CN116919989A - 一种利用表面电荷调节囊泡分布及治疗效果的方法 - Google Patents

一种利用表面电荷调节囊泡分布及治疗效果的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种利用表面电荷调节囊泡分布及治疗效果的方法。本发明提供了带负电荷的治疗药物在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的用途。所述带负电荷的治疗药物包括诱导性囊泡。本发明研究发现，诱导性囊泡带负电荷，其能够与NETs通过正负电荷相吸相互作用，从而使诱导性囊泡在脓毒血症患者的骨髓和脾脏富集，发挥治疗脓毒血症作用。机制方面，诱导性囊泡富集到骨髓后诱导性囊泡上的Fasl可以通过与中性粒细胞Fas蛋白结合，从而诱导中性粒细胞的凋亡，降低NETs的形成，发挥治疗脓毒血症的作用。

Description

一种利用表面电荷调节囊泡分布及治疗效果的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种利用表面电荷调节囊泡分布及治疗效果的方法。
背景技术
脓毒血症是一种危及生命的器官功能障碍，每年影响全世界数百万人。[1]在脓毒血症中，炎症和免疫反应的过度激活，例如炎性单核细胞和中性粒细胞的浸润，会导致器官功能障碍、感染性休克和死亡。脓毒血症中性粒细胞对先天免疫系统和脓毒血症的炎症发病机制至关重要。[2]中性粒细胞经历一种独特形式的细胞死亡(NETosis)，产生中性粒细胞胞外陷阱(NETs)。[3]NETs可以作为趋化因子吸引癌细胞[3]，并促进细胞迁移和粘附。此外，NETs的形成是宿主防御脓毒血症脓毒血症核心，而NETs的异常积累可能导致血管内凝血和器官衰竭。[4]因此，NET产生的调节对于脓毒血症治疗至关重要。
最近的一项研究表明，中性粒细胞死亡从NETosis转变为凋亡是调节NETs形成和含量的有效方法。[5]外在凋亡途径依赖于细胞表面受体如死亡受体Fas(CD95)的激活。[6,7]Fas是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员，可触发中性粒细胞的凋亡信号级联反应受特定配体Fas配体(FasL)刺激后。[8]然而，Fas/FasL通路与NETosis之间的关系仍不清楚。
发明内容
一些实施方案中，本发明提供了一种带负电荷的治疗药物在制备治疗脓毒血症的药物中的用途。
一些实施方案中，所述带负电荷的治疗药物包括诱导性囊泡。
一些实施方案中，所述药物用于减少肺、脾脏、骨髓或肝脏中的中性粒细胞浸润。
一些实施方案中，所述诱导性囊泡具有标志物FasL。
一些实施方案中，所述诱导性囊泡促进中性粒细胞的凋亡，抑制NETosis。
一些实施方案中，所述诱导性囊泡通过降低NETs的形成治疗脓毒血症。
一些实施方案中，所述诱导性囊泡通过其具有的标志物FasL与中性粒细胞上的Fas蛋白结合诱导中性粒细胞凋亡。
本发明研究发现，骨髓间充质干细胞来源的诱导性囊泡(apoVs)可以提高脓毒血症小鼠的生存率。与正常小鼠(Sham)相比，apoVs在脓毒血症小鼠(CLP)中骨髓和脾脏富集增加，而在肝脏富集减少。
发明人的另一研究发现表明，CLP引起的脓毒症脓毒血症中的apoVs在特定器官的富集分布与apoVs的表面电荷有关，脓毒血症导致小鼠骨髓和脾脏中，中性粒细胞胞外陷阱(NETs)增多，NETs通过静电荷相互作用在脓毒症脓毒血症小鼠中吸引apoVs。apoVs与NETs通过正负电荷相吸相互作用，从而使apoVs在脓毒血症小鼠的骨髓和脾脏富集，发挥治疗脓毒血症作用。
一些实施方案中，发明人研究发现，apoVs富集到骨髓后，apoVs上的Fasl可以通过与中性粒细胞Fas蛋白结合，可以介导中性粒细胞从NETosis到凋亡的细胞死亡模式转换，从而诱导中性粒细胞的凋亡，降低NETs的形成，从而治疗脓毒血症或进而抑制中性粒细胞从骨髓向远端器官的迁移，减轻器官损伤，提高脓毒症小鼠的存活率。
诱导性囊泡治疗脓毒血症是一个很复杂的机理过程。基于本发明的研究发现，本发明可以通过调节囊泡或宿主器官电荷，调节供体囊泡分布进而改善治疗脓毒血症的效果，对临床上治疗脓毒血症具有很好的应用价值和指导意义。一些实施方案中，所述的药物选自注射剂、口服制剂或外用制剂。
一些实施方案中，所述药物为注射剂。
一些实施方案中，所述药物选自静脉注射剂、肌肉注射剂、皮下注射剂或鞘内注射剂。
一些实施方案中，所述药物还包括药学上可接受的药用载体。
一些实施方案中，所述药用载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂和润滑剂中的一种或几种。
一些实施方案中，诱导性囊泡或骨髓或者脾脏的电荷调节剂在制备治疗脓毒血症药物中的用途。
一些实施方案中，骨髓或者脾脏的电荷调节剂在制备诱导性囊泡治疗脓毒血症药物中的用途。
一些实施方案中，本发明提供了诱导性囊泡在制备用于治疗脓毒血症患者肝脏或肾脏或肺部损伤的药物中的用途。
一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，包含诱导性囊泡和带负电荷的材料。
一些实施方案中，所述带负电荷的材料包括化合物。
一些实施方案中，所述化合物包括带负电的类固醇脂质。
一些实施方案中，所述化合物选自硫酸胆固醇。所述的硫酸胆固醇又称为胆固醇硫酸酯Cholesterol sulfate(CS)，可结合细胞膜上的正电荷脂质，从而导致细胞膜电位负值增大。
一些实施方案中，所述组合物包含硫酸胆固醇修饰的诱导性囊泡。
一些实施方案中，所述组合物还包括治疗或预防脓毒血症的药物。
一些实施方案中，所述组合物还包括诱导中性粒细胞凋亡的药物。
一些实施方案中，本发明提供了所述的组合物在制备药物载体系统中的用途。
一些实施方案中，所述载药系统包括为抗脓毒血症药物的载药系统。
一些实施方案中，本发明提供了所述的组合物在制备治疗脓毒血症的药物中的用途。
一些实施方案中，所述诱导性囊泡是在干细胞处于正常存活时通过外加因素诱导凋亡而产生的囊泡。
一些实施方案中，所述诱导方法包括添加星形孢菌素、紫外线照射、饥饿法、或热应力法。
一些实施方案中，所述干细胞为间充质干细胞。
一些实施方案中，所述间充质干细胞来源包括骨髓、尿液、口腔、脂肪、胎盘、脐带、骨膜、肌腱，但又不限于此。
一些实施方案中，所述诱导性囊泡具有的标志物包括CD9、CD63、TSG101、Alix、Integrin alpha-5、Calreticulin、cleaved caspase-3、S1PR1和Annexin V中的一种或多种。
