CN116948042A - 一种靶向psma/cd3/cd80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体及应用 - Google Patents
一种靶向psma/cd3/cd80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因重组抗体药物技术领域，公开了一种靶向PSMA/CD3/CD80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体及其应用。该抗体为单链融合抗体，包括针对PSMA的单链抗体、针对CD3的单链抗体、人源IgG1抗体的FC段及CD80的胞外段，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的三特异性融合抗体对前列腺实体瘤具有较为理想的治疗效果，从而解决了双特异性抗体对实体瘤效果不佳的问题。
Description
技术领域
本发明属于基因重组抗体药物技术领域，涉及一种融合蛋白，尤其涉及一种靶向PSMA/CD3/CD80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体及其在前列腺肿瘤治疗中的应用。
背景技术
前列腺癌是男性癌症疾病中最常见的类型之一，是导致男性癌症死亡的第二大原因。早期前列腺癌的治疗主要包括手术切除和激素剥夺；但随着病程进展，针对转移性激素抵抗的晚期前列腺癌，临床上尚缺乏有效的治疗手段，迫切需要新的治疗策略出现。
随着肿瘤免疫机制的深入研究，利用自身免疫系统抗击肿瘤被认为是最有前途的全身癌症治疗方法，其中包括肿瘤疫苗、过继嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)、细胞因子注射、免疫检查点抑制剂和双特异性抗体(BsAbs)等。由于免疫疗法已经在部分类型肿瘤的临床治疗中显示出强大而持久的治疗效果，这让研究人员相信肿瘤免疫治疗也可以成为晚期前列腺癌一种理想的治疗策略。同时，随着基因工程技术的快速推进，多功能双特异性抗体的产生形式更加多样，其展现出来的治疗潜力也受到极大关注，尤其是数个双特异性抗体已由临床前研究成功转化进入临床治疗阶段，例如已批准上市的Blinatumomab等抗体药物。虽然双特异性抗体在血液肿瘤治疗中表现出惊人的疗效，但是其对实体肿瘤时的治疗效果却不理想。
目前，前列腺癌相关的双特异性抗体研制主要集中在肿瘤特异性抗原(TSA)联合CD3的设计思路上，该类双特异性抗体根据其功能特点也可被统称为T细胞衔接器(TCE)。造成TCE对实体肿瘤效果不佳的原因是实体肿瘤周围复杂的微环境对免疫反应的抑制。临床前研究表明，PSMA-CD3的TCE对实体肿瘤的抗肿瘤效果为剂量依赖性，同时对小体积肿瘤抗瘤效果明显，大体积肿瘤欠佳；在抗体联合使用4-1BB通路共刺激药物后，抗体的抗瘤效果明显得到改善(Danica Chiu.A PSMA-Targeting CD3 Bispecific Antibody InducesAntitumor Responses that Are Enhanced by 4-1BB Costimulation.CancerImmunology Research.2020)。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种治疗前列腺肿瘤的三特异性融合抗体，并在临床前的治疗实验中发现该三特异性融合抗体对前列腺实体瘤具有较为理想的治疗效果，从而解决了双特异性抗体对实体瘤效果不佳的问题。
本发明人推测前列腺癌周围浸润的T细胞可能存在免疫抑制，但具体机制不详。为了实现上述技术目的，本发明人将同时激活T细胞TCR/CD28两条激活信号通路作为改善TCE在实体瘤内功能的优化方向，经过反复论证，最终将T细胞第二激活通路的主要配体分子CD80作为优化TCE治疗策略的突破口，设计并成功合成了包含CD80的新型PSMA-CD3-CD80三特异性TCE(TriTE)。
具体地，本发明的目的是采用如下技术方案实现的：一种靶向PSMA/CD3/CD80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体，包括针对PSMA的单链抗体、针对CD3的单链抗体、、人源IgG1抗体的Fc段及CD80的胞外段。
进一步优选地，如上所述靶向PSMA/CD3/CD80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体，其中针对PSMA的单链抗体尾部通过柔性肽连接针对CD3的单链抗体，针对CD3的单链抗体的尾部通过柔性肽连接人源IgG1抗体的Fc段，人源IgG1抗体的Fc段尾部通过柔性肽连接CD80的胞外段。
再进一步优选地，如上所述靶向PSMA/CD3/CD80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体，其中针对PSMA的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，针对CD3的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
