CN116926182A - 快速对焦的测序成像方法、系统和测序装置 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种测序成像方法、系统和测序装置，方法包括：获取测序芯片各视场的对焦数据，各视场的对焦数据包括各视场连续若干轮碱基延伸循环的最佳焦面数据；根据各视场的对焦数据确定各视场的固定最佳焦面位置；在后续每一轮碱基延伸循环过程中，根据各视场的固定最佳焦面位置对各视场进行成像。本申请发现各视场连续的碱基延伸循环的最佳焦面数据具有较好的重复性，能够用于后续循环过程确定最佳焦面位置，进而减少测序成像的对焦次数，简化测序成像流程，显著提升测序速度。
Description
技术领域
本申请涉及基因测序技术领域，具体而言，涉及快速对焦的测序成像方法、系统和测序装置。
背景技术
基因测序技术的核心原理是对每一个碱基延伸后进行成像，由于碱基已进行荧光标记，对图像的信号分析即可确定碱基种类，从而实现测序。为了使得基因测序装置能够对生物芯片的不同位置即FOV(Filed of View，视场)进行成像检测，可以通过位移台移动生物芯片的位置，在生物芯片移动的过程中，基因测序装置的相机(成像模块)对生物芯片的不同位置进行成像，从而实现对整个生物芯片的扫描与成像。
在实际应用中，生物芯片待测表面的不同位置具有微米级的高度差，因此，当位移台移动生物芯片的位置时，基因测序装置的物镜与待测表面的相对距离会发生微米级的变化。
然而，在测序过程中，尽管延伸后的碱基已被多次扩增，但尺寸仍只有数百纳米，碱基成像景深接近1μm，过于窄的景深造成测序成像系统对对焦要求十分严格。由于显微成像系统具有分辨率高、景深小的特点，在上述生物芯片的移动过程中，物镜的位置保持不变，待测表面与物镜的相对距离发生微米级的变化，即有可能发生离焦，从而导致基因测序装置的成像模糊。
为了减少成像模糊的情况，传统上对测序每个视场的自动对焦方法主要有两种。一种是被称作爬坡对焦的方法，通过来回调节物镜和基因芯片的距离获取一系列图像，从这一些系列图像中寻找最清晰的，将此照片对应的焦面作为最佳焦面。但这种方法通常需要多次调整，耗时显著。另一种常用的对焦方法是基于信号法的自动对焦方法，但需要增加自动对焦模块，且高度依赖自动对焦模块的可靠性。
如何优化测序成像对焦过程是提高二代测序性能的难点。
发明内容
为了解决上述问题，简化测序对焦过程，提高测序速度，本申请的第一目的提供了一种快速对焦的测序成像方法，方法包括：
获取测序芯片各视场的对焦数据，各视场的对焦数据包括各视场连续若干轮碱基延伸循环的最佳焦面数据；
根据各视场的对焦数据确定各视场的固定最佳焦面位置；
在后续每一轮碱基延伸循环过程中，根据各视场的固定最佳焦面位置对各视场进行成像。
本申请发现各视场若干轮循环的最佳焦面数据具有重复性较好的特性，能够用于后续循环过程确定最佳焦面位置，进而减少测序成像的对焦次数，简化测序成像流程，显著提升了测序速度。
在其中一个实施例中，根据各视场的对焦数据确定各视场的固定最佳焦面位置包括：
根据各视场的对焦数据确定各视场最佳焦面数据的偏差；
对于最佳焦面数据的偏差不超过预设阈值的视场，根据该视场的最佳焦面数据确定各视场的固定最佳焦面位置。
在其中一个实施例中，根据各视场的对焦数据确定各视场最佳焦面数据的偏差之后还包括：
对于最佳焦面数据的偏差超过预设阈值的视场，获取该视场新一轮碱基延伸循环的对焦数据；
根据该视场新一轮碱基延伸循环的对焦数据更新该视场连续若干轮碱基延伸循环的最佳焦面数据，直至该视场最佳焦面数据的偏差不超过预设阈值。
在其中一个实施例中，每个视场的固定最佳焦面位置根据该视场连续若干轮碱基延伸循环的最佳焦面数据的均值确定。
在其中一个实施例中，连续若干轮碱基延伸循环为连续3～10轮碱基延伸循环。
在其中一个实施例中，对焦数据通过手动对焦法和自动对焦法中的至少一种方法得到；
在其中一个实施例中，自动对焦法包括爬坡对焦法。
本申请的第二目的在于提供一种快速对焦的测序成像系统，测序成像系统包括：
