CN116888470A - 介电常数测量探针在包含细胞聚集体的悬浮培养聚集体中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测量包含细胞聚集体的细胞悬浮液中的细胞密度的方法，所述方法包括(i)测量所述细胞悬浮液的介电常数；(ii)将所测量的介电常数与指示细胞密度的预定值进行比较，从而确定细胞密度。本发明还描述了一种用于确定包含细胞聚集体的悬浮细胞培养物的细胞密度的介电常数探针。

Description

介电常数测量探针在包含细胞聚集体的悬浮培养聚集体中的 应用

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年1月21日提交的欧洲专利申请第21152718.9号的优先权的权益，其内容通过引用整体结合于此，以用于所有目的。

技术领域

本发明涉及一种测量包含细胞聚集体的细胞悬浮液中细胞密度的方法，所述方法包括(i)测量所述细胞悬浮液的介电常数；(ii)将所测量的介电常数与指示细胞密度的预定值进行比较，从而确定细胞密度。本发明进一步描述介电常数探针用于确定包含细胞聚集体的悬浮细胞培养物的细胞密度的用途。

发明背景

据报道，使用生物反应器系统能够生产大量的贴壁细胞，例如PSC、iPSC和iPSC衍生的细胞(Kropp等人，2017)。在这些系统中，细胞通常不附着于培养皿的表面，而是在自由漂浮的悬浮液中生长，这是因为当在悬浮液中培养时，贴壁细胞如PSC会形成聚集体。生物反应器系统中的悬浮培养被描述为比贴壁培养更有效，这是因为即使在高细胞数量和需要较少材料和工作量的情况下，培养也可以被监测、控制和自动化。重要的是，由于这些原因，对于GMP控制的应用，生物反应器系统的使用将优于静态培养。已经报道了不同的生物反应器系统用于贴壁细胞如PSC的悬浮培养，其中搅拌罐反应器(STR)系统是描述的最好的系统。研究表明，在STR系统中可成功地产生大量的iPSC和iPSC-CM(Chen等人，2012；Halloin等人，2019；Hemmi等人，2014；Jiang等人，2019；Kempf等人，2015；Kropp等人，2016)。

除了监测贴壁细胞悬浮培养物中的培养条件，例如pH和溶解氧(DO)，STR的使用也能够监测细胞培养物本身的质量。为此目的，已经描述了用于STR的探针，其可用于细胞的在线监测和培养条件的控制。细胞浓度的动力学是一个重要的参数，因为它指示培养物的总体质量，并且可以用于控制补料和收获。在不使用在线探针的情况下，细胞浓度仅可通过定期取样和离线测量来确定。迄今为止，还没有描述过对包含细胞聚集体的细胞悬浮液的细胞密度的在线测量。

因此，仍然需要测量包含细胞聚集体的细胞悬浮液中的细胞密度的方法。本发明旨在解决这种需要。

发明简述

该问题通过权利要求中限定的主题来解决。本文提供一种测量包含细胞聚集体的细胞悬浮液中的细胞密度的方法、介电常数探针用于确定包含细胞聚集体的悬浮细胞培养物的细胞密度的用途、以及介电常数探针在本发明的方法中的用途。

因此，本发明涉及一种测量包含细胞聚集体的细胞悬浮液中的细胞密度的方法，所述方法包括：

(i)测量所述细胞悬液液的介电常数；

(ii)将所测量的介电常数与指示所述细胞密度的预定值进行比较，从而确定所述细胞密度。

本发明还涉及介电常数探针用于确定包含细胞聚集体的悬浮细胞培养物的细胞密度的用途。

(步骤(i)的)测量可以在生物反应器中进行。

生物反应器可以是搅拌生物反应器、摇摆运动生物反应器和/或多个平行生物反应器。

所述悬浮培养物的细胞密度可以在线测量(实时)。

可以使用介电常数探针来执行介电常数的测量。介电常数的测定可以使用电介质光谱法进行。

细胞可以选自原代细胞、从组织或器官获得的细胞、永生化细胞、干细胞如多能干细胞或源自干细胞的细胞。细胞可以是多能干细胞。细胞还可以是选自诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)、孤雌生殖干细胞(pPSC)和核转移衍生的PSC(ntPSC)的多能干细胞，优选iPSC。

转换因子可以通过以下方式获得：

(a)测量至少两种、优选至少三种不同细胞密度的参考悬浮培养物的介电常数和细胞密度；

(b)将所测量的所述参考悬浮培养物的细胞介电常数与所述细胞密度相关联，从而确定指示所述细胞密度的预定值。

相关性可以提供线性相关性。参考悬浮培养物和悬浮培养物可以来自相似或相同或相似的细胞类型、细胞系、组织或器官。可以使用相同的培养基培养参考悬浮培养物和悬浮培养物。参考悬浮培养物和悬浮培养物可以在相似或相同的生物反应器中培养。