一些实施方案中，所述囊泡对标志物CD9、CD63、TSG101、Alix、Integrin alpha-5、Calreticulin或cleaved caspase-3的表达量高于间充质干细胞。
一些实施方案中，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
一些实施方案中，所述诱导性囊泡具有标志物FasL。
一些实施方案中，所述诱导性囊泡具有标志物Syntaxin 4。在一些实施例中，所述诱导性囊泡高表达标志物Syntaxin 4。在一些实施例中，所述诱导性囊泡对标志物Syntaxin 4的表达高于MSCs或外泌体。在一些实施例中，所述标志物Syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中Syntaxin 4的表达量的3-6倍。在一些实施例中，所述标志物Syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中Syntaxin 4的表达量的3.5-5倍。在一些实施例中，所述标志物Syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中Syntaxin 4的表达量的4.45倍。在一些实施例中，所述标志物还包括Annexin V、Flotillin-1、Cadherin11和Integrin alpha 5中的一种或多种。在一些实施例中，所述标志物为Syntaxin 4、Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11和Integrin alpha 5的组合。在一些实施例中，所述诱导性囊泡高表达标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5。在一些实施例中，所述诱导性囊泡对标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量高于MSCs或外泌体。在一些实施例中，所述诱导性囊泡中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1-2倍、2-3倍、1-3倍和3-4倍。一些实施例中，所述诱导性囊泡中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量分别为1.5-2倍、2.5-3倍、1.5-2.5倍和3.5-4倍。在一些实施例中，所述囊泡中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量分别为1.76倍、2.81倍、2.41倍、3.68倍。
一些实施方案中，所述诱导性囊泡的制备方法包括步骤：(1)培养间充质干细胞；(2)收集间充质干细胞的培养基上清；(3)从步骤(2)中的培养基上清中分离出囊泡。
一些实施方案中，所述步骤(1)中的培养间充质干细胞的步骤包括：(4)从组织中分离间充质干细胞；(5)添加培养基培养间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养基中接触凋亡诱导剂。
一些实施方案中，所述步骤(3)中，分离囊泡的方法包括选用超速离心的方法分离所述囊泡。
一些实施方案中，所述超速离心的方法分离所述囊泡的步骤包括：(a)将收集到的培养上清进行第一次离心，取上清；(b)将步骤(a)中收集到的上清进行第二次离心，取上清；(c)将步骤(b)中收到的上清进行第三次离心，取沉淀；(d)将步骤(c)中收到的沉淀进行第四次离心，取沉淀。
一些实施方案中，所述第一次离心为500-1500g离心5-30分钟；或者所述第一次离心为500-1000g离心5-20分钟；或者所述第一次离心为500-900g离心5-15分钟。在一些实施例中，所述第二次离心为1000-3000g离心5-30分钟；或者所述第二次离心为1500-2500g离心5-20分钟；或者所述第二次离心为1500-2200g离心5-15分钟。在一些实施例中，所述第三次离心为10000-30000g离心15-60分钟；或者所述第三次离心为12000-25000g离心20-60分钟；或者所述第三次离心为12000-20000g离心20-40分钟。在一些实施例中，所述第四次离心为10000-30000g离心15-60分钟，或者所述第四次离心为12000-25000g离心20-60分钟；或者所述第四次离心为12000-20000g离心20-40分钟。
一些实施方案中，所述间充质干细胞的代数可以为第2～5代，但又不限于此。
一些实施方案中，将所述诱导性囊泡用于疾病治疗的过程中，可以将所述诱导性囊泡任选地通过选自由静脉内注射、肌肉注射、皮下注射、鞘内注射或输注以及器官内输注所组成的组中的途径进行给药。例如，作为例子，对于静脉注射，可以通过尾静脉注射。器官内输注包括输注至解剖学空间中，例如，作为例子，胆囊、胃肠腔、食道、肺系统(通过吸入)和/或膀胱。
附图说明
图1A-1Q.apoVs可提高CLP诱导的脓毒血症小鼠的存活率和器官功能。(图1A)BMMSCs和apoVs给药时间表示意图。(图1B)用PBS、BMMSCs或ApoMSCs(n＝10)治疗的脓毒血症小鼠的存活曲线。(图1C)用PBS、BMMSCs或apoVs(n＝10)治疗的脓毒血症小鼠的存活曲线。(图1D)不同组(n＝4)中IL-1β和IL-6的血浆浓度。(图1E)不同组(n＝4)血浆中检测到的TNF-α和IL-10浓度。(图1F)不同组肺的HE染色和组织学评分；箭头表示肺泡壁的厚度。比例尺，100μm(n＝5)。(图1G)检测不同组(n＝4)的肝功能指标(LDH、ALT和AST)水平。(图1H)不同组(n＝4)检测到的肾功能指标(血清肌酐，Scr；血尿素氮，BUN)水平。通过流式细胞术检测骨髓(图1I、图1J)和脾(图1K、图1L)中的中性粒细胞(CD11b+Ly6G+)和炎性单核细胞(CD11b+Ly6C+)的比例(n＝3)。血液中(图1M)中性粒细胞(CD11b+Ly6G+)和(图1N)炎性单核细胞(CD11b+Ly6C+)的比例(n＝3)。肺(图1O)和脾脏(图1P)(n＝3)中的中性粒细胞(Ly6G+)的免疫组织化学和鉴定；箭头表示Ly6G+染色。比例尺，50μm。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。(图1Q)骨髓和肝脏中的中性粒细胞(Ly6G+)的免疫组织化学和定量；箭头表示Ly6G+染色(n＝3)。比例尺，25μm。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图2A-2E.apoVs的表征。(图2A)来自BMMSCs的apoVs的透射电子显微镜分析。比例尺，100nm。(图2B)Western印迹分析显示BMMSCs和apoVs中apoVs和凋亡标志物的表达存在差异。(图2C)ZetaView检测到apoVs的平均直径和zeta电位。(图2D)通过纳米流式细胞术评估apoVs的CD63、整合素alpha-5、S1PR1和膜联蛋白V的表达。(图2E)通过SIM观察apoVs的标记。比例尺，100nm。