对焦数据获取模块：用于获取测序芯片各视场的对焦数据，各视场的对焦数据包括各视场连续若干轮碱基延伸循环的最佳焦面数据；
最佳焦面位置确定模块：用于根据各视场的对焦数据确定各视场的固定最佳焦面位置；
成像模块：用于在后续每一轮碱基延伸循环过程中，根据各视场的固定最佳焦面位置对各视场进行成像。
本申请的第三目的在于提供一种测序装置，测序装置包括上述测序成像系统。
本申请的第四目的在于提供一种测序成像系统，测序成像系统包括处理器，处理器用于执行存储器中存储的计算机程序时实现上述测序成像方法。
本申请的第五目的在于提供一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，计算机程序被处理器执行时实现上述测序成像方法。
本申请的第六目的在于提供一种计算机程序产品，包含指令，当指令被计算机执行时，指令使得计算机执行上述测序成像方法。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的测序成像方法的流程图；
图2为本申请实施例提供的测序成像系统的功能模块示意图；
图3为本申请实施例提供的计算机设备的内部结构图；
图4为本申请实施例1提供三轮循环中视场成像的虚焦示意图；
图5为本申请实施例1提供的三轮循环的对焦分析结果。
具体实施方式
现将详细地提供本申请实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本申请。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本申请进行多种修改和变化而不背离本申请的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本申请覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本申请的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本申请更广阔的方面。
为了至少解决上述技术问题的至少一个，本申请的第一方面提供了一种快速对焦的测序成像方法，测序成像方法的流程图如图1所示，包括：
S10：获取测序芯片各视场的对焦数据，各视场的对焦数据包括各视场连续若干轮碱基延伸循环的最佳焦面数据；
S20：根据各视场的对焦数据确定各视场的固定最佳焦面位置；
S30：在后续每一轮碱基延伸循环过程中，根据各视场的固定最佳焦面位置对各视场进行成像。
具体地，测序芯片(Flowce11)即测序反应的反应器，测序芯片可包含一条或多条平行的流道(channel)，流道用于出入以及承载试剂以形成序列测定反应所需的环境。测序过程包含镜头对测序芯片的一个固定位置进行多轮拍照，每次拍摄的位置可称之为FOV(field of view)，每一轮拍照可称为一个循环(cycle)，两个cycle之间包含重新通入试剂进行化学反应。
最佳焦面数据是指镜头对视场成像最清晰时所在位置的数据，各视场每轮碱基延伸循环的最佳焦面数据可以根据手动对焦方法和/或自动对焦法确定。
其中，手动对焦方法通常是在每一个FOV沿物镜方向来回移动镜头(或测序芯片)采集一系列镜头和芯片不同距离的图片，通过对一系列图片进行算法分析找到成像最清晰的镜头和芯片距离，即最佳焦面；自动对焦法是采用基于信号法的自动对焦方法，在每一个FOV，通过信号计算出离焦量从而准确定位最佳焦面。
一些具体实施方案中，自动对焦法包括爬坡对焦法。
本申请发现各视场若干轮循环的最佳焦面数据具有重复性较好的特性，能够用于后续循环过程确定最佳焦面位置，进而减少测序成像的对焦次数，简化测序成像流程，显著提升测序速度。
一些实施方案中，为了保证测序成像的清晰度，连续若干轮碱基延伸循环为连续3～10轮碱基延伸循环。
一些实施方案中，根据各视场的对焦数据确定各视场的固定最佳焦面位置包括：
S301：根据各视场的对焦数据确定各视场最佳焦面数据的偏差；
S302：对于最佳焦面数据的偏差不超过预设阈值的视场，根据该视场的最佳焦面数据确定各视场的固定最佳焦面位置。