细胞密度可以是活细胞密度。

本发明还涉及介电常数探针在本发明的方法中的用途。

附图简要说明

当结合非限制性实施例和附图考虑时，参考发明详述将更好地理解本发明，其中：

图1显示相对于离线细胞计数(Nucleocounter 200)的在线介电常数测量(ViaMass)。介电常数测量与细胞浓度相关。有趣的是，介电常数测量记录了未被离线测量捕获的动态变化(示例性平稳期由星号标记，突然的培养基添加由箭头标记)。图1A示出示例性的第1轮：在标记的时间点增加培养体积。图1B示出示例性的第2轮：通过灌注将培养体积保持在恒定水平。灌注率在第3天的标记时间增加，此时电容测量达到稳定水平。在第4天和第9天，iPSC传代，这通过由UniVessel的抽吸和再填充引起的电容的突然强烈变化来指示。

图2显示相对于聚集体尺寸的离线分析(Cellavista)的在线介电常数测量(ViaMass)。介电常数测量结果与聚集体尺寸不相关。在电容记录中清楚地显示了培养体积的变化，而聚集体尺寸不受它们的影响。图1A示出示例性的第1轮：在标记的时间点增加培养体积。图1B示出示例性的第2轮：通过灌注将培养体积保持在恒定水平。在第4天和第9天，iPSC传代，这由UniVessel的抽吸和再填充引起的电容的突然强烈变化来指示。

发明详述

本发明将在下文中详细描述，并且还将通过所附的实施例和附图进一步说明。

迄今为止，仅显示在微载体上培养的细胞的悬浮培养允许介电常数测量和与细胞浓度的相关性。然而，重要的是，注意到仅细胞聚集体悬浮培养和基于微载体的悬浮培养是不可比的。这是因为细胞在微载体上生长为单层或几层。另一方面，聚集体中的细胞在许多层中紧密生长，并且具有显著更高量的细胞-细胞相互作用。本发明首次描述了介电常数测量探针在仅含细胞的，即无微载体的，细胞如PSC的聚集体悬浮培养物中的成功应用，以及与细胞浓度的相关性。如实施例1所示，测量的介电常数与PSC聚集体的细胞密度良好相关，但令人惊讶的是与细胞聚集体尺寸不相关。因此，测量介电常数可以用于确定细胞聚集体中细胞的细胞密度，而不受聚集体尺寸变化的影响。本发明能够在线监测和评估悬浮培养物中的PSC质量、增殖和细胞浓度，并将允许控制培养参数和关键工艺步骤。因此，本发明将有助于GMP控制的大规模细胞生产。另外，计数细胞聚集体中的细胞数目总是包括细胞聚集体预先解离成单个细胞。当使用本发明的方法和用途时，细胞解离不再是细胞计数所必需的，这允许直接监测细胞密度而没有任何延迟。

本发明方法的一般原理如下：首先，必须获得表示细胞密度的预定值，或者换句话说，必须获得允许介电常数转换成细胞密度的预定值。这可以例如通过测量从悬浮培养物获得样品的细胞密度、解离细胞聚集体和使用“离线”方法如手动计数或使用自动细胞计数器计数细胞来进行。同时，测量悬浮培养物的介电常数。在另一种细胞密度下将此重复至少一次，例如通过简单地培养PSC一段时间以使细胞密度增加。基于这至少两个数据对，可以获得介电常数和细胞密度之间的相关性，从而可以获得预定值。然后，该预定值可用于将在线介电常数的测量值转换为在线细胞密度，用于任何后续培养。

因此，本发明涉及一种测量包含细胞聚集体的细胞悬浮液中的细胞密度的方法，所述方法包括：

(i)测量所述细胞悬浮液的介电常数；

(ii)将所测量的介电常数与指示所述细胞密度的预定值进行比较，从而确定所述细胞密度。

本文所使用的“绝对介电常数”通常简称为“介电常数”，用希腊字母ε表示，涉及电介质电极化率的量度。具有高介电常数的材料比具有低介电常数的材料响应于施加的电场更极化，从而在材料中储存更多能量。介电常数的SI单位是法拉/米(F/m)。在本发明的上下文中，电介质可以被看作是活细胞的细胞体积。细胞，特别是细胞的数量，对细胞介电常数具有可测量的影响，其原则上可以用于导出细胞数量。然而，细胞悬浮液是相当复杂的电系统，并且本领域技术人员不能预期细胞聚集体的行为类似于单细胞。然而，本发明人还是能够成功地将介电常数测量用于细胞聚集体的细胞密度确定。

如本文所述(也参见实施例1)，本发明人发现，细胞悬浮液的细胞密度可以在线测量，或者换句话说，可以实时测量。因此，可以在线(实时)测量悬浮培养物的细胞密度。

细胞悬浮液的介电常数可以通过本领域技术人员知道的各种方法测量。一种示例性方式是使用介电常数探针。因此，可以使用介电常数探针来进行介电常数的测量。介电常数探针是商业上可获得的：例如ViaMass，获自Sartorius Stedim Biotech；Incyte，获自Hamilton；或Futura Probe，获自Aber Instruments Ltd。

