CN116925948A - 分离的益生菌被膜及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酶制剂领域，具体公开了一种结合有营养素水解的益生菌被膜的制备方法及其应用。益生菌是一类对人体健康有益的活性微生物的总称，被广泛应用于乳制品发酵领域。发酵过程中，与益生菌被膜结合的营养素水解酶通过水解牛乳中的乳清蛋白、酪蛋白等营养物质，不仅能产生具有独特感官和生物活性的短肽，还能显著降低牛乳成分的致敏性。本发明提出利用物理、化学或生物学方法裂解益生菌，获得益生菌被膜或部分被膜结构以及其上结合的蛋白水解酶、乳糖水解酶等营养成分水解酶类，以细菌被膜结构作为这些水解酶的天然固定化载体，用于营养成分的预消化过程。

Description

分离的益生菌被膜及其应用
技术领域
本发明涉及酶制剂领域，具体涉及结合有营养素水解酶的益生菌被膜的制备方法及其应用。
背景技术
牛乳是一种优质的营养食品，含有人体所必须的所有种类的氨基酸，能满足人体对蛋白营养的需求。尽管如此，牛乳与人乳之间的差异还是非常显著的，比如说牛乳中酪蛋白与乳清蛋白的含量比为8:2，而人乳中则为4:6。对人类健康影响最大的是牛乳中的αs-酪蛋白和β-乳球蛋白，它们是牛乳中主要的蛋白成分，在人乳中却不存在。这两种蛋白是牛乳中最重要的过敏原，在5-15％的婴幼儿中引起牛乳不耐受或过敏症状。为了解决牛乳不耐受问题，通常的做法是将牛乳中蛋白进行水解，降低蛋白过敏原的含量，抑制致敏作用，以制备具有低致敏性的婴儿配方奶粉。
除了制备低致敏性婴儿配方奶粉以外，水解牛乳蛋白还被应用于以下场景中。1)生物活性肽的制备：以牛乳酪蛋白为原料，水解制备多种生物活性肽，比如血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽。2)部分水解乳蛋白的制备：以牛乳酪蛋白和乳清蛋白为原料，水解制备易消化的部分水解乳蛋白产品。
血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽，是现阶段人们较为关注的一个来源于乳蛋白的生物活性肽品种。ACE又称为激肽酶Ⅱ或肽基-羧基肽酶，是一种存在于血管内皮细胞表面的膜结合糖蛋白，广泛分布于人体组织中。ACE附着于血管内皮细胞的表面，可被分解释放进入血液循环，发挥催化血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ、以及灭活缓激肽的作用。这些重要的生理作用使其成为治疗高血压、心力衰竭、2型糖尿病、肾病的理想靶点。作为具有拮抗作用的小分子肽，ACE抑制肽可通过抑制ACE的活性，实现调节人体血压的目的。1965年，Ferreim首次从巴西蝮蛇蛇毒中分离出ACE抑制肽。从那以后，人们就尝试从乳蛋白、植物蛋白、以及海洋生物蛋白等不同来源的蛋白质中分离ACE抑制肽，目前该领域的一个热点方向是以牛乳蛋白为原料，水解制备ACE抑制肽。
此外，部分水解乳蛋白产品作为一种易吸收的蛋白质补充剂，有助于体能的快速恢复和肌肉组织的发育，深受运动员、健身爱好者的喜爱。这种有益的性质使其在临床营养领域也具有非常广阔的应用前景。
对以上、以及其他乳蛋白相关的应用而言，优化的乳蛋白水解工艺是产品开发的核心环节。一般来说，蛋白质水解指的是利用水解作用，将完整的蛋白质降解为多肽或氨基酸的过程，水解工艺主要有化学水解、酶水解两种。
化学水解是利用强酸、强碱处理，使蛋白质降解为小片段的过程。该工艺过程简单、操作容易，但剧烈的反应条件常会导致氨基酸的结构损伤，比如使L-氨基酸转化成D-氨基酸，形成氯丙醇等有毒物质。
与化学水解不同，酶水解通常在较为温和的反应条件下进行，利用蛋白酶降解氨基酸之间的肽键，将蛋白质分解成小分子肽。由于每种蛋白酶都具有较为稳定的降解位点和活性，有利于对水解进程和水解产物的控制，产品的批次稳定性好，能够满足生产的要求。常用的蛋白水解酶有：1)动物来源的蛋自酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶(胰肽酶E)和组织蛋白酶A；2)植物来源的蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋自酶；3)微生物来源的蛋自酶，如枯草杆菌蛋自酶。
尽管与化学水解相比，蛋白质的酶水解具备较大优势，但在技术方案上仍然存在一些不足，比如纯化蛋白酶的生产成本高，残留蛋白酶的失活和去除困难，蛋白质水解过程中会产生苦味等。其中，苦味的产生是对工艺过程最为不利的一个方面，不仅影响产品的风味，还制约了水解蛋白的应用。
