CN116920127A - 一种刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系及其制备方法。所述刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系包括：MR造影剂纳米粒子、配体分子、有机构建单元以及药物分子；其中MR造影剂纳米粒子表面修饰有配体分子，有机构建单元与配体分子通过相互作用，将MR造影剂纳米粒子自组装在一起形成自组装纳米结构，药物分子分散在所述自组装纳米结构中，靶分子偶联在所述有机构建单元表面。本发明的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的使用可增强肿瘤的磁共振成像诊断和癌症的治疗效率。

Description

一种刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系及其制备方法。
背景技术
磁共振成像(Magnetic resonance imaging，MRI)是利用生物体不同组织中水分子质子在外加磁场影响下产生不同的共振信号来成像的一种极具潜力的诊断技术，其信号的强弱取决于组织内水的含量和水质子的弛豫时间，其作为临床医学影像学的重要技术，广泛应用于原发肿瘤以及转移肿瘤的诊断。为了获得更高的对比度，MRI检查需要借助造影剂实现MR增强以达到更准确的诊断。MRI造影剂包括如Gd-DOTA(钆特酸葡胺)、Gd-BOPTA(钆贝葡胺)、Mn-DPDP(二吡哆醇二磷酸锰)、超顺磁性氧化铁(SPION)等，近年来，超顺磁性氧化铁造影剂因其良好的生物相容性以及双模态造影特性而广受关注，成为MRI造影剂的研究热点。
动态组合化学(DCC)作为一种潜在的自组装和自复制方法，可应用于多功能自组装纳米材料的研究和开发。DCC以动态共价化学键和构建单元与模板间的主客体相互作用作为驱动力构建有序的自组装结构，具有纳米结构化学可控、稳定性好、刺激响应等优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的增强肿瘤的MR成像诊断和癌症治疗效率的一种刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系及其制备方法。
本发明的一个目的通过以下技术方案来实现：
一种刺激响应型自组装磁共振(MR)造影剂载药体系，包括：MR造影剂纳米粒子、配体分子、有机构建单元以及药物分子；
其中MR造影剂纳米粒子表面修饰有配体分子，有机构建单元与配体分子通过相互作用，将MR造影剂纳米粒子自组装在一起形成自组装纳米结构，药物分子分散在所述自组装纳米结构中，靶分子偶联在所述有机构建单元表面。
作为优选，所述MR造影剂纳米粒子为超顺磁性纳米粒子，包括氧化铁、四氧化三铁、过渡金属掺杂的氧化铁、过渡金属掺杂的四氧化三铁中的一种或几种；
所述MR造影剂纳米粒子的形状选自于球形、碟形、片状、立方体、三角型、棒形、花形中的一种或几种；
所述MR造影剂纳米粒子的粒径为1～500nm。
作为优选，所述配体分子为季铵盐类分子、吡啶盐类分子、氨基类分子中的一种或多种。
作为优选，季铵盐类分子为烷基季铵盐，烷基季铵盐具有如下式I或式II所示的结构式：
其中，X为卤族元素，n为1～30的整数；
吡啶盐类分子为烷基吡啶盐，烷基吡啶盐具有如下式III或式IV所示的结构式：
其中，X为卤族元素，n为1～30的整数。
作为优选，所述有机构建单元为苯环羧酸类双巯基有机分子、蒽环羧酸类双巯基有机分子、萘环羧酸类双巯基有机分子中的一种或多种。
作为优选，有机构建单元中的“-SH”通过氧化作用形成“S-S”的动态共价键，通过“S-S”的动态交换形成二硫环状分子，所述二硫环状分子与所述MR造影剂纳米粒子表面所修饰的配体分子之间形成相互作用。
作为优选，所述刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系在谷胱甘肽刺激下，自组装纳米结构中的“S-S”被破坏，二硫环状分子重新变成有机构建单元，自组装纳米结构解组装，T2信号减弱，实现MR信号从T2信号到T1信号的变换。
本发明的另一个目的通过以下技术方案来实现：
一种刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备方法，包括以下步骤：
(1)将配体分子溶液与MR造影剂纳米粒子溶液搅拌反应；
(2)将药物分子溶液、步骤(1)所得的混合液加入至有机构建单元溶液中搅拌反应，获得自组装纳米结构；
(3)自组装纳米结构经催化剂活化后，将活化自组装纳米结构和靶分子溶液混合搅拌反应，得到刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系；或者，靶分子经催化剂活化后，将自组装纳米结构和活化的靶分子溶液混合搅拌反应，得到刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系。
作为优选，步骤(1)中，搅拌反应的温度为5～40℃，反应时间为0.5～10h。
作为优选，步骤(2)中，搅拌反应的温度为5～40℃，反应时间为20～55h。
作为优选，步骤(3)中，搅拌反应温度为5～40℃，反应时间为5～40h。
作为优选，步骤(2)中，铁元素的摩尔量、药物分子的摩尔量、有机构建单元的摩尔量的比例为1：(0.08～0.15)：(0.20～0.35)。
进一步优选，步骤(2)中，铁元素的摩尔量、药物分子的摩尔量、有机构建单元的摩尔量的比例为1：(0.09～0.12)：(0.29～0.33)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过MR造影剂纳米粒子表面修饰的带正电的官能团与动态共价交换形成的环状分子相互作用，形成自组装纳米结构，并在自组装过程中，将药物分子装载在自组装结构中，并在表面修饰与肿瘤细胞具有特异性相互作用的抗体，即获得刺激响应型自组装MR造影剂载药体系；