图3A-3M.apoVs再分布与静电荷有关。(图3A)CLP诱导的脓毒血症和假手术组小鼠(n＝3)中肝脏、骨髓和脾脏中apoVs的IVIS图像。(图3B)CLP诱导的脓毒血症和假手术组小鼠(n＝4)中血液、肝脏、骨髓和脾脏中apoVs的数量。(图3C)CLP诱导的脓毒血症和假手术组小鼠(n＝3)中肺、肾和心脏中apoVs的IVIS图像。(图3D)IVIS(n＝3)检测了不同组织中apoVs的辐射效率。(图3E)通过荧光显微镜评估apoVs的生物分布。比例尺，20μm。**P<0.01；NS，无统计学差异。(图3F)检测脓毒血症小鼠不同器官的pH值(n＝3)。(图3G)apoVs-OAm和apoVs-CS的集合示意图。(图3H)通过ZetaView(n＝3)分析apoVs-OAm和apoVs-CS的zeta电位。(图3I)IVIS(n＝3)检测到apoVs-OAm和apoVs-CS的生物分布。NS，无统计学差异。(图3J)静脉输注到CLP诱导的脓毒血症和假小鼠(n＝3)后，apoVs和脂质体在肝脏、骨髓和脾脏中的生物分布。(图3K)脂质体(++)预注入肝脏(n＝3)后，apoVs在肝脏、骨髓和脾脏中的生物分布。**P<0.01；***P<0.001；NS，无统计学差异。(图3L)CLP诱导的脓毒血症小鼠和(图3M)脓毒血症小鼠用脂质体(++)预处理后进入肝脏，其apoVs和脂质体在肺部、肾脏和心脏的IVIS图像。
图4A-4D.脂质体的表征。ZetaView(n＝3)检测apoVs和脂质体的(图4A)zeta电位和(4B)直径。(图4C)带不同电荷的apoVs和脂质体的透射电子显微镜分析。比例尺，100nm。(图4D)apoVs和脂质体的初始荧光强度由IVIS确定。
图5A-5I.NETs与apoVs的相互作用。(图5A)PMA和GSK484刺激的中性粒细胞H3Cit和MPO染色的代表性图像。比例尺，50μm。(图5B)通过ELISA(n＝3)检测上清液中MPO和弹性蛋白酶的浓度。(图5C)中性粒细胞中H3Cit和MPO表达的蛋白质印迹分析(n＝3)。(图5D)AFM检测到的回缩力曲线示意图。从(图5E、图5F)NETs和(图5G、图5H)中性粒细胞分离的apoVs和脂质体(n＝3)的代表力曲线和吸引力。(图5I)PMA处理的中性粒细胞和PMA+GSK484处理的中性粒细胞的代表性图像；箭头表示DNA纤维。比例尺，50μm。(图5J)在不同刺激下与中性粒细胞共培养的apoVs和脂质体的代表性荧光图像。比例尺，10μm(n＝3)。**P<0.01；***P<0.001；NS，无统计学差异。(图5K-5M)在不同类型的刺激(n＝3)下与中性粒细胞共培养的apoVs和脂质体的荧光定量。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；NS，无统计学差异。
图6A-6F.apoVs在骨髓中的积累对于apoVs的治疗效果至关重要。(图6A)免疫荧光和(图6B)蛋白质印迹分析H3Cit和MPO在CLP诱导的脓毒血症小鼠的骨髓和脾脏中的表达。比例尺，20μm。(图6C)在骨髓或脾脏中注入GSK484的CLP诱导的脓毒血症小鼠的肝脏、骨髓和脾脏中的apoVs的IVIS图像(n＝3)。(图6D)具有指定治疗的脓毒血症小鼠的存活曲线(n＝5)。(图6E)不同组肺HE染色及组织学评分；箭头表示肺泡壁的厚度(n＝5)。比例尺，50μm。(图6F)不同组(n＝3)血浆中IL-1β和IL-6的浓度。*P<0.05；**P<0.01；NS，无统计学差异。
图7A-7F.NETs与体内apoVs分布之间的关系。(图7A)CLP小鼠肺部H3Cit和MPO染色的代表性图像。比例尺，20μm。(图7B)评估H3Cit和MPO的相对表达水平(n＝3)。分别将GSK484注射到脓毒血症小鼠的骨髓和脾脏后，(图7C)骨髓和(图7D)脾脏中H3Cit和MPO染色的代表性图像。比例尺，20μm。(图7E)不同组间骨髓和脾脏中MPO的浓度(n＝3)。(图7F)在不同类型的治疗(n＝3)下CLP小鼠肺、肾和心脏中apoVs的生物分布。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；NS，无统计学差异。
图8A-8M.apoVs将LPS诱导的NETosis转换为细胞凋亡。(图8A)MTS测定显示apoVs抑制LPS刺激的中性粒细胞的增殖(n＝3)。(图8B)H3Cit和MPO染色和(图8C、图8D)不同类型刺激后中性粒细胞的表达(n＝3)。比例尺，50μm。(图8E)不同组中MPO和弹性蛋白酶的浓度(n＝3)。(图8F)中性粒细胞在不同类型刺激下的ceDNA荧光(n＝3)。(图8G)用PMA和apoVs处理的中性粒细胞的NET形成。比例尺，50μm。(图8H)不同组中MPO和弹性蛋白酶的浓度(n＝3)。(图8I)和(图8J)不同组的膜联蛋白V/7AAD染色(n＝3)。(图8K)FADD、FLIP和Cleavedcaspase-3的表达检测和定量通过蛋白质印迹(n＝3)进行。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。(图8L)流式细胞仪检测到的ROS荧光强度(n＝3)。(图8M)在不同组中检测到MDA和SOD的水平(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图9A-9N.apoVs过表达FasL可提高其治疗效果脓毒血症脓毒血症。(图9A)LPS(n＝3)刺激的中性粒细胞的膜和细胞质Fas表达。(图9B)体外LPS刺激的中性粒细胞膜Fas水平的流式细胞术分析(n＝3)。(图9C)脓毒血症小鼠(n＝3)中性粒细胞的膜和细胞质Fas表达。(图9D)脓毒血症小鼠(n＝3)中性粒细胞膜Fas水平的流式细胞术分析。(图9E)BMMSCs和apoVs(n＝3)中FasL的敲低和(图9F)过表达。(图9G)在apoVs、siFasl-apoVs和ovFasl-apoVs组(n＝3)中检测到LPS刺激的中性粒细胞的ceDNA。(图9H)H3Cit和MPO在不同组(n＝3)中的表达和定量。(图9I)通过ELISA(n＝3)测试MPO和弹性蛋白酶的浓度。(图9J)FADD、FLIP和Cleaved caspase-3在不同组中的表达和定量(n＝3)。