研究发现，苦味的出现是因为水解过程中产生了一类具有疏水性末端氨基酸的多肽。生理状态下，这些疏水性氨基酸多被隐藏在球状蛋白分子的疏水性内核结构中，食用过程中不会接触到味蕾，所以我们感觉不到它们所带来的苦味。在蛋白质的酶水解工艺中，它们被充分地暴露了出来，就会接触到味蕾而产生苦味。随着水解程度加深，更多的疏水性基团被暴露出来，苦味也会随之加重。
为了减轻、消除苦味，提高产品品质，通常采用活性炭吸附、乙醇选择性吸附、去苦味酶处理等方法，对蛋白水解产物进行后处理。目前的主流技术是利用去苦味酶处理，最常用的是来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的去苦味酶。
去苦味酶能够选择性地水解苦味肽末端的疏水性氨基酸，使其游离出来，从而减少这类多肽对味蕾的刺激，降低苦味的程度。尽管去苦味酶处理在一定程度上能够缓解苦味肽对产品品质的影响，但将大量游离氨基酸释放到水解产物中，又会使其出现令人不悦的肉汤样或滑腻的口感。此外，去苦味酶处理还会增加操作步骤、提高工艺成本，并有可能破坏水解产物中重要的生物活性肽。
综上所述，在牛乳蛋白质的预消化水解过程中，人们利用来源于动物、植物和微生物的蛋白水解酶，使其降解生成容易消化吸收的一系列短肽。由于所使用的水解酶的切割特性，在该过程中也产生了大量含有疏水性末端氨基酸的苦味肽，对产品品质产生了不利的影响。为了解决苦味肽的问题，人们又引入了去苦味酶处理。去苦味酶处理能够特异地水解苦味肽末端的疏水性氨基酸，降低苦味肽的含量，但由于大量游离氨基酸的释放，又会产生不良的肉汤味口感。这种状况提示我们，牛乳蛋白的预消化领域还存在较大的可改进空间。
发明内容
微生物发酵是一项应用广泛的食物处理技术。对于乳制品而言，发酵过程也可以理解为其中蛋白质、乳糖等营养成分的预消化过程。以蛋白成分的预消化为例，微生物代谢产生的酶能够降解包括过敏蛋白原在内的蛋白组分，将它们水解为易吸收的短肽或氨基酸，降低牛乳不耐受情况的发生。与蛋白的化学水解、酶水解不同的是，微生物发酵不仅不会产生苦味物质，反而会形成令人愉悦的特殊品质和风味。受到这个现象的启发，发明人认为如果能够将微生物发酵的原理应用于营养成分的预消化，就能解决目前困扰该领域发展的一个瓶颈问题。
益生菌是一类对人体健康有益的活性微生物的总称，被广泛应用于食品发酵领域。常用的益生菌有：乳酸菌、双歧杆菌、丁酸梭菌、益生芽孢杆菌、放线菌、酵母菌(酿酒酵母属、德尔布有孢圆酵母属、假丝酵母属、威克汉姆酵母属、毕赤酵母属、布拉氏酵母属、白球拟酵母属、薛瓦酵母属、深红酵母属、粟酒裂殖酵母属、鲍氏酵母属)等类别。在人体体内，益生菌与人体组织具有良好的亲和性，可以定殖于肠道黏膜，改善其中的微生态结构和环境，发挥诸如促进营养物质吸收、调节黏膜与系统免疫功能等有益作用。
乳酸菌是一类在食品发酵领域应用最为广泛的微生物，能够通过糖类发酵产生大量的乳酸。乳酸菌广泛地存在于人体内，因为其具有许多有益的代谢特征并为人类长期、安全地使用，被认定为GRAS级微生物。乳酸菌细胞常呈球状和杆状，常使用的菌种有：保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbreckii)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、植物乳酸杆菌(Lactobaillus plantarum)、短乳酸杆菌(Lactobacillus brevis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosus)、乳酸片球菌(Pediococcus lactis)。
在乳酸菌的发酵过程中，其独特的蛋白水解系统发挥了重要的作用。一般认为，乳酸菌的蛋白水解过程分为三个步骤：1)胞外蛋白酶作用阶段，与细胞被膜相关联的蛋白酶将乳蛋白(主要是酪蛋白)水解，生成寡肽；2)跨膜转运段，细胞膜转运系统将寡肽从胞外转运到细胞内；3)内肽酶作用阶段，细胞质内的肽酶将寡肽进一步水解，分解成氨基酸，为细胞生长、代谢提供氮源。
与细胞被膜关联的蛋白酶，又被称作CEP(cell wall-bound proteinases，cellenvelope-bound proteinases，cell-surface proteinases，cell envelope-associatedproteinases，Lactocepins)，CEP属于丝氨酸蛋白酶家族成员。通过与细菌细胞壁或其外层的多糖结合，这些蛋白水解酶既可以与细胞膜直接整合，也可以锚定在细胞壁上。本申请书中，发明人将能锚定或结合CEP的细胞外层结构统称为“细胞被膜”。
乳酸菌发酵过程中，CEP水解酪蛋白、乳清蛋白，产生具有独特感官和生物活性的短肽，这种有益的特性使其在酸奶、以及奶酪的生产中得到了广泛的应用。研究发现，来源于不同菌株的CEP在生化特性、催化性能方面存在显著的差异，这也使得不同区域的奶制品具有特征性的风味。具有共性的是，不同乳酸菌的发酵都能产生令人愉悦的风味物质，而没有“苦味肽”问题的困扰。