2、本发明的有机构建单元为苯环羧酸类双巯基有机分子、蒽环羧酸类双巯基有机分子、萘环羧酸类双巯基有机分子中的一种或多种，有机构建单元中的“-SH”，可以通过空气和水中氧气的氧化作用形成“S-S”的动态共价键，通过“S-S”的动态交换形成动态二硫环状分子，二硫环状分子与MR造影剂纳米粒子表面所修饰的配体分子之间形成相互作用，从而将MR造影剂纳米粒子自组装在一起形成自组装纳米结构；
3、本发明的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系还包括偶联在有机构建单元表面的靶分子，有利于提高纳米材料对肿瘤细胞的靶向性能，促进纳米材料与肿瘤细胞的特异性相互作用，进一步实现肿瘤的MR成像和智能药物递送和释放；
4、本发明的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系在某一条件或者物质触发下，热力学平衡被打破，动态二硫环状分子结构被破坏，进而使得自组装纳米结构解组装，T2信号减弱，实现MR信号从T2信号到T1信号的变换，同时药物分子被释放，药物分子聚集在肿瘤细胞周边，大大提高药物治疗效率；
5、本发明通过控制自组装条件，包括调节自组装驱动反应时间至一定范围，控制铁元素、药物分子和有机构建单元的比例适宜等，得到包覆率和载药率较高的载药体系，有利于提高治疗效果；
6、本发明的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的使用可增强肿瘤的磁共振成像诊断和癌症的治疗效率。
附图说明
图1为本发明的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备及解组装图；
图2为实施例2步骤(1)制备得到的Fe3O4(SPION)的TEM图；
图3为实施例2制备得到的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的TEM图；
图4为实施例2制备得到的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系经GSH处理后的TEM图；
图5为实施例2制备得到的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的HPLC谱、UV-vis和荧光光谱图；
图6为实施例2步骤(1)制备得到的Fe3O4(SPION)以及本实施例2制备得到的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的MR成像图；
图7为实施例2制备得到的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的药物释放曲线和释放后的TEM图。
具体实施方式
在下文中，针对本发明的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系及其制备方法将详细地描述实施方式，然而，这些实施方式是示例性的，本发明公开内容不限于此。
在本发明的一些实施方式中，提供的一种刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系包括：MR造影剂纳米粒子、配体分子、有机构建单元以及药物分子；其中MR造影剂纳米粒子表面修饰有配体分子，有机构建单元与配体分子通过相互作用，将MR造影剂纳米粒子自组装在一起形成自组装纳米结构，药物分子分散在所述自组装纳米结构中，靶分子偶联在所述有机构建单元表面。
MR造影剂纳米粒子
MR造影剂纳米粒子具有增强MR信号的功能，对肿瘤实现T1和T2双模态MR成像，在本发明的一些优选实施方式中，所述MR造影剂纳米粒子为超顺磁性纳米粒子，包括氧化铁、四氧化三铁、过渡金属掺杂的氧化铁、过渡金属掺杂的四氧化三铁中的一种或几种，进一步优选为超顺磁性四氧化三铁纳米粒子或超顺磁性过渡金属掺杂的四氧化三铁纳米粒子，所述过渡金属包括钛、钒、钴、镍、铜、锌、锰、铬等中的一种或多种。所述MR造影剂纳米粒子的形状选自于球形、碟形、片状、立方体、三角型、棒形、花形等形状中的一种或几种。
在本发明的一些优选实施方式中，所述MR造影剂纳米粒子的粒径＜1μm，进一步优选为1～500nm，可选地，MR造影剂纳米粒子的粒径为1、10、20、30、40、50、80、100、200、500nm中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。
所述MR造影剂纳米粒子的制备可采取如下方法：
a)非水相法：铁的有机金属化合物或配合物(五羰基铁、乙酰丙酮铁、油酸铁等)在高沸点溶剂和配体(如油酸和油胺)及还原剂的存在下，将反应混合物加热到250℃以上。最终的纳米粒子尺寸由温度和加热时间长短决定。使用这种方法可以密切控制纳米粒子的尺寸分布，同时也能获得较高结晶度的纳米粒子。这种方法已被证明是非常通用的，并扩展到不同性质的过渡金属掺杂铁氧体纳米粒子(MxFe3-xO4，M＝Mn、Co、Ni、Zn等)的制备中。热分解法的主要缺点是，所获得的纳米粒子通常仅溶于非极性溶剂，因此必须在纳米粒子成核生长稳定之前通过中间配体引入功能化官能团。
