CN116808190A - SARS-Cov-2 mRNA通用疫苗的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及SARS‑Cov‑2 mRNA通用疫苗的制备，本发明通用疫苗在S1蛋白、RBD和TR1/TR2诱导中和抗体的基础上增加T细胞反应性抗原成分，一个是mRNA编码超过100个T细胞多表位或MTE疫苗，上述表位来自SARS‑CoV‑2的非spike保守区域；另一个是增加E、M、N和RdRp的保守抗原成分，加上诱导中和抗体的5种抗原，称为9价通用疫苗Universal。无论MTE mRNA或Universal mRNA疫苗免疫可保护小鼠和恒河猴免受SARS‑CoV‑2变体的致命攻击，并具有对MERS‑Cov、SARS‑Cov及SARS‑CoV‑2变体几乎相同的明显保护作用。用mRNA疫苗免疫，在肺中诱导的保护效果最好，病毒滴度最低，诱导T细胞反应足以赋予对严重疾病的保护。本发明为编码Spike成分和T细胞反应抗原的MTE mRNA通用疫苗及Universal mRNA 9价通用疫苗，可进一步开发为临床通用的SARS‑CoV‑2疫苗及人类冠状病毒预防疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及SARS-Cov-2 mRNA通用疫苗的制备。
背景技术
SARS-CoV-2变体的反复出现并能够逃避免疫的能力，与反复出现的感染浪潮有关。因此，有必要进一步开发COVID-19的通用新疫苗。在目前的疫苗平台中，最常见的策略是使用SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白仅作为抗原。然而，由于Spike蛋白突变，使病毒能够逃避基于其抗体的免疫保护。因此，需要新的策略来对抗新变体的流行。冠状病毒预防，可能要解决的最关键挑战是SARS-CoV-2的变异能力，病毒变体可导致病毒逃避已建立的免疫。虽然冠状病毒的RNA逆转录酶确实具有相对较好的校对能力，但已知它们会经历基因组突变和重组，从而促进选择具有适应性的病毒。SARS-CoV-2变体可能不会像季节性流感变体那样普遍，但现在知道它们的变体足以导致现有疫苗的效力降低。但是否需要类似流感样的季节性疫苗接种策略尚为时过早。对这些新出现的变体进行彻底监测并生成变体特异性疫苗应该可以克服这一潜在挑战。与流感类似，最终的长期目标是开发通用冠状病毒疫苗。
有效的T细胞反应是适应性免疫的必要条件。当新的病毒变体逃避中和抗体时，保守的T细胞反应可能特别重要。多项临床研究表明，自然感染SARS-CoV-2或接种疫苗诱导的T细胞对COVID-19的保护作用有重要作用。因此，如果T细胞表位来源于病毒的保守区域，那么T细胞诱导疫苗有可能成为开发通用COVID-19疫苗的替代策略。
使用Spike作为唯一的疫苗靶点的缺点是，随着病毒的进化，任何给定变体的抗体对新出现的变体的中和活性都会降低。
本发明将MTE中每个表位序列与MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2和SARS-CoV-2变体进行了比较。MTE的T细胞表位与SARS-CoV的一致性为88％，与SARS-CoV-2变体的一致性超过94％，而与MERS-CoV的一致性仅为36％。数据表明，MTE序列在SARS-CoV和SARS-CoV-2变体中高度保守。虽然这三种冠状病毒在临床上引起相似的疾病和症状，但它们的基因组同源性不同。SARS-CoV-2与SARS-CoV的基因组同源性为80％，而与MERS-CoV的同源性仅为50％。T细胞免疫应答包括病毒特异性CD8+和CD4+T细胞，两者均在宿主防御SARS-CoV-2中发挥重要作用。SARS-CoV-2灭活疫苗和Spike mRNA COVID-19疫苗均被批准用于预防SARS-CoV-2感染，两者均诱导相似的T细胞反应。刺突mRNA疫苗诱导T细胞仅靶向刺突蛋白，理论上灭活疫苗不仅靶向刺突蛋白，还靶向其他病毒蛋白，如膜蛋白和核蛋白，这些病毒蛋白不像刺突蛋白那样经常发生突变。然而，最近的研究表明，与mRNA疫苗不同，灭活病毒疫苗不像mRNA疫苗那样诱导细胞毒性CD8+T细胞。