在一个实施方式中，通过使用介电谱(DS)进行介电常数测量。DS基于导电介质中物质或生物单元的无源介电性能的测量。该术语基本上描述了在一定频率范围内电容和电导率的测量和分析。将称为电介质的样品置于两个电极之间的电场中。然后，在存在交变电场的情况下，电流-电压关系的变化被用于导出关于样品的信息。DS的基本思想是向系统(例如包含细胞聚集体的细胞悬浮液)施加例如不同频率的周期性交变电场。用于DS的系统可以是完整的多细胞生物体，例如DS医疗应用中的人，或者在感兴趣的情况下，是含有悬浮或支持细胞或单细胞生物体(其中至少一些是活的)以及低分子溶质(盐、营养物)和可能的细胞碎片、病毒和病毒颗粒的溶液/悬浮液。如果频率在正确的范围内，那么介质中的一些成分可以例如通过将一些能量存储为临时分离的电荷(极化)来响应。当电场周期性反转时，则检测到系统响应中的一些滞后(幅度和/或频率变化)。这种响应是电介质光谱学的基础。

根据频率和场强，施加到样品的AC电场可能会引起带电实体的极化、取向或位移，其范围可以从单个无机离子到整个细胞或甚至多细胞生物体。在0.1-10MHz的范围内，该方法被称为射频阻抗谱(RFI)，并且发生具有表面的非导电实体(例如细胞膜)的极化。因此，所施加的AC电场的频率可以在50kHz到20MHz之间的范围内，更优选地在300到900kHz的范围内，更优选地在400到800kHz的范围内，更优选地在500到700kHz的范围内，最优选地在大约580kHz。该范围代表DS可能的宽范围频率的一小部分。中间波长引起偶极子的取向变化，而近红外和红外频率引起原子弛豫。在可见光范围内观察到电子弛豫。在射频范围内，具有完整质膜的细胞基本上充当电容器，因为一般基于脂质的细胞质膜的非导电性质允许电荷的累积。活的生物体主动地维持穿过它们的膜的电化学电势差。关于如何使用介电光谱法的进一步指导可参见Justiece等人，2011年。

与非活细胞相比，具有完整膜的活细胞的电容值非常高，因此RFI基本上看不见非活细胞、渗漏细胞、细胞碎片、放出的气泡和其它培养基成分。因此，本文所用的细胞密度优选为活细胞密度(活细胞/体积)。

如本文所述，通过将测量的介电常数与预定的转换因子进行比较来确定细胞密度。该转化因子可以通过将参考悬浮培养物的测量的介电常数与不同细胞密度下参考悬浮培养物的实际细胞密度相关联而获得，例如通过手动或自动细胞计数获得。因此，本文所述的转换因子可以通过以下步骤获得：

(a)测量参考悬浮培养物的至少两种，优选至少三种不同细胞密度的介电常数和细胞密度；

(b)将所测量的参考悬浮培养物的介电常数与所述细胞密度相关联，从而确定指示所述细胞密度的预定值。

相关可以是线性相关，或者换句话说，相关可以提供线性相关。在本文中，“线性相关”可以理解为线性回归分析的结果。在统计学中，线性回归是对标量响应(或因变量)与一个或多个解释性变量(或自变量)之间的关系进行建模的线性方法。一个解释变量的情况被称为简单线性回归，并且适用于本公开内描述的线性回归。在线性回归中，使用线性预测函数对关系进行建模，从数据估计线性预测函数的未知模型参数。这种模型被称为线性模型。最常见的是，给定解释变量(或预测因子)的值的响应的条件均值假定为这些值的仿射函数；较不常见的是，使用条件中值或一些其它分位数。与所有形式的回归分析一样，线性回归关注给定预测因子的值的响应的条件概率分布，而不关注所有这些变量的联合概率分布，这是多变量分析的域。线性回归模型通常使用最小二乘法拟合，但是它们也可以以其他方式拟合，例如通过最小化一些其他范数中的“拟合缺失”(如利用最小绝对偏差回归)，或者通过最小化如岭回归(L2-范数惩罚)和lasso(L1-范数惩罚)中的最小二乘成本函数的惩罚版本。相反，最小二乘法可用于拟合非线性模型。因此，尽管术语“最小二乘法”和“线性模型”紧密关联，但它们不是同义的。然而，相关性不限于线性，也可以是非线性相关性或回归。在使用线性回归的情况下，可以计算如下所示的等式的线性函数：

f(x)＝ax+b

其中a是直线的斜率，b是截距。函数f(x)可以给出所测量的介电常数x的每个值的单元密度。因此，f(x)可以被视为预定值。

通过使至少两个值相关来获得预定值，该预定值例如是线性回归的绝对最小值。然而，获得的数据对(介电常数和单元密度)越多，相关结果越准确。因此，优选地，在执行相关之前，获得三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多数据对。有利地，对于一定范围的细胞密度获得介电常数，这是在细胞悬浮液的完全培养过程中预期的。