b)水相法：1)微乳液法：在表面活性剂的作用下两种不相溶的溶剂形成均匀的微乳液，在获得纳米粒子的同时，纳米粒子的成核、生长避免了粒子之间的团聚。2)溶胶-凝胶法：溶胶-凝胶法是一种湿法制备金属氧化物的方法。溶胶-凝胶法一般是用氯化铁，硝酸铁为原料，一定温度下在水或醇中溶解，并加入定量碱(或氨水)和用于改性的表面活性剂，通过调节溶液的pH值使反应液成胶体，经过干燥、煅烧等步骤最后获得氧化铁纳米粒子。3)共沉淀法：共沉淀法是指在多组分的溶液中，将两种或更多的阳离子在沉淀剂的存在下同时沉淀出来的过程。用这种方法制备MR造影剂纳米粒子是根据溶度积的原理，以沉淀反应为基础，在含有特定比例的阳离子溶液中，加入适当的沉淀剂后所形成的纳米粒子。其优点是反应原理简单，设备原料低廉，适合批量生产。但缺点是不易得到高质量的单分散胶体，而且通常饱和磁化强度较低。例如，使用共沉淀法制备铁氧化物(Fe3O4或γ-Fe2O3)，在惰性气体保护氛围中，通过向一定比例的Fe2+/Fe3+盐溶液中加入沉淀剂，在室温或提供温度时即可获得纳米粒子。4)水热法和溶剂热法：水热反应是在高压釜中进行的，在高温高压下，反应物在水做溶剂的密闭的体系中反应，最终得到所需产物。5)化学还原法：采取金属还原法，原料可以是金属氯化物、硝酸盐、乙酰丙酮盐，还原剂选取超氢锂或硼氢化钠，此外还有一些有机还原剂如多醇、水合肼和双氢气体等。
配体分子
在本发明的一些优选实施方式中，所述配体分子为季铵盐类分子、吡啶盐类分子、氨基类分子等带有正电荷官能团的有机分子中的一种或多种，配体分子连接在所述MR造影剂纳米粒子表面，使得MR造影剂纳米粒子表面带正电荷。
优选地，季铵盐类分子为烷基季铵盐，吡啶盐类分子为烷基吡啶盐。
优选地，烷基季铵盐具有如下式I或式II所示的结构式：
其中，X为卤族元素，n为1～30的整数。作为优选，X为Cl、Br、I中的一种。
优选地，烷基吡啶盐具有如下式III或式IV所示的结构式：
其中，X为卤族元素，n为1～30的整数。作为优选，X为Cl、Br、I中的一种。
有机构建单元
有机构建单元与配体分子通过相互作用，将有机构建单元与所述MR造影剂纳米粒子连接，从而将MR造影剂纳米粒子自组装在一起形成自组装纳米结构。所述相互作用为非共价相互作用，如主客体相互作用、静电相互作用、氢键相互作用、π-π共轭相互作用、疏水相互作用、偶极相互作用、范德华相互作用等非共价相互作用。
所述有机构建单元具有与所述MR造影剂纳米粒子表面修饰的配体分子进行结合的官能团，从而使得有机构建单元与配体分子之间形成非共价相互作用。
在本发明的一些优选实施方式中，有机构建单元为苯环羧酸类双巯基有机分子、蒽环羧酸类双巯基有机分子、萘环羧酸类双巯基有机分子中的一种或多种。可以举例为3,5-二巯基苯甲酸(如下B1所示)、2,5-二巯基对苯二甲酸(如下B2所示)、3,5-双(巯基甲基)苯甲酸(如下B3所示)、3,7-二巯基-2-萘甲酸(如下B4所示)、6,6'-双巯基-3,3'-甲叉基二苯甲酸(如下B5所示)等。
有机构建单元含有巯基“-SH”，有机构建单元中的“-SH”通过氧化作用形成“S-S”的动态共价键，通过“S-S”的动态交换形成二硫环状分子，所述二硫环状分子与所述MR造影剂纳米粒子表面所修饰的配体分子之间形成相互作用。
有机构建单元含有羧酸基团，所述有机构建单元通过羧酸基团修饰上靶分子。
在本发明的一些优选实施方式中，有机构建单元的分子量为60～10000Da。
药物分子
所述药物分子为具有疏水或者亲水结构的有机分子，可用于癌症的抑制和治疗，优选为具有抗肿瘤效果的小分子药物，例如，阿霉素、紫杉醇、米托蒽醌、盐酸阿霉素、来那度胺、伊布替尼、哌柏西利、奥希替尼、恩杂鲁胺、泊马度胺、奥拉帕利、阿比特龙、达沙替尼等。药物分子分散在所述自组装纳米结构中，随着整个刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系进入体内，靶向肿瘤，在谷胱甘肽(GSH)刺激下，造影剂载药体系的自组装纳米结构解组装，药物分子被释放，药物分子聚集在肿瘤细胞周边，大大提高药物治疗效率。
靶分子
所述靶分子为能与癌细胞表面抗原或受体发生特异性结合的抗体或配体，所述癌细胞可以为乳腺癌、肺癌、肝癌、食管癌等；作为优选，所述靶分子为多肽类物质或非多肽类物质，多肽类物质可列举为单克隆抗体(如EPCAM抗体、CD44抗体)，非多肽类物质可列举为叶酸、半乳糖胺等。
所述靶分子共价偶联在所述有机构建单元表面，有利于提高纳米材料对肿瘤细胞的靶向性能，促进纳米材料与肿瘤细胞的特异性相互作用，进一步实现肿瘤的MR成像和智能药物递送和释放。
所述刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系在谷胱甘肽刺激下，自组装纳米结构中的“S-S”被破坏，二硫环状分子重新变成有机构建单元，自组装纳米结构解组装，T2信号减弱，实现MR信号从T2信号到T1信号的变换。
下面，对自组装做详细说明：
在刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备过程中，有机构建单元的分子中的“-SH”通过空气和水中氧气的氧化作用形成“S-S”的动态共价键，通过“S-S”的动态交换形成动态二硫环状分子，形成动态组合化学库，所述MR造影剂纳米粒子表面所修饰的配体分子与二硫环状分子在非共价作用力的驱动下，将MR造影剂纳米粒子自组装在一起形成自组装纳米结构，同时药物分子装载在自组装结构中。因为该自组装纳米结构体系是热力学控制体系，也就是说某动态组合化学库达到热力学平衡时，这个体系中各组分处于热力学最低能量状态，也更加稳定。在某一条件或者物质触发下，热力学平衡被打破，动态环状分子结构被破坏，进而使得自组装纳米结构解组装，实现刺激响应型解组装。本发明的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系，在如谷胱甘肽(GSH)的刺激下，自组装纳米结构中的“S-S”被破坏，二硫环状分子重新变成有机构建单元的分子，自组装纳米结构解组装，T2信号减弱，实现MR信号从T2信号到T1信号的变换，同时药物分子被释放，药物分子聚集在肿瘤细胞周边，大大提高药物治疗效率。
在本发明的一些实施方式中，所述刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系粒径为5～10000nm。优选为5～5000nm。