(图9K)LPS和apoVs(n＝3)刺激的中性粒细胞凋亡率。(图9L)流式细胞仪检测到的ROS荧光强度(n＝3)。(图9M)在不同组中检测到MDA和SOD的水平(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。(图9N)用apoVs、siFasl-apoVs或ovFasl-apoVs(n＝5)治疗的CLP小鼠的存活曲线。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图10A-10D.apoVs中FasL的敲低和过表达会影响脓毒血症小鼠的炎症和中性粒细胞浸润。(图10A)当脓毒血症小鼠用apoVs、siFasl-apoVs或ovFasl-apoVs(n＝4)治疗时，IL-1β和IL-6的浓度。(图10B)各组的ALT、AST和Scr水平(n＝4)。(图10C)不同组肺HE染色及组织学评分；箭头表示肺泡壁的厚度(n＝4)。比例尺，50μm。(图10D)肺中中性粒细胞(Ly6G+)的免疫组织化学和定量；箭头表示Ly6G+染色(n＝3)。比例尺，25μm。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图11.apoVs通过FasL介导的细胞死亡模式转换对脓毒血症的治疗效果示意图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
本文中，“CLP”指的是盲肠结扎和穿刺。
本文中，“EV”指的是正常细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)，是细胞在正常培养过程或在体内生理条件下自发分泌的纳米级大小的具有膜结构的小体，直径从40-1000nm不等，主要由微囊泡(Microvesicles,MV)、凋亡囊泡(apoptotic vesicle)和外泌体(Exosomes)组成，含有多种RNA、蛋白质等信号分子。
在本文中，apoVs(或apoV)也可称为IEVs或IEV，又称凋亡囊泡，或诱导性囊泡，其为细胞凋亡过程中分泌的细胞外囊泡，直径在100-200nm不等，含有多种RNA、蛋白质等信号分子。体外可通过星形孢菌素(STS)诱导细胞凋亡，后通过差速离心等方法，收集apoVs。在中国专利申请202010066154.6、202010066155.0和202010345131.9等中，公开了一些IEV的研究。
中性粒细胞又称嗜中性粒细胞或多形核嗜中性粒细胞。中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是由活化的中性粒细胞释放的DNA组蛋白和蛋白质组成的网状结构，其在中性粒细胞介导的固有免疫反应中占据了主导地位。中性粒细胞分泌NETs的过程被称为NETosis，即为中性粒细胞的炎性细胞死亡方式。不同于细胞凋亡和坏死，NETs的形成是一种细胞死亡。前者是染色质降解和颗粒物释放到细胞外空间的过程。NETs的形成通常需要中性粒细胞的激活以及NADPH氧化酶产生ROS。可用于预测NETs形成的标记物是H3Cit和MPO-DNA。
“包含”或“包括”旨在表示组合物(例如介质)和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除不会实质上影响要求保护的本发明的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由……组成”是指排除其他组成部分的微量元素和实质性的方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本发明的范围内。
在本文中，“组合物”中的组分可以是混合的形式存在，也可以被分开包装。分开的包装的组分也可以含有其各自的佐剂。所述的佐剂是指在药学中，可辅助药物疗效的手段。对于组合物中的组分在分开包装的情况下，各个分开包装的组分可以是同时施用或者是以任意的前后顺序施用，其中患者先用一种药物治疗，然后再给以另一种药物。所述的患者是指哺乳动物受治疗者，尤其是人类。
在本文中，所述的“组合物”还可以是一种组分被另外一种组分包裹的形式存在。在一些实施方式中，在组合物中，所述的诱导性囊泡作为药物载体，将治疗或预防疾病的药物包裹在所述诱导性囊泡中，所述诱导性囊泡具有靶向性，从而将其所载的药物呈递至特定部位，从而达到高效治疗特定疾病的作用。在一些实施方式中，在组合物中，所述的诱导性囊泡经过修饰后再作为药物载体，将治疗或预防疾病的药物负载于在修饰后的诱导性囊泡中，所述被修饰后的诱导性囊泡具有靶向性，将具有治疗效果的诱导性囊泡富集到特定部位，从而达到高效治疗特定疾病的作用。
实验方法
小鼠
B6.MRL-Faslpr/J(MRL/lpr)和B6Smn.C3-Faslgld/J(BL6 gld)小鼠购自JacksonLaboratory。所有动物实验均按照中山大学机构动物护理和使用委员会(SYSU-IACUC-2021-000544)批准的方案进行。
抗体和试剂
针对CD63(sc-5257)、CD9(sc-13118)、Fas(sc-74540)、FasL(sc-19988)和辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(sc-2357)的抗体购自Santa Cruz Biotechnology(达拉斯，德克萨斯州，美国)。针对钙网蛋白(12238s)、cleaved caspase-3(9664s)、FLIP(8510s)和Ly6G(87048s)的抗体购自Cell Signaling Technology(CST,Beverly,MA,USA)。针对组蛋白H3(ab5103)和FADD(ab124812)的抗体购自Abcam(Cambridge,MA,USA)。Ly6G(GB11229)、GAPDH(GB12002)和髓过氧化物酶(GB12224)抗体购自ServiceBio(中国武汉)。CD11b-APC/Cyanine7(#101226)、Ly6C-APC(#128016)和Ly6G-PE(#127608)购自BioLegend(San Diego,CA,USA)。Annexin V-FITC(#556419)和7AAD(#559925)购自BD Biosciences(San Diego,CA,USA)。Staurosporine(STS,#ALX-380-014)购自Enzo Life Sciences(Farmingdale,NY,USA)。
apoVs的分离和鉴定
