CN116930129A - 一种spr生物分子检测数据处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种SPR生物分子检测数据处理方法，包括步骤1、计算SPR入射角；步骤2、动态监测传感芯片表面的反射率光谱；步骤3、利用多项式拟合法求解反射率光谱的最小值及其SPR共振峰波长；步骤4、用最小二乘法对多次实验所得的SPR共振峰波长与目标分子浓度进行线性拟合，获得目标分子浓度与SPR共振峰波长的对应关系；步骤5、计算传感芯片检测限；本发明的技术效果是：通过多项式拟合关系式求解反射率光谱的最小值，获取SPR共振峰波长，解决了因光电探测器的像素点有限导致难以确定反射率光谱中反射率最小值的问题，最终利用最小二乘法拟合出分子浓度与SPR共振峰波长的关系。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种分子检测数据处理方法。
背景技术
根据中国专利文献CN 115753693 A，专利名称为一种快速SPR检测方法的背景技术中记载：当一束P偏振光在一定的角度范围内入射至透光介质与金属膜(Au或Ag)的交界面时，该交界面上会产生表面等离子波。当入射光波的传播常数与表面等离子波的传播常数相匹配时，会引起金属膜内自由电子产生共振，即表面等离子共振。利用表面等离子共振(SPR)检测方法进行检测分析时，先在SPR传感芯片的金属膜上固定一层生物分子识别膜，然后将待测样品流过金属膜表面，若样品中有能够与金属膜表面的生物分子识别膜相互作用的分子，则会引起金膜表面反射率变化，反射率最低点对应的波长即为SPR共振峰波长，目标分子浓度的变化会导致SPR共振峰发生红移。因此，根据反射率光谱计算SPR共振峰的位置，可以获得目标分子的浓度。
采用激光或LED作光源的固定波长的单色光为入射光，改变入射光的角度，检测反射光强度随入射角的变化，对反射光强进行归一化处理后可得到反射率与入射角的SPR光谱曲线，最小反射光强度对应的入射角为共振角(通过检测共振角的变化可以测量金膜表面介质的折射率、膜厚或浓度的变化)。这种角度调制的SPR传感芯片，在探测器表面获得的SPR反射光谱是一条吸收光谱，峰的位置偏移能够反映传感器芯片表面介质的变化。SPR的绝对共振峰位置是光谱曲线的峰谷，但是由于阵列光电探测器的像素点有限，难以确定SPR曲线的最小值及其波长位置。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明所要解决的技术问题就是提供一种SPR生物分子检测数据处理方法，它在检测到反射率光谱曲线后，能获取反射率光谱的最小值及SPR共振峰波长，并能确定SPR共振峰波长与目标分子浓度的关系。
本发明所要解决的技术问题是通过这样的技术方案实现的，它包括
步骤1、计算SPR入射角
用三棱镜作为耦合棱镜，通过已知棱镜的折射率n及全反射入射角计算出棱镜侧边入射角，进而计算出光源入射角；
步骤2、动态监测传感芯片表面的反射率光谱
通过R1角分辨光谱仪实时监测传感芯片表面反射率光谱的变化曲线，并将获取的光谱数据保存；
步骤3、利用多项式拟合法求解反射率光谱的最小值及SPR共振峰波长
首先找到反射率光谱中反射率最小的像素点，然后以该点为中心，左右各取N个点，对这2N+1个点进行n阶多项式的最小二乘拟合，再使用拟合方程的多项式，找到更精确的最小值及SPR共振峰波长；
步骤4、最小二乘法线性拟合
用最小二乘法对多次实验所得的SPR共振峰波长与目标分子浓度进行线性拟合，获得目标分子浓度与SPR共振峰波长的对应关系；
步骤5、计算传感芯片检测限
传感芯片的检测限计算公式如下：
yLOD＝yblank+3σ
式中，yLOD是传感芯片的检测限对应的SPR共振峰波长，yblank是背景溶液对应的SPR共振峰波长，σ是背景溶液SPR共振峰波长的标准偏差；
将yLOD作为y值代入步骤4的线性拟合方程中，计算对应的目标分子浓度x。
本发明的技术效果是：
本方法发明通过多项式拟合关系式求解反射率光谱的最小值，获取SPR共振峰波长，解决了因光电探测器的像素点有限导致难以确定反射率光谱中反射率最小值的问题，最终利用最小二乘法拟合出目标分子浓度与SPR共振峰波长的关系。
附图说明
本发明的附图说明如下：