再进一步优选地，如上所述靶向PSMA/CD3/CD80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体，其中人源IgG1抗体的Fc段具有如下点突变：N297A。为了消除可能存在的ADCC效应，对抗体中IgG1的Fc段进行了单点突变(N297A)。
再进一步优选地，如上所述靶向PSMA/CD3/CD80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体，其中人源IgG1抗体的Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，CD80的胞外段的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
再进一步优选地，如上所述靶向PSMA/CD3/CD80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
另外，本发明还提供了一种编码上述靶向PSMA/CD3/CD80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体的核苷酸分子。进一步优选地，所述核苷酸分子的核苷酸序列如序列表中SEQID NO:2所示。
最后，本发明还提供了上述三特异性融合抗体在制备治疗前列腺癌的药物或生物制品中的应用。本发明所述的三特异性融合抗体可以改善双特异性抗体对实体肿瘤的抗瘤能力，因此特别适合应用于晚期前列腺癌的治疗。
与现有技术相比，本发明提供的三特异性融合抗体具有如下优点和进步性：
第一，本发明首次设计并合成了针对前列腺癌的三特异性TCE：TriTE-N13。利用基因工程技术，本发明筛选了一种人源PSMA单链抗体片段，然后与现有的人源CD3单链抗体片段进行拼接，构建针对PSMA-CD3的双特异性抗体；同时将CD80分子的胞外段融入抗体结构中，获得三特异性融合抗体TriTE-N13。
第二，本发明获得的TriTE-N13为单链融合抗体，结构由三部分组成：(1)抗原识别部位PSMA(scFv)-CD3(scFv)，起到双特异性靶向前列腺癌表面抗原PSMA和T细胞表面受体(TCR)中CD3的作用；(2)连接于抗原识别部位后的人源IgG1抗体的Fc段(CH2+CH3)，该部分可使抗体的结构更加稳定且易于表达后的纯化；同时便于在抗体尾部添加其他功能基团，减少不同片段间的功能干扰；(3)连接于Fc段尾部的CD80胞外段部分，作为激活CD28通路的功能基团，实现抗体的三特异性，从而改善前列腺肿瘤对免疫细胞的反应状态，并在临床前的治疗实验中发现该抗体对前列腺肿瘤具有较为理想的治疗效果。
第三，本发明TriTE-N13抗体可以通过技术成熟的真核蛋白表达系统生产获取，且后续的蛋白纯化稳定高效；TriTE-N13抗体与不同靶细胞(前列腺癌/T细胞)间的结合活性良好，证明TriTE-N13抗体的蛋白结构稳定且不影响抗体活性与功能，可在此结构基础上进行更多扩展。
第四，本发明TriTE-N13抗体的研制探索了CD80增强免疫细胞活性的功能对前列腺癌免疫治疗的改善作用，为今后制定更多形式的肿瘤免疫治疗策略提供了参考依据。
附图说明
图1：TriTE-N13的表达和纯化结果；左图为Western blotting，右图为SDS-PAGE。
图2：TriTE-N13与PSMA阳性/CD3阳性细胞的结合活性测定结果。
图3：TriTE-N13对T细胞的激活结果。
图4：体外共培养实验的肿瘤细胞存活率结果。
图5：体内验证TriTE-N13诱导的抗瘤作用；上图为体内治疗方案，下图为肿瘤体积随时间变化结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神下可以对技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1：三特异性融合抗体TriTE-N13的设计与制备
本实施例构建了三特异性抗体TriTE-N13的真核表达载体，将其瞬时转染HEK293-F细胞中进行表达，利用Protein A 亲和层析柱进行了蛋白纯化。通过SDS-PAGE和Westernblot证实得到了高纯度的三特异性抗体，命名为TriTE-N13，为下一步进行功能研究奠定了基础。
一、技术构思
TriTE-N13为单链融合抗体，结构由三部分组成：1.抗原识别部位采用了技术成熟的BITE形式：PSMA(scFv)-CD3(scFv)，起到双特异性靶向前列腺癌表面抗原PSMA和T细胞表面受体(TCR)中CD3的作用；2.抗原识别区后我们连接了人源IgG1抗体的Fc段(CH2+CH3)，该部分可使抗体的结构更加稳定且易于表达后的纯化；同时便于在抗体尾部添加其他功能基团，减少不同片段间的功能干扰；3.在Fc段尾部我们连接了CD80的胞外段部分，作为激活CD28通路的功能基团，实现抗体的三特异性。
