CN116925756B - 一种特异性检测生物体中半胱氨酸的纳米探针及其应用 - Google Patents
一种特异性检测生物体中半胱氨酸的纳米探针及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种特异性检测生物体中半胱氨酸的纳米探针及其应用,涉及生物检测技术领域。该纳米探针是采用丙烯酰基对羟基化绿色荧光碳量子点进行表面功能化修饰所得到。本发明还提供该纳米探针在检测生物体中半胱氨酸含量或生物体内半胱氨酸的荧光成像中的应用。该纳米探针可以高度选择性、快速和灵敏地响应区分半胱氨酸与其他生物硫醇,能够实现对生物体中半胱氨酸的特异性定量检测,并能够应用于生物体内半胱氨酸的荧光成像,有望成为研究和监测半胱氨酸在体内和体外中生理和病理作用的有力工具。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,特别是涉及一种特异性检测生物体中半胱氨酸的纳米探针及其应用。
背景技术
半胱氨酸(Cys)是三种内源性巯基化合物之一,在人体生理和病理过程中发挥着重要作用,例如细胞生长、酶和基因表达的调节、蛋白质合成。Cys是乙酰辅酶A、牛磺酸和谷胱甘肽(GSH)的前体,是硫酸盐的来源,也是许多蛋白质残基的活性位点。体内缺乏Cys可能导致健康问题,例如儿童生长迟缓、水肿性营养不良、头发变色和嗜睡。相反,过量的半胱氨酸与类风湿性关节炎、神经管缺陷、心血管疾病、帕金森病和阿尔茨海默病密切相关。由于生物硫醇,即谷胱甘肽(GSH)、同型半胱氨酸(Hcy)和Cys,都含有巯基,并且它们的结构和化学活性相似,几乎存在于所有哺乳动物细胞中。因此,准确、快速、特异性的检测复杂生物系统中的Cys,对于未来疾病的早期诊断和个体化治疗是一个巨大的挑战,同时也具有非凡意义。
与传统的生物硫醇测定方法相比,如高效液相色谱法、质谱法和拉曼光谱法,荧光光谱法因其操作简便、实时原位检测、高分辨率和高灵敏度等优点而备受研究人员的关注。迄今为止,对Cys的响应荧光探针主要有分子(有机)探针和纳米探针,它们通常由荧光团、识别基团和连接基团三部分组成。分子探针的荧光团一般为有机染料,如香豆素、荧光素、BODIPY、萘酰胺衍生物、花菁或半花菁等,但往往光稳定性不足、水溶性差、合成步骤繁琐。因此,寻找合成工艺简单、光学性能优良、生物相容性好的荧光团去构建优良的特异性检测Cys的荧光探针是十分有必要的。
碳量子点(CQDs)是一种新型的碳基纳米材料,尺寸小于10nm。由于其合成过程简单、几何结构独特、水溶性好、光学稳定性强等显著优点,在电器元件、光催化、药物递送和生物成像等领域引起了越来越多的研究兴趣。尽管CQDs具有各种光学优势,但CQDs表面的有限基团(如-NH2、-COOH和-OH)限制了它们在生物成像和化学分析中的选择性。此外,生物成像已成为疾病预防、跟踪疾病进展、检测疗效和治疗各种肿瘤细胞的热门话题。目前,CQDs的表面功能化已成为生物成像应用中提高分析物选择性识别,细胞器的特异性靶向和荧光信号灵敏度的重要途径之一,因此,设计相关功能化纳米探针成为研究人员感兴趣的课题之一。
当前设计不同化学基团修饰CQDs对多种分析物的荧光响应已经被报道。上官团队通过共价键构建噻唑橙修饰的碳量子点,用于G-四链体和双链DNA的比率荧光检测。张团队合成了表面具有C=C双键的碳量子点。溴水与其表面的双键发生反应,碳量子点被猝灭;苯丙氨酸的存在可以通过与溴的取代反应抑制荧光猝灭,基于此原理苯丙氨酸已被成功检测。Doong小组成功开发了一种双功能电化学生物传感器PHA-NGQDs,通过酰胺和酯键连接,在人血清检测中对乳腺癌细胞(MCF-7)具有超灵敏和高选择性。这些文献表明,CQDs的表面功能化是对待测物获得更高选择性的有效途径。
Strongin小组首创了一种基于丙烯酰基的荧光探针采用共轭加成环化策略来特异性检测Cys。此后,以丙烯酰基为识别基团的分子探针对生物硫醇的响应受到广泛关注。目前很少有基于CQDs的纳米探针能够在不受Hcy和GSH干扰的情况下实现对Cys的特异性和快速识别。目前,发明人团队已报道了一种双激发双发射荧光探针b-CQDs-O-NBD选择性区分和检测Cys/Hcy和GSH/NaSH,并成功实现了活细胞成像。然而,这种纳米探针无法特异性识别Cys以区分Hcy和GSH。因此,仍需进一步研究,以开发一种新型的荧光探针,实现对Cys的高选择性和灵敏性检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性检测生物体中半胱氨酸的纳米探针及其应用,以解决上述现有技术存在的问题,该纳米探针可以高度选择性、快速和灵敏地响应区分半胱氨酸与其他生物硫醇,能够实现对生物体中半胱氨酸的特异性定量检测,并能够应用于生物体内半胱氨酸的荧光成像。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种特异性检测生物体中半胱氨酸的纳米探针,所述纳米探针是采用丙烯酰基对羟基化绿色荧光碳量子点进行表面功能化修饰所得到。
进一步地,所述丙烯酰基以酯键修饰到所述羟基化绿色荧光碳量子点表面。
进一步地,所述羟基化绿色荧光碳量子点采用以下制备方法得到:将间苯二酚和浓硫酸溶解在无水乙醇中,之后进行热解反应,得到所述羟基化绿色荧光碳量子点。
进一步地,通过将所述羟基化绿色荧光碳量子与丙烯酰氯进行反应,来将所述丙烯酰基以酯键修饰到所述羟基化绿色荧光碳量子点表面。