在本发明的一些实施方式中，所述刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系具有稳定的T1和T2信号。
所述刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系可增强肿瘤的MR成像诊断和癌症的治疗效率。
在本发明的一些实施方式中，提供的一种刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备方法包括以下步骤：
(1)将配体分子溶液与MR造影剂纳米粒子溶液搅拌反应；
(2)将药物分子溶液、步骤(1)所得的混合液加入至有机构建单元溶液中搅拌反应，获得自组装纳米结构；
(3)自组装纳米结构经催化剂活化后，将活化自组装纳米结构和靶分子溶液混合搅拌反应，得到刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系；或者，靶分子经催化剂活化后，将自组装纳米结构和活化的靶分子溶液混合搅拌反应，得到刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系。
步骤(1)中，MR造影剂纳米粒子溶液为MR造影剂纳米粒子分散于水中形成，MR造影剂纳米粒子溶液的浓度不作限制；配体分子溶液为配体分子溶于溶剂中形成，但凡能溶解配体分子的溶剂均可，如水、乙醇等，配体分子溶液浓度不作限制。
在本发明的一些优选实施方式中，步骤(1)中，搅拌反应的温度为5～40℃，优选为室温条件下进行，搅拌反应的反应时间为0.5～10h。
步骤(2)中，药物分子溶液为药物分子溶于溶剂中形成，但凡能溶解配体分子的溶剂均可，如水、二甲基亚砜、乙醇等，配体分子溶液浓度不作限制。有机构建单元溶液为有机构建单元溶于溶剂中形成，但凡能溶解有机构建单元的溶剂均可，如PBS缓冲液、水、乙醇等，有机构建单元溶液浓度不作限制。作为优选，有机构建单元溶液的pH为7.0～7.8。作为优选，有机构建单元溶液为有机构建单元溶于PBS缓冲液中形成，PBS缓冲液的pH为7.0～7.8。
在本发明的一些优选实施方式中，步骤(2)中，搅拌反应的温度为5～40℃，优选为室温条件下进行，反应时间为6～72h，进一步优选为20～55h。
在本发明的一些优选实施方式中，步骤(2)中，铁元素的摩尔量、药物分子的摩尔量、有机构建单元的摩尔量的比例为1：(0.05～0.15)：(0.1～0.5)，进一步优选为1：(0.08～0.15)：(0.20～0.35)，进一步优选为1：(0.09～0.12)：(0.29～0.33)。
通过如ICP等测得步骤(1)所得的混合液中铁元素的浓度mg/mL，然后转换为摩尔量。
在此说明，本文中括号内的数值包括端点值，如比例为(1～5)：1，则包括1：1和5：1。
步骤(2)中的反应条件会显著影响载药体系中药物分子的包埋和稳定性，本发明通过控制MR造影剂纳米粒子、药物分子以及有机构建单元的摩尔量在合适范围以及调节反应时间，有利于载药体系中药物分子的载药率和包埋率的提高。步骤(2)的自组装结构中，载药率＞20％，包封率＞50％；进一步优选，自组装结构中，载药率＞30％，包封率＞70％。
步骤(3)中，催化剂活化自组装纳米结构还是靶分子，取决于：当自组装纳米结构材料含有羧基时，可以选择含有氨基的靶分子，然后用催化剂活化自组装纳米结构表面的羧基，再滴加含有氨基的靶分子溶液，使活化的羧基与靶分子的氨基共价反应形成稳定的酰胺键；当自组装纳米结构材料含有氨基时，可以选择含有羧基的靶分子，然后采取以上方法活化靶分子的羧基后，再与自组装纳米结构材料反应，使得靶分子嫁接于自组装纳米结构材料表面。
在本发明的一些优选实施方式中，步骤(3)中的催化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、含叠氮基团的化合物、多巴胺中的一种或多种。
在本发明的一些优选实施方式中，步骤(3)的活化在避光条件下进行，活化时间为1～20h。
在本发明的一些优选实施方式中，步骤(3)中，搅拌反应温度为5～40℃，优选为室温条件下进行，反应时间为5～40h，进一步优选为8～30h。
步骤(1)-(3)中的搅拌速度不作限定，可以列举为100～1000rpm。
下面通过具体实施例和附图，对本发明的技术方案作进一步描述说明，应当理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于帮助理解本发明，不用于本发明的具体限制。且本文中所使用的附图，仅仅是为了更好地说明本发明所公开内容，对保护范围并不具有限制作用。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
图1为本发明的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备及解组装图，如图所示，表面连接有配体分子的MR造影剂纳米粒子(SPION)、药物分子、有机构建单元在搅拌反应过程中，有机构建单元中的“-SH”通过空气和水中氧气的氧化作用形成“S-S”，通过“S-S”的动态交换形成动态二硫环状分子，动态二硫环状分子与MR造影剂纳米粒子表面所修饰的配体分子相结合，在非共价作用力的驱动下，将MR造影剂纳米粒子自组装在一起形成自组装纳米结构，同时药物分子装载在自组装纳米结构中。在谷胱甘肽(GSH)刺激下，自组装纳米结构中的“S-S”被破坏，动态二硫环状分子重新变成有机构建单元，自组装纳米结构解组装，T2信号减弱，实现MR信号从T2信号到T1信号的变换，同时药物分子得到释放。
实施例1
研究自组装MR造影剂纳米结构的制备过程中，不同反应条件对载药体系中药物分子的载药率和包埋率的影响。
刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备方法如下：
(1)MR造影剂四氧化三铁纳米粒子的制备
