CN116942903A - 一种骨再生材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种骨再生材料，其特征在于，所述骨再生材料包含以下组分：交联透明质酸钠凝胶、非交联透明质酸钠凝胶和骨颗粒。本发明提供的骨再生材料具有优异的内聚性以及粘弹性、良好的吸水性及血凝块的稳定性，较大的比表面积以及多孔的微观结构，为细胞粘附、迁移和增殖提供有利环境，具有优异的骨生成以及骨诱导作用。

Description

一种骨再生材料及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，更具体涉及一种骨再生材料及其制备方法。
背景技术
肿瘤、创伤、坏死、感染等疾病常导致骨缺损，缺损之后通常需要进行骨移植。自体骨移植在骨生成、骨诱导、骨引导等方面的突出表现被认为是临床治疗的“金标准”。然而，这种技术需要额外的手术来获取骨移植物，从而导致继发性创伤和潜在的供区发病率。此外，自体骨来源有限。
目前，有多种骨移植物可用于临床以替代自体骨移植物。脊椎动物尤其是牛骨被认为是与人类骨骼最相似的，被广泛应用于许多商业化产品中。由于免疫原性和病毒污染的风险，一些制造商使用不同脱蛋白、脱脂以及热处理方式制备形成骨颗粒，如Bio-Oss(Geistlich Biomaterials,Geistlich,Switzerland)，osteograft(CeraMed Co.，Denver,Co,USA)和Endobon(Merck Co.，Darmstadt,Germany)。然而，这些材料只保留无机成分，并完全去除一些生物活性成分，因此其骨生成和成骨诱导功能明显下降。且骨粉类产品在临床应用时不方便，易被血液冲散，尤其是用于血供充分的前牙术区以及Type II-0、TypeII-I、Type II-II型牙槽骨缺损(牙槽骨缺损分类如图1)。
有专家学者研究了人体骨骼的三维结构，主要由无机矿物相、水和有机生物分子组成，其中有机生物分子包括胶原蛋白、非胶原蛋白蛋白多糖(GAGs)组成。无机矿物质提供了基本的支架，有机基质提供了弹性，两种不同的化合物性质决定了骨材料的最佳性能。一种单独的胶原蛋白成分被添加到牛松质骨中形成可塑型骨材料，以模仿人类骨的结构，如国外上市的产品Bio-oss collagen(Geistlich Biomaterials,Geistlich,Switzerland)，由90％牛松质骨和10％猪胶原蛋白的组合，然而两种不同的物种来源增加了免疫原性排斥的风险。
CN105457097A公开了一种可注射矿化胶原骨修复材料及其制备方法，材料成分包括矿化胶原粉、胶原、抗溃散剂、钙磷盐颗粒，其中胶原取自牛跟腱的I型胶原。主要制备过程为：1.将胶原溶于酸溶液中并加入不同的钙离子以及碳酸钙离子进行静置及分离、冷冻干燥形成矿化胶原粉；2.将抗溃散剂用纯化水溶解配置形成溶液；3.胶原加入抗溃散剂溶液中进行溶胀；4.矿化胶原粉、胶原和溃散剂溶液与钙磷盐颗粒共混搅拌、真空冷冻干燥；5.将冻干之后的材料浸入戊二醛的乙醇溶液中进行交联，清洗纯化后再次进行干燥。使用过程中将材料与自体血液、骨髓、生理盐水进行混合，并进行揉捏形成面团状，然后置于骨缺损部位。但是，专利CN105457097A公布的技术制备方法复杂、且人工合成的无机物的支架结构无法完全模拟人骨的微观结构，其孔隙率、孔的贯通结构、比表面积、钙磷含量等与人骨有较大差异，其骨生成和成骨诱导功能不显著。