进一步地,所述反应在缚酸剂作用下进行,所述缚酸剂为N,N-二异丙基乙胺。
本发明还提供上述的纳米探针在检测生物体中半胱氨酸含量中的应用。
本发明还提供上述的纳米探针在生物体内半胱氨酸的荧光成像中的应用。
本发明还提供一种检测生物体中半胱氨酸含量的方法,包括以下步骤:
将待检生物体样本和上述的纳米探针加入到PBS缓冲溶液中进行反应,反应完成后检测525nm处的荧光强度,通过标准曲线计算得到所述待检生物体样本中的半胱氨酸含量;
所述标准曲线是根据半胱氨酸标准品的不同浓度和与之对应的525nm处的荧光强度构建得到;构建所述标准曲线时的反应条件与所述待检生物体样本检测时的反应条件相同。
进一步地,所述PBS缓冲溶液的pH为7.4;所述纳米探针加入所述PBS缓冲溶液后的终浓度为2.5μg/mL;所述反应的时间为10min。
本发明还提供上述的纳米探针在多种生物硫醇中鉴别半胱氨酸中的应用,所述多种生物硫醇为以下(1)-(3)任一项所述的组合:
(1)半胱氨酸和谷胱甘肽;
(2)半胱氨酸和同型半胱氨酸;
(3)半胱氨酸、谷胱甘肽和同型半胱氨酸本发明公开了以下技术效果:
本发明以间苯二酚为前驱体,采用溶剂热解法合成表面具有丰富羟基的绿色荧光碳量子点(g-CQDs-OH),以丙烯酰基对其进行表面功能化,得到了一种新型的生物相容的off-on型的纳米探针g-CQDs-O-Acryl。该纳米探针能够在PBS缓冲溶液中以高度选择性,快速和灵敏地响应区分Cys与其他生物硫醇(Hcy/GSH)。通过荧光光谱,紫外光谱和薄层层析色谱法(TLC)揭示了g-CQDs-O-Acryl对Cys的响应机理:Cys与丙烯酸酯部分发生迈克尔加成反应,亲核环化和离去反应。g-CQDs-O-Acryl的荧光强度与Cys的浓度在1-16μM范围内呈现很好的线性,相关系数为R2=0.99486,低检测限(0.095μM),具有快速响应(10min)和低毒性的优势。
经验证该纳米探针g-CQDs-O-Acryl可以成功应用于在细胞和斑马鱼体等生物体内的Cys荧光成像,有望成为研究和监测Cys在体内和体外中生理和病理作用的有力工具。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为g-CQDs-OH的TEM图(a)、粒径直方图(b)和XRD图(c);
图2为g-CQDs-OH和g-CQDs-O-Acryl的XPS全谱以及高分辨C1s和O1sXPS能谱;其中,a为g-CQDs-OH的XPS全谱;b为g-CQDs-OH的高分辨率C1sXPS谱图;c为g-CQDs-OH的高分辨率O1sXPS谱图;d为g-CQDs-O-Acryl的XPS全谱;e为g-CQDs-O-Acryl的高分辨率C1sXPS谱图;f为g-CQDs-O-Acryl的高分辨率O1sXPS谱图;
图3为g-CQDs-OH和g-CQDs-O-Acryl的FT-IR光谱;
图4为g-CQDs-OH和g-CQDs-O-Acryl的光学性质检测结果;其中,a为g-CQDs-OH、丙烯酰氯和g-CQDs-O-Acryl的紫外-可见吸收光谱,g-CQDs-OH的最大激发和发射光谱;b为不同激发波长下g-CQDs-OH在425nm至515nm的荧光光谱;c为g-CQDs-OH的三维荧光光谱;
图5为g-CQDs-OH的抗漂白性(a)、在不同pH下g-CQDs-OH吸收光谱(b)、FL光谱(c)和荧光强度变化(d);其中,λex/em=495/525nm,Cg-CQDs-OH=2.5μg/mL;
图6为g-CQDs-O-Acryl(2.5μg/mL)与Cys(50μM)、GSH(50μM)或Hcy(50μM)反应前后的紫外-可见吸收光谱(a)和荧光光谱(b);
图7为g-CQDs-OH和g-CQDs-O-Acryl的荧光衰减曲线;
图8为g-CQDs-O-Acryl和g-CQDs-O-Acryl/Cys溶液的pH值与荧光强度的关系图;
图9为g-CQDs-O-Acryl的荧光强度与反应时间的依赖关系(a)和化学反应速率的计算结果(b);
图10为g-CQDs-O-Acryl(2.5μg/mL)的荧光光谱变化;
图11为g-CQDs-O-Acryl(2.5μg/mL)对分析物(50μM)的荧光响应;
图12为探针g-CQDs-O-Acryl(2.5μg/mL)在不同Cys浓度下荧光光谱(a)和荧光强度的变化(b);
图13为探针g-CQDs-O-Acryl对生物硫醇的检测机理;
图14为g-CQDs-OH、g-CQDs-O-Acryl和g-CQDs-O-Acryl+Cys的反应产物(反应时间5min)的TCL结果;其中1:g-CQDs-OH;2:g-CQDs-O-Acryl;3:g-CQDs-O-Acryl+Cys;
图15为基于MTT法在不同浓度的g-CQDs-O-Acryl(0-20μg/mL)下A549的细胞存活率;
图16为A549细胞的共聚焦荧光成像;图中标尺均为50μm;
图17为斑马鱼幼鱼的荧光图像;图中标尺均为1000μm。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值,以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
实施例1
1.方法
1.1分析物的配制和光谱的测定