把1mmol六水硫酸亚铁铵加入10mL超纯水中，配置成硫酸亚铁铵溶液。把0.5g氢氧化钠加入到5mL油酸和5ml乙醇形成的混合液中，搅拌至完全溶解后，再加入10mL硫酸亚铁铵溶液，待混合液颜色变为棕红色后，将其转移至50mL反应釜中，230℃加热8h。待反应釜冷却后取出，乙醇离心洗涤三次，并分散在10mL环己烷中制得所需油溶性MR造影剂纳米粒子。而后将2g柠檬酸和10mL油溶性MR造影剂纳米粒子加入30mL氯仿/DMF(v/v:1/1)的混合溶液中，搅拌12h，乙醇离心洗涤三次，并分散在10mL水中制得所需四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4)。
(2)连接有配体分子的四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4-CTAB)的制备
取1mL步骤(1)制备的Fe3O4材料，加入9mL水中，并在搅拌状态下加入10.0μL 0.1M配体分子(十六烷基三甲基溴化铵，CTAB)，室温下，300rpm搅拌反应，待反应8h后，便制得Fe3O4-CTAB材料。
(3)自组装MR造影剂纳米结构的制备
取步骤(2)所述的Fe3O4-CTAB溶液(Fe3O4-CTAB溶液中，铁元素的浓度为0.53mg/mL)和1mM盐酸阿霉素(DOX)加入pH7.4 50mM PBS缓冲液中，再向其中加入5mM有机构建单元(3,5-二巯基苯甲酸BB1溶于pH 7.4 50mM PBS缓冲液中形成)和水，室温下，300rpm搅拌反应，离心并分散在水中，制得自组装MR造影剂载药纳米结构；
Fe3O4-CTAB溶液、1mM盐酸阿霉素、PBS缓冲液、3,5-二巯基苯甲酸B1溶液、水的体积量见表1，搅拌反应时间见表1。
(4)自组装MR造影剂纳米结构抗体的偶联
取10mL步骤(3)制备的自组装MR造影剂纳米粒子、EDC、NHS(质量比1000：20：15)，溶于10mM磷酸缓冲液(pH 7.4)中，避光反应8h。取1mg cRGD环状多肽加入到10mL活化的自组装MR造影剂纳米粒子中，室温下，300rpm搅拌反应16h，在使用超滤离心管(MWCO3.0kDa)离心，即可获得表面偶联有cRGD靶分子的自组装MR造影剂载药体系。
表1不同反应条件对载药体系的包埋率和载药率的影响
从表1可以看出，自组装MR造影剂纳米结构的制备过程中，不同反应条件会显著影响载药体系中药物分子的载药率和包埋率的影响，控制MR造影剂纳米粒子、药物分子以及有机构建单元的摩尔量在合适范围，同时调节反应时间，以得到较高载药率和包封率的载药体系。其中，样品12获得的自组装MR造影剂纳米结构，具有最佳的包埋率和载药率。
实施例2
选择载药率和包封率最高的样品12进行后续实验。
样品12的具体制备过程如下所示：
(1)MR造影剂四氧化三铁纳米粒子的制备
把1mmol六水硫酸亚铁铵加入10mL超纯水中，配置成硫酸亚铁铵溶液。把0.5g氢氧化钠加入到5mL油酸和5ml乙醇形成的混合液中，搅拌至完全溶解后，再加入10mL硫酸亚铁铵溶液，待混合液颜色变为棕红色后，将其转移至50mL反应釜中，230℃加热8h。待反应釜冷却后取出，乙醇离心洗涤三次，并分散在10mL环己烷中制得所需油溶性MR造影剂纳米粒子。而后将2g柠檬酸和10mL油溶性MR造影剂纳米粒子加入30mL氯仿/DMF(v/v:1/1)的混合溶液中，搅拌12h，乙醇离心洗涤三次，并分散在10mL水中制得所需四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4)。
(2)连接有配体分子的四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4-CTAB)的制备
取1mL步骤(1)制备的Fe3O4材料，加入9mL水中，并在搅拌状态下加入10.0μL 0.1M配体分子(十六烷基三甲基溴化铵，CTAB)，室温下，300rpm搅拌反应，待反应8h后，便制得Fe3O4-CTAB材料。
(3)自组装MR造影剂纳米结构的制备
取0.5mL步骤(2)所述的Fe3O4-CTAB溶液(Fe3O4-CTAB溶液中，铁元素的浓度为0.53mg/mL)和0.5mL 1mM盐酸阿霉素(DOX)加入0.4mL pH7.4 50mM PBS缓冲液中，再向其中加入0.3mL 5mM有机构建单元(3,5-二巯基苯甲酸BB1溶于pH 7.4 50mM PBS缓冲液中形成)和0.3mL水，室温下，300rpm搅拌反应48h，离心并分散在水中，制得自组装MR造影剂载药纳米结构。
(4)自组装MR造影剂纳米结构抗体的偶联
取10mL步骤(3)制备的自组装MR造影剂纳米粒子、EDC、NHS(质量比1000：20：15)，溶于10mM磷酸缓冲液(pH 7.4)中，避光反应8h。取1mg cRGD环状多肽加入到10mL活化的自组装MR造影剂纳米粒子中，室温下，300rpm搅拌反应16h，在使用超滤离心管(MWCO3.0kDa)离心，即可获得表面偶联有cRGD靶分子的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系。
图2为步骤(1)制备得到的Fe3O4(SPION)的TEM图，从图中可以看出，制备的Fe3O4大小均匀，粒径大概为～7nm。
图3为本实施例1制备得到的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的TEM图，图4为本实施例1制备得到的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系经GSH处理后的TEM图，从图3和图4中可以看出，自组装磁共振造影剂载药纳米粒子发生解组装，重新分散成小颗粒的SPIONs，粒径约为7nm。