CN108992708A公开了一种表面改性骨粉及其制备方法，将天然牛松质骨经前处理、煅烧粉碎获得羟基磷灰石多孔颗粒，然后将其置于浓度为10-40mg/ml的生物大分子溶液(如透明质酸钠、硫酸软骨素、聚乳酸、粘多糖等)中进行负压浸泡吸附2-4h，经烘干制备形成表面改性的骨颗粒。但是，专利CN108992708A公布的技术由于采用的生物大分子溶液的塑形效果不好，形成的膏状物在实际临床使用过程中对于Type II-0、Type II-I、TypeII-II型牙槽骨缺损使用非常不方便，而且易被血液冲散，对于出血量较大的前牙术区使用效果不佳，使得远期成骨质量降低，从而导致种植体暴露，需要二次手术，加大了患者的经济负担。
综上，还需开发塑形效果更好并且能够更好的促进骨生成的骨再生材料。
发明内容
针对上述产品技术的不足，本发明提供一种骨再生材料。本发明提供的骨再生材料具有优异的内聚性以及粘弹性、良好的吸水性及血凝块的稳定性，较大的比表面积以及多孔的微观结构，为细胞粘附、迁移和增殖提供有利环境，具有优异的骨生成以及骨诱导作用。
本发明的第一方面提供了一种骨再生材料，其特征在于，所述骨再生材料包含以下组分：交联透明质酸钠凝胶、非交联透明质酸钠凝胶和骨颗粒；其中，所述交联透明质酸钠凝胶和所述非交联透明质酸钠凝胶的质量比例为0.1～3:9.9～7；优选地，所述骨再生材料中总透明质酸钠含量为2％-8％。
研究人员通过大量实验发现，当交联透明质酸钠凝胶和非交联透明质酸钠凝胶的比例为3:7以上时，与骨颗粒混合后，材料的附水、附血液性能下降，骨缺损部位的再生需要充足的血液供应以及维持血凝块的稳定，因而会影响成果的效果。当交联透明质酸钠凝胶和非交联透明质酸钠凝胶的比例为0.1:9.9以下时，即非交联透明质酸钠占比较多，材料的塑形效果较差，在长时间过量水溶液浸泡下，容易散，不利于用于出血量较大的前牙术区。因此交联透明质酸钠凝胶和非交联透明质酸钠凝胶的比例为0.1～3:9.9～7。
可选地，上述的骨再生材料，其特征在于，所述骨颗粒为动物骨，优选地，所述动物骨为牛松质骨。
可选地，上述的骨再生材料，其特征在于，所述骨颗粒为经脱脂和脱蛋白的牛松质骨，优选地，所述骨颗粒为经200℃-500℃热处理的骨颗粒。
可选地，上述的骨再生材料，其特征在于，所述交联透明质酸钠凝胶使用1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、碳化二亚胺(EDC)、二乙烯基砜(DVS)中的一种或几种作为交联剂制备得到；优选地，制备过程中所述交联剂与透明质酸钠的质量比为0.1～0.5:1。选择这个范围内的交联剂与透明质酸钠的质量比，可以使形成的交联透明质酸钠的性质更适合用于本发明的骨再生材料，效果优于任何其它质量比。
可选地，上述的骨再生材料，其特征在于，所述交联透明质酸钠凝胶和非交联透明质酸钠凝胶使用特性粘数为1.56-3.19m3/kg的透明质酸钠制备得到。选择这个范围内的透明质酸钠的特性粘数，可以使形成的交联透明质酸钠和非交联透明质酸钠的性质更适合用于本发明的骨再生材料，效果优于任何其它特性粘数。
可选地，上述的骨再生材料，其特征在于，所述骨再生材料在制备过程中使用的原料为透明质酸钠浓度为1％-5％的交联透明质酸钠凝胶和透明质酸钠浓度为3％-8％的非交联透明质酸钠凝胶。
在制备交联透明质酸钠的试验过程中发现，交联透明质酸钠的最终可实现有效的脱水浓度下限值为1％，而当最终浓度为5％以上时，交联透明质酸钠凝胶流动性下降，粘弹性增加，不便于后续与骨颗粒的混合。因此交联透明质酸钠的浓度为1％-5％。
制备非交联透明质酸试验过程中发现，当浓度为8％以上时，凝胶变得粘稠、流动性变差，不便于后续的混合工序，而当浓度在3％以下时，溶液变稀，与骨颗粒混合的效果不佳。因此非交联透明质酸钠的浓度为3％-8％。