利用乳酸菌来源的蛋白酶制备水解蛋白，大体有两个方案。一个方案是从乳酸菌中分离、纯化游离状态的蛋白水解酶，应用于蛋白质原料的水解。考虑到蛋白酶的表达、分离、纯化的工艺较为复杂，游离蛋白酶的价格普遍较高，且酶活力不易保持。在工业化生产中，存在蛋白酶的用量大、生产成本高、以及添加的蛋白酶回收困难等问题。
另一个方案是固定化酶方案，该方案对酶活力的保持、以及反应以后酶的回收都非常有利。固定化酶技术开始于二十世纪五十年代，发展至今积累了大量可用于酶固定化的载体，如海藻酸钠、树脂、壳聚糖、纤维素磁性高分子微球等，其中壳聚糖的应用最为广泛。
考虑到乳酸菌的蛋白水解酶天然结合于细胞被膜表面这一特性，本发明提出利用物理、化学或生物学方法裂解乳酸菌，获得细菌被膜或部分被膜结构以及其上结合的蛋白水解酶、乳糖水解酶等营养成分降解酶类。以细菌被膜结构作为这些水解酶的天然固定化载体，用于营养成分的预消化过程。
多数乳酸菌是安全级的益生菌，将其被膜或被膜的功能性结构应用于营养成分的预消化，在食品安全性方面具有明显的优势。
除能够水解蛋白质营养成分以外，本发明提供的技术方案还能用于降解食物中乳糖成分，开发低乳糖乳制品。
以上仅是以乳酸菌为例，说明本发明的应用。应当理解，除了乳酸菌以外，本发明提供的技术方案还适用于其他益生菌，包括且不限于乳酸菌、双歧杆菌、丁酸梭菌、益生芽孢杆菌、放线菌、酵母菌(酿酒酵母属、德尔布有孢圆酵母属、假丝酵母属、威克汉姆酵母属、毕赤酵母属、布拉氏酵母属、白球拟酵母属、薛瓦酵母属、深红酵母属、粟酒裂殖酵母属、鲍氏酵母属)等益生菌类别。
本发明涉及以下按顺序编号的段落中定义的主题。
1、分离的益生菌被膜在营养成分预消化中的应用。
2、段落1所述的益生菌，其特征在于所述益生菌选自乳酸菌、双歧杆菌、丁酸梭菌、益生芽孢杆菌、放线菌、酵母菌、以及其经基因工程改造得到的变体中的一种或几种。
3、段落2所述的乳酸菌，其特征在于所述乳酸菌选自德氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌、短乳酸杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和乳酸乳球菌、以及其经基因工程改造得到的变体中的一种或几种。
4、段落1所述的分离的益生菌被膜，其特征在于所述分离的益生菌被膜选自完整的益生菌被膜、部分的益生菌被膜、由益生菌被膜形成的囊泡、益生菌被膜的功能性结构或组分。
5、段落1所述的分离的益生菌被膜，其特征在于所述分离的益生菌被膜来源于一种或一种以上的益生菌。
6、段落1所述的营养成分，其特征在于所述营养成分选自蛋白质、短肽、多聚或寡聚碳水化合物。
7、段落1所述的分离的益生菌被膜或被膜结构在配制配方食品中的应用。
8、一种预消化营养成分，其特征在于所述营养成分经由段落1所述的分离的益生菌被膜的预消化作用制备。
9、段落8所述的预消化营养成分，其特征在于所述预消化营养成分在配制预消化配方食品中的应用。
10、段落8所述的预消化营养成分，其特征在于所述预消化营养成分在配制医用配方食品中的应用。
附图说明：
图1、益生菌被膜样品的相对蛋白水解活性。
图2、益生菌被膜囊泡样品的相对蛋白水解活性。
图3、益生菌被膜混合样品的相对蛋白水解活性。
具体实施方式：
下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不能用于限制本发明的范围。在未背离本发明提出技术方案及原理，对本发明所作的任何改变、修饰、替代、组合、简化得到的技术方案，均应为等效的置换方式，包含在本发明的保护范围之内。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一：益生菌的培养制备
按照以下方法，分别培养并制备瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌的培养物。
瑞士乳杆菌培养物的制备。瑞士乳杆菌是干酪领域中常用的菌株，具有较高酶活力。选用瑞士乳杆菌(L.helveticus)ATCC 15019菌株进行本发明研究。将保存的菌种连续活化二代以上，使其活力达到108CFU/mL。按4％的接种量，接种到MRS液体培养基中进行扩大培养，37℃条件下厌氧培养至生长对数期，离心收获菌体(4500r/min，20min，4℃)。用含有Ca2+(30mmol/L)的Tris-HCl(50mmol/L，pH 7.10)缓冲液洗涤收集的菌体，连续洗涤三次，4℃条件下保存备用。