图1为SPR生物分子检测系统结构示意图；
图2为本发明的分子检测数据处理方法的流程图；
图3为棱镜耦合SPR的光路图；
图4为实施例中不同浓度ctDNA的反射率光谱图；
SPR共振峰是反射率光谱的最低点对应的波长；
图5为SPR共振峰波长与ctDNA样品浓度的线性拟合图。
图1中，1、数据处理器；2、光谱仪；3、R1测试平台；4、传感芯片；5、样品溶液。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
如图1所示，SPR生物分子检测系统包括数据处理器1、光谱仪2、R1测试平台3和传感芯片4，传感芯片4采用微电极阵列式的金属膜。在传感芯片4的硅胶腔室滴入样品溶液5，将传感芯片与棱镜耦合后放置于R1测试平台3上，使入射臂的入射光通过棱镜反射后尽可能多地被反射臂接收到，反射光信息被光谱仪2接收，数据处理器1从光谱仪2采集光谱数据，并进行数据处理。
以乳腺癌ctDNA的SPR检测为实施例，如图2所示，SPR生物分子检测数据处理方法，按以下步骤：
步骤1、计算SPR入射角
用三棱镜作为耦合棱镜，通过已知棱镜的折射率n及全反射入射角计算出棱镜侧边入射角，进而计算出光源入射角。
在棱镜耦合的SPR激发过程中，如图3所示，光源从三棱镜的侧面入射，从另一侧面出射。使用K9等腰直角棱镜作为耦合棱镜，已知K9棱镜的折射率n＝1.514。根据光的折射定律，棱镜侧边入射角θin，全反射入射角θc与R1光源入射角θR1之间的关系如下(参见文献“基于SPR光谱分析的液体折射率计”，邹璐,李慧明,菅傲群,王雷阳.激光技术,2018,42(03):357-361.)：
θin＝arcsinnsin(θc-45°)
θR1＝θin+45°
计算可得θin＝39.780°，θR1＝84.780°。因此，确定84.780°作为R1光源最佳入射角。
步骤2、动态监测传感芯片表面的反射率光谱
通过R1角分辨光谱仪及其配套软件实时监测传感芯片表面反射率光谱的变化曲线，并将获取的光谱数据保存。
在传感芯片的电极上施加20kHz、100mV的交流电信号，以激发交流动电效应，加速分子运动。利用光谱仪及其配套软件调整(可以通过键盘输入设置角度)入射角为84.780°，光谱仪检测到的背景溶液和不同浓度ctDNA溶液的反射率光谱如图4所示，从图4看出：随着ctDNA溶液浓度增大，SPR曲线的共振峰沿波长增大方向移动。
步骤3、利用多项式拟合法求解反射率光谱的最小值及其SPR共振峰波长
首先找到反射率光谱中反射率最小的像素点，然后以该点为中心，左右各取N个点，对这2N+1个点进行n阶多项式的最小二乘拟合，再使用拟合方程的多项式，找到更精确的最小值位置。
多项式拟合式为：
y＝axn+bxn-1+…+cx2+dx+e
式中，y是SPR共振峰的波长，x是ctDNA的浓度，a、b、c、d、e为拟合多项式的系数。
根据拟合的方程找到波谷对应的横坐标，即为产生SPR共振的共振波长
对于图4所示的曲线，在尝试了不同的函数拟合之后，发现反射率光谱与3次多项式拟合情况良好，所得拟合方程如下：
y0.01pM＝5.448×10-6x3-0.008x2+3.007x-184.040,R2＝0.922
y0.1pM＝1.615×10-5x3-0.029x2+16.801x-3164.794,R2＝0.964
y1pM＝2.001×10-5x3-0.037x2+22.013x-4313.799,R2＝0.979
y10pM＝1.598×10-5x3-0.029x2+17.853x-3508.227,R2＝0.992
根据拟合方程找到拟合图像中波谷对应横坐标的位置，即为SPR共振峰波长。
步骤4、最小二乘法线性拟合
用最小二乘法对多次实验所得的SPR曲线最小值对应的波长与目标分子浓度进行线性拟合，获得目标分子浓度与SPR曲线共振峰的对应关系。
拟合直线表达式为：y＝k×lgx+b
式中，y是SPR共振峰的波长，x是ctDNA的浓度，k、b为拟合直线的系数。
在本实施中，对不同浓度的ctDNA样品进行多次反射率实验，取多次测量的平均值并作出误差棒散点图，然后进行SPR共振波长与ctDNA浓度关系的线性拟合，得到图5所示的拟合直线。从图5可以看出，SPR共振波长和ctDNA浓度之间符合线性关系，且拟合关系良好，整体误差较小。SPR共振波长随着ctDNA浓度的增加而增加，拟合方程为：