有利地，“参考悬浮培养物”是在与待评估的细胞悬浮液基本上相同的条件下培养的细胞悬浮液，例如通过本文所述的方法或用途。相同的条件可以包括但不限于细胞类型、细胞系、培养基和/或用于培养的培养容器如生物反应器。在一些实施方案中，相同的条件包括细胞类型、细胞系、培养基和用于培养的培养容器如生物反应器。

因此，参考悬浮培养物和悬浮培养物优选来自相似或相同的细胞类型、细胞系、组织或器官。细胞类型、细胞系、组织或器官类似是指它们不一定获自相同的受试者，而是相同的细胞类型。从两个不同患者获得的PSC可以看作是相似的。另一方面，来自同一患者的心肌细胞和神经元可以被看作不相似。从同一患者获得的PSC可以看作是相同的细胞。类似的推理适用于细胞系。例如，来源于两个不同患者的两个PSC细胞系可看作相似。描述相似或相同细胞类型、细胞系、组织或器官的另一优选特征是分化状态。在分化阶段期间，介电性质可能改变。因此，细胞悬浮液和参考悬浮培养物的细胞优选具有相同的分化阶段。在PSC的情况下，这可能意味着细胞悬浮液和参考悬浮培养物的PSC不是分化的，而是保持多能状态。

另外或可选地，使用相同的培养基培养参考悬浮培养物和悬浮培养物。相同的培养基至少是具有基本相同的盐浓度和/或(优选“和”)基本相同的pH值的培养基。另外或可选地，培养基的电导率可以基本上相同。相同的培养基也可以涉及(完全地)相同的培养基。它也可以涉及具有基本上相同组成的介质。

此外，另外或可选地，参考悬浮培养物和悬浮培养物优选在相似或相同的生物反应器中培养。类似的生物反应器是指与生物反应器相同型号的生物反应器，或者是指具有基本相同尺寸并且其培养容器由相同材料制成的生物反应器。

术语“悬浮培养物”或“细胞悬浮液”，这两个术语可以互换使用，如本文所用，是一种细胞培养物，其中允许单细胞或细胞的小聚集体在优选搅拌的生长培养基中起作用和繁殖，从而形成悬浮液(参见化学中的定义：“悬浮在液体中的小固体颗粒”)。这与贴壁培养相反，在贴壁培养中，细胞附着于细胞培养容器上，细胞培养容器可以包被有细胞外基质(ECM)的蛋白质。在悬浮培养中，在一个实施方案中，细胞和/或培养基中不加入ECM的蛋白。悬浮培养物优选基本上不含固体颗粒，例如珠、微球、微载体颗粒等；在本文中，细胞或细胞聚集体不是固体颗粒。在一个实施方案中，细胞不在微载体(悬浮)培养物中。优选地，悬浮培养物是灌注悬浮培养物。

悬浮培养的贴壁细胞，即不能附着于培养容器的细胞，可以形成细胞聚集体。这也适用于在本文所述的用途和方法中培养的PSC。如本文所用，术语“聚集体”和“细胞聚集体”可互换使用，是指多个细胞，例如(诱导的)多能干细胞，其中细胞之间的缔合是由细胞-细胞相互作用(例如，通过彼此的生物附着)引起的。生物附着可以是例如通过表面蛋白，如整联蛋白、免疫球蛋白、钙粘着蛋白、选择蛋白或其它细胞粘附分子。例如，细胞可以在悬浮液中自发地缔合并且形成细胞-细胞附着(例如，自组装)，从而形成聚集体。在一些实施方案中，细胞聚集体可以是基本上均质的(即，主要含有相同类型的细胞)。在其它实施方案中，细胞聚集体可以是异质的(即，含有一种以上类型的细胞)。

本公开的方法和用途适用于细胞聚集体。细胞聚集体的尺寸可以变化。细胞聚集体的平均直径可以为约50至800μm、约150至800μm、至少约800μm、至少约600μm、至少约500μm、至少约400μm、至少约300μm、至少约200μm、至少约150μm、约300至500μm、约150至300μm、约50至150μm、约80至100μm、约180至250μm或约200至250μm。