保加利亚乳杆菌培养物的制备。选用保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)Lb0925B菌株进行本发明研究。将保存的菌种连续活化二代以上，使其活力达到109CFU/mL。按6％的接种量，将活化好的菌株接种到MRS液体培养基中，42℃条件下培养至生长对数期，离心收获菌体。用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤三次，4℃条件下保存备用。
嗜热链球菌培养物的制备。选用嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)StCH-1菌株进行本发明研究。将保存的菌种连续活化二代以上，使其活力达到109CFU/mL。按3％的接种量，将活化好的菌株接种到LM 17液体培养基中，42℃条件下培养至生长对数期，离心收获菌体。用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤三次，4℃条件下保存备用。
嗜酸乳杆菌培养物的制备。选用嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)KLDS1.0901菌株进行本发明研究。将保存的菌种连续活化二代以上，使其活力达到109CFU/mL。按5％的接种量，将活化好的菌株接种到M17培养基中，42℃条件下培养至生长对数期，离心收获菌体。用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤三次，4℃条件下保存备用。
乳酸乳球菌培养物的制备。选用乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)IMAU11823菌株进行本发明研究。将保存的菌种连续活化二代以上，使其活力达到109CFU/mL。按2％的接种量，将活化好的菌株接种到M17液体培养基中，37℃条件下培养至生长对数期，离心收获菌体。用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤三次，4℃条件下保存备用。
干酪乳杆菌培养物的制备。选用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)1.0319菌株进行本发明研究。将保存的菌种连续活化二代以上，使其活力达到109CFU/mL。按3％的接种量，将活化好的菌株接种到MRS肉汤中，37℃条件下厌氧培养至生长对数期，离心收获菌体。用pH 7.10Tris-HCl(50mmol/L)缓冲液洗涤收集的菌体，连续洗涤三次，4℃条件下保存备用。
双歧杆菌培养物的制备。选用双歧杆菌(Bifidobacterium)HCS04-002菌株进行本发明研究。将保存的菌种连续活化二代以上，使其活力达到109CFU/mL。按10％的接种量，将活化好的菌株接种到MRS液体培养基中，39℃条件下培养至生长对数期，离心收获菌体。用Tris-HCl缓冲液洗涤三次，4℃保存备用。
实施例二：益生菌细胞被膜的制备
本发明的主旨是将与益生菌被膜结合的水解酶应用于营养成分的预消化过程，这就要求所分离的被膜保留较为完整的营养成分降解体系，要求被膜的分离过程不能过度影响其表面成分的完整性。为了达成这一目标，本实施例中，我们尝试利用不同技术方案，制备分离的无细胞益生菌被膜。
1、冻融法制备无细胞益生菌被膜
取某种益生菌培养物500mg，悬浮于5mL PBS溶液中，吹打混匀。将益生菌混悬液置于液氮中速冻，随后取出，置于37℃水浴锅中解冻。解冻后将混悬液震荡1分钟，再进行第二次速冻和解冻。反复冻融三次后，将处理产物于4℃、2000×g条件下进行离心5分钟，取上清。将上清于4℃、15000×g条件下离心30分钟，取沉淀，即得到分离的无细胞益生菌被膜。向其中加入5mL PBS溶液，混匀后置于4℃条件下保存备用。
利用上述冻融处理方法，分别制备瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌的无细胞被膜，标记为“瑞士乳杆菌冻融法被膜”、“保加利亚乳杆菌冻融法被膜”、“嗜热链球菌冻融法被膜”、“嗜酸乳杆菌冻融法被膜”、“乳酸乳球菌冻融法被膜”、“干酪乳杆菌冻融法被膜”、“双歧杆菌冻融法被膜”。
2、超声法制备无细胞益生菌被膜
取某种益生菌培养物500mg，悬浮于5mL裂解液(0.02mol/L PBS pH7.4，0.025％PMSF)中，PMSF为苯甲基磺酰氟。利用Huber公司生产的VCX400超声破碎仪，在冰水浴条件下对样本进行超声处理。优化的超声处理条件为：超声功率280W，超声循环为超声3s、间隔4s，超声时长7分钟，超声探头温度4℃。将超声处理产物于4℃、2000×g条件下离心5分钟，取上清；然后将上清于4℃、15000×g条件下离心30分钟，取沉淀，即得到分离的无细胞益生菌被膜。向其中加入5mL PBS溶液，混匀后置于4℃条件下保存备用。