冠状病毒之间的抗原关系和保守蛋白的免疫保护价值。SARS-CoV-2是一种引起严重急性呼吸综合征的冠状病毒2，是冠状病毒科中Beta冠状病毒属一种有包膜的正义单链RNA(ssRNA)病毒。SARS-CoV-2全长基因组由29,881个核苷酸组成(GenBank登录号：MN908947)，具有甲基化的5'-cap和3'-poly(A)尾，由9860个氨基组成编码16种非结构蛋白(nsp)、9种辅助蛋白和4种结构蛋白。四种结构蛋白包括刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。冠状病毒的基因组顺序通常是5'复制酶、S、E、M、N、辅助基因和3'polyA序列。虽然结构和非结构基因在冠状病毒之间保持相对保守，但辅助基因有所不同。在三种流行性冠状病毒(HCoV)中，SARS-CoV和SARS-CoV-2在基因上比MERS-CoV更相似。SARS-CoV全长29,727个核苷酸，具有5个NSP和8个辅助蛋白(ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8a、ORF8b、ORF9b)，SARS-CoV-2包含29,903个核苷酸和15个NSP，具有6个辅助蛋白(ORF3、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8和ORF9)，MERS-CoV包含30,119个核苷酸和16个NSP，以及5种辅助蛋白(ORF3、ORF4a、ORF4b、ORF5和ORF8)。辅助基因的这些变异导致了冠状病毒之间的致病性差异。例如，在SARS-CoV中，NSP1、木瓜蛋白酶(PLpro)、NSP7、NSP15、ORF3b、M、ORF6和N蛋白已被证明可以拮抗干扰素(IFN)反应。
N蛋白在病毒RNA的转录、复制和衣壳化中起核心作用。它由三个高度保守的结构域组成：与病毒基因组相关的N端结构域(NTD)；参与RNA结合和蛋白质寡聚化的C端结构域(CTD)；一种本质上无序的中心富含丝氨酸/精氨酸(SR)的接头，其高度磷酸化。N蛋白形成二聚体，通过CTD排列成八聚体，并可以进一步组装成更大的缠绕细丝。核糖核蛋白复合物通过与M蛋白的相互作用被整合到形成的病毒颗粒中。N蛋白还参与干扰素抑制、肌动蛋白重组、细胞周期进程和细胞凋亡。因此，N蛋白的潜在靶标包括抑制RNA结合的NTD、抑制寡聚化的N的自结合结构域、抑制全长基因组合成的激酶和富含SR的区域，以及M蛋白在N上的结合位点抑制病毒粒子的组装。
E是一种完整的膜蛋白，在病毒粒子中含量较低，对粒子组装很重要；这种作用归因于它对膜曲率的诱导及其与M蛋白的相互作用。E蛋白组装成五聚体病毒孔蛋白样蛋白，起离子通道的作用。它还包含一个PDZ结合基序(PBM)，使其能够结合细胞蛋白。抗体通过抑制通道形成、PBM基序的相互作用以及E与M的结合将抑制感染。
RdRp(RNA依赖性RNA聚合酶)负责RNA基因组的复制和转录，它通过获得突变帮助病毒逃避宿主防御。辅助蛋白增强了RdRp的活性。Nsp7和nsp8形成引物酶复合物，可激活和增强RdRp的引物依赖性活性，并增加RdRp模板结合。在复制病毒基因组时，RNA 3'端的序列和结构促进了RdRp的访问。正义基因组RNA的复制需要病毒基因组5'和3'端的RNA元件。因此，抑制SARS-CoV-2感染的潜在靶点包括与辅助蛋白、模板RNA和rNTP结合位点以及催化活性位点相互作用的结构域。
发明内容
本发明针对现有技术不足，提出SARS-Cov-2mRNA通用疫苗的制备，以解决病毒变异、感染力增强和免疫逃避的问题。
本发明提出了病毒变异与T细胞多表位疫苗的保护作用。本发明研究显示，T细胞多表位疫苗(MTE)或通用疫苗(Univeral)单独可以保护小鼠和恒河猴免受致命剂量的SARS-CoV-2的攻击，提供最好的保护。除了中和抗体外，T细胞表位在病毒变体中更为保守。因此，T细胞表位可以为下一代SARS-CoV-2mRNA疫苗提供巨大的优势。研究发现，在COVID-19患者的多个免疫组织和器官中，T细胞数量减少，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应的大小与COVID-19疾病的严重程度呈负相关，这表明T细胞对于识别和清除感染细胞很重要。另外，研究表明，病毒特异性T细胞在SARS-CoV感染后可维持6年，足以防止再次感染。本发明在研究中使用了三种模型，hace2转基因小鼠模型和野生型小鼠适应SARS-CoV-2小鼠模型和恒河猴模型。这三种模型通常用于评估疫苗对SARS-CoV-2感染的有效性，因为这些模型都模拟人类感染并导致剂量依赖性呼吸道症状和致死率。