可选地，上述的骨再生材料，其特征在于，所述骨再生材料在制备过程中使用的原料中的总凝胶重量与骨颗粒的质量比为10:5～8。
在混合试验过程中发现，当凝胶与骨颗粒的混合比例为10:5以下时，动物实验的成骨效果下降，口腔骨缺损修复过程中除了要有稳定的血凝块，还需要骨材料提供稳定的支架让自身的细胞进行迁移、粘附和增殖从而生成新生骨，因此要保证骨颗粒的量不能太少。而当骨颗粒的比例增大时，会影响与凝胶的混合过程，且形成的骨块在过量附水和附血液的情况下溶液冲散，不利于术区骨材料的稳定性。因此凝胶和骨颗粒的比例为10:5-10:8。
本发明的第二个方面，提供了第一个方面所述骨再生材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)交联透明质酸钠凝胶的制备：
1.1在碱溶液中加入交联剂混合均匀，再加入透明质酸钠，搅拌，获得凝胶；
1.2将步骤1.1中获得的产物置于容器中静置交联10～16h，交联温度为40～60℃；
1.3将步骤1.2中获得的产物置于PBS缓冲溶液中进行溶胀；
1.4将步骤1.3之后获得的产物在50～70℃、真空负压下进行脱水获得交联透明质酸钠凝胶；
优选地，所述交联透明质酸钠凝胶的透明质酸钠浓度为1％-5％；
(2)非交联透明质酸钠凝胶的制备：
2.1将透明质酸钠干粉加入纯化水中进行搅拌，使其均匀分散，形成凝胶；
2.2将步骤2.1中获得的凝胶静置溶胀4～20h获得非交联透明质酸钠凝胶；
优选地，所述非交联透明质酸钠凝胶的透明质酸钠浓度为3％-8％；
(3)骨颗粒制备：
3.1取骨块，切割粉碎形成骨颗粒，使用有机试剂按照有机试剂：骨颗粒2～5:1质量比进行脱脂，优选地，所述有机试剂选自异丙醇和/或乙醇；
3.2用1M的强碱溶液浸泡1h进行病毒灭活；
3.3将步骤3.2病毒灭活之后的骨颗粒置于反应容器中进行脱蛋白处理，脱蛋白采用化学试剂联合高温煮沸处理过程，化学试剂采用强氧化试剂以及伯氨类试剂，优选过氧化氢和乙二胺试剂，试剂与骨颗粒的比例为2～5:1，处理温度为100～120℃。
3.4将步骤3.3脱蛋白处理之后的骨颗粒进行清洗；
3.5将步骤3.4清洗之后的骨颗粒进行热处理，热处理温度为200～500℃，热处理时间为5～14h；热处理完之后的骨颗粒进行筛分；
(4)混合
4.1将上述1.4步骤获得的交联透明质酸钠凝胶、步骤2.2获得的非交联透明质酸钠凝胶、步骤3.5获得的骨颗粒按照以下质量比例进行混合搅拌：交联与非交联透明质酸钠凝胶的质量比例为0.1～3:9.9～7；总凝胶重量与骨颗粒的质量比为10:5～8；
4.2将步骤4.1混合之后的材料置于模具中采用真空冷冻干燥或真空烘干方式干燥；
4.3将步骤4.2干燥之后的样品进行包装及灭菌形成最终产品。
其中，步骤(1)(2)(3)可以依次、同时或以任意顺序进行，并不受步骤序号所束缚。
具体地，该制备方法包括以下步骤：
步骤一：交联透明质酸钠凝胶的制备
1.1在NaOH溶液中加入一定质量的交联剂混合均匀，缓慢加入特性粘数为1.56-3.19m3/kg范围内注射级别的透明质酸钠，连续搅拌至无明显白色团状物质，其中交联剂与透明质酸钠的质量比为0.2:1；
1.2将步骤1.1中的凝胶置于水浴锅中静置交联12h，交联温度为50℃；
1.3将步骤1.2中交联完成的透明质酸钠凝胶置于PBS缓冲溶液中进行溶胀，PBS缓冲溶液与透明质酸钠凝胶的重量比为1:40；
1.4将步骤1.3之后的交联透明质酸钠凝胶在70℃、真空负压下进行脱水获得交联透明质酸凝胶，其中透明质酸钠的浓度为1％～5％，优选2％-4％。