当在生物反应器中的悬浮培养中进行时，本文所述的方法和用途是特别有用的。如本文所述，使用介电常数探针允许在线监测细胞密度，而不需要从细胞悬浮液获得样品或与生物反应器中的细胞悬浮液进行任何其它手动交互。因此，可以在生物反应器中进行测量。换句话说，介电常数可以在生物反应器中确定。如本文所用，术语“反应器”和“生物反应器”，可以互换使用，是指构造为提供细胞培养的动态流体环境的封闭培养容器。生物反应器可以是搅拌的和/或搅动的，但不限于搅拌釜式生物反应器、波浪混合/摇摆生物反应器、上下搅拌生物反应器(即，包括活塞作用的搅拌反应器)、转瓶、摇瓶、振荡生物反应器、桨式混合器，垂直轮生物反应器。搅拌反应器可以被配置成容纳约2mL-20，000L的细胞培养体积。优选的生物反应器可以具有高达50L的体积。适用于本发明方法的示例性生物反应器是可从Sartorius Stedim Biotech获得的ambr 15生物反应器，生物反应器可以是不锈钢或一次性使用的生物反应器。生物反应器可以由单个容器组成或者可以包括几个平行的生物反应器，一次性使用的生物反应器可以由玻璃或塑料制造，一次性使用的生物反应器可以是搅拌罐生物反应器或摇摆运动生物反应器。例如：Sartorius STR、RM、ambr15，ambr250。培养基的pH值可以通过生物反应器控制，优选通过CO₂供应控制，并且可以保持在6.6至7.6的范围内，优选地为约7.4。

生物反应器可以是搅拌生物反应器(STR)。STR例如可从Sartorius StedimBiotech获得，包括但不限于A/B/B-DCU/Cplus/D-DCU、/>15和/>250。生物反应器可以是摇摆运动生物反应器(RM)。RM例如可从Sartorius Stedim Biotech获得，并且包括但不限于/>RM和/>RM TX。生物反应器可以是多个平行的生物反应器，例如可从Sartorius Stedim Biotech获得，并且包括但不限于/>15和/>250。

在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约20,000L。在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约2,000L。在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约200L。在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约100L。在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约50L。在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约20L。在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约10L。在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约1L。在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约100mL至约10L。在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约100mL至约5L。在一些实施方案中，在生物反应器中的体积为约150mL至约1L。在一些实施方案中，生物反应器中培养容器的体积为约1L至约1,000L。

细胞可以是任何可以悬浮培养的细胞。所述细胞可以选自原代细胞、从组织或器官获得的细胞、永生化细胞、干细胞如多能干细胞或源自干细胞的细胞，优选源自PSC的细胞，优选源自iPSC的细胞。细胞可以是多能干细胞。所述细胞还可以是选自诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)、孤雌生殖干细胞(pPSC)和核转移衍生的PSC(ntPSC)的多能干细胞，优选iPSC。优选地，所述细胞是多能干细胞，更优选诱导多能干细胞(iPSC)，或衍生自干细胞的细胞，例如(i)PSC。干细胞的实例包括但不限于多能干细胞、脐带血干细胞、间充质干细胞和/或造血干细胞，优选多能干细胞。特别优选的是诱导多能干细胞(iPSCs)。“源自干细胞的细胞”涉及分化的细胞或分化成特定细胞类型的细胞，其不再能够在身体的任何细胞类型中分化。所述衍生自干细胞的细胞涉及衍生自在本发明的方法和用途中使用的(多能)干细胞的细胞，因此优选不包括天然存在的分化细胞。从干细胞例如(i)PSC开始分化成不同细胞类型的方法是本领域技术人员已知的。“衍生自干细胞的细胞”可以涉及心脏细胞和/或组织、肝细胞和/或组织、肾细胞和/或组织、脑细胞和/或组织、胰腺细胞和/或组织、肺细胞和/或组织、骨骼肌细胞和/或组织、胃肠细胞和/或组织、神经元细胞和/或组织、皮肤细胞和/或组织、骨细胞和/或组织、骨髓、脂肪细胞和/或组织、结缔细胞和/或组织、视网膜细胞和/或组织、血管细胞和/或组织、基质细胞或心肌细胞。WO2015/025030和WO2015/040142中公开了产生心脏组织的方法。细胞也可以在生物反应器中或生物反应器外分化，例如分化成心肌细胞或基质细胞。这些分化的细胞也可利用本发明的方法在生物反应器中培养。从组织或器官获得的细胞可以从心脏细胞和/或组织、肝细胞和/或组织、肾细胞和/或组织、脑细胞和/或组织、胰腺细胞和/或组织、肺细胞和/或组织、骨骼肌细胞和/或组织、胃肠细胞和/或组织、神经元细胞和/或组织、皮肤细胞和/或组织、骨细胞和/或组织、骨髓、脂肪细胞和/或组织、结缔细胞和/或组织、视网膜细胞和/或组织、血管细胞和/或组织、基质细胞或心肌细胞获得。