利用上述超声处理方法，分别制备瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌的无细胞被膜，标记为“瑞士乳杆菌超声法被膜”、“保加利亚乳杆菌超声法被膜”、“嗜热链球菌超声法被膜”、“嗜酸乳杆菌超声法被膜”、“乳酸乳球菌超声法被膜”、“干酪乳杆菌超声法被膜”、“双歧杆菌超声法被膜”。
3、溶菌酶酶解法制备无细胞益生菌被膜
溶菌酶又称胞壁质酶、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶。通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键，溶菌酶可以将构成细胞壁的不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，破坏细菌被膜结构的完整性，导致内容物逸出、甚至细菌裂解。
取某种益生菌培养物500mg，悬浮于5mL Tris-HCl(10mmol/L，1mmol/L EDTA，pH8.0)溶液中。加入100uL溶菌酶溶液(20mg/mL)的，置于37℃条件下酶解30分钟。将酶解产物于4℃、2000×g条件下离心5分钟，取上清。将上清于4℃、15000×g条件下离心30分钟，取沉淀，即得到分离的无细胞益生菌被膜。向其中加入5mL PBS溶液，混匀后置于4℃条件下保存备用。
利用上述溶菌酶处理方法，分别制备瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌的细胞被膜，标记为“瑞士乳杆菌溶菌酶法被膜”、“保加利亚乳杆菌溶菌酶法被膜”、“嗜热链球菌溶菌酶法被膜”、“嗜酸乳杆菌溶菌酶法被膜”、“乳酸乳球菌溶菌酶法被膜”、“干酪乳杆菌溶菌酶法被膜”、“双歧杆菌溶菌酶法被膜”。
4、电穿孔法制备无细胞益生菌被膜
取某种益生菌培养物500mg，用5mL山梨醇溶液(1mol/L)悬浮，2000×g离心5分钟，弃上清。将菌体沉淀重悬于5mL山梨醇溶液(1mol/L)中，随后2000×g离心5分钟，弃上清。将菌体沉淀再次悬浮于适量的山梨醇溶液(1mol/L)，显微镜下检查和计数，将细菌浓度调整为107/mL。将细菌悬液置于冰水浴中，30分钟以后进行电击操作。每次取160uL预冷细菌悬液加入至预冷的电击杯(2mm)中，冰水浴5分钟后，定电击参数进行电击，将电场强度设定为17.0kV/cm、电容25μF、电阻250Ω。一次电击后，将电击杯置于冰水浴中冷却5分钟，然后取出，在同样条件下进行第二次电击。将电击产物混合，于4℃、2000×g条件下进行离心5分钟，取上清。将上清于4℃、15000×g条件下离心30分钟，取沉淀，即得到分离的无细胞益生菌被膜。向其中加入5mL PBS溶液，混匀后置于4℃条件下保存备用。
利用上述电穿孔处理方法，分别制备瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌的细胞被膜，标记为“瑞士乳杆菌电穿孔法被膜”、“保加利亚乳杆菌电穿孔法被膜”、“嗜热链球菌电穿孔法被膜”、“嗜酸乳杆菌电穿孔法被膜”、“乳酸乳球菌电穿孔法被膜”、“干酪乳杆菌电穿孔法被膜”、“双歧杆菌电穿孔法被膜”。
实施例三：益生菌细胞被膜囊泡的制备
获得实施例二制备的益生菌被膜悬液5mL。利用Avanti miniextruder脂质体挤出器610000，将被膜悬液依次通过10μm、5μm、1μm、0.2μm孔径的Whatman醋酸膜(110615，110613，800319，10404112)，反复挤出8-12次。收集挤出产物，于4℃、15000×g条件下离心15分钟去除细胞被膜碎片，取上清。将上清于4℃、20000×g条件下离心15分钟，弃上清，将沉淀用200μL PBS重悬，得到益生菌被膜囊泡。全程置于冰上或者低温环境中，防止蛋白变性。
利用上述方法，分别制备瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌的被膜囊泡，标记为：“瑞士乳杆菌冻融法被膜囊泡”、“保加利亚乳杆菌冻融法被膜囊泡”、“嗜热链球菌冻融法被膜囊泡”、“嗜酸乳杆菌冻融法被膜囊泡”、“乳酸乳球菌冻融法被膜囊泡”、“干酪乳杆菌冻融法被膜囊泡”、“双歧杆菌冻融法被膜囊泡”；“瑞士乳杆菌超声法被膜囊泡”、“保加利亚乳杆菌超声法被膜囊泡”、“嗜热链球菌超声法被膜囊泡”、“嗜酸乳杆菌超声法被膜囊泡”、“乳酸乳球菌超声法被膜囊泡”、“干酪乳杆菌超声法被膜囊泡”、“双歧杆菌超声法被膜囊泡”；“瑞士乳杆菌溶菌酶法被膜囊泡”、“保加利亚乳杆菌溶菌酶法被膜囊泡”、“嗜热链球菌溶菌酶法被膜囊泡”、“嗜酸乳杆菌溶菌酶法被膜囊泡”、“乳酸乳球菌溶菌酶法被膜囊泡”、“干酪乳杆菌溶菌酶法被膜囊泡”、“双歧杆菌溶菌酶法被膜囊泡”；“瑞士乳杆菌电穿孔法被膜囊泡”、“保加利亚乳杆菌电穿孔法被膜囊泡”、“嗜热链球菌电穿孔法被膜囊泡”、“嗜酸乳杆菌电穿孔法被膜囊泡”、“乳酸乳球菌电穿孔法被膜囊泡”、“干酪乳杆菌电穿孔法被膜囊泡”、“双歧杆菌电穿孔法被膜囊泡”。