人骨髓MSCs(BMMSCs)购自ScienCell Research Laboratories,Inc(Carlsbad,CA,USA)。将P4-P6代细胞与STS(250nM)一起孵育10小时以诱导细胞凋亡(凋亡MSCs,ApoMSCs)。进行连续离心(800g 10分钟、2,000g 10分钟,16,000g 30分钟，16,000g，30分钟)以分离apoVs。最后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤apoVs，并使用BCA蛋白质测定试剂盒(23227,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)测量蛋白质浓度。如先前报道的，apoVs的特征是通过透射电子显微镜(TEM)、蛋白质印迹、ZetaView、纳米流式细胞仪和结构照明显微镜(SIM)。[6,9]
脓毒血症小鼠模型
CLP模型如前所述生成。简而言之，通过吸入异氟烷(4％异氟烷用于诱导；2％异氟烷用于维持)麻醉小鼠。剖腹手术后，用丝线4-0缝合线结扎盲肠，并使用21号针头穿刺两次。盲肠被送回中央腹腔。假手术小鼠接受了相同的剖腹手术，但盲肠既没有结扎也没有穿刺。腹部切口用6-0尼龙线缝合。手术后6小时静脉注射BMMSCs(每只小鼠1×106个细胞)或apoVs(每只小鼠1×1010个颗粒)。然后，在处理后24小时处死小鼠以进行进一步评估。
中性粒细胞的分离和刺激
处死小鼠并取出骨髓。根据制造商的说明，使用分离试剂盒(Solarbio ScienceTechnology，北京，中国)分离骨髓中性粒细胞。细胞在RPMI 1640培养基(BiologicalIndustries，Kibbutz Beit Haemek，Israel)中培养。对于NETosis诱导，用LPS(5μg/mL，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)或PMA(100nM，PeproTech，Cranbury，NJ，USA)刺激细胞4小时。对于NETosis抑制剂(GSK484,Cayman Chemicals,Ann Arbor,MI,USA)[10,11]，添加GSK484(100μmol/L)以抑制体外NET形成。当如前所述生成CLP模型时，将GSK484注射到骨髓(5μg/胫骨)和脾脏(10μg/小鼠)以抑制体内NETosis。[12]
原子力显微镜(AFM)
为了评估电荷依赖性粘附的物理特性，我们使用固定在悬臂尖端的单核细胞进行AFM。AFM是一种带有压电元件的扫描探针显微镜，可以像悬臂一样移动弹簧。将悬臂尖端(MLCT-010，Bruker，Karlsruhe，German)插入含有apoV或脂质体的PBS(50μL)中5分钟，以使apoV或脂质体固定在悬臂中。[13]中性粒细胞接种在盖玻片上，有或没有PMA(NET感应器)刺激。然后，允许悬臂尖端以10μm/s的速度接近和缩回中性粒细胞或NET结构。力-距离曲线报告了接触力(I)、最大粘附力(II)、将单核细胞与NET(III)完全分离所需的力以及这种分离的距离(IV)。使用JPK数据处理软件(版本spm-5.0.96)记录和分析尖端的力。
将小干扰RNA(siRNA)和质粒转染到BMMSCs
对于Fasl敲低，按照制造商的说明，使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Thermo Fisher)用siRNA-Fasl(siFasl，Santa Cruz Biotechnology)或siRNA阴性对照(siControl)转染BMMSC。对于Fasl过表达，使用Lipofectamine 3000转染试剂(ThermoFisher)用Fasl过表达质粒(RiboBio，广州，中国)或具有相同骨架的空质粒转染BMMSC。通过蛋白质印迹评估转染效率。
组织pH值的测量
小鼠脾脏和肝脏被匀浆，随后转移到装有5ml去离子水的培养皿中。从后肢收集骨髓悬浮液以使用用两种标准(pH 4.00和pH 7.00)预先校准的pH计(Mettler-Toledo，Columbus，OH，USA)在室温下测量pH值。每个样品的测量一式两份。
脂质体制备
不同电荷的脂质体购自SunLipo NanoTech(中国上海)。通过混合不同的脂质制备脂质体，包括1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC,850365,sigma)。胆固醇(Chol,700000,sigma),1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane(DOTAP,890890,sigma),1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine(DOPS,840035,西格玛)。通过按设定比例(mol％)混合每种脂质来制备具有不同电荷的脂质体：DSPC/Chol/DOPS在55/40/5(zeta电位接近-40mV)，DSPC/Chol/DOTAP在55/43/2(zeta电位接近+10mV)和55/37/8(zeta电位接近+40mV)。
氧化应激评估
通过ROS测定试剂盒(Beyotime Biotechnology，Shanghai，China)测量细胞内ROS水平。简而言之，在不同处理后用apoV培养中性粒细胞，然后在37℃下用DCFH-DA(10μM/L)孵育20分钟，并通过流式细胞术(NovoExpress,Santa Clara,CA,USA)检测荧光。对于超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)活性测定，使用总SOD测定试剂盒(Beyotime)测量SOD水平。通过脂质过氧化MDA测定试剂盒(Beyotime)测试中性粒细胞的MDA水平。两者都是根据制造商的说明进行的。
细胞凋亡分析
收集中性粒细胞并用1×膜联蛋白V结合缓冲液(#422201，BioLegend)洗涤两次。然后，中性粒细胞与膜联蛋白V和7-AAD在室温下孵育15分钟。通过使用流式细胞术分析细胞凋亡。
组织病理学评估
处死小鼠后，将组织(肺、肝、脾、肾、心脏和骨髓)分离并固定在4％磷酸盐缓冲的甲醛中。然后，将它们脱水并包埋在石蜡中。切片用苏木精和伊红染色并检查以评估器官损伤程度。
对于组织学评估，对肺段的肺泡充血、出血和中性粒细胞浸润进行评分(1，无；2，局灶性间质充血和炎性细胞浸润<50％；3，弥漫性间质充血和炎性细胞浸润；4，局灶性实变和炎性细胞浸润<50％；5、弥漫性实变和炎性细胞浸润>50％)。