图5为本实施例制备得到的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的HPLC谱、UV-vis和荧光光谱图。首先对最终制备的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系(FDB)中的分子组成进行HPLC分析，对照组包括同等反应条件下的BB1组(仅包括有机构建单元BB1)、无药物的纳米载体(FB)组(仅包括有机构建单元BB1和Fe3O4-CTAB溶液，无药物分子)和单一药物(DOX)组(仅包括药物分子)。在FDB动态共价反应体系中，BB1主要被氧化成三聚体大环(3mer，BB3在15.2min)和四聚体大环(4mer，BB4在16.2min)。与FB和BB的对照组相比，IO-DB系统的3mer和4mer的量明显增加。HPLC分析结果表明，氧化铁纳米粒子与二硫大环之间存在主客体相互作用，促使它们形成自组装纳米结构。同时也进行了FDB的紫外-可见光谱和荧光光谱的表征，结果表明DOX成功地封装在自组装纳米结构中。
图6为本实施例步骤(1)制备得到的Fe3O4(SPION)以及本实施例制备得到的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的MR成像图，显示了不同铁浓度(CFe：0-200μg/mL)下SPION和FDB的T1加权和T2加权图像。研究发现，FDB在T1加权和T2加权的MR成像中都具有良好的信号增强能力，可作为双模MRI造影剂以应用于肿瘤诊断。
图7为本实施例制备得到的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的药物释放曲线和释放后的TEM图(pH 5.5/GSH)。模拟细胞内微环境(2mM GSH，PBS溶液)，通过监测GSH存在时DOX的释放行为进行评估。如图7所示，在GSH存在的pH 5.5条件下，经过药物释放后，DOX的累积释放量可显著大于无GSH存在的PBS中和GSH存在的pH7.4的PBS中。以上结果表明，GSH显著促进了药物的释放，同时pH值也影响了GSH存在下的药物释放性能。此外，也利用TEM表征药物释放后纳米粒子的尺寸分布，在GSH作用下药物释放后，纳米颗粒衬度明显变低、尺寸变小，进一步验证上述GSH触发药物释放的结果。
实施例3
本实施例的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备方法如下：
(1)MR造影剂锌掺杂四氧化三铁纳米粒子的制备
把0.865mmol六水硫酸亚铁铵和0.267mmol七水硫酸锌加入10mL超纯水中，配置成硫酸亚铁铵和硫酸锌的混合溶液。把0.5g氢氧化钠加入到5mL油酸和5ml乙醇形成的混合液中，搅拌至完全溶解后，再加入10mL硫酸亚铁铵和硫酸锌的混合溶液，待混合液颜色变为棕红色后，将其转移至50mL反应釜中，230℃加热8h。待反应釜冷却后取出，乙醇离心洗涤三次，并分散在10mL环己烷中制得所需油溶性MR造影剂纳米粒子。而后将2g柠檬酸和10mL油溶性MR造影剂纳米粒子加入30mL氯仿/DMF(v/v:1/1)的混合溶液中，搅拌12h，乙醇离心洗涤三次，并分散在10mL水中制得所需锌掺杂四氧化三铁纳米粒子(Zn0.2Fe2.8O4)。
后续步骤同实施例2，可以制备得到一种增强肿瘤的MR成像和癌症的治疗效率的自组装MR造影剂载药体系。
实施例4
本实施例的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备方法如下：
(1)MR造影剂锰掺杂四氧化三铁纳米粒子的制备
把0.865mmol六水硫酸亚铁铵和0.267mmol硫酸锰加入10mL超纯水中，配置成硫酸亚铁铵和硫酸锰的混合溶液。把0.5g氢氧化钠加入到5mL油酸和5ml乙醇形成的混合液中，搅拌至完全溶解后，再加入10mL硫酸亚铁铵和硫酸锰的混合溶液，待混合液颜色变为棕红色后，将其转移至50mL反应釜中，230℃加热8h。待反应釜冷却后取出，乙醇离心洗涤三次，并分散在10mL环己烷中制得所需油溶性MR造影剂纳米粒子。而后将2g柠檬酸和10mL油溶性MR造影剂纳米粒子加入30mL氯仿/DMF(v/v:1/1)的混合溶液中，搅拌12h，乙醇离心洗涤三次，并分散在10mL水中制得所需锌掺杂四氧化三铁纳米粒子(Mn0.2Fe2.8O4)。
后续步骤同实施例2，可以制备得到一种增强肿瘤的MR成像和癌症的治疗效率的自组装MR造影剂载药体系。
实施例5
本实施例的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备方法同实施例2的区别在于，步骤(2)具体为：取1mL步骤(1)制备的Fe3O4材料，加入9mL水中，并在搅拌状态下加入10.0μL 0.1M配体分子(十六烷基溴化吡啶，CTPB)，室温下，300rpm搅拌反应，待反应8h后，便制得Fe3O4-CTPB材料。其它步骤同实施例2，可以制备得到一种增强肿瘤的MR成像和癌症的治疗效率的自组装MR造影剂载药体系。
实施例6
本实施例的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备方法同实施例2的区别在于，步骤(2)具体为：取1mL步骤(1)制备的Fe3O4材料，加入9mL水中，并在搅拌状态下加入10.0μL 0.1M配体分子(十二烷基溴化吡啶，DPB)，室温下，300rpm搅拌反应，待反应8h后，便制得Fe3O4-DPB材料。其它步骤同实施例2，可以制备得到一种增强肿瘤的MR成像和癌症的治疗效率的自组装MR造影剂载药体系。
实施例7
本实施例的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备方法同实施例2的区别在于，步骤(2)具体为：取1mL步骤(1)制备的Fe3O4材料，加入9mL水中，并在搅拌状态下加入10.0μL 0.1M配体分子(十四烷基溴化吡啶，TPB)，室温下，300rpm搅拌反应，待反应8h后，便制得Fe3O4-TPB材料。其它步骤同实施例2，可以制备得到一种增强肿瘤的MR成像和癌症的治疗效率的自组装MR造影剂载药体系。