实施例四：蛋白水解活性研究
为了检测上述实施例中制备的益生菌被膜及囊泡的蛋白水解能力，申请人开展了本实施例研究。通过检测蛋白水解过程中产生的游离氨基氮，定量分析益生菌被膜、被膜囊泡对乳蛋白的水解能力。
一、检测方案
1、对脱脂乳蛋白、酪蛋白的水解作用研究
实验组：取制备的益生菌被膜或被膜囊泡悬液1mL，加入到2mL脱脂乳溶液(12g/100mL)、或纯化的酪蛋白溶液(12g/100mL)中；于37℃条件下，孵育30分钟；加入3mL三氯乙酸溶液(24g/100mL)，室温静置30分钟终止反应。将反应体系于4℃、20000×g条件下离心15分钟，去除益生菌被膜或囊泡；取上清，用Whatman 2#滤纸过滤，将滤液置于-20℃条件下保存备用。
阴性对照组：向1mL益生菌被膜或被膜囊泡悬液中，加入3mL三氯乙酸溶液(24g/100mL)；于37℃条件下孵育30分钟，使水解酶活力被充分破坏；向反应体系中加入2mL脱脂乳溶液(12g/100mL)、或酪蛋白溶液(1g/100mL)，室温静置30分钟。后续处理步骤同上。
实验的阳性对照组：以1mL混合酶(12mg/mL)溶液替代实验体系中的益生菌被膜或益生菌被膜囊泡悬液，混合酶由纯化的胰蛋白酶(HIGUCHI INC.)与纯化的木瓜蛋白酶(NAGASE&CO.,LTD.)以1:1(质量比)的比例配制。其他操作步骤同上。
2、蛋白水解氨基氮的测定
采用邻苯二甲醛法测定蛋白水解产生的氨基氮，以确定蛋白的水解度(刘丰、陈历俊、隋欣、姜铁民、卢阳，契达干酪浆中使用热激瑞士乳杆菌的研究，中国食品学报，2012，12:87)。邻苯二甲醛试剂的配制：准确称取0.040g邻苯二甲醛，溶解于1mL甲醇溶液中；加入0.950g四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)、0.5g十二烷基磺酸钠和100μLβ-琉基乙醇；全部溶解后定容至50mL，现配现用。
量取步骤1获得的蛋白水解物滤液100μL，加入2mL现配的邻苯二甲醛试剂，室温条件下孵育2分钟，测定340nm波长处的吸光度。
3、氨基酸标准曲线的制作
配制1mg/mL的亮氨酸溶液，依次稀释为50、100、200、300、400、500μg/mL的标准溶液系列。按照步骤2中的方法，测定这些标准溶液340nm波长处的吸光度，制作标准曲线。
4、蛋白质水解度计算
按照下列公式(1)中的计算方法，计算蛋白水解样品中游离氨基氮的含量。
ρ＝A×n (1)
其中：ρ为样品中游离氨基氮的含量/(μg/mL)；A为根据滤液的吸光度，通过标准曲线计算出的游离氨基氮的质量浓度/(μg/mL)；n为稀释倍数。
5、数据处理
针对每个实验组，设置一个阴性对照组，每组设三个独立的重复样本检测。将各实验组游离氨基氮的平均检测值与其对应的阴性对照组游离氨基氮的平均检测值的差值作为该实验组游离氨基氮的含量。
以实验阳性对照组的游离氨基氮含量为参照(100％)，以各实验组游离氨基氮的含量与阳性对照组游离氨基氮含量的百分比，计算各实验组的相对蛋白水解活性。
二、检测结果
以脱脂乳蛋白为底物，测试分离的益生菌被膜对乳蛋白的水解作用。被测试的益生菌被膜样品有：瑞士乳杆菌冻融法被膜、保加利亚乳杆菌冻融法被膜、嗜热链球菌冻融法被膜、嗜酸乳杆菌冻融法被膜、乳酸乳球菌冻融法被膜、干酪乳杆菌冻融法被膜、双歧杆菌冻融法被膜；瑞士乳杆菌超声法被膜、保加利亚乳杆菌超声法被膜、嗜热链球菌超声法被膜、嗜酸乳杆菌超声法被膜、乳酸乳球菌超声法被膜、干酪乳杆菌超声法被膜、双歧杆菌超声法被膜；瑞士乳杆菌溶菌酶法被膜、保加利亚乳杆菌溶菌酶法被膜、嗜热链球菌溶菌酶法被膜、嗜酸乳杆菌溶菌酶法被膜、乳酸乳球菌溶菌酶法被膜、干酪乳杆菌溶菌酶法被膜、双歧杆菌溶菌酶法被膜；瑞士乳杆菌电穿孔法被膜、保加利亚乳杆菌电穿孔法被膜、嗜热链球菌电穿孔法被膜、嗜酸乳杆菌电穿孔法被膜、乳酸乳球菌电穿孔法被膜、干酪乳杆菌电穿孔法被膜、双歧杆菌电穿孔法被膜。
益生菌被膜样品的测试结果如图1所示。结果显示与冻融法、超声法制备的被膜样品相比，溶菌酶法和电穿孔法制备样品的水解活性普遍较高。实验结果还显示，对于同一种菌株而言，不同裂解处理方法对水解酶活性的影响较大。