细胞可以是哺乳动物的细胞，例如人、狗、小鼠、大鼠、猪、非人灵长类动物，例如恒河猴、狒狒、食蟹猴或普通狨猴，仅举几个说明性实例。优选地，细胞是人的。

在多细胞生物中，“干细胞”是未分化的或部分分化的细胞，其可以分化成各种类型的细胞并无限增殖以产生更多的相同干细胞。它们通常与不能无限分裂的祖细胞和通常定向分化成一种细胞类型的前体细胞或原始细胞区分开。因此，术语干细胞包括多能干细胞，也包括多能干细胞(可分化为多种细胞类型，但仅是那些密切相关的细胞家族)、寡能干细胞(可分化为仅少数细胞类型，如淋巴样或骨髓干细胞)或单能干细胞如卫星细胞。干细胞的实例包括但不限于多能干细胞、脐带血干细胞、间充质干细胞和/或造血干细胞，优选多能干细胞。本文所用的术语“多能干细胞”(PSC)是指能够分化成身体的每种细胞类型的细胞。因此，多能干细胞提供了分化成基本上任何组织或器官的独特机会。目前，最常用的多能细胞是胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)。人ESC系首先由Thomson及其同事建立(Thomson等人(1998)，Science 282:1145-1147)。最近，人类ESC研究使得能够开发一种新技术，将机体细胞重编程为ES样细胞。这项技术是由Yamanaka及其同事在2006年首创的(Takahashi&Yamanaka(2006),Cell,126:663-676和Takahashi等人(2007),Cell,131(5):861-72)。由此产生的诱导的多能细胞(iPSC)显示出与ESC非常相似的行为，并且重要的是，还能够分化成身体的每个细胞。因此，在一个实施方案中，术语iPSC包括ESC。然而，在本发明的上下文中，优选不使用涉及修饰人类种系遗传身份或涉及将人类胚胎用于工业或商业目的方法来产生这些多能干细胞。优选地，多能干细胞来自灵长类动物，更优选是人类。

合适的诱导PSC可例如获自NIH人胚胎干细胞登记库、诱导多能干细胞欧洲库(EBiSC)、德国心血管研究中心的干细胞储存库(DZHK)或ATCC，仅举几个来源。诱导的多能干细胞也可用于商业用途，例如，来自NINDS人类序列和细胞库(https://stemcells.nindsgenetics.org)，该库由美国国家神经障碍和中风研究所(NINDS)经营，并将人类细胞资源广泛地分配给学术和工业研究人员。可用于本发明的合适细胞系的一个说明性实例是细胞系TC-1133，一种衍生自脐带血干细胞的诱导(未编辑)的多能干细胞。该细胞系例如可直接从美国NINDS获得。优选地，TC-1133是符合GMP的。可用于本发明的其它示例性iPSC细胞系包括但不限于，Gibco^TM(订单号A18945，Thermo Fisher Scientific)的人Episomal iPSC细胞系，或得自ATTC的iPSC细胞系ATCC ACS-1004、ATCC ACS-1021、ATCCACS-1025、ATCC ACS-1027或ATCC ACS-1030。或者，重编程领域的任何技术人员可通过已知方案容易地产生合适的iPSC系，例如Okita等人的“A more efficient method togenerate integration-free human iPS cells”Nature Methods,第8卷第5期，2011年5月，第409-411页或Lu等人的“A defined xeno-free and feeder-free culture systemfor the derivation,expansion and direct differentiation of transgene-freepatient-specific induced pluripotent stem cells”,Biomaterials 35(2014)2816e2826所述的方案。

细胞可以选自TC-1133、Gibco ATCC ACS-1004的人Episomal iPSC系、ATCC ACS-1021、ATCC ACS-1025、ATCC ACS-1027和ATCC ACS-1030。另外或可选地，细胞可以选自HEK293、HEK293T、BHK 21、CHO、NS0、Sp2/0-Ag14。

如本文所解释的，用于本发明的(诱导)多能干细胞可以衍生自任何合适的细胞类型(例如，衍生自干细胞如间充质干细胞，或上皮干细胞或分化细胞如成纤维细胞)和衍生自任何合适的来源(体液或组织)。这些来源(体液或组织)的实例包括脐带血、皮肤、牙龈、尿、血液、骨髓、脐带的任何部分(例如，脐带羊膜或脐带胶质)、脐带-胎盘连接、胎盘或脂肪组织，仅举几个例子。在一个说明性实例中，从脐带血中分离CD34阳性细胞，例如通过使用特异性针对CD34的抗体的磁性细胞分选，然后重编程，如Chou等人(2011)，Cell Research，21:518-529中所述。Baghbadeerani等人(2015)，Stem Cell Reports，5(4)：647-659表明iPSC的生产工艺可以符合良好生产实践的规定，以生产细胞系ND50039。因此，多能干细胞优选满足良好的生产实践的要求。

本发明还涉及在悬浮培养物中扩增细胞聚集体中的细胞的方法，所述方法包括：(i)测量细胞悬浮液的介电常数；以及(ii)将测得的介电常数与指示细胞密度的预定值进行比较，从而确定细胞密度。本文所述的“扩增”或“细胞扩增”描述了由于细胞分裂而导致的细胞数量增加。

本发明还涉及介电常数探针用于确定包含细胞聚集体的悬浮细胞培养物的细胞密度的用途。本发明还涉及介电常数探针在本发明的方法中的使用。

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应当指出，除非上下文另有明确说明，如本文所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代。因此，例如，提及“一种试剂”包括一种或多种这样的不同试剂，并且提及“该方法”包括提及本领域普通技术人员已知的等同步骤和方法，其可以被修改或替代本文所述的方法。