本发明中所使用的PSMA单链抗体片段(scFv)是我们在之前的研究中从一个大型酵母展示的人源性单链抗体文库中所筛选获得的；单链抗体片段CD3(scFv)以及CD80胞外段序列则是通过对NCBI进行检索和比对，选取合适的目标序列后通过基因编辑而获取。同时，为了消除可能存在的ADCC效应，对抗体中IgG1的Fc段进行了单点突变(N297A)。最终，本发明设计的TriTE-N13各部分的氨基酸序列为：人源PSMA单链抗体片段的氨基酸序列如SEQID NO:3所示，人源CD3单链抗体片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，人源IgG1抗体的Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，CD80的胞外段的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。本发明对所有片段进行了密码子的优化，以便于能够在293F工具细胞中的高效表达。使用Overlap PCR技术将各基因片段按照设计方案通过柔性linker(G4S)n进行连接，连接后的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；表达序列整体构建成功后，将目标片段通过酶切/链接技术接入Bi-Gs表达载体中。
将构建完成的表达载体进行基因测序，验证表达载体构建成功后，使用真核细胞(293F细胞)蛋白表达系统进行抗体生产：通过转染试剂FreeStyleTMMAX Reagent(Gibco)将表达质粒瞬时转染进入293F细胞，使用无血清培养基(Gibco)悬浮培养(37℃，8％ CO2)；3天后抽取200ul上清观察表达体系是否正常(细胞状态及培养基有无污染)，同时进行PAGE-SDS电泳+WB验证目标抗体表达情况；7天后收集培养基，离心(5000rpm/10min)后取上清使用AKTA 蛋白纯化仪通过Protein A层析柱纯化获取培养上清中的目标抗体。目标抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
二、实验操作
1.质粒的扩增
1)吸取待扩增质粒1μL，加入到20μL DH5α感受态中，冰上孵育30min；
2)42℃水浴，热休克90s，迅速取出，冰上放置3min；
3)在无菌条件下，向管内加入80μL Amp-的LB培养液，吹打混匀后，37℃温箱中放置30min；
4)将管中液体均匀涂于Amp+的LB平板上，室温放置1min，倒置，37℃孵箱中孵育过夜；
5)次日，用无菌枪头挑取单克隆菌落，置于装有5mL Amp+的LB培养液的摇菌管中，37℃220rpm振荡培养过夜；
6)次日，按照质粒小提试剂盒说明书进行质粒提取，Nanodrop 2000超微量分光光度计进行质粒浓度及纯度的测定。
2.常规PCR反应体系
(1)反应体系：
(2)循环条件：
| Temperature | Time | cycles | |
| Initial denaturation | 95℃ | 2min | 1 |
| Denaturation | 95℃ | 30s | 20-30 |
| Annealing | 55℃ | 30s | 20-30 |
| Extension | 72℃ | 1min/kb | 20-30 |
| Final extension | 72℃ | 10min | 1 |
| Hold | 4℃ | ～ | 1 |
3.Overlap PCR反应体系
(1)反应体系：
(2)循环条件：
| Temperature | Time | cycles | |
| Initial denaturation | 95℃ | 2min | 1 |
| Denaturation | 95℃ | 30s | 30 |
| Annealing | 60℃(视情提高) | 30s | 30 |
| Extension | 72℃ | 1min/kb | 30 |
| Final extension | 72℃ | 10min | 1 |
| Hold | 4℃ | ～ | 1 |
4.质粒双酶切体系
Takara的快切酶Nhe I/Xho I/Not I的酶切体系：
反应温度：37℃；反应时间：15分钟。
5.DNA片段连接体系
Takara的T4连接酶连接的连接体系：
4℃过夜。
6.琼脂糖凝胶电泳+胶回收
配制1％的琼脂糖凝胶，将PCR产物进行电泳分离。电泳电压：150V；时间：15分钟；使用胶回收试剂盒，将片段大小正确(与设计方案中大小相同)的目标条带回收。
三、真核表达载体PC-F-CD80的构建
1.对Fc段中297A位点进行突变处理
使用Overlap PCR技术，以含有HN3-Fc的LH007CL表达载体为底物对Fc段中对应位点进行点突变。
1)设计并合成下列引物：
Fc-A-F:CCGCTCGAGGGAGGCGGAGGATCTGATAAA；
Fc-A-R:ACGATAGGTACTGGCGTACTGTTCCTCTCG；
Fc-B-F:CGAGAGGAACAGTACGCCAGTACCTATCGT；
Fc-B-R:ATAGTTTAGCGGCCGCTCAGTGG；
2)以HN3-Fc载体为模板，分别使用配对引物Fc-A-F和Fc-A-R，Fc-B-F和Fc-B-R进行PCR；将产物胶回收，分别获得A和B片段。
3)将A和B片段混合后作为模板，以Fc-A-F和Fc-B-R为引物进行Overlap PCR，产物胶回收：Fc-N297A(含酶切位点的平滑片段)。
4)将目标片段Fc-N297A使用Xho I和Not I进行双酶切，对片段进行胶回收并纯化，得到Fc-N297A(可连接片段)；
5)同时使用Xho I和Not I对LH007CL载体进行双酶切，将载体进行回收；将上述胶回收的Fc-N297A片段和LH007CL载体进行连接，转化后获得含有突变片段的载体，命名为LH007CL-297A。
2.构建His-PSMAscFv-CD3scFv
1)设计并合成下列引物：
His-PSMA-F:
CTAGCTAGCCACCATCACCACCATCATCACCACCATCACGGCGGAGGCGGAT
CTCAGTCTGTGCTGACT
His-PSMA-R:TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCGGGGCC
CD3-F：
GTCACCGTCTCCTCAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGAGGCGGATCTGGCGGAGGCGGATCTCAGGTGCAGCTGGTG
CD3-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTCAGCGGGTGATCTGCAG
2)以包含PSMA(scFv)序列的质粒为模板，分别使用配对引物His-PSMA-F和His-PSMA-R进行PCR；以包含CD3(scFv)序列的质粒为模板使用配对引物CD3-F和CD3-R进行PCR，产物进行胶回收，分别获得His-PSMA(scFv)和(G4S)3linker-CD3(scFv)片段。
3)将His-PSMA(scFv)和(G4S)3linker-CD3(scFv)片段混合后作为模板，使用引物His-PSMA-F和CD3-R进行Overlap PCR，产物进行胶回收，获得His-PSMA-linker-CD3序列片段(含酶切位点的平滑片段)。
4)将His-PSMA-linker-CD3片段用Nhe I和Not I双酶切，酶切后片段进行胶回收，纯化，获得His-PSMA-linker-CD3(可连接片段)；
5)同时使用Nhe I和Not I对组内已有的表达用载体Bi-Gs进行双酶切，将酶切后载体进行回收；将上述胶回收的His-PSMA-linker-CD3片段和Bi-Gs载体进行连接，转化后获得His-PSMAscFv-(G4S)3linker-CD3scFv的表达载体(此载体可用于表达带His标签的BITE格式的PSMA-CD3双特异性抗体BITE-N1，对照备用)。
3.构建PSMAscFv-CD3scFv-Fc-N297A
1)设计并合成下列引物：
P-C-Fc-F：CTAGCTAGCCAGTCTGTGCTGACT
P-C-Fc-R：CCGCTCGAGGCGGGTGATCTGCAG
2)使用已构建好的His-PSMA-CD3表达载体为模板，用引物P-C-Fc-F和P-C-Fc-R进行PCR，产物片段进行胶回收，获得PSMAscFv-CD3scFv片段(不带His标签；含酶切位点的平滑片段)；
3)使用Nhe I和Xho I双酶切PSMAscFv-CD3scFv片段后胶回收；将第一阶段突变完成的LH007CL-297A载体使用Nhe I和Xho I进行双酶切；酶切完成的片段和载体连接，获得包含PSMAscFv-CD3scFv-Fc(N297A)片段的载体LH007CL-PCFc，转化后进行扩增，冻存。
4)同时使用Nhe I和Not I对组内已有的表达用载体Bi-Gs以及LH007CL-PCFc进行双酶切，将酶切后载体(Bi-Gs)及目标片段(PC-Fc)进行回收；将上述胶回收的PSMAscFv-CD3scFv-Fc(N297A)片段和Bi-Gs载体进行连接，转化后获得PSMAscFv-CD3scFv-Fc(N297A)的表达载体(此载体可表达带Fc段的HF-BITE格式的PSMA-CD3双特异性抗体BITE-N2，对照备用)。
4.构建PSMAscFv-CD3scFv-Fc-CD80
1)设计并合成下列引物：
Fc-A-F:CCGCTCGAGGGAGGCGGAGGATCTGATAAA(阶段一中已合成)
Fc-CD80-R:
GGTCACGTGGATCACAGATCCGCCTCCGCCGTGGTGGTGATGGGG
CD80-F：GTGATCCACGTGACC
CD80-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTCAGGGAAAGTGCTC
2)使用引物Fc-A-F和Fc-CD80-R对LH007CL-297A进行PCR；使用CD80-F和CD80-R对含有CD80的载体进行PCR，分别获得的PCR产物为Fc-(G4S)linker和CD80，回收后纯化；
3)使用引物Fc-A-F和CD80-R，将第二步中获得的片段Fc-(G4S)linker和CD80作为底物，进行Overlap PCR获得完整的目标片段Fc-(G4S)linker-CD80(含酶切位点的平滑片段)；
4)再用Xho I和Not I同时双酶切已构建好的PSMAscFv-CD3scFv-Fc(N297A)表达载体以及上一步的目标片段Fc-(G4S)linker-CD80，将酶切后载体(含有PSMA-CD3段的Bi-Gs)与目标片段Fc-(G4S)linker-CD80(可连接片段)进行回收，连接，转化扩增后获得最终产物：包含PSMAscFv-CD3scFv-Fc(N297A)-(G4S)linker-CD80序列的表达用载体PC-F-CD80(此载体可表达带CD80胞外段的PSMA+CD3+CD80三特异性抗体TriTE-N13，目标抗体)。
四、表达质粒的瞬时转染
1)转染前一天，将HEK293-F细胞大量扩增，调整细胞密度至5×105/mL，分至数个500mL的摇瓶中(每个摇瓶150mL细胞悬液)，37℃、8％、CO2、125rpm振荡培养过夜；
2)次日，按照以下体系配制转染试剂：
室温放置5min；