具体地，预设阈值的确定可以通过多个循环对焦结果确定，例如连续对焦10轮，分析成像图片的信噪比或碱基识别准确性确定可接受的阈值。为了使阈值获取结果更有代表性，可以在测序芯片上选取多个不同FOV进行测试，进而确定阈值。
需要说明的是，阈值的获取过程针对特定平台仅需要预先测试一次，即该参数可以通过出厂校准，作为校准参数写入测序平台。后续测序过程，则不需要重复进行。
偏差按照平方差、极差或其他方式计算。
一些具体实施方案中，偏差为极差，预设阈值为0.2μm。
一些实施方案中，根据各视场的对焦数据确定各视场最佳焦面数据的偏差之后还包括：
S303：对于最佳焦面数据的偏差超过预设阈值的视场，获取该视场新一轮碱基延伸循环的对焦数据；
S305：根据该视场新一轮碱基延伸循环的对焦数据更新该视场连续若干轮碱基延伸循环的最佳焦面数据，直至该视场最佳焦面数据的偏差不超过预设阈值。
具体地，若视场连续若干轮碱基延伸循环的最佳焦面数据之间偏差过大，则通过增加对焦次数对视场进行对焦以获取新一轮碱基延伸循环的对焦数据，并且舍弃其中最早一轮循环的最佳焦面数据，从而更新视场若干轮碱基延伸循环的最佳焦面数据，重复上述步骤直至该视场连续若干轮碱基延伸循环的最佳焦面数据的偏差小于预设阈值。
一些具体实施方案中，每个视场的固定最佳焦面位置根据该视场最佳焦面数据的均值确定。
具体地，目标视场最佳焦面数据的均值是指目标视场若干轮循环的最佳焦面数据进行测量后，把测量偏离于真实最佳焦面的所有最佳焦面数据进行平均所得的结果，均值可以是若干轮循环的最佳焦面数据的算术平均值、中位数或者众数。
相应地，本申请的第二方面提供了一种测序成像系统，如图2所示，测序成像系统包括：
对焦数据获取模块：用于获取测序芯片各视场的对焦数据，各视场的对焦数据包括各视场连续若干轮碱基延伸循环的最佳焦面数据；
最佳焦面位置确定模块：用于根据各视场的对焦数据确定各视场的固定最佳焦面位置；
成像模块：用于在后续每一轮碱基延伸循环过程中，根据各视场的固定最佳焦面位置对各视场进行成像。
一些具体实施方案中，连续若干轮碱基延伸循环为连续3～10轮碱基延伸循环。
一些实施方案中，最佳焦面位置确定模块包括：
偏差计算单元：用于根据各视场的对焦数据确定各视场最佳焦面数据的偏差；
最佳焦面位置确定单元：用于对于最佳焦面数据的偏差不超过预设阈值的视场，根据该视场的最佳焦面数据确定各视场的固定最佳焦面位置。
一些实施方案中，最佳焦面位置确定模块还包括：
对焦数据获取单元：用于对于最佳焦面数据的偏差超过预设阈值的视场，获取该视场新一轮碱基延伸循环的对焦数据；
最佳焦面数据更新单元：用于根据该视场新一轮碱基延伸循环的对焦数据更新该视场连续若干轮碱基延伸循环的最佳焦面数据，直至该视场最佳焦面数据的偏差不超过预设阈值。
本申请的第三方面提供了一种测序成像系统，测序成像系统包括处理器，处理器用于执行存储器中存储的计算机程序时实现上述测序成像方法。
上述装置中的各个模块可全部或部分通过软件、硬件及其组合来实现。上述各模块可以硬件形式内嵌于或独立于计算机设备中的处理器中，也可以以软件形式存储于计算机设备中的存储器中，以便于处理器调用执行以上各个模块对应的操作。
在一些实施方案中，提供了一种计算机设备，该计算机设备可以是服务器104，也可以是终端102，其内部结构图可以如图3所示。该计算机设备包括通过系统总线连接的处理器、存储器和通信接口。当该计算机设备为终端时，还包括与系统总线连接的显示屏和输入装置。其中，该计算机设备的处理器用于提供计算和控制能力。该计算机设备的存储器包括非易失性存储介质和内存储器。该非易失性存储介质存储有操作系统和计算机程序。该内存储器为非易失性存储介质中的操作系统和计算机程序的运行提供环境。该计算机设备的网络接口用于与外部的终端通过网络连接通信。该计算机程序被处理器执行时以实现上述方法中的步骤。该计算机设备的显示屏可以是液晶显示屏或者电子墨水显示屏，该计算机设备的输入装置可以是显示屏上覆盖的触摸层，也可以是计算机设备外壳上设置的按键、轨迹球或触控板，还可以是外接的键盘、触控板或鼠标等。