本发明MTE mRNA编码来自SARS-CoV-2保守区域的100多个T细胞表位，包括60个MHC I表位和40多个MHC II表位。本发明的研究结果表明，该MTE疫苗激活CD4+T和CD8+T细胞反应，保护小鼠免受SARS-CoV-2及其变体的致命感染。因此，基于多个T细胞表位的疫苗可以通过激活病毒特异性T细胞反应来保护小鼠免受致命攻击，甚至可能保护人类免受严重疾病。虽然T细胞不能阻止SARS-CoV-2进入宿主细胞，但本发明研究显示，在没有预先存在中和抗体的情况下，T细胞诱导疫苗可以在两种小鼠和恒河猴模型中提供足够的保护，以抵抗致命剂量的SARS-CoV-2。这一数据为T细胞疫苗的发展提供了强有力的支持，这是一种克服基于抗体的疫苗对病毒变异无效的策略。本发明还发现，如果RNA疫苗同时诱导中和抗体和T细胞反应，则可以实现协同效应，这一结果不仅对COVID-19疫苗的设计，而且对其他病毒感染的疫苗设计具有重要意义。
本发明的技术方案主要包括SARS-Cov-2mRNA通用疫苗的制备。所述通用疫苗包括SARS-CoV-2MTE mRNA疫苗和SARS-CoV-2Universal mRNA疫苗；所述通用疫苗均基于中和抗体和T细胞反应的共免疫；所述中和抗体与T细胞反应位点抗原间设有P2A剪切位点，所述剪切位点的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述SARS-CoV-2原始毒株序列来源于GenBank:MN908947.3，Omicron及XBB1.5变体公开的变异序列；所述中和抗体由S1、RBD、HR1/HR2 mRNA诱导。
进一步地，所述SARS-CoV-2MTE mRNA疫苗的T细胞反应由100个多表位mRNA诱导。
进一步地，所述SARS-CoV-2Universal mRNA疫苗的T细胞反应由E、M、N和RdRp保守蛋白诱导。
进一步地，所述SARS-CoV-2MTE mRNA疫苗的中和抗体诱导抗原由Omicron变体S1蛋白、XBB.1.5变体RBD蛋白、原始毒株RBD蛋白和Omicron变体的HR1/HR2蛋白构成。
进一步地，所述SARS-CoV-2 Universal mRNA疫苗的中和抗体诱导抗原由XBB.1.5S1蛋白、Omicron RBD蛋白、原始毒株RBD蛋白和XBB.1.5 HR1/HR2蛋白构成。
进一步地，所述SARS-CoV-2 MTE mRNA疫苗的T细胞反应抗原包含100个来自SARS-CoV-2非spike保守区域的T细胞表位，所述T细胞表位在已知的SARS-CoV-2变体以及冠状病毒家族的其他成员中均为保守的。
进一步地，所述SARS-CoV-2 Universal mRNA疫苗的T细胞反应抗原包含E、M、N和RdRp保守蛋白。
进一步地，所述通用疫苗为以mRNA疫苗结构为主体的疫苗，包含1个体外转录mRNA、由抗原编码的开放阅读框、5’和3’端UTR及一个7甲基鸟苷5’帽结构，合并到第一个核苷酸的序列，和3’端Poly A；所述通用疫苗进行密码子优化，假尿苷取代；所述5’UTR区域结构为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，来自高表达的人类基因α-球蛋白的5-UTR，以及一个优化的下游Kozak共识序列GCCACCAUG；所述3'端UTR结构位于核苷酸3880-4174，由AES基因序列和mtRNA1组合而成，用于增加蛋白质表达和mRNA稳定性；所述mtRNA1为线粒体12S核糖体RNA；所述Poly A序列约30-300个核苷酸单位；各抗原之间的链接为SEQ ID NO:3。