以酪蛋白为水解底物，测试分离的益生菌被膜囊泡对酪蛋白的水解作用。被测试的益生菌被膜囊泡样品有：瑞士乳杆菌冻融法被膜囊泡、保加利亚乳杆菌冻融法被膜囊泡、嗜热链球菌冻融法被膜囊泡、嗜酸乳杆菌冻融法被膜囊泡、乳酸乳球菌冻融法被膜囊泡、干酪乳杆菌冻融法被膜囊泡、双歧杆菌冻融法被膜囊泡；瑞士乳杆菌超声法被膜囊泡、保加利亚乳杆菌超声法被膜囊泡、嗜热链球菌超声法被膜囊泡、嗜酸乳杆菌超声法被膜囊泡、乳酸乳球菌超声法被膜囊泡、干酪乳杆菌超声法被膜囊泡、双歧杆菌超声法被膜囊泡；瑞士乳杆菌溶菌酶法被膜囊泡、保加利亚乳杆菌溶菌酶法被膜囊泡、嗜热链球菌溶菌酶法被膜囊泡、嗜酸乳杆菌溶菌酶法被膜囊泡、乳酸乳球菌溶菌酶法被膜囊泡、干酪乳杆菌溶菌酶法被膜囊泡、双歧杆菌溶菌酶法被膜囊泡；瑞士乳杆菌电穿孔法被膜囊泡、保加利亚乳杆菌电穿孔法被膜囊泡、嗜热链球菌电穿孔法被膜囊泡、嗜酸乳杆菌电穿孔法被膜囊泡、乳酸乳球菌电穿孔法被膜囊泡、干酪乳杆菌电穿孔法被膜囊泡、双歧杆菌电穿孔法被膜囊泡。
益生菌被膜囊泡样品的测试结果如图2所示。与图1显示的被膜样品的水解作用相比，被膜囊泡的水解活性有了一定程度的提高。溶菌酶法和电穿孔法制备样品仍具有较大的优势。
以酪蛋白为水解底物，测试益生菌被膜混合样品对酪蛋白的水解作用。被测试的混合样品有：1)保加利亚乳杆菌冻融法被膜与嗜热链球菌超声法被膜的混合物，混合比为1:1(体积比)。2)嗜酸乳杆菌超声法被膜与双歧杆菌超声法被膜的混合物，混合比为1:1(体积比)。3)嗜酸乳杆菌溶菌酶法被膜与嗜酸乳杆菌电穿孔法被膜的混合物，混合比为1:2(体积比)。4)保加利亚乳杆菌溶菌酶法被膜与嗜热链球菌电穿孔法被膜，混合比为2:3(体积比)。5)双歧杆菌冻融法被膜与嗜热链球菌溶菌酶法被膜，混合比为2:1(体积比)。6)瑞士乳杆菌冻融法被膜囊泡与保加利亚乳杆菌超声法被膜囊泡，混合比为1:1(体积比)。7)干酪乳杆菌冻融法被膜囊泡与双歧杆菌超声法被膜囊泡，混合比为1:4(体积比)。8)嗜热链球菌溶菌酶法被膜囊泡与瑞士乳杆菌电穿孔法被膜囊泡，混合比为3:1(体积比)。9)嗜酸乳杆菌超声法被膜囊泡与嗜热链球菌电穿孔法被膜囊泡，混合比为1:2(体积比)。10)保加利亚乳杆菌冻融法被膜与干酪乳杆菌溶菌酶法被膜囊泡，混合比为1:1(体积比)。
混合样品的测试结果如图3所示。
实施例五：分离的益生菌被膜或被膜结构在配制配方食品中的应用
获得实施例二中制备的双歧杆菌溶菌酶法被膜200mL。经冷冻干燥，获得双歧杆菌被膜干粉12.8克。利用获得的双歧杆菌被膜干粉，配制一种配方食品组合物，包括如下重量份的组分：蛋白质12760份、脂肪9310份、碳水化合物59890份、膳食纤维5200份、维生素K10.036份、维生素B1 0.656份、维生素B2 0.72份、叶酸0.126份、泛酸1.74份、碘0.038份、双歧杆菌被膜干粉360份。
获得实施例三制备的干酪乳杆菌溶菌酶法被膜囊泡400mL，经冷冻干燥，获得干酪乳杆菌被膜干粉9.6克。利用获得的干酪乳杆菌被膜干粉，配制一种配方食品组合物，包括如下重量份的组分：蛋白质12860份、脂肪9160份、碳水化合物60290份、膳食纤维5360份、维生素K1 0.046份、维生素B1 0.684份、维生素B2 0.68份、维生素B6 0.809份、维生素B120.00092份、磷210.6份、碘0.042份、干酪乳杆菌被膜干粉570份。
实施例六：乳清蛋白、酪蛋白水解产物在配制预消化配方食品中的应用
1、乳清蛋白水解产物的制备。获得实施例二中制备的瑞士乳杆菌溶菌酶法被膜500mL，加入到1000mL纯化的乳清蛋白溶液(12g/100mL)中。于37℃条件下，孵育30分钟；将反应体系于4℃、20000×g条件下离心15分钟，去除益生菌被膜；取上清，用Whatman 2#滤纸过滤；冷冻干燥，获得乳清蛋白水解产物干粉108.2克。
2、酪蛋白水解产物的制备。获得实施例三制备的乳酸乳球菌超声法被膜囊泡500mL，加入到1000mL纯化的酪蛋白溶液(12g/100mL)中。于37℃条件下，孵育30分钟；将反应体系于4℃、20000×g条件下离心15分钟，去除益生菌被膜；取上清，用Whatman 2#滤纸过滤；冷冻干燥，获得乳酪蛋白水解产物干粉105.8克。
2、配制预消化配方食品
利用获得的乳清蛋白水解产物干粉，配制一种配方食品组合物，包括如下重量份的组分：蛋白质4760份、乳清蛋白水解产物干粉8240份、脂肪3310份、碳水化合物70890份、膳食纤维5680份、维生素K1 0.039份、维生素B1 0.664份、维生素B2 0.75份、维生素B60.708份、泛酸1.76份、烟酸3.41份、磷168.6份、碘0.040份。
利用获得的乳酪蛋白水解产物干粉，配制一种配方食品组合物，包括如下重量份的组分：蛋白质6760份、乳酪蛋白水解产物干粉6480份、脂肪8310份、碳水化合物68890份、膳食纤维5820份、维生素K1 0.051份、维生素B1 0.586份、维生素B2 0.71份、叶酸0.112份、泛酸1.69份、烟酸4.12份、磷176.2份、碘0.039份。