步骤二：非交联透明质酸钠凝胶的制备
2.1将特性粘数为1.56-3.19m3/kg范围内注射级别的透明质酸钠干粉加入纯化水中进行搅拌，使其均匀分散；
2.2将步骤2.1中的凝胶静置溶胀16h获得非交联透明质酸钠凝胶，凝胶应呈完全透明状，无肉眼可见白色颗粒物质，所述的非交联透明质酸钠凝胶的浓度为3％～8％，优选4％-7％。
步骤三：牛松质骨颗粒制备
3.1取牛股骨的松质骨部分，切割粉碎形成骨颗粒，选用常规的有机试剂按照1:3质量比进行脱脂，有机试剂可以选择异丙醇、乙醇等；
3.2选择WHO世卫组织推荐的病毒灭活方法(4％氢氧化钠浸泡1h)进行病毒灭活；
3.3将步骤3.2病毒灭活之后的骨颗粒置于双层循环反应釜中进行脱蛋白处理，脱蛋白采用化学试剂联合高温煮沸处理过程。化学试剂采用强氧化试剂以及伯氨类试剂，优选30％过氧化氢和85％乙二胺试剂，试剂与骨颗粒的比例为3:1，高温处理温度为120℃。
3.4将步骤3.3脱蛋白处理之后的骨颗粒进行清洗，以去除试剂残留；
3.5将步骤3.4清洗之后的骨颗粒置于真空烘箱中或马弗炉中进行热处理，热处理温度为350℃，热处理时间为5h；热处理完之后的骨颗粒进行筛分，筛分的粒径范围0.25-0.5mm、0.5-1.0mm、1.0-1.5mm、1.5-2.0mm、0.25-1.0mm、1-2mm。
步骤四：混合
4.1将上述1.4步骤获得的交联透明质酸钠凝胶、步骤2.2获得的非交联透明质酸钠凝胶、步骤3.5获得的骨颗粒按照一定比例采用双螺旋搅拌反应釜进行混合搅拌，交联与非交联透明质酸钠凝胶的比例为0.1～3:9.9～7；总凝胶重量与骨颗粒的质量比为10:5～8。
4.2将步骤4.1混合之后的材料置于模具中采用常规方式干燥形成块状形式，干燥方式可为真空冷冻干燥、真空烘干方式。骨块可进一步通过物理粉碎筛分形成不同粒径范围的颗粒状形式，粒径范围0.25-0.5mm、0.5-1.0mm、1.0-1.5mm、1.5-2.0mm、0.25-1.0mm、1-2mm本发明第三方面提供了第一个方面所述骨再生材料在制备治疗骨缺损的材料中的应用。优选地，所述骨缺损可以是颅骨缺损、口腔骨缺损或四肢非承重部位骨缺损。与之相对应地，本发明还提供了一种治疗骨缺损的方法，所述方法使用上述的骨再生材料进行。
本发明提供的骨再生材料由交联透明质酸钠形成的三维网状凝胶、非交联透明质酸钠凝胶、经过脱脂脱蛋白以及低温处理的具有生物活性的骨颗粒共同组装而成，具备与人体天然骨组织高度相似的仿生结构。该材料中含有交联的透明质酸钠凝胶，具有优异的内聚性以及粘弹性。这种组装材料可在体外附水、附血液下随意切割以匹配缺损大小，或者直接以干态块状填充至牙槽骨缺损部位进行原位塑型，方便临床医生操作，节省手术时间，尤其对于一些复杂骨缺损或Type II-0、Type II-I、Type II-II型的牙槽骨缺损操作更为灵活。在植入牙槽骨缺损后，非交联透明质酸钠凝胶快速吸附血液的能力将血凝块稳定在生物活性骨支架上，通过内源性的生长因子诱导后期的成骨，具有优异的骨生成以及骨诱导作用，对于出血量较大的前牙术区，仍能保持生物活性骨支架的稳定性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为牙槽骨缺损分类示意图。
图2为材料在模拟口腔牙窝放置的示意图(可干态直接放置或者体外附水/附血液切割之后放置)。
图3为不同材料吸水性能对比。
图4为不同材料抗溃散性能对比。
图5为不同材料对新西兰兔颅骨缺损的修复效果。