除非另有说明，在一系列元件之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个元件。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这些等同方案也包括在本发明中。

本文使用的术语“和/或”无论何处都包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元件的全部或任何其它组合”的含义。

术语“小于”或“大于”不包括具体的数字。

例如，小于20意味着小于所指示的数目。类似地，大于或多于意味着大于或多于指示的数目，例如大于80％意味着大于或多于指示的80％的数目。

在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”及其变体如“包含”和“含有”应理解为暗示包括所述的整体或步骤或整体或步骤的组，但不排除任何其它整体或步骤或整体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或“包括”代替，或者有时当在本文中使用时用术语“具有”代替。当在本文中使用时，“由……组成”排除未指定的任何要素、步骤或成分。

术语“包括”是指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。

如本文所用，术语“约”、“大约”或“基本上”是指在给定值或范围的20％内，优选在15％内，优选在10％内，更优选在5％内。还包括具体的数字，即“约20”包括20的数字。

应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案、材料、试剂和物质等，因此可以变化。本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是要限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。

本说明书全文中引用的所有出版物(包括所有专利、专利申请、科学出版物、说明书等)，无论在上文或下文中，均全文以引用方式并入本文。本文中没有任何内容被解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于这些公开。在通过引用并入的材料与本说明书矛盾或不一致的程度上，本说明书将取代任何这样的材料。

在此引用的所有文献和专利文献的内容通过引用整体并入。

实施例

从以下仅用于说明目的实施例，将清楚地了解本发明及其优点。这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：介电常数测量可用于在线监测细胞密度

1为了测量介电常数，根据制造商的说明使用以下材料和设备(参见表1)：

1表1：实施例1中使用的材料

仅细胞聚集体悬浮培养如以下所述进行：TC1133细胞以2.5×10⁵细胞/ml接种。在第2天通过加入62％的当前体积/天的新鲜培养基开始更换培养基。细胞在37℃，pH 7.4，DO23.8％下培养。每次传代后，再次以2.5×10⁵细胞/ml接种细胞。

ViaMass探针在580kHz下以“细胞培养”测量模式运行，使用BM220PolC、过滤器30和电容零值0pF/cm。接种前，Viamass测量值被设置为零，并且在整个培养过程中记录测量值。细胞浓度用取自UniVessel生物反应器的样品离线评估。使用Nucleocounter 200，以“生存力和细胞计数A100和B”方案测量细胞数。从第1天开始，iPSC聚集体需要在用Nucleocounter 200测量之前解离。为此，将1mL样品以100×g离心1分钟，并除去上清液。随后，加入1ml TrypLE Express(Life Technologies)并在室温下孵育15分钟。每5分钟通过移液重悬聚集体。当聚集体解离时，以与上述相同的方式测量细胞数。

图1显示在两次独立的培养运行期间ViaMass介电常数和Nucleocounter200的记录。用Nucleocounter 200测定的细胞浓度与用ViaMass介电常数探针测定的容量相关。重要的是，ViaMass介电常数记录显示动态变化，例如在培养参数变化后的平稳和增加。在示例性的第2轮试验中，电容率测量通过快速的、随后的电容上升响应灌注速率的增加(图1B)。这些发现突出了介电常数测量探针在iPSC的仅细胞聚集体悬浮培养物中的潜力。

重要的是，介电常数的测量与iPSC聚集体尺寸不相关(图2)。在示例性第1轮试验中，聚集体尺寸不受培养基添加和培养体积变化的影响，然而电容动态下降(图2A)。此外，在示例性第2轮试验中，第4天传代后，细胞和聚集体浓度低，但聚集体大小如预期的那样增加。这无法由介电常数测量来表示(图2B)。电容和聚集体之间的初始表观相关性是恒定培养体积以及聚集体大小和聚集体细胞数目之间的相关性的结果。

因此，介电常数的测量允许在线监测PSC聚集体的细胞密度。重要的是，介电常数令人惊讶地不受聚集体尺寸增加的影响，其会增加细胞相互作用的数量。总之，发明人惊奇地发现PSC聚集体的介电常数测量允许细胞密度的在线监测，这又允许通过过程控制对细胞密度发展做出反应。

实施例2：基于标准曲线确定预定值

在该实施例中，发明人通过细胞介电常数测量(Viamass探针)在线跟踪iPSC聚集体培养物的细胞密度，并通过标准细胞计数(Nucleocounter)离线跟踪iPSC聚集体培养物的细胞密度。使用以下培养条件：