实施例8
本实施例的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备方法同实施例2的区别在于，步骤(2)具体为：取1mL步骤(1)制备的Fe3O4材料，加入9mL水中，并在搅拌状态下加入10.0μL 0.1M配体分子(十二烷基溴化铵，TAB)，室温下，300rpm搅拌反应，待反应8h后，便制得Fe3O4-TAB材料。其它步骤同实施例2，可以制备得到一种增强肿瘤的MR成像和癌症的治疗效率的自组装MR造影剂载药体系。
实施例9
本实施例的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备方法同实施例2的区别在于，步骤(2)具体为：取1mL步骤(1)制备的Fe3O4材料，加入9mL水中，并在搅拌状态下加入10.0μL 0.1M配体分子(十二烷基溴化铵，DAB)，室温下，300rpm搅拌反应，待反应8h后，便制得Fe3O4-DAB材料。其它步骤同实施例2，可以制备得到一种增强肿瘤的MR成像和癌症的治疗效率的自组装MR造影剂载药体系。
实施例10
本实施例的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备方法同实施例2的区别在于，步骤(3)具体为：取0.5mL步骤(2)所述的Fe3O4-CTAB溶液(Fe3O4-CTAB溶液中，铁元素的浓度为0.53mg/mL)和0.5mL 1mM盐酸阿霉素(DOX)加入0.4mL pH7.4 50mM PBS缓冲液中，再向其中加入0.3mL 5mM有机构建单元(2,5-二巯基对苯二甲酸B2溶于pH 7.4 50mMPBS缓冲液中形成)和0.3mL水，室温下，300rpm搅拌反应48h，离心并分散在水中，制得自组装MR造影剂载药纳米结构。其它步骤同实施例2，可以制备得到一种增强肿瘤的MR成像和癌症的治疗效率的自组装MR造影剂载药体系。
实施例11
本实施例的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备方法同实施例2的区别在于，步骤(3)具体为：取0.5mL步骤(2)所述的Fe3O4-CTAB溶液(Fe3O4-CTAB溶液中，铁元素的浓度为0.53mg/mL)和0.5mL 1mM盐酸阿霉素(DOX)加入0.4mL pH7.4 50mM PBS缓冲液中，再向其中加入0.3mL 5mM有机构建单元(3,5-双(巯基甲基)苯甲酸B3溶于pH 7.4 50mMPBS缓冲液中形成)和0.3mL水，室温下，300rpm搅拌反应48h，离心并分散在水中，制得自组装MR造影剂载药纳米结构。其它步骤同实施例2，可以制备得到一种增强肿瘤的MR成像和癌症的治疗效率的自组装MR造影剂载药体系。
实施例12
本实施例的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备方法同实施例2的区别在于，步骤(3)具体为：取0.5mL步骤(2)所述的Fe3O4-CTAB溶液(Fe3O4-CTAB溶液中，铁元素的浓度为0.53mg/mL)和0.5mL 1mM盐酸阿霉素(DOX)加入0.4mL pH7.4 50mM PBS缓冲液中，再向其中加入0.3mL 5mM有机构建单元(3,7-二巯基-2-萘甲酸B4溶于pH 7.4 50mM PBS缓冲液中形成)和0.3mL水，室温下，300rpm搅拌反应48h，离心并分散在水中，制得自组装MR造影剂载药纳米结构。其它步骤同实施例2，可以制备得到一种增强肿瘤的MR成像和癌症的治疗效率的自组装MR造影剂载药体系。
实施例13
本实施例的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备方法同实施例2的区别在于，步骤(3)具体为：取0.5mL步骤(2)所述的Fe3O4-CTAB溶液(Fe3O4-CTAB溶液中，铁元素的浓度为0.53mg/mL)和0.5mL 1mM盐酸阿霉素(DOX)加入0.4mL pH7.4 50mM PBS缓冲液中，再向其中加入0.3mL 5mM有机构建单元(6,6'-双巯基-3,3'-甲叉基二苯甲酸B5溶于pH7.4 50mM PBS缓冲液中形成)和0.3mL水，室温下，300rpm搅拌反应48h，离心并分散在水中，制得自组装MR造影剂载药纳米结构。其它步骤同实施例2，可以制备得到一种增强肿瘤的MR成像和癌症的治疗效率的自组装MR造影剂载药体系。
实施例14
本实施例的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备方法同实施例2的区别在于，步骤(3)具体为：取0.5mL步骤(2)所述的Fe3O4-CTAB溶液(Fe3O4-CTAB溶液中，铁元素的浓度为0.53mg/mL)和0.5mL 1mM紫杉醇(PTX)加入0.4mL pH7.4 50mM PBS缓冲液中，再向其中加入0.3mL 5mM有机构建单元(3,5-二巯基苯甲酸B1溶于pH 7.4 50mM PBS缓冲液中形成)和0.3mL水，室温下，300rpm搅拌反应48h，离心并分散在水中，制得自组装MR造影剂载药纳米结构。其它步骤同实施例2，可以制备得到一种增强肿瘤的MR成像和癌症的治疗效率的自组装MR造影剂载药体系。
实施例15
本实施例的刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备方法同实施例2的区别在于，步骤(3)具体为：取0.5mL步骤(2)所述的Fe3O4-CTAB溶液(Fe3O4-CTAB溶液中，铁元素的浓度为0.53mg/mL)和0.5mL 1mM米托蒽醌(MTZ)加入0.4mL pH7.450mM PBS缓冲液中，再向其中加入0.3mL 5mM有机构建单元(3,5-二巯基苯甲酸B1溶于pH 7.4 50mM PBS缓冲液中形成)和0.3mL水，室温下，300rpm搅拌反应48h，离心并分散在水中，制得自组装MR造影剂载药纳米结构。其它步骤同实施例2，可以制备得到一种增强肿瘤的MR成像和癌症的治疗效率的自组装MR造影剂载药体系。