进一步地，所述通用疫苗的mRNA疫苗的脂质系统配方包括可电离脂质十七烷-9-基8-[2-羟乙基-(6-氧-6-十一氧己基)氨基]辛酸酯，辅助脂质1,2-二硬脂酰-sng-甘油-3-磷酸胆碱，胆固醇和1,2-二肉豆醇-sng-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]；所述可电离脂质十七烷-9-基8-[2-羟乙基-(6-氧-6-十一氧己基)氨基]辛酸酯：辅助脂质1,2-二硬脂酰-sng-甘油-3-磷酸胆碱：胆固醇：1,2-二肉豆醇-sng-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]的摩尔百分比为48：12：38：2。
进一步地，所述通用疫苗的mRNA疫苗的脂质系统配方通过使用微流体装置，将有机相中的脂质与含有mRNA的水相混合制备而得。
与现有技术相比，本发明提供SARS-Cov-2 mRNA通用疫苗的制备，具备以下有益效果：
1.本发明由于冠状病毒E、M、N和RdRp的保守性，本发明制备的多表位疫苗和通用疫苗，对小鼠和恒河猴模型的XBB.1.5病毒攻毒实验有显著的保护作用，而且对MERS-Cov,SARS-Cov和SARS-Cov-2病毒均有保护作用。
2.本发明通过设计通用的COVID-19疫苗以解决可以通过统一识别SARS-CoV-2保守区域的T细胞免疫来实现广泛的COVID-19疫苗。其中一个是mRNA编码SARS-CoV-2Omicron S1蛋白，用于诱导中和抗体的预融合确认；外加mRNA编码超过100个来自SARS-CoV-2非spike保守区域的T细胞表位，这些多T细胞表位(Multi-epitope，MTE)在所有已知的SARS-CoV-2变体以及冠状病毒家族的其他成员中都是保守的。本发明的研究结果表明，单独接种MTE足以保护小鼠免受两种小鼠模型和恒河猴的致命攻击。用这种mRNA免疫在肺中诱导的保护效果最好，病毒滴度最低。值得注意的是，使用0.1μg mRNA实现了这些保护。另一个是基于一项单独编码核衣壳(N)蛋白的mRNA疫苗可以不依赖中和抗体而对SARS-CoV-2提供保护。本发明为含有SARS-CoV-2 XBB.1.5 S1蛋白、Omicron RBD和野生型RBD基础上的N蛋白、E蛋白、M蛋白和RdRp蛋白联合的mRNA通用疫苗，通用疫苗含有保守的N、E、M和RdRp蛋白，在S蛋白变异时，能够提供足够的保护以防止病毒的感染和传播。单独接种通用疫苗足以保护小鼠免受两种小鼠模型和恒河猴的致命攻击。
3.本发明在MTE中发现24个与MERS-CoV相似度超过70％的表位，这可能对MERS-CoV具有一定的保护作用。另外，本发明设计了一种MTE mRNA，编码来自Spike以外的保守区域的许多T细胞表位，以引发广泛的T细胞反应。
4.本发明显示T细胞诱导疫苗可能是抗体诱导疫苗的有效补充，这种策略可以应用于SARS-CoV-2以及其他病毒的通用疫苗开发。
附图说明
图1示出了本发明的mRNA疫苗的体外设计；其中，A：Multi-Epitope(MTE)mRNAVaccine结构设计示意图；B：Universal mRNA Vaccine结构设计示意图。
图2示出了本发明的新冠病毒多表位抗原MTE在MERS-Cov，SARS-Cov和SARS-Cov-2及其变种中的比较和评分(A)以及用原有二价疫苗对照，检测全部设计抗原的WesternBlotting表达(B)。
图3示出了本发明的MTE和Universal mrna通过T7聚合酶的IVT产生；其中，A:免疫荧光染色显示MTE和Universal蛋白的膜定位；B,C：流式细胞术证实MTE和Universal的细胞表面定位和高水平的蛋白表达；D:S1蛋白和S1+RBDomi+RBDorig+HR1/HR2全长蛋白表达检测；E:MTE-his蛋白的表达检测。
图4示出了本发明的通用疫苗在BALB/c小鼠中产生强大的特异性免疫原性；其中，A：BALB/c小鼠的免疫接种；B：Spike结合抗体IgG滴度：C:IgG2a/IgG1的百分比决定Th1/Th2比值；D:Delta假病毒中和抗体(IC50的对数)滴度；E：Omicron假病毒的中和抗体(IC50的对数)滴度；F:XBB.1.5假病毒的中和抗体(IC50的对数)滴度；G:Spike肽池刺激脾细胞的T细胞反应；H:MTE肽池刺激脾细胞的T细胞反应。