实验设计和实验进展：

·细胞：TC1133 TL004，p4

·接种条件：450ml，2.5×10⁵细胞/ml。

·更换培养基：从d2开始，灌注60％。

·培养条件：37℃，pH 7.4，DO 23.8％，45°叶片角，120rpm向下搅拌(第0-1天)和100rpm向下搅拌(第1-4天)。

通道1-3

·接种条件：320ml，2.5×10⁵细胞/ml。

·换培养基：从d2开始，灌注60％靶向。

·培养条件：37℃，pH 7.4，DO 23.8％，45°叶片角，120rpm向下搅拌(第0-1天)和100rpm向下搅拌(第1天-传代结束)。

材料

试剂和材料：

·StemACS iPS-Brease XF，基础培养基，订单号：130-107-086

·STEMACS iPS-BREW XF 50x补料；订单号：130-107-087

设备

·Biostat B–DCU II:Type:BB-8841212

·塔3：类型：BB-8840152

оpH传感器：Hamilton；Easyferm Plus VP 120

о氧传感器：Hamilton；Oxyferm FDA VP 120

оUniVessel 0.5L

·pH计：Multi 3510IDS；Xylem Analytics Germany GmbH

·pH电极：SenTix Micro 900P；WTW

·Nucleocounter NC-200Type 900-0201

·Cellavista

此处，本发明人将“内部”预定值(通过相同培养运行的细胞电容和细胞密度数据对进行线性回归计算)与“外部”预定值进行比较，该预定值源自参考悬浮培养物。

图3显示一个示例性iPSC培养运行，其被在线和离线监测。从图3A中可以明显看出，在整个运行期间，电容和细胞计数值良好相关。对于内部(见图3B的标准曲线)和外部(见图4B的标准曲线)计算的细胞浓度值(即基于预定值计算的那些值)来说，同样如此。图3B显示通过计数细胞获得的介电常数测量值和细胞密度的标准曲线和线性相关性。线性相关性产生高的R²值，表明细胞密度和介电常数之间存在线性相关。

类似地，图4显示另一个示例性iPSC培养运行。这里，使用相同的培养条件。然而，细胞不传代。同样，细胞介电常数、细胞密度和内部(参见图4B的标准曲线)和外部(参见图3B的标准曲线)计算相关性良好(参见图4A)。图3B显示通过计数细胞获得的介电常数测量值和细胞密度的标准曲线和线性相关性。线性相关性产生高的R²值，表明细胞密度和介电常数之间存在线性相关。

重要的是，没有必要为每次细胞培养运行计算预定值。相反，预定值在如上所示的类似培养条件之间是可比较的。因此，可以使用从参考悬浮培养物获得的预定值。这允许容易地在线测量PSC聚集体的细胞密度，同时避免采集样本用于手动或自动细胞计数。因此，本发明的方法提供了细胞培养的额外的重要价值。最重要的是，细胞密度速率是实时提供的，因此可以考虑用于过程控制。

参考文献

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Kropp,C.,Massai,D.,and Zweigerdt,R.(2017).Progress and challenges inlarge-scale expansion of human pluripotent stem cells.Process Biochemistry59,244–254.

Claims (16)

1.一种测量包含细胞聚集体的细胞悬浮液中的细胞密度的方法，所述方法包括：

(i)测量所述细胞悬浮液的介电常数；

(ii)将所测量的介电常数与指示所述细胞密度的预定值进行比较，从而确定所述细胞密度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述测量在生物反应器中进行。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物反应器是搅拌生物反应器、摇摆运动生物反应器和/或多平行生物反应器。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述悬浮培养物的细胞密度在线(实时)测量。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使用介电常数探针来执行介电常数的测量。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述介电常数通过使用介电光谱来执行。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞选自原代细胞、获自组织或器官的细胞、永生化细胞、干细胞诸如多能干细胞、或衍生自干细胞的细胞，其中所述细胞优选是多能干细胞，其中所述细胞更优选是选自诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)、孤雌生殖干细胞(pPSC)和核转移衍生PSC(ntPSC)的多能干细胞、优选iPSC。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转换因子通过以下获得

(a)测量参考悬浮培养物的至少两种，优选至少三种不同细胞密度的介电常数和细胞密度；

(b)将所述测量的所述参考悬浮培养物的细胞介电常数与所述细胞密度相关，从而确定指示所述细胞密度的预定值。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述相关提供线性相关。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述参考悬浮培养物和所述悬浮培养物是：

(i)来自相似或相同的细胞类型、细胞系、组织或器官；

(ii)使用相同的培养基培养；和/或

(iii)在相似或相同的生物反应器中培养。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞密度是活细胞密度。

12.介电常数探针用于确定包含细胞聚集体的悬浮细胞培养物的细胞密度的用途。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述细胞密度是活细胞密度。

14.根据权利要求12或13所述的用途，

(i)其中所述细胞密度在生物反应器中测定；和/或

(ii)其中所述细胞选自原代细胞、从组织或器官获得的细胞、永生化细胞、干细胞如多能干细胞、或源自干细胞的细胞，优选所述细胞是多能干细胞，更优选诱导多能干细胞(iPSC)，更优选所述多能干细胞选自诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)、孤雌生殖干细胞(pPSC)和核转移衍生的PSC(ntPSC)。

15.介电常数探针在权利要求1-11中任一项所述的方法中的用途。

16.根据权利要求1-11中任一项所述的方法或根据权利要求12-15中任一项所述的用途，其中所述细胞不在微载体培养物中。