本领域技术人员可以理解，图3中示出的结构，仅仅是与本申请方案相关的部分结构的框图，并不构成对本申请方案所应用于其上的计算机设备的限定，具体的计算机设备可以包括比图中所示更多或更少的部件，或者组合某些部件，或者具有不同的部件布置。
本申请的第三方面提供了一种测序装置，测序装置包括上述测序成像系统。
本申请还提供了一种计算机可读存储介质。计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，计算机程序被处理器执行时实现上述方法中的步骤。
本申请还提供了一种计算机程序产品。计算机程序产品，包括计算机程序，该计算机程序被处理器执行时实现上述方法中的步骤。
需要说明的是，本申请所涉及的用户信息(包括但不限于用户设备信息、用户个人信息等)和数据(包括但不限于用于分析的数据、存储的数据、展示的数据等)，均为经用户授权或者经过各方充分授权的信息和数据。
本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例方法中的全部或部分流程，是可以通过计算机程序来指令相关的硬件来完成，的计算机程序可存储于一非易失性计算机可读取存储介质中，该计算机程序在执行时，可包括如上述各方法的实施例的流程。其中，本申请所提供的各实施例中所使用的对存储器、数据库或其它介质的任何引用，均可包括非易失性和易失性存储器中的至少一种。非易失性存储器可包括只读存储器(Read-OnlyMemory，ROM)、磁带、软盘、闪存、光存储器、高密度嵌入式非易失性存储器、阻变存储器(ReRAM)、磁变存储器(Magnetoresistive Random Access Memory，MRAM)、铁电存储器(Ferroelectric Random Access Memory，FRAM)、相变存储器(Phase Change Memory，PCM)、石墨烯存储器等。易失性存储器可包括随机存取存储器(Random Access Memory，RAM)或外部高速缓冲存储器等。作为说明而非局限，RAM可以是多种形式，比如静态随机存取存储器(Static Random Access Memory，SRAM)或动态随机存取存储器(DynamicRandomAccess Memory，DRAM)等。本申请所提供的各实施例中所涉及的数据库可包括关系型数据库和非关系型数据库中至少一种。非关系型数据库可包括基于区块链的分布式数据库等，不限于此。本申请所提供的各实施例中所涉及的处理器可为通用处理器、中央处理器、图形处理器、数字信号处理器、可编程逻辑器、基于量子计算的数据处理逻辑器等，不限于此。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。
实施例1
取基因测序芯片加载于芯片载台上，调整位置以使芯片某一FOV位于物镜视野下，获取该FOV最佳焦面高度，记为f0。调整物镜和芯片间距，如从f0开始，按照步进0.01μm的距离，向上移动150步，每一步移动后获取当前位置的照片。流程结束后回到f0，再按照步进0.01μm的距离，向下移动150步，每一步移动后获取当前位置的照片。至此，获取了在f0±1.5μm范围内的多张照片，对照片进行识别分析，确定可接受的对焦范围。
分析照片信噪比，确定可以接受的f0±1.2μm。即焦面高度在f0±1.2μm范围内的照片质量可接受或碱基识别准确性可接受，而范围外的不可接受。
实施例2
对基因芯片(4个流道，每个流道4行，每行38个FOV)进行全芯片的3轮测序循环的对焦，不同轮数的循环过程获取的最佳焦面数据分析结果如图4所示。根据图4的对焦结果可知，三轮对焦整体重复性较好，即不同循环间对焦获得的最佳焦面高度偏差小。但也存在某个FOV，三个循环间获取的最佳焦面高度偏差较大的问题。
根据如图5所示的实际拍摄的图片发现，对于某个FOV，三轮对焦获取的最佳焦面高度偏差过大的FOV，通常有虚焦，如上图箭头位置(FOV-244)，在第2、3个循环拍出的图片如下图，而第一个循环拍摄的亮点清晰。这种虚焦，可能是循环间生化反应的流体冲刷或热循环导致。