y＝10.838*lg x+672.725，R2＝0.991
步骤5、计算传感芯片检测限
由于检测的浓度范围有限，无法完全覆盖传感芯片的检测极限，还需要通过数据处理来计算传感芯片的检测限。
传感芯片的检测限定义为从背景溶液的SPR共振峰波长，加上背景溶液的3个SPR共振峰波长的标准偏差，获得传感芯片的检测限对应的SPR共振峰波长yLOD，将yLOD作为y值代入步骤4的线性拟合方程中，计算对应的ctDNA浓度x。
传感芯片的检测限计算公式如下：
yLOD＝yblank+3σ
式中，yLOD是传感芯片的检测限对应的SPR共振峰波长，yblank是背景溶液对应的SPR共振峰波长，σ是背景溶液SPR共振峰波长的标准偏差。通过多次实验(均5次以上)进行算术平均法计算不同浓度的ctDNA和背景溶液对应的SPR共振峰波长的平均值，以及不同浓度的ctDNA和背景溶液对应的SPR共振峰波长的标准偏差。
本实施例中，背景溶液1×SSC的共振峰波长及标准偏差为624.443±7.057，将计算出来的共振波长带入拟合方程中，最终计算ctDNA的传感芯片检测限达到0.003pM。
Claims (6)
1.一种SPR生物分子检测数据处理方法，其特征是，包括以下步骤：
步骤1、计算SPR入射角
用三棱镜作为耦合棱镜，通过已知棱镜的折射率n及全反射入射角计算出棱镜侧边入射角，进而计算出光源入射角；
步骤2、动态监测传感芯片表面的反射率光谱
通过R1角分辨光谱仪实时监测传感芯片表面反射率光谱的变化曲线，并将获取的光谱数据保存；
步骤3、利用多项式拟合法求解反射率光谱的最小值及SPR共振峰波长
首先找到反射率光谱中反射率最小的像素点，然后以该点为中心，左右各取N个点，对这2N+1个点进行n阶多项式的最小二乘拟合，再使用拟合方程的多项式，找到更精确的最小值及SPR共振峰波长；
步骤4、最小二乘法线性拟合
用最小二乘法对多次实验所得的SPR共振峰波长与目标分子浓度进行线性拟合，获得目标分子浓度与SPR共振峰波长的对应关系；
步骤5、计算传感芯片检测限
传感芯片的检测限计算公式如下：
yLOD＝yblank+3σ
式中，yLOD是传感芯片的检测限对应的SPR共振峰波长，yblank是背景溶液对应的SPR共振峰波长，σ是背景溶液SPR共振峰波长的标准偏差；
将yLOD作为y值代入步骤4的线性拟合方程中，计算对应的目标分子浓度x。
2.根据权利要求1所述的SPR生物分子检测数据处理方法，其特征是，在步骤3中，多项式拟合式为：
y＝axn+bxn-1+…+cx2+dx+e
式中，y是SPR共振峰的波长，x是目标分子的浓度，a、b、c、d、e为拟合多项式的系数。
3.根据权利要求2所述的SPR生物分子检测数据处理方法，其特征是，在步骤4中，拟合直线表达式为：
y＝k×lgx+b
式中，y是SPR共振峰的波长，x是目标分子的浓度，k、b为拟合直线的系数。
4.根据权利要求2所述的SPR生物分子检测数据处理方法，其特征是，在步骤3中，ctDNA溶液的反射率光谱的多项式拟合式为：
y0.01pM＝5.448×10-6x3-0.008x2+3.007x-184.040,R2＝0.922
y0.1pM＝1.615×10-5x3-0.029x2+16.801x-3164.794,R2＝0.964
y1pM＝2.001×10-5x3-0.037x2+22.013x-4313.799,R2＝0.979
y10pM＝1.598×10-5x3-0.029x2+17.853x-3508.227,R2＝0.992
根据拟合方程找到拟合图像中波谷对应横坐标的位置，为SPR共振峰波长。
5.根据权利要求4所述的SPR生物分子检测数据处理方法，其特征是，在步骤4中，SPR共振波长随着ctDNA浓度变化的拟合式为：
y＝10.838*lgx+672.725，R2＝0.991
式中，y是SPR共振峰的波长，x是ctDNA的浓度，10.838、672.725为拟合直线的系数。
6.根据权利要求5所述的SPR生物分子检测数据处理方法，其特征是，在步骤5中，ctDNA的传感芯片检测限为0.003pM。
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