3)5min后，将质粒管中的液体加入至脂质体管，室温孵育20min；
4)20min后，将上述转染复合物逐滴加入至500mL细胞摇瓶中(每个摇瓶中加入4.8mL转染复合物)，37℃、8％、CO2、125rpm振荡培养。
5)于转染后第7d，收取培养液上清，置于冰上备用。
五、抗体的纯化
1)将收集的培养液上清于4℃，5000rpm离心20min，吸取上清，用0.45μm滤器进行过滤，按1:1的比例将滤液与Binding buffer充分混匀，即得到待纯化样品；
2)打开AKTA蛋白纯化仪，分别将A管置于Binding buffer，B管置于Elutionbuffer，调节流速至0.3mL/min，按说明安装Hitrap rProteinA Fast Flow(1mL)蛋白纯化柱；
3)调节流速至2mL/min，选择“pump wash”清洗纯化柱及管道系统；
4)清洗结束后，利用Elution buffer进行柱再生，过5个柱体积(5mL)；
5)柱再生结束后，利用Binding buffer进行柱平衡，过5个柱体积(5mL)；
6)平衡结束后，将A管置于待纯化样品中，上样，并收集流穿液；
7)上样结束后，将A管重新置于Binding buffer中，待紫外吸收峰下降，停止收集流穿液，再过5个柱体积(5mL)；
8)利用Elution buffer进行蛋白洗脱，观察紫外吸收峰的出峰情况，收集洗脱液至含有800μL 1M pH9.0的Tris-HCl中进行中和；
9)洗脱结束后，用20％乙醇进行封柱，将柱子置于4℃保存；
10)将洗脱下来的蛋白装入透析管中进行透析，将蛋白透析至PBS中，每12h换液一次，共4次，之后用Nanodrop 2000中的Protein A280方法进行蛋白定量，将抗体进行分装，-80℃保存。
六、抗体的SDS-PAGE和Western blot检测
1.蛋白样品的制备
1)变性蛋白样品的制备
分别取空载体、纯化前蛋白、纯化后蛋白各80μL，加入20μL 5×变性上样缓冲液，沸水中煮10min，立即置于冰上。
2)非变性蛋白样品的制备
取纯化蛋白80μL，加入20μL 5×非变性上样缓冲液(不含β-ME和DTT)，置于冰上。
2.SDS-PAGE
1)按要求组装好玻璃板，并检测密封性；
2)按照说明书配置10％的SDS-PAGE胶，共2块；
3)配制Tris-甘氨酸电泳缓冲液，向电泳槽中加入适量电泳缓冲液，微量进样器上样；
4)浓缩胶用70V电压，分离胶用120V电压，恒压电泳约90min，待溴酚蓝到达胶底部时停止电泳；
5)取出其中一块胶，置于考马斯亮蓝R-250染色液中，室温染色1h；之后置于脱色液中脱色，用凝胶成像系统拍照并分析。
3.Western blot
1)配制转膜缓冲液，将电泳后的另一块胶置于转膜缓冲液中，同时，根据胶的大小裁剪合适的PVDF膜，将膜置于甲醇中浸泡15s，然后取出在ddH2O中浸泡2min，采用湿转法，按照“黑胶白膜”的顺序进行组装，电流调至280mA，恒流条件下转膜80min；
2)将膜取出，先置于TBST中洗2min，去除转膜缓冲液，然后用5％ BSA室温封闭2h；
3)用5％ BSA稀释HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体(1:5000稀释)，将膜置于稀释好的抗体中，4℃孵育过夜；
4)将膜取出，用TBST洗5遍，每遍5min，配制化学发光液，进行发光，用凝胶成像系统观察并分析。结果如图1所示。
实施例2：TriTE-N13对目标细胞的结合活性研究
1.Ficoll密度梯度离心法提取人源PBMC
(1)将15ml淋巴细胞分离液加入50ml离心管中；
(2)用EasySepTMBuffer以1：2的比例稀释健康供体外周血；
(3)用滴管沿管壁缓慢叠加于分离液面上(分离液与稀释后血液的比例约为1：2)，注意保持界面分层明显，水平离心20℃，2000rpm/min，20min，缓升缓降；
(4)离心后管内分为三层，上层为血浆和EasySepTMBuffer缓冲液，中层为分离液和单个核细胞，下层红细胞和粒细胞。其中，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，位于中层界面白色浑浊液体层；弃掉上层，将1ml移液器插到浑浊液体层，吸取PBMC，置入另50ml离心管中，加入5倍体积EasySepTMBuffer缓冲液洗涤细胞，4℃，350g，15min；
(5)弃掉上清液，加入10ml红细胞裂解液，4℃裂解(5-10)min后加入一定量EasySepTMBuffer洗涤细胞，4℃，100g，15min；
(6)弃掉上清液，加入一定量EasySepTMBuffer缓冲液，洗涤细胞，4℃，100g，15min；
(7)重复步骤(6)两次后，加入30ml EasySepTMBuffer缓冲液重悬，用于细胞计数及台盼蓝染色细胞活性检测。
2.细胞培养
22RV1/C4-2/PC-3等前列腺癌细胞系使用含10％新生胎牛血清的RPMI-1640培养，(贴壁培养)于37℃、5％ CO2条件下，定期换液、传代；人源性T细胞(PBMC分选获取)使用含20％新生胎牛血清的RPMI-1640培养，(悬浮培养)于37℃、5％CO2条件下，定期(短期)换液。
3.流式细胞术检测TriTE-N13与PSMA阳性细胞的结合能力
1)取处于对数生长期的前列腺癌细胞，将其消化成单细胞悬液，将细胞密度调整至1×10-6/test；