对于FOV-244，前三个循环获取的最佳焦面高度分别为8264、8315和8321μm，偏差(最大值与最小值的差)为5.7μm，本测序成像系统景深1.0μm，对于信噪比良好的图片，对焦偏离景深外小范围也不影响算法识别，具体容许的对焦范围需在具体平台上进行测定，例如通常可以容许的对焦精度范围是1.0±Δ(本实施例平台Δ＝1.2um)，即为前文提到的阈值。显然FOV-244前三轮对焦结果的偏差大于阈值，故对FOV-244舍弃循环1的对焦结果，增加对焦次数，如在循环4，对FOV-244进行对焦，如循环2-4的偏差仍超过阈值，则舍弃循环2，在循环5继续对FOV-244进行对焦，直到连续三轮循环的最佳焦面数据的偏差小于阈值，则以三轮循环的最佳焦面数据的均值作为FOV-244的最佳焦面位置。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种快速对焦的测序成像方法，其特征在于，所述方法包括：
获取测序芯片各视场的对焦数据，所述各视场的对焦数据包括各视场连续若干轮碱基延伸循环的最佳焦面数据；
根据各视场的对焦数据确定各视场的固定最佳焦面位置；
在后续每一轮碱基延伸循环过程中，根据各视场的固定最佳焦面位置对各视场进行成像。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述根据各视场的对焦数据确定各视场的固定最佳焦面位置包括：
根据各视场的对焦数据确定各视场最佳焦面数据的偏差；
对于最佳焦面数据的偏差不超过预设阈值的视场，根据该视场的最佳焦面数据确定各视场的固定最佳焦面位置。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述根据各视场的对焦数据确定各视场最佳焦面数据的偏差之后还包括：
对于最佳焦面数据的偏差超过预设阈值的视场，获取该视场新一轮碱基延伸循环的对焦数据；
根据该视场新一轮碱基延伸循环的对焦数据更新该视场连续若干轮碱基延伸循环的最佳焦面数据，直至该视场最佳焦面数据的偏差不超过预设阈值。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述每个视场的固定最佳焦面位置根据该视场最佳焦面数据的均值确定。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对焦数据满足以下条件中的至少一个：
(1)所述连续若干轮碱基延伸循环为连续3～10轮碱基延伸循环；
(2)所述对焦数据通过手动对焦法和自动对焦法中的至少一种对焦方法得到。
6.一种快速对焦的测序成像系统，其特征在于，所述测序成像系统包括：
对焦数据获取模块：用于获取测序芯片各视场的对焦数据，所述各视场的对焦数据包括各视场连续若干轮碱基延伸循环的最佳焦面数据；
最佳焦面位置确定模块：用于根据各视场的对焦数据确定各视场的固定最佳焦面位置；
成像模块：用于在后续每一轮碱基延伸循环过程中，根据各视场的固定最佳焦面位置对各视场进行成像。
7.一种测序成像系统，其特征在于，所述测序成像系统包括处理器，所述处理器用于执行存储器中存储的计算机程序时实现如权利要求1至5中任意一项所述测序成像方法。
8.一种测序装置，其特征在于，所述测序装置包括权利要求6或7所述的测序成像系统。
9.一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，其特征在于，所述计算机程序被处理器执行时实现如权利要求1至5中任意一项所述测序成像方法。
10.一种计算机程序产品，包含指令，其特征在于，当所述指令被计算机执行时，所述指令使得所述计算机执行如权利要求1至5中任意一项所述测序成像方法。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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