图5示出了本发明的MTE和Universal mRNA疫苗可保护小鼠免受SARS-CoV-2病毒致死性感染；其中，A：Delta变体的K18-hACE2转基因小鼠实验设计；B:病毒挑战后的体重丧失；C:病毒挑战的存活数量；D:病毒挑战后肺组织的病毒拷贝数。E:病毒挑战后肺部的病理改变；F:病毒挑战后肺部的免疫病理改变。
图6示出了本发明的MTE和Universal mRNA疫苗可保护小鼠适应的SARS-CoV-2MA30病毒攻击；其中，A:小鼠适应性SARS-CoV-2MA30攻毒实验；B:病毒挑战后的体重丧失；C：病毒挑战后的存活数量。
图7示出了本发明的恒河猴对疫苗接种的体液反应；其中，A：恒河猴实验方案；B:RBD特异性体液反应；C:血清抗体抑制ACE2与RBD抗原结合。
图8示出了本发明的疫苗接种免疫后结合抗体对MERS-CoV、SARS-CoV野生型和SARS-CoV-2突变型的毒株均有显著中和反应。
图9示出了本发明的MTE和Universal疫苗接种产生了强大的特异性结合抗体；其中，A：疫苗免疫后，SARS-CoV-2真病毒抗体交互中和反应；B:疫苗免疫后，SARS-CoV-2假病毒的抗体交互中和反应；C:康复期COVID-19人类病例的血清与疫苗动物血清免疫原性比较。
图10示出了本发明的疫苗接种后记忆B细胞及T细胞活化百分比明显增高；其中，A：MTE免疫后记忆性B细胞激活的程度(百分比)；B：Universal免疫后记忆性B细胞激活的程度(百分比)。C:MTE和Universal疫苗接种后2周CD4+T细胞活化的百分比；D:MTE和Universal疫苗接种后2周CD8+T细胞活化的百分比。
图11示出了本发明的SARS-CoV-2挑战保护的疗效和免疫相关性；其中，A:免疫后两周病毒攻击，支气管肺泡灌洗液中病毒RNA检测；B:免疫后两周病毒攻击，鼻咽拭子中病毒RNA检测；C:免疫后两周病毒攻击，唾液中病毒RNA检测。
图12示出了本发明的病毒攻击后，呼吸道病理学和抗原表达；包括常规病理(HE染色)和免疫组化染色(IHC)检测。
具体实施方式
为更好地理解本发明，将结合本发明的内容和实施例及附图，对本发明的内容和实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的发明内容和实施例仅仅是本发明的一部分内容和实施例，而不是全部的内容和实施例。基干本发明中的内容和实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他内容和实施例，都属于本发明保护的范围。另外，下述内容和实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述内容和实施例中所涉及的实验和检测方法等，若无特别说明，均为现有的常规实验和检测方法。
本发明所述SARS-Cov-2mRNA通用疫苗的制备机理及步骤主要包括：
(1)MTE和Universal mRNA通用疫苗的设计和体外表达。本发明基于中和抗体(由S1、RBD、HR/HR2 mRNA等诱导)和T细胞反应(主要由100个(百)多表位mRNA诱导，以及9价疫苗的E、M、N和RdRp保守蛋白的T细胞反应)的共免疫策略(见图1A和1B)，中和抗体抗原大小：S1(527bp)，RBD(223bp)，HR1/HR2(285bp)；T细胞反应抗原大小：100个多表位抗原(72KD)，E蛋白(225bp)，M蛋白(100bp)，N蛋白(1257bp)，RdRp蛋白(720bp)。本发明涉及的MTE mRNA和Universal mRNA序列来源于SARS-CoV-2原始毒株，(GenBank:MN908947.3)，根据已发表的公认的Delta变异和Omicron及XBB1.5变异突变，本发明利用包含每个突变所需的寡核苷酸进行多重PCR片段扩增，并利用重叠片段组装生成每个菌株的完整突变体。对其进行了Delta和Omicron及XBB1.5变异的修饰。并分别对SARS-CoV-2MTE mRNA序列和UniversalmRNA序列进行密码子优化及假尿苷取代，并插入PUC57中，PUC57含有T7启动子、5'-UTR、3'-UTR和polyA尾(图1A)。MTE mRNA由数百个T细胞表位组成，这些表位来源于除S基因外的所有基因，包括结构蛋白E、M、N和其他编码非结构蛋白的开放阅读框。T细胞表位基于先前描述的基于IEDB web服务器的MHC T细胞表位鉴定工具预测序列。