各种分析物的配制:将氨基酸Cys,GSH,Hcy,Glu,Arg,Asp,Gly,His,Lys,Met,Phe,Ser,Thr,Trp,Tyr,Val,葡萄糖,和各种离子(Ca2+,CH3COO-,ClO-,CO3 2-,Fe3+,H2O2,HCO3 -,Mg2 +,HS-,NO2 -,SO4 2-)的可溶性盐分别溶于水中,配制最终浓度为1mM的水溶液。将g-CQDs-O-Acryl溶解在二甲基亚砜(DMSO)中配制成质量浓度为1mg/mL的溶液。取适量体积的g-CQDs-O-Acryl溶液加入到PBS(CPBS=10mM和pH=7.4)缓冲溶液中使探针(g-CQDs-O-Acryl)的最终浓度为10μg/mL。最后,将氨基酸或各种离子溶液加入含有2.0mLg-CQDs-O-Acryl(10μg/mL)溶液的5mL离心管中。在室温下反应一定时间后将溶液转移至石英池中,测定紫外-可见光谱或荧光光谱。
1.2g-CQDs-OH的制备
通过一步溶剂热法合成表面富含羟基绿色碳量子(g-CQDs-OH):首先在无水乙醇(10mL)中溶解0.40g间苯二酚(m-C6H6O2)和100μL浓硫酸,超声处理直至完全溶解。然后将溶液转移到聚四氟乙烯(Teflon)衬里的高压釜(25mL)中并在180℃下加热12小时。反应结束后,将反应器自然冷却至室温,得到棕黑色溶液。将其转移到透析袋中透析12小时。将溶液冷冻干燥,得到深棕色碳量子点g-CQDs-OH。
1.3g-CQDs-O-Acryl的制备
将0.10gg-CQDs-OH溶解在2.0mL无水DMF(作为溶剂)中,然后加入0.1mL丙烯酰氯和100μLDIPEA(N,N-二异丙基乙胺,作为缚酸剂),在室温下搅拌4小时后,通过硅胶柱色谱纯化,用20:1到5:1的洗脱液(VCH2Cl2:VMeOH)分离和纯化产物,将溶剂旋干获得棕褐色固体,命名为g-CQDs-O-Acryl。
1.4荧光寿命的测定
g-CQDs-OH和g-CQDs-O-Acryl的荧光寿命曲线可以通过双指数函数公式计算:
其中τi是特定组份的寿命,Ai是该特定组份的贡献,τ是平均寿命。
1.5反应动力学研究
在g-CQDs-O-Acryl(10μg/mL)的PBS(10mM,pH7.4)缓冲溶液中,加入生物硫醇记录探针在525nm处荧光发射强度。反应在室温下进行,通过将样品的荧光强度拟合到伪一级方程,确定伪一级速率常数:
Ln[(Fmax-Ft)/Fmax]=-k′t
其中Ft是t时的荧光强度,Fmax是反应完成时的最大荧光强度,k′是拟一阶速率常数。
1.6细胞毒性测定
MTT法用于评价g-CQDs-O-Acryl对人肺癌细胞系A549的细胞毒性。使用添加有10%胎牛血清和1%抗生素(100U·mL-1链霉素和100U·mL-1青霉素)的RoswellParkMemorial Institute1640培养基(RPMI-1640)在96孔板中培养细胞24小时,环境条件为37℃和5.0%CO2。除去培养基后,依次向孔中加入不同浓度探针的新鲜培养基,继续培养24h。随后,向孔中加入20μL(5.0mg/mL)MTT并孵育4.0h,然后去除所有培养基并用PBS洗三遍,最后加入150μL/孔DMSO以溶解形成的甲臜晶体。将96孔板在振荡器上低速振荡10分钟使晶体完全溶解。在酶联免疫吸附测定仪OD490nm处测定各孔的吸光度值。对每个单独的浓度进行五次实验,并使用数据的平均值±标准偏差评估细胞活力。
1.7细胞培养和荧光成像
将人肺癌细胞系A549在RoswellPark Memorial Institute1640培养基(RPMI-1640)培养基中于37℃,5.0%CO2条件下培养24小时。其中,完全培养基DMEM需要添加10%胎牛血清(FBS)、100U·mL-1青霉素和100U·mL-1链霉素。然后除去培养基并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.4)洗涤细胞3次。将细胞分为五组,首先用Hoechst33342溶液加入到细胞培养基中,每组细胞在此培养基培养5min对细胞核进行染色,然后用PBS洗涤细胞三次后进行下面的实验。第一组实验中,将细胞与探针(10μg/mL)孵育15min。第二组实验中,细胞与N-乙基马来酰亚胺(NEM,1.0mM)在37℃下预处理40min,然后加入探针(10μg/mL)继续培养15min。第三到第五组实验中,首先细胞用N-乙基马来酰亚胺(NEM,1.0mM)37℃下预处理40min,然后加入探针(10μg/mL)孵育15min后,最后分别加入0.5mL,100μMCys/Hcy/GSH继续孵育15min。每次孵化后,细胞需要用PBS冲洗3次,然后用激光扫描共聚焦显微镜(LeicaSP5Ⅱ)在405nm和488nm的激发波长下获得细胞图像。Hoechst33342通道在425-480nm处收集,绿色通道在500-540nm处收集。
1.8斑马鱼实验
5-7dpf(受精后5-7天)的斑马鱼幼鱼购自EzeRinka生物技术有限公司(中国南京)。所有动物实验均符合锦州医科大学伦理委员会发布的指南。超过24小时的斑马鱼胚胎需要在1×E3培养基中添加PTU以抑制黑色素生成。在第一组实验中,斑马鱼与g-CQDs-O-Acryl(20μg/mL)一起培养20分钟。在第二组实验中,斑马鱼用NEM(200μM)培养20分钟,然后用g-CQDs-O-Acryl培养20分钟。第三组实验按照第二组实验的步骤,再加入Cys(500μM)继续孵育15min。每次孵化后,斑马鱼需要更换新的培养基溶液。使用MS-222(0.01%,3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸酯)进行麻醉。图像用荧光显微镜在×40放大倍率下拍摄。