2)分别设置空白对照组、同型对照组、TriTE-N13抗体组，每管加入200μL 细胞悬液；
3)每管用1mL FACS液(预冷，后同)洗涤(1000r/5min，4℃，后同)2遍；
4)弃上清，空白对照管加入200μL FACS液；同型对照管200μL 100nM Human IgG，抗体管加入200μL 100nM TriTE-N13，4℃孵育30min；
5)每管用1mL FACS液洗涤2遍；
6)弃上清，空白对照管、同型对照管和TriTE-N13抗体管加入100μL FITC标记的小鼠抗人IgG抗体(1:20稀释)，4℃避光孵育30min；
7)每管用1mL FACS液洗涤2遍；
8)弃上清，用400μL FACS液重悬细胞，流式细胞仪进行检测。
4.流式细胞术检测TriTE-N13与CD3阳性细胞的结合能力
1)取短期内由新鲜PBMC中分选获得的人源T细胞，将细胞密度调整至1×10-6/test；
2)分别设置空白对照组、同型对照组、TriTE-N13抗体组，每管加入200μL 细胞悬液；
3)每管用1mL FACS液(预冷，后同)洗涤(1500r/5min，4℃，后同)2遍；
4)弃上清，空白对照管加入200μL FACS液；同型对照管200μL 100nM Human IgG，抗体管加入200μL 100nM TriTE-N13，4℃孵育30min；
5)每管用1mL FACS液洗涤2遍；
6)弃上清，空白对照管、同型对照管和TriTE-N13抗体管加入100μL FITC标记的小鼠抗人IgG抗体(1:20稀释)，4℃避光孵育30min；
7)每管用1mL FACS液洗涤2遍；
8)弃上清，用400μL FACS液重悬细胞，流式细胞仪进行检测。
TCE发挥治疗功能的关键是能够同时识别肿瘤细胞表面的特异性抗原(TTA)以及T细胞表面TCR中的CD3，当抗体同时结合上述两种抗原后，就能够在肿瘤与T细胞之间形成有效的人工免疫突触，进而实现肿瘤细胞对T细胞的特异激活。我们使用荧光抗体免疫标记的方法通过细胞流式检测了TriTE-N13对不同细胞(抗原)的特异性结合能力。首先是分别选用22RV1(PSMA+)/C4-2(PSMA+)/PC3(PSMA-)/改造后的PC3(PSMA+)四种前列腺癌细胞系与TriTE-N13共孵育，检测抗体对人源PSMA抗原的结合活性。流式结果证明TriTE-N13能够与表达内源性PSMA的前列腺癌细胞(22RV1(PSMA+)/C4-2(PSMA+))结合，不与无PSMA表达的PC3结合，抗体与抗原的结合活性良好；另外，TriTE-N13能够灵敏的识别改造后的PC3(PSMA+)细胞，说明抗体中的PSMA(scFv)仅针对人源性PSMA抗原识别，特异性良好。而后我们分别选用Jurkat细胞系和人源性T细胞(PBMC分选获取)对目标抗体进行检测。流式结果显示TriTE-N13能够特异性识别T细胞表面的CD3且结合活性良好(参见图2)。由于我们的TriTE-N13中添加了CD80(ECD)基团，这种新式的结构设计可能造成抗体二级结构改变进而影响到原有抗原识别片段PSMA(scFv)/CD3(scFv)的识别功能(影响其中一种或同时影响两种)。通过上述抗体结合实验我们证明：新设计的抗体结构未影响头端抗原识别片段的功能，TriTE-N13能够特异性的识别目标抗原且结合活性良好。
实施例3：TriTE-N13体外激活T细胞的实验研究
1.细胞培养
C4-2前列腺癌细胞系使用含10％新生胎牛血清的RPMI-1640培养，(贴壁培养)于37℃、5％ CO2条件下，定期换液、传代；人源性PBMC(从新鲜血液中分选获取)使用含15％新生胎牛血清的RPMI-1640培养，(悬浮培养)于37℃、5％CO2条件下，定期(短期)换液。
2.Ficoll密度梯度离心法提取人源PBMC(同实施例2)
3.流式细胞术检测TriTE-N13对T细胞的体外激活能力
1)取处于对数生长期的C4-2细胞，按每孔2*104个细胞的密度将肿瘤细胞铺于24孔板中，过夜培养；
2)从2个不同供体的新鲜血液中提取PBMC，按照E：T＝4：1的比例将PBMC加入到完成铺板的24孔板中(每孔8*104个细胞)；
3)治疗组中TriTE-N13抗体按照0.1ug/ml的浓度剂量加入到各孔中；对照组加入相同体积的无菌PBS，于37℃、5％ CO2条件下共培养48小时；
4)共培养48小时后，收集培养上清(轻吹孔板底部后收集，每孔为一管样本)，离心(1500r/5min，4℃，后同)后弃上清，每管用1mL FACS液洗涤2遍；
5)弃上清，对照组管和TriTE-N13治疗组管同时加入100μL PerPC-Cyanine5.5标记(小鼠抗人)的CD3抗体及100μL PE-Cyanine 7标记(小鼠抗人)的CD69抗体(1:20稀释)，4℃避光孵育30min；
6)每管用1mL FACS液洗涤2遍；
7)弃上清，用400μL FACS液重悬细胞，流式细胞仪进行检测。
在验证了TriTE-N13对肿瘤细胞和T细胞具有良好结合活性后，我们进一步评估了TriTE-N13介导的双特异性结合是否能够产生激活淋巴细胞(主要是CD3+T细胞)的作用(双特异性抗体的结合功能使得肿瘤细胞与T细胞之间产生大量的人工免疫突出)。为此，我们从不同的健康供体获取新鲜的PBMC，而后选用C4-2细胞系在体外与PBMC进行共培养，模拟前列腺肿瘤细胞与T细胞共存状态下TriTE-N13发挥免疫介导作用的环境，最后通过检测CD3+T细胞上CD69的表达情况验证抗体对T细胞的激活作用。共培养后收集悬浮的T细胞进行细胞流式，发现TriTE-N13能够有效的刺激T细胞发生活化(参见图3)。