对于免疫组织化学分析，切片在柠檬酸盐缓冲液中煮沸用于抗原修复，并用10％山羊血清封闭1小时。Ly6G一抗在4℃孵育12小时。将二抗孵育30分钟。加入DAB(100μl)并用苏木精进行复染。最后，用显微镜(Carl Zeiss，Oberkochen，Germany)对切片进行拍照。通过ImageJ软件(美国国立卫生研究院)分析阳性染色的强度。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
ELISA法检测小鼠血浆中白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-10的浓度，按照制造商的说明进行(美棉生物技术有限公司)。,有限公司,北京,中国)。
流式细胞仪
将组织消化成单细胞悬液后，将细胞与抗体在黑暗中孵育30分钟，然后洗涤两次并通过流式细胞仪(NovoCyte，ACEA Biosciences，USA)进行分析。为了评估细胞凋亡率，将细胞与膜联蛋白V和7AAD一起孵育15分钟。然后通过NovoCyte分析细胞。
蛋白质印迹
如前所述进行蛋白质印迹。用蛋白质提取试剂盒(Thermo Fisher)裂解样品。使用BCA试剂盒进行定量后，将来自每个样品的20μg蛋白质用于电泳并转移到PVDF膜(Millipore，Billerica，MA，USA)。然后将膜封闭1h，与一抗4℃孵育过夜，与HRP标记的二抗孵育1h。最后，通过SuperSignal West Pico化学发光底物(Thermo Fisher，Carlsbad，CA，USA)对膜进行可视化，并通过凝胶成像系统(Bio-Rad，USA)进行扫描。
apoVs的标记和生物分布
对于共培养分析，按照制造商的说明，用PKH26(Invitrogen)标记apoV。ApoV用PKH26染色5分钟并用PBS洗涤。使用显微镜(Carl Zeiss)检测荧光并拍照。对于生物分布分析，用DiR Iodide探针(Yeasen，Beijing，China)标记apoV 10分钟并用PBS洗涤。静脉注射24小时后，处死小鼠，分离组织进行冷冻切片和荧光成像。对于冷冻切片，切片用DAPI(ab104139，abcam)染色。对于荧光成像，使用IVIS Lumina III系统(PerkinElmer，UK)对荧光强度进行量化。
统计分析
使用SPSS Statistics软件(20.0版；IBM，Armonk，NY，USA)进行统计分析。所有数据均表示为平均值±标准差(mean±SD)。Student's t-test用于两组之间的比较。使用Tukey检验的单因素方差分析(ANOVA)进行组间比较。使用Kaplan-Meier曲线的对数秩检验分析生存数据。当P值<0.05时，差异被定义为显着。
实施例1全身输注apoVs可改善盲肠结扎穿刺(CLP)诱导的脓毒血症小鼠的存活率和器官功能
实验结果表明，全身输注骨髓间充质干细胞(BMMSCs)或凋亡间充质干细胞(ApoMSCs)显着提高了CLP诱导的脓毒血症小鼠的存活率(图1A，B)。
我们制备了MSCs来源的apoVs。透射电子显微镜(TEM)显示apoVs表现为双膜球形结构(图2A)。与BMMSCs相比，apoVs表达更多的EV标志物(CD9、CD63、TSG101、Alix和Integrin alpha-5)和特异性凋亡相关标志物(Calreticulin和cleaved caspase-3)，而表达更低的GAPDH和白蛋白(图2B)。ZetaView分析显示apoV的平均大小为150.1±14.8nm，zeta电位为-34.00±2.73mV(图2C)。纳米流式细胞术显示apoVs正表达1-磷酸鞘氨醇受体1(S1PR1)和膜联蛋白V(Annexin V)，它们是凋亡相关标志物(图2D)。结构照明显微镜(SIM)显示切割的caspase-3位于apoVs的表面和内部。而CD63、整合素alpha-5和S1PR1位于apoV的表面(图2E)。
然后，我们测试了apoVs在CLP诱导的脓毒血症小鼠中的治疗效果。发现全身输注apoVs可降低CLP诱导的脓毒血症小鼠的死亡率(图1C)。在CLP诱导的脓毒血症小鼠中，白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α的水平显着增加，而apoVs显着降低了细胞因子的产生(图1D；图1E)。当用apoVs治疗时，脓毒血症小鼠的肺部炎症引起的组织损伤有所改善，类似于BMMSCs治疗组(图1F)。
此外，用apoVs或BMMSCs治疗降低了乳酸脱氢酶(LDH)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、血清肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)的水平，表明apoVs和MSCs可以减轻CLP诱导的脓毒血症小鼠的肝脏和肾脏损伤(图1G，图1H)。
我们发现apoV治疗减少了血液、骨髓和脾脏中CD11b+Ly6G+中性粒细胞和CD11b+Ly6C+炎性单核细胞的数量(图1M，图1N；图1I-图1L)。此外，apoV治疗减少了肺、脾脏、骨髓和肝脏中的中性粒细胞浸润(图1O，图1P；图1Q)，表明apoVs抑制中性粒细胞在远端器官中的浸润以抑制过度炎症反应和器官伤害，从而提高成活率。
在本研究中，我们发现MSC来源的apoVs改善了小鼠的疾病表型并降低了死亡率与CLP引起的脓毒血症。
实施例2 CLP引起的脓毒血症中的ApoV分布与电荷有关
EV的生物分布对其治疗效果和药物递送至关重要。[14,15]因此，我们检查了ApoV在CLP诱导的脓毒血症小鼠中的生物分布。与假手术组相比，apoVs主要分布在输注后24小时的骨髓和脾脏中，肝脏中的数量显着减少(图3A，图3B,图3C，图3D)。荧光显微镜检查还显示，与假手术组相比，脓毒血症小鼠骨髓和脾脏中的apoV数量增加(图3E)。
EVs的生物分布受许多因素的影响，包括pH值和电荷。虽然我们发现假手术小鼠和CLP组小鼠的肝脏、脾脏和骨髓中的pH值没有显着差异(图3F)。
为了评估apoV在脓毒血症小鼠中的电荷驱动生物分布，MSC与油胺(OAm)或硫酸胆固醇(CS)一起孵育24小时，随后分离出apoVs-OAm和apoVs-CS(图3G)。OAm是一种带正电的不饱和脂肪酸，而CS是一种带负电的类固醇脂质。[13,16]两种脂质都与其亲脂部分整合到细胞膜的磷脂双层中，因此可以操纵细胞表面电荷。[13]ZetaView显示apoVs-OAm的zeta电位为+10.04±0.72mV，apoVs-CS为-39.50±0.57mV(图3H)。体内成像系统(IVIS)分析显示，apoVs-OAm组肝脏荧光强度高于其他组，而apoVs-CS组脾脏和骨髓荧光强度高于其他组(图3I)。这些数据表明，apoVs在CLP小鼠中的生物分布与apoVs的表面电荷有关。