2.结果
2.1g-CQDs-OH和g-CQDs-O-Acryl的合成与表征
首先,用透射电子显微镜(TEM)和X射线衍射(XRD)对所制备的g-CQDs-OH的表面形貌和尺寸分布进行表征。如图1中a所示。g-CQDs-OH具有类似球形,单分散性好,无明显聚集。高分辨率TEM(HRTEM)图像显示,g-CQDs-OH具有清晰的晶格条纹,晶面间距为0.27nm,晶格条纹与石墨烯碳的(020)衍射面相对应。g-CQDs-OH的尺寸分布直方图(图1中b)显示平均直径为2.71nm(基于TEM图像中的100个粒子),范围为1.32至5.32nm。g-CQDs-OH的X射线衍射(XRD)图(图1中c)显示了24.68°处存在较宽的(002)峰和43.46°处的肩缝峰,表明g-CQDs-OH具有部分石墨化程度和相对规则的碳结构。
通过X射线光电子能谱(XPS)进一步研究了g-CQDs-OH的表面化学组成和结构,如图2中a-c所示。XPS全谱(图2中a)中存在285.25和532.94eV处的两个峰,表明所制备的g-CQDs-OH由C和O元素组成,原子百分比分别为81.32和18.68%。高分辨率C1sXPS谱图(图2中b)可以解卷积为三种类型的峰,分别为C-C/C=C(284.80eV,72.36%)、C-O(286.49eV,21.60%)、C=O(289.18eV,6.04%)。O1s(图2中c)的高分辨率XPS谱图中531.22eV和533.04eV的两个峰归因于C=O(531.22eV,17.50%)和C-OH(533.04eV,82.50%)。上述结果表明g-CQDs-OH的碳核由π-共轭结构域构成,其表面存在大量羟基和羧基,因此在水中具有较好的溶解性和分散性。
将丙烯酰基以酯键连接到碳量子点g-CQDs-OH表面上合成了探针g-CQDs-O-Acryl。图2中d显示了纳米探针g-CQDs-O-Acryl的XPS全谱图。可以看出,纳米探针主要由C和O元素组成,原子百分比分别为85.90%和14.10%,其中C1s峰值出现在285.18eV,O1s峰值出现在532.78eV。在C1s的高分辨XPS能谱中,存在三个特征峰,它们的结合能分别在284.80eV,286.37eV和288.89eV,对应于碳碳单键/双键(C-C/C=C),碳氧单键(C-O),碳氧双键(C=O)(图2中e)。在O1s的高分辨XPS能谱显示两个特征峰,结合能对应于532.80eV,533.70eV,分别归属于碳氧双键(C=O),碳-羟基键(C-OH)(图2中f)。将g-CQDs-OH和纳米探针g-CQDs-O-Acryl的高分辨率O1sXPS能谱中的特征峰的含量进行比较,如表1所示。由于丙烯酰基中碳氧双键(C=O)的引入,使得g-CQDs-O-Acryl的碳氧双键(C=O)的含量(84.36%)比碳量子点中的含量明显增高(17.50%)。此外,由于碳量子点表面的大量羟基与丙烯酰氯发生,所以g-CQDs-O-Acryl的-OH含量(15.64%)明显比碳量子点中-OH含量(82.50%)低。这些分析结果表明丙烯酰基被成功的连接到碳量子表面。
表1g-CQDs-OH和g-CQDs-O-Acryl的O1s光谱的XPS数据分析
将g-CQDs-OH和g-CQDs-O-Acryl的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)进行对比分析,如图3所示。3200-3415cm-1处的宽吸收带归因于g-CQDs-OH的O-H伸缩振动峰,1100和1200cm-1处的峰归属于C-OH的伸缩振动,这些证明了g-CQDs-OH表面-OH官能团的存在。从图3中的还可以看出纳米探针g-CQDs-O-Acryl中仍存在3200-3415cm-1处的羟基峰,这意味着并非CQDs的所有羟基-OH都与丙烯酰基反应,纳米探针g-CQDs-O-Acryl表面仍残存着少量的-OH。另外,g-CQDs-O-Acryl在1405cm-1和1740cm-1的两个特征吸收峰分别归属于乙烯基β-碳的C-H键对称变形和羰基的伸缩振动。位于3000-3100cm-1的吸收峰归属于g-CQDs-O-Acryl中乙烯基β-碳的C-H键伸缩振动吸收峰。通过g-CQDs-OH和纳米探针g-CQDs-O-Acryl的XPS和FT-IR光谱的综合分析,可以证明丙烯酰基通过酯键被成功地修饰到了g-CQDs-OH的表面。
随后,通过紫外-可见吸收光谱和荧光光谱详细考察了g-CQDs-OH和g-CQDs-O-Acryl的光学性质,如图4中a所示。g-CQDs-OH和g-CQDs-O-Acryl在紫外区210nm处均有一个吸收峰,这可归因于碳核中C=C键的π-π*跃迁。g-CQDs-OH在可见光区域493nm处存在一个宽吸收峰,对应于g-CQDs-OH表面上C=O和C-O键的n-π*跃迁。一般来说,这种表面缺陷状态会捕获激发态的能量并产生强荧光。g-CQDs-OH在不同激发波长下的发射光谱如图4中b所示。当激发波长从425nm增加到515nm,g-CQDs-OH在525nm处的发射峰的位置没有发生变化,与激发波长无关,这可能是由于其表面分子态均匀且粒径窄尺寸分布。g-CQDs-OH在PBS缓冲溶液(10mM,pH7.4)中的3D荧光光谱(图4中c)可以看出,最大激发和发射波长分别为495nm和525nm,与UV-vis在493nm处的吸收带相对应。这些结果清楚地表明了g-CQDs-OH光学性质的一致性。