实施例4：TriTE-N13体外诱导T细胞杀伤PSMA+肿瘤细胞的实验研究
1.细胞培养
C4-2前列腺癌细胞系使用含10％新生胎牛血清的RPMI-1640培养，(贴壁培养)于37℃、5％ CO2条件下，定期换液、传代；人源性PBMC(从新鲜血液中分选获取)使用含15％新生胎牛血清的RPMI-1640培养，(悬浮培养)于37℃、5％CO2条件下，定期(短期)换液。
2.Ficoll密度梯度离心法提取人源PBMC(同实施例2)
3.流式细胞术检测TriTE-N13体外对肿瘤细胞的杀伤能力
1)取处于对数生长期的C4-2细胞，使用CFSE染料进行细胞染色(按说明书配制染料；染料试剂重悬目标细胞后静置；PBS离心洗脱2遍)；按每孔2*104个细胞的密度将肿瘤细胞(已染色)铺于24孔板中，过夜培养；
2)从同一供体的新鲜血液中提取PBMC，按照E：T＝4：1的比例将PBMC加入到完成铺板的24孔板中(每孔8*104个细胞)；同时准备一板不加PBMC的细胞作为阴性对照；
3)治疗组中TriTE-N13抗体按照0.1ug/ml的浓度剂量加入到各孔中；治疗对照组(PBMC)/阴性对照组(NC)加入相同体积的无菌PBS，于37℃、5％ CO2条件下共培养72小时；
4)分别于培养24、48、72小时分组处理：各组选3个培养孔细胞消化成单细胞悬液，分装于检测管中，操作过程尽量避光；
5)每管用2mL FACS液洗涤2遍；
6)弃上清，用400μL FACS液重悬细胞，流式细胞仪进行检测。
体外验证了TriTE-N13能够有效激活T细胞后，我们接着进行了共培养杀伤实验，验证目标抗体是否具有介导T细胞杀伤前列腺癌细胞的功能。分别选用内源性表达PSMA+的肿瘤细胞系C4-2/22RV1作为靶细胞(PSMA-细胞系PC-3作为对照组靶细胞)与新鲜获取的PBMC进行共培养(E:T＝4:1)，而后通过荧光显微镜(Calcein/PI细胞染色)、细胞流式(CFSE活细胞染色)等分组检测肿瘤细胞杀伤情况。我们发现，目标抗体TriTE-N13在共培养环境中对所有PSMA+肿瘤细胞均有很强的杀伤作用，平均最大杀伤率为60％-80％；而此种杀伤效果是随着共培养时间的延长逐渐增强的(48小时后明显加强)，推测这可能与T细胞充分活化后的级联效应相关。在相同的干预条件下，PSMA-的PC-3细胞共培养治疗组中没有观察到明显的肿瘤杀伤效果，说明杀伤效果的产生与抗体特异性识别PSMA相关。为了验证上述的杀伤效果是由T细胞活化而产生的，我们将各组共培养后的T细胞分时间段进行收集，检测其中CD8+/CD4+T细胞的活化水平，发现在TriTE-N13治疗组中CD8+/CD4+T细胞表面的CD25/CD69均有明显升高；收取培养上清进行细胞因子ELISA检测，在足以诱导最大肿瘤杀伤的抗体浓度下，与NC相比TriTE-N13诱导的IL-2、IL-6、IFN-γ的产生明显增加(参见图4)。上述实验结果证明共培养实验中的肿瘤杀伤效果是由T细胞活化产生细胞毒性作用而造成的。
实施例5：TriTE-N13抑制前列腺肿瘤生长的体内实验研究
1.实验动物
选用6周龄的SPF级雄性重度联合免疫缺陷小鼠(NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt)(NCG)，30只，体重25g±2g，购自成都药康生物科技有限公司【生产许可证号：SCXK(川)2020-034】。所用实验小鼠均饲养于空军军医大学实验动物中心的SPF级屏障隔离设施中【使用许可证号为SYXK(陕)2019-001】。所有小鼠均分笼饲养在特定的无菌鼠笼中，并提供高压蒸汽灭菌后的饲料和水，12小时光照/日，明暗交替，相对湿度55％±5％，温度(23±2)℃。
2.实验细胞系
人前列腺癌细胞系22RV1来源于ATCC，由空军军医大学实验动物中心保存。
3.Ficoll密度梯度离心法提取人源PBMC(同实施例2)
4.前列腺肿瘤免疫双人源化小鼠模型的构建
将分离出的健康供体PBMC通过尾静脉注射到小鼠体内，具体步骤如下：
(1)雄性重度联合免疫缺陷小鼠NCG，置于SPF级隔离屏障环境中；
(2)用PBS将分离出的健康供体新鲜PBMC重悬至终浓度为2×107/200μL，放置冰上，短暂保存；
(3)用1ml无菌注射器将PBMC悬液移植(尾静脉注射)入小鼠体内，每只雄性小鼠获取200μL的2×107个PBMC；
(4)收集对数生长期的人PCa细胞系22RV1，用PBS重悬，注射于雄性Hu-PBMC小鼠皮下，每只鼠的剂量为5×106/200μL；
(5)3周后通过流式细胞计术监测小鼠外周血中hCD45+免疫细胞的比例；通过免疫组化染色观察小鼠肝脏、肺以脾脏及肿瘤中人免疫细胞的浸润情况。
5.抗体治疗策略
将前列腺癌细胞系22RV1皮下移植于雄性NCG小鼠/雄性Hu-PBMC小鼠后，观察肿瘤生长情况，肿瘤约达到50～100mm3时，根据实验设计，将实验NCG小鼠随机分为3组(其中NC组为未重建的NCG小鼠组)，并开始治疗，具体如下：
(1)模型对照组(NC组)，PBS，静脉注射，5天2次；
(2)治疗对照组(Control组)，PBS，静脉注射，5天2次；
(3)TriTE-N13抗体组，5mg/kg，静脉注射，5天2次；
6.肿瘤体积检测