图6为不同材料对兔口腔骨缺损的修复效果。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非另外定义，本说明书中有关技术术语和科学术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中的定义为准。另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。
本发明实施例中所采用的试验方法、检测方法和常规实验试剂配制方法，如无特别说明，均按照本领域常规操作。
实施例1骨再生材料制备
在NaOH溶液中加入一定质量的交联剂混合均匀，缓慢加入特性粘数为2.3-2.5m3/kg范围内注射级别的透明质酸钠，连续搅拌至无明显白色团状物质，其中交联剂与透明质酸钠的质量比为0.2:1；将其置于水浴锅中静置交联12h，交联温度为50℃；交联完成的透明质酸钠凝胶置于PBS缓冲溶液中进行溶胀，PBS缓冲溶液与透明质酸钠凝胶的重量比为1:40。交联后的透明质酸钠凝胶在70℃、真空负压下进行脱水获得交联透明质酸凝胶，保证最终透明质酸钠的浓度为4％。
将特性粘数为2.3-2.5m3/kg范围内注射级别的透明质酸钠干粉加入纯化水中进行搅拌，使其均匀分散并静置溶胀16h获得非交联透明质酸钠凝胶，凝胶应呈完全透明状，无肉眼可见白色颗粒物质，所述的非交联透明质酸钠凝胶的浓度为4％。
取牛股骨的松质骨部分，切割粉碎形成骨颗粒，选用异丙醇和乙醇按照溶剂：骨颗粒＝3:1质量比进行脱脂；再使用4％氢氧化钠浸泡1h进行病毒灭活；将病毒灭活之后的骨颗粒置于双层循环反应釜中在乙二胺和过氧化氢溶液中进行脱蛋白处理，试剂与骨颗粒的比例为3:1，高温处理温度为120℃。对脱蛋白处理之后的骨颗粒进行清洗，以去除试剂残留；将清洗之后的骨颗粒置于真空烘箱中进行热处理，热处理温度为350℃，热处理时间为5h；热处理完之后的骨颗粒进行筛分，此次选择筛分的粒径范围0.25-1.0mm。
将4％浓度的交联透明质酸钠凝胶、4％浓度的非交联质酸钠凝胶、骨颗粒按照一定比例采用搅拌反应釜进行混合搅拌，交联与非交联透明质酸钠凝胶的质量比例为1:9；总凝胶重量与骨颗粒的质量比为10:6；混合之后的材料置于模具中进行真空冷冻干燥；干燥之后的样品进行包装及灭菌形成最终产品。最终的透明质酸钠含量为4％。
实施例2
按照实施例1的制备方法，交联透明质酸钠的浓度为4％、非交联透明质酸钠的浓度为4％，总凝胶与骨颗粒的质量比为10:6，交联透明质酸钠凝胶和非交联透明质酸钠凝胶的质量比例调整为0.5:9.5，最终的透明质酸钠含量为4％。
实施例3
按照实施例1的制备方法，交联透明质酸钠的浓度为4％、非交联透明质酸钠的浓度为4％，总凝胶与骨颗粒的质量比为10:6，交联透明质酸钠凝胶和非交联透明质酸钠凝胶的质量比例调整为0.1:9.9，最终的透明质酸钠含量为4％。
对比例1
按照实施例1的制备方法，不加交联透明质酸钠，非交联透明质酸钠的浓度为4％，总凝胶与骨颗粒的质量比为10:6，最终的透明质酸钠含量为4％。
对比例2
按照实施例1的制备方法，不加透明质酸钠，仅使用骨颗粒形成产品。
对比例3
按照实施例1的制备方法，交联透明质酸钠的浓度为4％、非交联透明质酸钠的浓度为4％，总凝胶与骨颗粒的质量比为10:6，交联透明质酸钠凝胶和非交联透明质酸钠凝胶的质量比例调整为4:6，最终的透明质酸钠含量为4％。
对比例4
按照实施例1的制备方法，交联透明质酸钠的浓度为4％、非交联透明质酸钠的浓度为4％，总凝胶与骨颗粒的质量比为10:6，交联透明质酸钠凝胶和非交联透明质酸钠凝胶的质量比例调整为0.05:9.95，最终的透明质酸钠含量为4％。
实验例1