2.2g-CQDs-OH的光学稳定性与pH对荧光的影响
通过持续光照对g-CQDs-OH的光学稳定性进行考察,如图5中a所示。在495nm激发波长的持续照射下,碳量子点的荧光强度几乎没有发生改变,表明g-CQDs-OH具有较强的抗漂白能力。g-CQDs-OH在不同pH下的紫外吸收光谱如图5中b所示。在pH从9到1的过程中,g-CQDs-OH在495nm处的吸收峰强度明显降低,在435nm处出现了一个新的吸收峰并逐渐增高,同时在455nm处观察到了明显的等吸收点。这表明在此pH区间内,g-CQDs-OH存在质子化和去质子化平衡,在435nm和495nm的吸收峰分别归结于酚类(-OH)和酚盐形式(-O-)。pH对g-CQDs-OH荧光发射光谱的影响如图5中c-d所示。当pH值为1-5时,g-CQDs-OH在525nm处基本没有荧光;当溶液的pH从6增加到9时,碳量子点的荧光强度随pH值增加而迅速上升,说明g-CQDs-OH的酚盐形式(-O-)能发射出强烈的荧光,这和紫外吸收光谱的结果是相一致的。
2.3g-CQDs-O-Acryl的光谱性质及对Cys/Hcy/GSH的光学响应
通过紫外-可见吸收光谱和荧光光谱研究了g-CQDs-O-Acryl的光谱性质及对生物硫醇(Cys/GSH/Hcy)的光学响应,在室温下PBS缓冲溶液(20mM,pH=7.4)中反应10分钟(λex=495nm),如图6所示。g-CQDs-OH的UV-vis吸收光谱(图6中a)在495nm处有一个较宽的吸收峰,而g-CQDs-O-Acryl的吸收峰很弱。当将Cys/Hcy/GSH添加到g-CQDs-O-Acryl溶液中,495nm处的吸收峰再次出现。与Hcy/GSH相比,加入Cys后此吸收峰的增强较为明显。在495nm激发波长下,如图6中b所示,g-CQDs-O-Acryl和g-CQDs-OH的发射光谱差异非常明显。相同浓度下,g-CQDs-O-Acryl的荧光发射强度很弱,说明丙烯酰基的引入对g-CQDs-OH的荧光具有明显的淬灭作用,这与文献报道的丙烯酰基对荧光团的作用一致。而在g-CQDs-O-Acryl溶液中分别添加50μMCys/Hcy/GSH后,Cys引起了反应体系近7倍的荧光增强,Hcy/GSH引起了约2倍的荧光增强。以上结果表明,g-CQDs-O-Acryl作为turn-on纳米探针可能具有区分Cys和Hcy/GSH的能力。
2.4g-CQDs-OH被丙烯酰基淬灭的机理研究
为了研究丙烯酰基对g-CQDs-OH的荧光猝灭机理,通过时间相关单光子计数技术(TCSPC)测量了g-CQDs-OH和g-CQDs-O-Acryl的荧光衰变模式以及荧光寿命值,如图7和表2所示。对于静态淬灭主要依据两个特征进行判断。其一,荧光寿命是否会发生变化,即τ0/τ=1,其中τ0和τ分别是连接淬灭基团前后荧光物质/探针的荧光寿命。其二,由于淬灭剂的存在形成了基态络合物,紫外-可见吸收光谱会发生一定的变化。根据1.4中平均荧光寿命计算可得,g-CQDs-OH的平均荧光寿命为3.88ns,g-CQDs-O-Acryl的平均荧光寿命为3.63ns,τ0/τ≠1,但是数值十分接近,这意味着静态淬灭在此系统中占据主要位置,同时兼有部分动态淬灭。图4中a也显示,g-CQDs-OH与g-CQDs-O-Acryl的紫外吸收谱图有明显区别,同样提供了静态淬灭存在的证据。动态淬灭机理通常有能量转移和电子转移,图4中a显示丙烯酰基的紫外吸收光谱与g-CQDs-OH的发射光谱没有重叠,所以在动态淬灭部分,g-CQDs-OH的荧光淬灭不是由能量转移引起,而可能是由电子转移引起的。
综上所述,由于丙烯酰基与碳量子点通过共价键相连,改变了碳量子点的表面状态,提供了一种电子转移途径。碳量子点的淬灭是由静态淬灭占主体同时伴随着电子转移过程。g-CQDs-OH和g-CQDs-O-Acryl的绝对量子产率分别为26.32%和5.47%,碳量子点的量子产率是探针的5倍。这种高量子产率主要由于其表面大量羟基更有助于形成氢键,进而刚性结构得到加强有助于抑制了非辐射衰变通道。
表2样品荧光寿命的计算λex=495nm
2.5g-CQDs-O-Acryl检测Cys的实验条件优化及反应动力学研究
由图5中d可知,g-CQDs-OH的荧光发射与溶液的pH值密切相关。考察了溶液pH值对g-CQDs-O-Acryl检测生物硫醇的影响。鉴于生物体内大部分细胞所处的pH范围,本发明考察了溶液pH=5.6、6.0、6.5、7.0、7.2、7.4、8.0对g-CQDs-O-Acryl和g-CQDs-O-Acryl+Cys体系荧光强度的影响,实验条件:PBS缓冲溶液(CPBS=10mM,pH=7.4)中,λex/em=495/525nm,结果如图8所示。
g-CQDs-O-Acryl溶液在pH=5.6-8.0范围内的荧光变化不明显,说明g-CQDs-O-Acryl在一定pH范围内具有较高的稳定性。将50μMCys加入到g-CQDs-O-Acryl体系后,随着pH的升高,反应体系的荧光强度逐渐增高。这是由两方面原因造成的,第一:Cys的亲核能力随着pH增高逐渐增强,能够更加快速地与g-CQDs-O-Acryl发生反应;第二:反应生成的g-CQDs-OH中处于酚氧负离子状态所占的比例逐渐增多,对荧光强度的贡献越来越大。由于pH=8.0与pH=7.4条件下体系的荧光差异不明显,且大部分生理环境的pH为7.4,所以本发明选择pH=7.4作为g-CQDs-O-Acryl检测Cys的pH值。