将前列腺癌细胞系22RV1皮下植入重建NCG小鼠皮下，每隔3天动态监测肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线，肿瘤体积计算方法：V(mm3)＝长(mm)×宽(mm)×宽(mm)/2。
7.统计学分析
各免疫细胞比例以平均数±标准差表示，P＜0.05为差异具有统计学意义。采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计学分析，数据处理结果用平均值±标准差表示；组间差异采用方差分析以P<0.05作为显著差。
获取体外数据后，我们开展了对目标抗体在体内发挥作用的验证实验。由于TriTE-N13是全人源性的融合抗体(这样能够更好的避免发生ADA)，类似于其他免疫治疗的研究，要求治疗模型拥有能够更真实反应人体正常免疫环境的特点。为此，我们选择使用NCG小鼠进行人源化免疫系统重建，在重建成功的基础上进行异种移植瘤的建立和后续治疗实验。重建成功后在小鼠皮下使用22RV1细胞荷瘤，而后按照治疗方案尾静脉给药治疗(移植瘤体积约为50mm3时开始治疗)，对照组使用无菌的PBS。在治疗过程中随机抽检对照组和干预组个体肿瘤组织中免疫细胞的浸润情况；其余模型在治疗终止时测量肿瘤体积。观察发现：在实验结束时干预组与对照组的肿瘤体积大小差异明显，干预组瘤体明显小于对照组，证明抗体在体内具有明确的抑瘤作用(参见图5)。实验中对肿瘤组织标本进行免疫组化的结果表明：在抗体干预的情况下，肿瘤组织内的CD45+细胞浸润明显，进一步肯定了抗体介导免疫细胞的抑瘤活性，说明TriTE-N13能够很好的抑制肿瘤生长。
Claims (10)
1.一种靶向PSMA/CD3/CD80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体，其特征在于，包括针对PSMA的单链抗体、针对CD3的单链抗体、人源IgG1抗体的Fc段及CD80的胞外段。
2.根据权利要求1所述靶向PSMA/CD3/CD80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体，其特征在于，所述针对PSMA的单链抗体尾部通过柔性肽连接针对CD3的单链抗体，所述针对CD3的单链抗体的尾部通过柔性肽连接人源IgG1抗体的Fc段，所述人源IgG1抗体的Fc段尾部通过柔性肽连接CD80的胞外段。
3.根据权利要求2所述靶向PSMA/CD3/CD80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体，其特征在于，所述针对PSMA的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述针对CD3的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求2所述靶向PSMA/CD3/CD80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体，其特征在于，所述人源IgG1抗体的Fc段具有如下点突变：N297A。
5.根据权利要求4所述靶向PSMA/CD3/CD80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体，其特征在于，所述人源IgG1抗体的Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述CD80的胞外段的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
6.根据权利要求2所述靶向PSMA/CD3/CD80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体，其特征在于，所述三特异性融合抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
7.一种编码权利要求1-6任一项所述靶向PSMA/CD3/CD80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体的核苷酸分子。
8.根据权利要求7所述靶向PSMA/CD3/CD80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
9.权利要求1-6任一项所述的三特异性融合抗体在制备治疗前列腺癌的药物或生物制品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述的前列腺癌为晚期前列腺癌。
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| CN202310897407.8A Pending CN116948042A (zh) | 2023-07-20 | 2023-07-20 | 一种靶向psma/cd3/cd80治疗前列腺癌的三特异性融合抗体及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116948042A (zh) |
-
2023
- 2023-07-20 CN CN202310897407.8A patent/CN116948042A/zh active Pending
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