利用GenScript软件合成pucc-MTE质粒构建体和Universal mRNA质粒构建。采用伪utp法用T7聚合酶体外转录(IVT)合成MTE mRNA和Universal mRNA。IVT完成后进行加帽，IVT产物先纯化后进行加帽反应。我们使用双酶加帽反应，牛痘加帽系统(NEB,Cat#M2080B-1ml)和MTE(NEB,M0266B-1ml)系统。用于LNP制备的脂质是Broadpharm(BP-25499)可电离脂质十七烷-9-基8-[2-羟乙基-(6-氧-6-十一氧己基)氨基]辛酸酯(SM-102)。辅助脂质1,2-二硬脂酰-sng-甘油-3-磷酸胆碱(dspc,850365C-1g)，胆固醇(700100P)和1,2-二肉豆醇-sng-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DMG-PEG-2000,880151P-1g)，来自Avanti Polar Lipids。该配方是通过使用Ignite微流体装置(Precision NanoSystems)将有机相中的脂质与含有mRNA的水相混合制备的。SM-102的组成脂质摩尔百分比为48％，DSPC为12％，胆固醇为38％，DMG-PEG为2％。在1:3的流动比下，溶液在微流控装置中组合。每个微流控芯片的总流速为12mL/min。将LNP-mRNA混合物透析并离心浓缩。配制后的mRNA定量，本发明采用了RiboGreen测定法。本发明遵循制造商的方案(赛默飞世尔:Quant-iTTM RiboGreenTM RNA试剂和试剂盒，Cat#R11490,R11491,T11493；No.MAN0002073)。配制后从LNPs中分离mRNA并进行琼脂糖凝胶电泳。凝胶电泳结果见图2B，我们用以前发明的针对Omicron变异的二价疫苗做对照(专利申请号：202210114265.9)。
(2)MTE表位序列与MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2冠状病毒表位序列比较和评分。MTE mRNA编码约100个T细胞表位，包括来自SARS-CoV-2原始毒株保守的MHC I和MHC II序列。一些T细胞表位与小鼠T细胞发生强烈的交叉反应，已被实验证实。因此，MTE疫苗能够在小鼠体内诱导T细胞免疫反应。将每个MTE表位序列与MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2变异的冠状病毒表位序列进行比较和评分(图2A)。MTE的T细胞表位与MERS-CoV的同源性为36.4％，与SARS-CoV的同源性为87.9％，与SARS-CoV-2omicron BA.2变体的同源性为98.3％，与SARS-CoV-2α变体、β变体、γ变体、δ变体和omicron BA.5变体的同源性超过99.8％(图2)。进一步分析发现，与MERS-CoV有20多个表位，同源性超过70％。数据表明，在SARS-CoV、SARS-CoV-2和SARS-CoV-2变体中，MTE中T细胞表位序列高度保守。
(3)MTE和Universal mRNA通过T7聚合酶的IVT产生。本发明在293T细胞中转染MTE和Universal mRNA，用抗spike抗体检测其表达。免疫荧光染色显示MTE和Universal蛋白的膜定位(图3A)。流式细胞术证实了MTE(MFI 1.24M)和Uniiversal(MFI 1.17M)的细胞表面定位和高水平的蛋白表达(图3B，C)。在小鼠抗spike S1单克隆抗体变性条件下，Westernblotting检测MTE和Universal蛋白。可见两条主要条带，分别对应约90KD的S1蛋白和198KDS1+RBDomi+RBDorig+HR1/HR2蛋白全长(图3D)。由于没有抗体可用于MTE检测，因此除了MTEmRNA外，还平行构建了MTE-his mRNA，在C端用6个组氨酸标记MTE。转染293T细胞后，裂解细胞，用His标签纯化柱试剂盒(SigmaAldrich,Cat#H7787)浓缩MTE-His融合蛋白，变性条件下进行Western blotting。在第一次和第二次洗脱(E1和E2)中观察到预期的72KD主带大小和较小分子量的降解产物(图3E)。