反应时间是探针性能的一项重要参数,因此在存在或不存在Cys/Hcy/GSH的情况下评估了g-CQDs-O-Acryl的荧光强度随反应时间的变化,如图9中a所示。在pH=7.4条件下(在PBS(10mM,pH=7.4)缓冲溶液中加入Cys/Hcy/GSH(50μM)时,λex/em=495/525nm),g-CQDs-O-Acryl溶液的荧光不随时间发生变化,进一步说明探针的稳定性较强。在加入生物硫醇后,反应体系的荧光强度增加。在加入Cys后,体系的荧光迅速增强且在10min内基本达到平衡。在加入Hcy或GSH后,体系荧光的增强的速率明显小于Cys。这是由Cys本身的分子结构决定的。与Hcy和GSH相比,Cys的结构更短更简单,巯基更容易与丙烯酰基发生迈克尔加成反应。为了同时保证对Cys具有较高的选择性及快速测定,选择10min作为实验的反应时间是合理的。
响应速率对于有效监测活细胞中的生物硫醇至关重要,通过监测525nm处荧光强度随时间的变化研究了g-CQDs-O-Acryl与Cys、Hcy和GSH的反应动力学,如图9中b所示。使用1.5中公式确定反应的准一级速率常数分别为0.23907min-1、0.02504min-1和0.02338min-1。Cys的速率常数比Hcy和GSH的速率常数快一个数量级,分别为9.55倍和10.23倍,这清楚地表明g-CQDs-O-Acryl可以有效地区分Cys和Hcy/GSH。
2.6g-CQDs-O-Acryl检测Cys/Hcy/GSH的选择性和竞争性实验
研究探针g-CQDs-O-Acryl对生物体系中与Cys共存的各种分析物的选择性和干扰性实验,包括Hcy和GSH,10种离子(Ca2+,CH3COO-,ClO-,CO3 2-,Fe3+,HCO3 -,Mg2+,HS-,NO2 -,SO4 2-),2种小分子物质(Glucose和H2O2)和13种氨基酸(Glu,Arg,Asp,Gly,His,Lys,Met,Phe,Ser,Thr,Trp,Tyr,Val),在PBS缓冲溶液(CPBS=10mM,pH=7.4)中加入各种离子和氨基酸(50μM)后,λex/em=495/525nm。从图10可以看出Cys引起了g-CQDs-O-Acryl荧光信号的明显增强,Hcy和GSH引起了g-CQDs-O-Acryl荧光信号的少量增强,其他物质的加入对g-CQDs-O-Acryl荧光强度基本没有影响,这可能是由于这些氨基酸或离子结构中均不含有巯基,不能与g-CQDs-O-Acryl探针有效发生亲核取代反应。
在选择性实验的基础上,在PBS缓冲溶液(CPBS=10mM,pH=7.4)中不存在和存在Cys(50μM)的情况下,完成了一系列氨基酸和离子对Cys检测的干扰性实验,结果如图11所示。氨基酸和离子的序号顺序对应如下1.Cys,2.Blank,3.GSH,4.Hcy,5.Ca2+,6.CH3COO-,7.ClO-,8.CO3 2-,9.Fe3+,10.Glucose,11H2O2,12HCO3 -,13Mg2+,14.HS-,15.NO2 -,16.SO4 2-,17.Glu,18.Arg,19.Asp,20.Gly,21.His,22.Lys,23.Met,24.Phe,25.Ser,26.Thr,27.Trp,28.Tyr,29.Val。从图11可以看出这些干扰物种的加入均没有显著影响Cys对探针的荧光恢复强度。这表明g-CQDs-O-Acryl作为探针检测生物系统中的Cys具有高度的选择性和抗干扰能力,其他氨基酸和各种离子的存在不会显著影响探针对Cys的检测。
2.7g-CQDs-O-Acryl检测Cys的线性范围和检测限
Cys的浓度和g-CQDs-O-Acryl荧光强度的关系被进一步研究,实验在PBS缓冲溶液(10mM,pH7.4),探针的浓度为2.5μg/mL,反应时间为10min的条件下进行,如图12所示。随着Cys浓度的增加,g-CQDs-O-Acryl在525nm处的荧光强度逐渐增加。当Cys的浓度达到50μM时,g-CQDs-O-Acryl体系的荧光强度增加近7倍。当Cys的浓度继续增加时,g-CQDs-O-Acryl体系的荧光强度变化不明显,基本达到了上限。从图12中b的插图可以看出g-CQDs-O-Acryl的荧光强度与Cys的浓度在1-16μM范围内呈现良好的线性,相关系数为R2=0.9949。基于公式LOD=3σ/ρ(σ为空白溶液的标准偏差;ρ为校准曲线的斜率),计算得到g-CQDs-O-Acryl对Cys的检测限(LOD)为0.095μM,远低于分子内Cys的浓度30-200μM,所测得的LOD值相当或优于先前报道的荧光探针(如表3所示)。以上结果表明,g-CQDs-O-Acryl体系对Cys有良好的灵敏性,可以实现对Cys的定量检测。
表3不同感应系统对Cys检测性能的比较
2.8g-CQDs-O-Acryl检测Cys的机理研究
丙烯酸酯基团是识别Cys的良好的基团。三种生物硫醇均可与g-CQDs-O-Acryl表面上丙烯酰基的双键发生共轭加成反应,如图13所示。对于Cys和Hcy,共轭加成后分别生成七元和八元内酰胺环状化合物。由于七元内酰胺比八元内酰胺更加稳定,所以Cys的分子内环化动力学速率远高于Hcy,因此g-CQDs-O-Acryl对Cys的选择性远高于Hcy。对于GSH,共轭加成中间体硫醚g-CQDs-O-Acryl-GSH由于其长链的空间位阻效应,使得进一步的环化反应变得更加困难。综上所述,只有加成中间体g-CQDs-O-Acryl-Cys更容易发生环化离去反应,释放出具有强绿色荧光的荧光团g-CQDs-OH,从而实现对Cys的特异性识别。图13描述了g-CQDs-O-Acryl特异性识别Cys的传感机制。
