将ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面朝上置于喷雾仓正中间，将步骤(6)制备的CHCA溶液喷洒到喷雾仓中，共使用溶液3mL，共分12次喷涂，最终喷涂量为0.21mg/cm2，每层喷涂后室温自然干燥，最后一层喷涂后，将ITO载玻片含有标准品干燥点的一测表面朝上置于真空干燥器中室温干燥15分钟；
(11)利用布鲁克UltraFlexⅢMALDI-TOF/TOF型质谱仪，在正离子、反射模式下，质荷比检测范围140～1000，对ITO载玻片上小鼠脑组织切片表面进行质谱分析；
(12)利用布鲁克DataAnalysis提取绿原酸衍生化产物的质谱信号m/z522.17。结果如图7所示，可见当以2,4,6-三甲基吡啶鎓-3-甲基苯基硼酸合成溶液为衍生化试剂、CHCA为基质时，能够得到绿原酸衍生化产物的质谱信号m/z522.17，检测限为0.95pmol/mm2。

Claims (9)

1.组织中含邻二酚羟基官能团化合物的质谱成像检测方法，其特征在于，所述方法至少包括：
1)在溶液中合成衍生化试剂吡啶鎓-甲基苯硼酸，衍生化试剂如式(I)和/或(Ⅱ)中的一种或二种以上；
R1到R5可以是氢或取代基甲基、苯基、苯甲基中的一种、两种或三种，取代基数量可以是一个、两个、三个、四个或五个；
2)将衍生化试剂喷涂到组织切片表面，进行衍生化反应，反应结束后得到含邻二酚羟基化合物衍生化产物；
3)将上述衍生化处理后的组织切片进行基质喷涂，得到可用于质谱成像的组织切片样品；
4)采用激光解吸附离子源(MALDI)采集组织切片样品上衍生化产物的质谱信号，对组织中含邻二酚羟基官能团化合物进行定性，提取衍生化产物的质荷比信息获得质谱成像图。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生化试剂的合成过程为，将吡喃鎓盐溶液和氨甲基苯硼酸盐酸盐溶液混合得混合液，加入有机碱催化，充分混合，得到衍生化试剂吡啶鎓-甲基苯硼酸溶液；
所述的吡喃鎓盐的R1到R5可以是氢和取代基甲基、苯基、苯甲基中的一种、两种或三种，取代基数量可以是一个、两个、三个、四个或五个，阴离子为BF4；其具体结构式为(Ⅲ)
氨甲基苯硼酸盐酸盐可以是3-氨甲基苯硼酸盐酸盐和4-氨甲基苯硼酸盐酸盐中的一种或二种；
吡喃鎓盐溶液和氨甲基苯硼酸盐酸盐溶液的浓度分别为10～50mM，优选20～30mM，更优选25mM和10～50mM，优选20～30mM，更优选25mM；在混合后的溶液合成体系中吡喃鎓盐和氨甲基苯硼酸盐酸盐的摩尔比为10:1～1:1，优选8:1～2:1，更优选2:1。
3.如权利要求2所述的方法，所述的吡喃鎓盐和氨甲基苯基硼酸盐酸盐的溶剂为甲醇的水溶液，优选地，水溶液中甲醇体积浓度为25～100％，进一步优选为甲醇50～75％。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述有机碱催化剂为三乙胺或N，N-二异丙基乙胺中的一种或二种，有机碱与吡喃鎓盐溶液和氨甲基苯基硼酸盐酸盐溶液混合液的体积比为1:1000～4:1000。
5.如权利要求1所述的方法，所述的衍生化试剂溶液于组织切片一侧表面(待检测面)的喷涂量按吡啶鎓-甲基苯硼酸计100～500nmol/cm2，优选150～300nmol/cm2。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所用基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)，质量浓度为7～10mg/mL；溶剂为体积浓度40～60％乙腈水溶液，其中含有0.1～0.2％三氟乙酸；于组织切片一侧表面的喷涂量0.07～0.35mg/cm2，优选0.15～0.25mg/cm2。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，选用组织切片为动物组织切片。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，动物组织切片包括小鼠脑组织切片或大鼠脑组织切片。
9.如权利要求1～8任一项所述的方法，所述含邻二酚羟基官能团化合物为组织中的含邻二酚羟基内源代谢物和外源药物中的一种或二种以上，包括儿茶酚类神经递质和酚酸、黄酮类药物中的一种或二种以上。
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