吸水性能实验：在不同配比的材料中加入5ml的甲苯胺蓝试液，观察不同材料吸附甲苯胺蓝试液的状态。分组1：交联透明质酸钠和非交联透明质酸钠的比例为4:6(对比例3)；分组2：交联透明质酸钠和非交联透明质酸钠的比例为1:9(实施例1)；分组3：交联透明质酸钠和非交联透明质酸钠的比例为0.5:9.5(实施例2)；分组4：交联透明质酸钠和非交联透明质酸钠的比例为0.1:9(实施例3)；分组5：交联透明质酸钠和非交联透明质酸钠的比例为0.05:9.95(对比例4)。实验结果如图3所示。
抗溃散性能实验：将不同配比的材料置于生理盐水中浸泡，分别在0min、10min、30min不同时间点观察外观状态，观察材料是否完整。实验结果如图4所示。由以上两个实验可知，当交联透明质酸钠凝胶和非交联透明质酸钠凝胶的质量比例为3:7以上时，与骨颗粒混合后，材料的附水、附血液性能下降，口腔骨缺损部位的再生需要充足的血液供应以及维持血凝块的稳定，因而会影响成果的效果。当交联透明质酸钠凝胶和非交联透明质酸钠凝胶的比例为0.1:9.9以下时，即非交联透明质酸钠占比较多，材料的塑性效果较差，在长时间过量水溶液浸泡下，容易散，不利于用于出血量较大的前牙术区。因此选择交联透明质酸钠凝胶和非交联透明质酸钠凝胶的质量比例为0.1～3:9.9～7。
实验例2有效性测试(动物实验)
兔颅骨缺损实验：对实验新西兰兔进行麻醉，剃顶部头毛后，置于专用手术台上，腹卧位，以碘酒、酒精消毒，铺无菌巾。头顶正中偏后位置，取颅骨中线直切口5cm，切开头皮，暴露颅骨冠状缝及矢状缝。在冠状缝后侧，人字缝前侧，矢状缝两侧进行造模。以高速涡轮机磨开颅骨，形成直径大小约1.0cm圆形骨窗，医用纱布止血。将不同材料(本发明实施例1制备得到的骨再生材料、对比例1的仅加非交联透明质酸的骨材料、对比例2的不加透明质酸的的骨材料和同类产品(商购的天然煅烧骨修复材料国械注准20173634049批号201101))置于颅骨缺损处，每一动物制造左右两个骨缺损，植入材料之后缝合伤口。分别于术后1周、4周、12周进行Micro-CT拍照进行颅骨缺损修复观察。实验结果如图5所示。从图5中可以看出，本材料的骨修复性能十分优异，在12周时可以基本修复骨缺损并诱导新生骨的形成，并且与仅加非交联透明质酸的骨材料、不加透明质酸的骨材料以及同类产品相比，有着显著的修复与诱导骨再生的优势。
兔口腔骨缺损实验：动物采用徒手固定，采用静脉注射麻醉，舒泰(50)静脉注射麻醉，剂量5mg/kg。麻醉后，仰卧固定于手术台上，侧卧。开口器撑开口腔上下颚。利多卡因下颌孔注射0.5mL，局部麻醉。取牙钳，完整拔除下颌P1磨牙，所有牙槽窝位点均用刮匙搔刮至净，生理盐水冲洗，测量牙窝尺寸。植入不同材料(本发明实施例2制备得到的骨再生材料、对比例1的仅加非交联透明质酸的骨材料、对比例2的不加透明质酸的骨材料)之后在材料上方用可吸收生物膜覆盖，使其完全覆盖骨缺损区并超过牙槽骨缘2mm，沿骨膜瓣缝合牙龈。术后1周、4周、12周进行Micro-CT拍照进行口腔骨缺损修复观察。实验结果如图6所示。从图6中可以看出，术后4周本材料组缺损部位已经有较多的新生骨从骨壁向中间形成，术后12周缺损部位有大量的新生骨形成，与仅加非交联透明质酸的骨材料、不加透明质酸的骨材料对比有显著的差异，说明本实施案例制备的骨材料具有优异的骨诱导、骨形成的优势。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims (10)

1.一种骨再生材料，其特征在于，所述骨再生材料包含以下组分：交联透明质酸钠凝胶、非交联透明质酸钠凝胶和骨颗粒；其中，所述交联透明质酸钠凝胶和所述非交联透明质酸钠凝胶的质量比例为0.1～3:9.9～7；优选地，所述骨再生材料中总透明质酸钠含量为2％-8％。