荧光光谱、紫外光谱和薄层层析色谱结果(TLC)用于验证上述反应机理。g-CQDs-O-Acryl与Cys反应后的UV-vis和荧光光谱与荧光团g-CQDs-OH的光谱相比除强度有差异外基本相同。在TLC板上从左到右依次为g-CQDs-OH,g-CQDs-O-Acryl和g-CQDs-O-Acryl与Cys的反应产物(反应5min)。经展开剂展开后,分别在365nm、254nm波长紫外线照射及明场下的结果如图14所示。TLC结果显示,g-CQDs-OH的极性比g-CQDs-O-Acryl大,这与极性较强的酚羟基与丙烯酰氯反应后形成极性较弱的酯键是一致的。在g-CQDs-O-Acryl与Cys的反应产物中,部分未反应完的g-CQDs-O-Acryl与第二列中g-CQDs-O-Acryl的展开高度一致;另外出现了与g-CQDs-OH展开高度相同的绿色荧光点,表明Cys与g-CQDs-O-Acryl反应后重新释放出荧光团g-CQDs-OH。
2.9g-CQDs-O-Acryl对生物样品中生物硫醇的检测及活细胞荧光成像
鉴于g-CQDs-O-Acryl对Cys的良好荧光响应,评估g-CQDs-O-Acryl测定胎牛血清(FBS)中Cys的可行性。使用三苯基膦将FBS中的二硫化物转化为游离硫醇化合物。然后将转化后的FBS稀释50倍备用。分别通过标准加样法在g-CQDs-O-Acryl和FBS溶液中分别加入2、6和10μMCys后,在525nm处测量该反应体系的荧光强度。每种添加剂的浓度通过上述线性方程计算,回收率范围为97.5-103.7%。采用Ellman法进行对比,验证g-CQDs-O-Acryl体系对Cys的检测准确度。如表4所示,测定结果与Ellman法相似,说明g-CQDs-O-Acryl作为探针可以准确定量检测血清样品中的Cys。
表4g-CQDs-O-Acryl对胎牛血清中Cys的测定(λex/em=495/525nm)
在g-CQDs-O-Acryl作为纳米探针的生物学应用之前,有必要通过MTT法评估g-CQDs-O-Acryl的细胞毒性。将不同浓度的g-CQDs-O-Acryl添加到A549细胞中并孵育24小时,如图15所示。g-CQDs-O-Acryl的浓度为20μg/mL时,细胞活力仍保持在90%以上,说明g-CQDs-O-Acryl对活细胞具有较低的细胞毒性和良好的生物相容性,具有在细胞中进行成像应用的前提。
随后,本发明探索了g-CQDs-O-Acryl作为纳米探针对活细胞(A549)中生物硫醇进行荧光成像的可行性,结果见图16,其中hoechest33342通道(λex=405nm和λem=425-480nm)(第1列),绿色通道(λex=488nm和λem=500-540nm)(第2列),明场(第3列)和叠加场(第4列)),各组分别加入探针、NEM+探针、NEM+探针+Cys和NEM+探针+GSH,比例尺:50μm。首先,将细胞用Hoechst33442染色以标记细胞核。接着,将A549细胞与g-CQDs-O-Acryl(10μg/mL)共孵育15分钟,之后在Hoechst通道(图16中a、c)和绿色通道(图16中b、d)中分别采集细胞成像图片。通过比较两个通道中成像的结果,可以看出g-CQDs-O-Acryl具有良好的细胞膜穿透性和核穿透性,可以与细胞内的生物硫醇反应,对整个细胞进行染色。为了进一步验证探针对Cys反应的高选择性,首先使用NEM(N-乙基马来酰亚胺,一种细胞内硫醇清除剂)清除细胞内的生物硫醇,然后加入g-CQDs-O-Acryl继续孵育15分钟。如图16中e-h所示,绿色通道中显示极弱的绿色荧光(图16中f),而Hoechst通道中出现明亮的蓝色荧光(图16中e)。再将细胞进行上述NEM预处理和探针孵化后,再向细胞中加入Cys、Hcy或GSH,继续孵育15分钟,结果如图16中i-t。加入Cys的细胞在绿色通道中观察到最为明亮的发光(图16中j),而加入Hcy和GSH组的细胞在绿色通道中仅出现微弱的绿色荧光(图16中n/r)。上述结果表明,g-CQDs-O-Acryl作为纳米探针具有良好的细胞相容性和穿透性,并可以有效对活细胞中的Cys进行高选择性成像。
2.10g-CQDs-O-Acryl在斑马鱼和小鼠模型中的荧光成像
基于g-CQDs-O-Acryl在荧光实验和细胞实验中对Cys良好的选择性和灵敏性,以斑马鱼为活体样本,进一步研究g-CQDs-O-Acryl在活体中检测Cys的可行性,结果见图17,其中,a-c为斑马鱼与CQDs-O-Acryl(20μg/mL)孵育20min后的成像结果;d-f为NEM预处理的斑马鱼(200μM,20分钟)与g-CQDs-O-Acryl(20μg/mL)孵育20分钟后的成像结果;g-i为用NEM(200μM,20分钟)预处理斑马鱼,紧接着用Cys(500μM)处理15分钟,最后用g-CQDs-O-Acryl(10μg/mL)孵育30分钟后的成像结果。