本发明的各方面、实施例、特征应视为在所有方面为说明性的且不限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明的制备方法中，各步骤的次序并不限于所列举的次序，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，对各步骤的先后变化也在本发明的保护范围之内。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
最后应说明的是，本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明作举例说明，而并非对本发明的实施方式进行限定。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，这里无需也无法对所有的实施方式予以全例。而这些属于本发明的实质精神所引申出的显而易见的变化或变动仍属于本发明的保护范围，把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。

Claims (10)

1.一种刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系，其特征在于，包括：MR造影剂纳米粒子、配体分子、有机构建单元以及药物分子；
其中MR造影剂纳米粒子表面修饰有配体分子，有机构建单元与配体分子通过相互作用，将MR造影剂纳米粒子自组装在一起形成自组装纳米结构，药物分子分散在所述自组装纳米结构中，靶分子偶联在所述有机构建单元表面。
2.根据权利要求1所述的一种刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系，其特征在于，所述MR造影剂纳米粒子为超顺磁性纳米粒子，包括氧化铁、四氧化三铁、过渡金属掺杂的氧化铁、过渡金属掺杂的四氧化三铁中的一种或几种；
所述MR造影剂纳米粒子的形状选自于球形、碟形、片状、立方体、三角型、棒形、花形中的一种或几种；
所述MR造影剂纳米粒子的粒径为1～500nm。
3.根据权利要求1所述的一种刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系，其特征在于，所述配体分子为季铵盐类分子、吡啶盐类分子、氨基类分子中的一种或多种；
所述有机构建单元为苯环羧酸类双巯基有机分子、蒽环羧酸类双巯基有机分子、萘环羧酸类双巯基有机分子中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的一种刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系，其特征在于，季铵盐类分子为烷基季铵盐，烷基季铵盐具有如下式I或式II所示的结构式：
其中，X为卤族元素，n为1～30的整数；
吡啶盐类分子为烷基吡啶盐，烷基吡啶盐具有如下式III或式IV所示的结构式：
其中，X为卤族元素，n为1～30的整数。
5.根据权利要求3所述的一种刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系，其特征在于，有机构建单元中的“-SH”通过氧化作用形成“S-S”的动态共价键，通过“S-S”的动态交换形成二硫环状分子，所述二硫环状分子与所述MR造影剂纳米粒子表面所修饰的配体分子之间形成相互作用。
6.根据权利要求1或5所述的一种刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系，其特征在于，所述刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系在谷胱甘肽刺激下，自组装纳米结构中的“S-S”被破坏，二硫环状分子重新变成有机构建单元，自组装纳米结构解组装，T2信号减弱，实现MR信号从T2信号到T1信号的变换。
7.如权利要求1所述的一种刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将配体分子溶液与MR造影剂纳米粒子溶液搅拌反应；
(2)将药物分子溶液、步骤(1)所得的混合液加入至有机构建单元溶液中搅拌反应，获得自组装纳米结构；
(3)自组装纳米结构经催化剂活化后，将活化自组装纳米结构和靶分子溶液混合搅拌反应，得到刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系；或者，靶分子经催化剂活化后，将自组装纳米结构和活化的靶分子溶液混合搅拌反应，得到刺激响应型自组装磁共振造影剂载药体系。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，搅拌反应的温度为5～40℃，反应时间为0.5～10h；
步骤(2)中，搅拌反应的温度为5～40℃，反应时间为20～55h；
步骤(3)中，搅拌反应温度为5～40℃，反应时间为5～40h。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，铁元素的摩尔量、药物分子的摩尔量、有机构建单元的摩尔量的比例为1：(0.08～0.15)：(0.20～0.35)。
10.根据权利要求7或9所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，铁元素的摩尔量、药物分子的摩尔量、有机构建单元的摩尔量的比例为1：(0.09～0.12)：(0.29～0.33)。
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