实施例七：乳清蛋白、酪蛋白水解产物在配制医用配方食品中的应用
1、乳清蛋白水解产物的制备。获得实施例二中制备的保加利亚乳杆菌溶菌酶法被膜500mL，加入到1000mL纯化的乳清蛋白溶液(12g/100mL)中。于37℃条件下，孵育30分钟；将反应体系于4℃、20000×g条件下离心15分钟，去除益生菌被膜；取上清，用Whatman 2#滤纸过滤；冷冻干燥，获得乳清蛋白水解产物干粉110.5克。
2、酪蛋白水解产物的制备。获得实施例三制备的瑞士乳杆菌超声法被膜囊泡500mL，加入到1000mL纯化的酪蛋白溶液(12g/100mL)中。于37℃条件下，孵育30分钟；将反应体系于4℃、20000×g条件下离心15分钟，去除益生菌被膜；取上清，用Whatman 2#滤纸过滤；冷冻干燥，获得乳酪蛋白水解产物干粉107.2克。
2、配制医用配方食品
利用获得的乳清蛋白水解产物干粉，配制一种医用配方食品组合物，包括如下重量份的组分：蛋白质2540份、乳清蛋白水解产物干粉10320份、脂肪8920份、碳水化合物61750份、膳食纤维4960份、维生素K1 0.031份、维生素B1 0.68份、维生素B2 0.67份、维生素B6 0.70份、维生素B12 0.00092份、叶酸0.154份、泛酸1.78份、烟酸3.86份、磷185.6份、碘0.032份。
利用获得的酪蛋白水解产物干粉，配制一种医用配方食品组合物，包括如下重量份的组分：蛋白质6780份、酪蛋白水解产物干粉6780份、脂肪9360份、碳水化合物60790份、膳食纤维5280份、维生素K1 0.046份、维生素B1 0.784份、维生素B2 0.74份、维生素B60.82份、维生素B12 0.00076份、叶酸0.145份、泛酸1.78份、烟酸3.88份、磷156.6份、碘0.042份。
实施例八：益生菌被膜在乳糖水解中的作用
乳糖是一种二糖，也是人类的一种重要营养素，主要存在于牛奶和乳制品中。在体内，乳糖被小肠内的乳糖酶分解成可以利用的葡萄糖和半乳糖。当体内缺乏乳糖酶或乳糖酶量不足时，食物中的乳糖会以未分解的形式进入大肠部分，在其中被肠道细菌发酵，导致气体产生、大肠内水量增多的情况。这会导致如胃痛、胃肠胀气、腹胀或腹泻等身体不适，被称为乳糖不耐受症。
为了解决这些问题，通常采用游离的、或者固定化的乳糖酶对乳制品进行处理，将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，制备低乳糖奶制品。本实施例中，申请人利用制备的益生菌被膜来处理普通牛奶，能有效降低其中乳糖的含量，研究方案及结果具体如下。
乳糖水解率的测定方法是葡萄糖氧化酶法，用葡萄糖试剂盒在505nm波长处测定吸光值并计算葡萄糖浓度，进而得出乳糖浓度及乳糖水解率。计算公式：葡萄糖浓度(mM)＝测定管吸光度/标准管吸光度×标准液浓度，标准液浓度为：1g/L(5.55mM)。
获得实施例三制备的瑞士乳杆菌溶菌酶法被膜囊泡0.5mL，加入到1mL普通牛奶中；将混合物放入65℃、150rpm振荡器中，反应0-300分钟；每隔一段时间取样，测定葡萄糖的含量，进而得出乳糖水解率。研究结果显示：在50分钟内可水解68％的乳糖，达到低乳糖牛奶的标准；继续反应5小时，能够水解93％以上的乳糖。

Claims (10)

1.分离的益生菌被膜在营养成分预消化中的应用。
2.根据权利要求1，其特征在于所述益生菌选自乳酸菌、双歧杆菌、丁酸梭菌、益生芽孢杆菌、放线菌、酵母菌、以及其经基因工程改造得到的变体中的一种或几种。
3.根据权利要求2，其特征在于所述乳酸菌选自德氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌、短乳酸杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和乳酸乳球菌、以及其经基因工程改造得到的变体中的一种或几种。
4.根据权利要求1，其特征在于所述分离的益生菌被膜选自完整的益生菌被膜、部分的益生菌被膜、由益生菌被膜形成的囊泡、益生菌被膜的功能性结构或组分。
5.根据权利要求1，其特征在于所述分离的益生菌被膜来源于一种或一种以上的益生菌。
6.根据权利要求1，其特征在于所述营养成分选自蛋白质、短肽、多聚或寡聚碳水化合物。
7.分离的益生菌被膜或被膜结构在配制配方食品中的应用。
8.一种预消化营养成分，其特征在于所述营养成分经由权利要求1所述的分离的益生菌被膜的预消化作用制备。
9.根据权利要求8，其特征在于所述预消化营养成分在配制预消化配方食品中的应用。
10.根据权利要求8，其特征在于所述预消化营养成分在配制医用配方食品中的应用。
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