选择五日龄斑马鱼作为实验模型。首先,所有斑马鱼都需要用PTU预处理以去除黑色素。在第一组实验中,斑马鱼用g-CQDs-O-Acryl孵育20分钟,在立体荧光显微镜下进行荧光成像实验。如图17中a-c所示,斑马鱼在肝脏和肠道附近显示出亮绿色荧光,这归因于g-CQDs-O-Acryl与斑马鱼内源性生物硫醇的反应。在作为对照的第二组实验中,用NEM清除斑马鱼体内的生物硫醇。在加入g-CQDs-O-Acryl后,只显示微弱的绿色荧光信号(图17中d-f)。在第三组实验中,斑马鱼依次经NEM处理、g-CQDs-O-Acryl孵育和Cys孵育,在斑马鱼中再次观察到亮绿色荧光(图17中g-i)。这些结果清楚地表明,g-CQDs-O-Acryl作为纳米探针可以很好地识别斑马鱼体内内源性和外源性Cys。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (4)
1.一种特异性检测生物体中半胱氨酸的纳米探针,其特征在于,所述纳米探针是采用丙烯酰基对羟基化绿色荧光碳量子点进行表面功能化修饰所得到;
所述羟基化绿色荧光碳量子点采用以下制备方法得到:将间苯二酚和浓硫酸溶解在无水乙醇中,之后进行热解反应,得到所述羟基化绿色荧光碳量子点。
2.根据权利要求1所述的纳米探针,其特征在于,所述丙烯酰基以酯键修饰到所述羟基化绿色荧光碳量子点表面。
3.根据权利要求2所述的纳米探针,其特征在于,通过将所述羟基化绿色荧光碳量子与丙烯酰氯进行反应,来将所述丙烯酰基以酯键修饰到所述羟基化绿色荧光碳量子点表面。
4.根据权利要求3所述的纳米探针,其特征在于,所述反应在缚酸剂作用下进行,所述缚酸剂为N,N-二异丙基乙胺。
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Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103755672A (zh) * | 2014-01-26 | 2014-04-30 | 大连理工常熟研究院有限公司 | 一种用于识别半胱氨酸的特异性荧光探针及其应用 |
CN105601658A (zh) * | 2016-01-15 | 2016-05-25 | 中南大学 | 一种能够区分生物硫醇的新型荧光探针的制备与应用 |
CN107253961A (zh) * | 2017-06-29 | 2017-10-17 | 湖南科技大学 | 一种可比率检测半胱氨酸的水溶性荧光传感器的制备及应用 |
CN108753282A (zh) * | 2018-07-26 | 2018-11-06 | 大连理工大学 | 一种合成可见光源激发下红色荧光碳点的方法 |
CN110117488A (zh) * | 2018-02-07 | 2019-08-13 | 中国科学院宁波材料技术与工程研究所 | 近红外抗生素荧光探针检测试剂、其制备方法与应用 |
CN111603570A (zh) * | 2020-07-06 | 2020-09-01 | 南京工业大学 | 一种碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子及制备方法和应用、药物递送系统及应用 |
CN116178349A (zh) * | 2023-02-22 | 2023-05-30 | 许昌学院 | 一种检测半胱氨酸的高尔基体靶向近红外荧光探针、其制备方法和应用 |
-
2023
- 2023-07-21 CN CN202310899844.3A patent/CN116925756B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103755672A (zh) * | 2014-01-26 | 2014-04-30 | 大连理工常熟研究院有限公司 | 一种用于识别半胱氨酸的特异性荧光探针及其应用 |
CN105601658A (zh) * | 2016-01-15 | 2016-05-25 | 中南大学 | 一种能够区分生物硫醇的新型荧光探针的制备与应用 |
CN107253961A (zh) * | 2017-06-29 | 2017-10-17 | 湖南科技大学 | 一种可比率检测半胱氨酸的水溶性荧光传感器的制备及应用 |
CN110117488A (zh) * | 2018-02-07 | 2019-08-13 | 中国科学院宁波材料技术与工程研究所 | 近红外抗生素荧光探针检测试剂、其制备方法与应用 |
CN108753282A (zh) * | 2018-07-26 | 2018-11-06 | 大连理工大学 | 一种合成可见光源激发下红色荧光碳点的方法 |
CN111603570A (zh) * | 2020-07-06 | 2020-09-01 | 南京工业大学 | 一种碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子及制备方法和应用、药物递送系统及应用 |
CN116178349A (zh) * | 2023-02-22 | 2023-05-30 | 许昌学院 | 一种检测半胱氨酸的高尔基体靶向近红外荧光探针、其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Carbon dots and gold nanocluster–based hybrid microgels and their application in cells imaging;Longping Zhou ,et al.;《J Nanopart Res》;20220706;第24卷;140 * |
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