接下来，我们使用直径和形态与apoV相似但电荷不同的脂质体来评估电荷在CLP诱导的脓毒血症小鼠apoVs分布中的作用(图4A-图4C)。不同类型脂质体(此处称为-、+和++组)的电荷分别为-39.7±0.13mV、+11.5±1.10mV和+47.2±0.99mV(图4A)。将具有相似荧光强度的apoVs和脂质体静脉注射到CLP小鼠中(图4D)。有趣的是，apoVs和脂质体(-)主要分布在骨髓和脾脏中，而脂质体(+)和(++)主要分布在肝脏中(图3J；图3L)。此外，与apoV组相比，脂质体(-)组的荧光图像显示肝脏密度较低，骨髓和脾脏密度较高(图3J)。
为了进一步验证静电荷相互作用的功能作用，我们在CLP期间将脂质体(++)注入肝脏。结果表明，脂质体(++)注射到肝脏后，肝脏中的apoVs数量增加，而骨髓和脾脏中的数量减少(图3K；图3M)。这些数据表明，apoVs的分布在CLP诱导的脓毒血症小鼠中是电荷依赖性的。
在这项研究中，仔细比较apoVs和具有不同电荷的脂质体的生物分布表明，apoVs在CLP诱导的脓毒血症小鼠中的分布是一个电荷依赖性过程。
实施例3 NETs通过静电荷相互作用在脓毒血症小鼠中吸引apoVs
许多中性粒细胞在脓毒血症小鼠中经历NETosis并释放NET。
收集来自骨髓的中性粒细胞并在体外诱导进行NETosis。Phorbol 12-myristate13-acetate(PMA)用于诱导NETs形成，GSK484盐酸盐(PMA抑制剂)用于抑制它(图5A-图5C)。接下来，我们使用带有悬臂的扫描探针显微镜通过原子力显微镜(AFM)评估了apoVs和NETs之间的相互作用。apoVs和脂质体分别固定在悬臂的顶端。悬臂完全附着在中性粒细胞或NET上并随后脱离。在接触过程中，记录作用在悬臂上的力。回缩力曲线包括四个阶段：接触力(I)、最大粘附力(II)、将apoVs从中性粒细胞或NET完全分离所需的力(III)以及这种分离的距离(IV；图5D)。吸引力是曲线上的最小值。[13]与脂质体(+)和(++)相比，apoVs和脂质体(-)对NETs具有明显的吸引力，NETs装饰有带正电荷的组蛋白。脂质体(-)组中NETs的吸引力高于apoVs组，这与脂质体(-)和apoVs之间的电荷差异一致(图5E，图5F)。脂质体(+)和(++)对NET显示排斥力(图5E，图5F)，对中性粒细胞显示吸引力(图5G、5H)。
中性粒细胞呈圆形，有一些膜皱襞。用PMA刺激后，细胞变平，形成膜突起并释放DNA纤维，而GSK484可以抑制NETs的形成(图5I)。接下来，使用共培养测定来评估apoVs和NETs之间的相互作用。与中性粒细胞共培养时，脂质体(++)的数量最高(图5J；图5K-图5M)。然而，当用PMA处理中性粒细胞时，脂质体(-)和apoV组中的颗粒数量大于脂质体(+)和(++)组中的颗粒数，表明NET产生可以通过静电相互作用吸引带负电荷的脂质体(-)和apoVs(图5J；5K-5M)。
此外，当同时用PMA和GSK484处理中性粒细胞时，apoVs和NETs之间的静电相互作用受到抑制(图5J；图5K-5M)。在我们的研究中，我们发现NETs通过静电荷相互作用吸引apoVs，并在CLP诱导的脓毒血症小鼠中引起apoVs的重新分布，这与apoVs的治疗效果密切相关。
当脂质体与嗜中性粒细胞共培养时，脂质体(++)与嗜中性粒细胞具有吸引力。当用PMA处理中性粒细胞时，NETs产生并释放带正电荷的组蛋白。脂质体(++)与组蛋白有排斥力。当脂质体与中性粒细胞共培养时，脂质体(++)的数量最多，在PMA处理下显着减少。
实施例4骨髓中ApoV的积累对于脓毒血症治疗至关重要
我们根据骨髓和脾脏中apoVs的积累评估了不同器官中NETs的状态。与肺相比，CLP诱导的脓毒血症小鼠的骨髓和脾脏表现出丰富的NETs形成(图6A；图7A)。CLP诱导的脓毒血症小鼠骨髓中H3Cit和MPO的表达水平增加(图6B；图7B)。为了进一步探索NET在apoVs募集中的作用，我们在CLP诱导的脓毒血症小鼠中用GSK484治疗了骨髓和脾脏。GSK484治疗抑制NETs的形成并减少骨髓和脾脏中MPO的产生(图7C-图7E)。有趣的是，用GSK484预处理骨髓可以减少骨髓中的apoVs积累，同时促进脓毒血症小鼠肝脏和脾脏中的积累(图6C；图7F)。同样，用GSK484预处理脾脏可减少apoVs积累(图6C；图7F)。因此，这些数据证实了电荷驱动的apoV s招募。
此外，我们发现骨髓中的GSK484预处理阻断了apoVs介导的CLP诱导的脓毒血症小鼠的治疗效果，加重了肺损伤和炎症反应(图6D-图6F)。然而，脾脏的GSK484预处理未能显示出对apoVs介导的治疗效果的明显抑制作用(图6D)。因此，apoVs在骨髓中的积累对于apoVs介导的脓毒血症治疗至关重要。
实施例5 ApoVs将脂多糖(LPS)诱导的NETosis转换为细胞凋亡
中性粒细胞迁移到感染部位对于宿主防御反应至关重要，然而，中性粒细胞在炎症部位的过度积累会导致组织损伤和器官衰竭。[17]结果表明，apoVs抑制了中性粒细胞和单核细胞向远程器官的浸润(图1M-图1P)。此外，当LPS刺激中性粒细胞时，apoVs抑制中性粒细胞增殖(图8A)。有趣的是，当LPS或PMA刺激中性粒细胞时，apoVs抑制NETs的形成(图8B-图8D；图8E-图8H)，而当用LPS刺激中性粒细胞时，apoVs促进中性粒细胞凋亡(图8I，8J)。ApoVs提高了Fas相关死亡域蛋白(FADD)和切割caspase-3的表达水平，同时在LPS刺激时降低嗜中性粒细胞中抗凋亡蛋白FLICE样抑制蛋白(FLIP)的表达水平(图8K)。
先前的研究表明，过量的NET产生会导致炎症损伤和器官功能障碍。[4,18]细胞死亡类型从NETosis转变为凋亡可能有助于维持组织稳态并防止疾病发展。[5,19]因此，apoVs治疗脓毒血症可能与中性粒细胞死亡模式的转变有关。活性氧(ROS)被确定为加剧氧化应激的基本自由基。[20,21]我们发现LPS处理提高了ROS和丙二醛(MDA)的水平，但降低了超氧化物歧化酶(SOD)的活性(图8L，图8M)。ApoVs处理减少了ROS的产生和MDA的形成以及SOD活性的升高(图8L，8M)。这些数据表明，apoVs可以减弱LPS诱导的氧化应激并对中性粒细胞发挥抗氧化作用。
程序性细胞死亡在维持组织稳态中起着至关重要的作用。[22]不同细胞死亡模式之间的转换可能为炎症性疾病提供潜在的治疗方法。[23,24]金黄色葡萄球菌引发从细胞凋亡到坏死细胞死亡的转变，导致严重的炎症反应。[25]在脓毒血症中，过度的NET形成会导致组织损伤和器官衰竭。[26]因此，转换细胞死亡模式可能有助于脓毒血症的治疗。ApoVs将中性粒细胞的死亡模式从NETosis转变为凋亡，从而减轻过度的NET负担并提高脓毒血症的存活率。