2.权利要求1所述的骨再生材料，其特征在于，所述骨颗粒为动物骨，优选地，所述动物骨为牛松质骨。
3.权利要求2所述的骨再生材料，其特征在于，所述骨颗粒为经脱脂和脱蛋白的牛松质骨。
4.权利要求1所述的骨再生材料，其特征在于，所述骨颗粒为经200℃-500℃热处理的骨颗粒。
5.权利要求1所述的骨再生材料，其特征在于，所述交联透明质酸钠凝胶使用1,4-丁二醇二缩水甘油醚、碳化二亚胺、二乙烯基砜中的一种或几种作为交联剂制备得到；优选地，制备过程中所述交联剂与透明质酸钠的质量比为0.1～0.5:1。
6.权利要求1所述的骨再生材料，其特征在于，所述交联透明质酸钠凝胶和非交联透明质酸钠凝胶使用特性粘数为1.56-3.19m3/kg的透明质酸钠制备得到。
7.权利要求1所述的骨再生材料，其特征在于，所述骨再生材料在制备过程中使用的原料为透明质酸钠浓度为1％-5％的交联透明质酸钠凝胶和透明质酸钠浓度为3％-8％的非交联透明质酸钠凝胶。
8.权利要求1所述的骨再生材料，其特征在于，所述骨再生材料在制备过程中使用的原料中的总凝胶重量与骨颗粒的质量比为10:5～8。
9.权利要求1-8任一项所述的骨再生材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)交联透明质酸钠凝胶的制备：
1.1在碱溶液中加入交联剂混合均匀，再加入透明质酸钠，搅拌，获得凝胶；
1.2将步骤1.1中获得的产物置于容器中静置交联10～16h，交联温度为40～60℃；
1.3将步骤1.2中获得的产物置于PBS缓冲溶液中进行溶胀；
1.4将步骤1.3之后获得的产物在50～70℃、真空负压下进行脱水获得交联透明质酸钠凝胶；
优选地，所述交联透明质酸钠凝胶的透明质酸钠浓度为1％-5％；
(2)非交联透明质酸钠凝胶的制备：
2.1将透明质酸钠干粉加入纯化水中进行搅拌，使其均匀分散，形成凝胶；
2.2将步骤2.1中获得的凝胶静置溶胀4～20h获得非交联透明质酸钠凝胶；
优选地，所述非交联透明质酸钠凝胶的透明质酸钠浓度为3％-8％；
(3)骨颗粒制备：
3.1取骨块，切割粉碎形成骨颗粒，使用有机试剂按照有机试剂：骨颗粒＝2～5：1质量比进行脱脂，优选地，所述有机试剂选自异丙醇和/或乙醇；
3.2用1M的强碱溶液浸泡1h进行病毒灭活；
3.3将步骤3.2病毒灭活之后的骨颗粒置于反应容器中进行脱蛋白处理，脱蛋白采用化学试剂联合高温煮沸处理过程，化学试剂采用强氧化试剂以及伯氨类试剂，优选过氧化氢和乙二胺试剂，试剂与骨颗粒的比例为2～5:1，处理温度为100～120℃；
3.4将步骤3.3脱蛋白处理之后的骨颗粒进行清洗；
3.5将步骤3.4清洗之后的骨颗粒进行热处理，热处理温度为200～500℃，热处理时间为5h～14h；热处理完之后的骨颗粒进行筛分；
(4)混合
4.1将上述1.4步骤获得的交联透明质酸钠凝胶、步骤2.2获得的非交联透明质酸钠凝胶、步骤3.5获得的骨颗粒按照以下质量比例进行混合搅拌：交联与非交联透明质酸钠凝胶的质量比例为0.1～3：9.9～7；总凝胶重量与骨颗粒的质量比为10:5～8；
4.2将步骤4.1混合之后的材料置于模具中采用真空冷冻干燥或真空烘干方式干燥形成块状；
4.3将步骤4.2干燥之后的样品进行包装及灭菌形成最终产品。
10.权利要求1-8任一项所述的骨再生材料在制备治疗骨缺损的材料中的应用。
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