实施例6 Fas/FasL/ROS通路对ApoV治疗脓毒血症的重要性
为了阐明在炎症刺激下apoVs诱导中性粒细胞凋亡的机制，使用蛋白质印迹和流式细胞术检查膜Fas表达。
结果表明，当用LPS刺激时，嗜中性粒细胞中的膜Fas表达增加(图9A，图9B)。同样，脓毒血症小鼠骨髓中性粒细胞中的膜Fas表达增加，同时细胞质中Fas表达减少(图9C，图9D)。
为了进一步验证Fas/FasL通路的作用，我们分别使用Fasl siRNA和Fasl质粒产生siFasl-BMMSCs和ovFasl-BMMSCs，随后产生了siFasl-apoVs和ovFasl-apoVs(图9E，图9F)。结果表明，apoVs中Fasl的敲除减弱了对NET形成的抑制作用(图9G-图9I)。相反，Fasl的过度表达增强了apoVs对NETs形成的抑制作用(图9G-图9I)。敲除Fasl会损害apoVs对LPS刺激的中性粒细胞的促凋亡作用，抑制FADD和裂解的caspase-3的表达，并提高FLIP的表达(图9J；图9K)。此外，Fasl的敲低削弱了apoVs对ROS产生和氧化应激的抑制作用，而ovFasl-apoVs具有相反的作用(图9L，9M)。
与apoVs组相比，siFasl-apoVs组对脓毒血症的治疗效果受到抑制，而ovFasl-apoVs组则有所改善(图9N)。ovFasl-apoVs进一步减轻了CLP诱导的脓毒血症小鼠的器官损伤并抑制了炎症反应，而Fasl的敲低削弱了apoVs对组织炎症和器官损伤的治疗作用(图10A-图10D)。因此，这些数据表明，apoVs诱导中性粒细胞凋亡，并通过Fas/FasL/ROS途径将LPS诱导的NETosis转换为凋亡(图11)。
从机制上讲，ROS爆发对于蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的组蛋白瓜氨酸化和NETosis期间MPO的释放至关重要。此外，ROS爆发可以刺激髓细胞白血病1(Mcl1，主要的抗凋亡蛋白)表达并阻止半胱天冬酶活化。在这项研究中，我们发现apoVs抑制NETosis并通过Fas/FasL通路将中性粒细胞NETosis转换为细胞凋亡。结果表明，当用LPS处理中性粒细胞时，apoVs降低了ROS水平(图8L-图8M)。此外，当用LPS处理中性粒细胞时，siFasl-apoVs组的ROS水平增加(图9L-图9M)。相反，ovFasl-apoVs组的ROS水平降低(图9L-图9M)。因此，Fas/FasL通路通过抑制ROS爆发将中性粒细胞NETosis转换为凋亡，这可能进一步调节抗凋亡蛋白和半胱天冬酶的表达。
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[25]A.van Kruchten,J.J.Wilden,S.Niemann,G.Peters,B.Loffler,S.Ludwig,C.Ehrhardt,FASEB J.2018,32,2779.
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Claims (10)

1.带负电荷的治疗药物在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述带负电荷的治疗药物包括诱导性囊泡；
优选地，所述药物用于减少肺、脾脏或肝脏中的中性粒细胞浸润；
优选地，所述诱导性囊泡具有标志物FasL；
优选地，所述诱导性囊泡促进中性粒细胞的凋亡；
优选地，所述诱导性囊泡通过降低NETs的形成治疗脓毒血症；
优选地，所述诱导性囊泡通过其标志物FasL与中性粒细胞上的Fas蛋白结合诱导中性粒细胞凋亡。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的药物选自注射剂、口服制剂或外用制剂；
优选地，所述药物为注射剂；
优选地，所述药物选自静脉注射剂、肌肉注射剂、皮下注射剂或鞘内注射剂；
优选地，所述药物还包括药学上可接受的药用载体；
优选地，所述药用载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂和润滑剂中的一种或几种。
4.诱导性囊泡或骨髓或者脾脏的电荷调节剂在制备治疗脓毒血症药物中的用途。
5.诱导性囊泡在制备用于治疗脓毒血症患者肝脏或肾脏或肺部损伤的药物中的用途。
6.一种组合物，其特征在于，包含诱导性囊泡和带负电荷的材料；
优选地，所述带负电荷的材料包括化合物；
优选地，所述化合物包括带负电的类固醇脂质；
优选地，所述化合物选自硫酸胆固醇。
优选地，所述组合物包含硫酸胆固醇修饰的诱导性囊泡。
优选地，所述组合物还包括治疗或预防脓毒血症的药物；
优选地，所述组合物还包括诱导中性粒细胞凋亡的药物。
7.权利要求6所述的组合物在制备药物载体系统中的用途；
优选地，所述载药系统包括为抗脓毒血症药物的载药系统。
8.权利要求6所述的组合物在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的用途。
9.如权利要求2所述的用途，权利要求4所述的用途，权利要求5所述的用途，权利要求6所述的组合物，权利要求7所述的用途或权利要求8所述的用途，其特征在于，所述诱导性囊泡是在干细胞处于正常存活时通过外加因素诱导凋亡而产生的囊泡；
优选地，所述诱导方法包括添加星形孢菌素、紫外线照射、饥饿法、或热应力法；
更为优选地，所述干细胞为间充质干细胞；
更为优选地，所述间充质干细胞来源包括骨髓、尿液、口腔、脂肪、胎盘、脐带、骨膜、肌腱。
10.如权利要求2所述的用途，权利要求4所述的用途，权利要求5所述的用途，权利要求6所述的组合物，或权利要求7所述的用途或权利要求8所述的用途，其特征在于，所述诱导性囊泡具有的标志物包括CD9、CD63、TSG101、Alix、Integrin alpha-5、Calreticulin、cleaved caspase-3、S1PR1和Annexin V中的一种或多种；
优选地，所述囊泡对标志物CD9、CD63、TSG101、Alix、Integrin alpha-5、Calreticulin或cleaved caspase-3的表达量高于间充质干细胞；
优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞；
优选地，所述诱导性囊泡具有标志物FasL。
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