(4)BALB/c小鼠的免疫接种。本发明将MTE mRNA-LNP和Universal mRNA-LNP疫苗分别进行BALB/c小鼠的免疫接种。以PBS为对照，在第0天(初始期)和第21天(增强期)用10μg LNP-mRNA疫苗肌内免疫BALB/c小鼠，在初始期和增强期两周后收集血清，在第35天收集脾脏(图4A)。首先，本发明用ELISA检测了初次和增强免疫后血清中spike特异性IgG抗体。Spike特异性抗体的产生模式相同，Spike结合抗体IgG滴度在MTE mRNA疫苗或UniversalmRNA疫苗之间无显著差异。峰值特异性抗体IgG滴度的对数为4.93(MTE)vs.4.99(Universal)，增强后5.80(MTE)vs.5.80(Universal)(图4B)。据报道，Omicron Spike蛋白的抗原性与以前的变体不同，也就解释了该疫苗在D14时IgG滴度较低。据报道，IgG2a/IgG1的百分比决定Th1/Th2比值。在接种疫苗之前，Th1细胞或Th2细胞的偏差也与免疫疾病有关。LNP-mRNA MTE组中spike特异性IgG2a/IgG1的平衡为1.21，Universal组为1.36。本发明的LNP-mRNA配方未检测到Th1或Th2明显偏倚(图4C)。然后，本发明在293T-hACE2细胞中评估了小鼠血清对Delta假病毒、Omicron假病毒和XBB.1.5假病毒进入细胞的抑制作用(图4D，E，F)。作为对照，使用Delta假病毒对MTE组和Universal组进行评价，发现针对Delta变体的假病毒的中和抗体(IC50的对数)滴度稍低于针对Omicron BA.5和XBB1.5变体的中和抗体滴度。因此，异质性变异的中和作用降低表明开发一种不依赖抗体但通用的SARS疫苗的重要性。本发明使用ELISPOT测定了用Spike肽池或MTE肽池刺激脾细胞的T细胞反应。作为对照，在Spike肽池刺激后对MTE组进行评估。LNP-mRNA MTE和Universal免疫BALB/c小鼠分别有1172和1272个脾细胞形成斑点(SFC)/106个，两组间T细胞应答无显著差异(图4G)。MTE组的SFC/106个脾细胞数量分别为960和1742个。说明所有组分别引发了强烈的spike特异性T细胞反应或MTE特异性T细胞反应。总之，这些数据表明，MTE和Universal疫苗诱导了强大的Spike特异性抗体反应以及强大的Spike和MTE特异性T细胞反应。
(5)MTE和Universal mRNA疫苗可保护小鼠免受SARS-CoV-2病毒致死性感染。本发明使用了两种小鼠模型，分别是携带SARS-CoV-2Delta变体的K18-hACE2转基因小鼠和携带小鼠适应SARS-CoV-2MA30的BALB/c小鼠。在第一个模型中，K18-hACE2转基因小鼠在D0和D21时分别肌内注射0.1μg LNP-mRNA 2价疫苗(本发明组原有疫苗，专利申请号：202210114265.9)、LNP-mRNA MTE和LNP-mRNA Universal疫苗，并在D35时用致死剂量的SARS-CoV-2Delta变体攻毒。挑战后记录体重和存活率。在感染后4天(DPI)收集组织(图5A)。观察到PBS组的体重明显下降(6DPI时减少20％)，但在所有接种疫苗组(MTE和Universal组)中，1DPI时体重仅轻微下降(5％)，4DPI时体重恢复(图5B)。在6DPI时，模拟组的所有小鼠均死亡，而接种疫苗组没有小鼠死亡(图5C)。本发明还使用qPCR定量检测了1mg肺mRNA中SARS-CoV-2δ型变异病毒。PBS组(1.4×107)检测到高拷贝的SARS-CoV-2病毒RNA,二价疫苗组肺中检测到低拷贝的病毒RNA(3590),MTE组(3386)和Universal组(507)检测到极低拷贝的病毒RNA(图5D)。肺组织学也显示PBS组肺中有广泛的中性粒细胞浸润，而2价疫苗和MTE及Universal疫苗组肺中没有中性粒细胞浸润(图5E)。同样，PBS组肺中检测到大量病毒颗粒，而2价疫苗组肺中检测到少量病毒颗粒，而MTE和Universal组肺中未检测到病毒颗粒(图5F)。
(6)MTE和Universal mRNA疫苗可保护小鼠适应的SARS-CoV-2MA30病毒攻击。在第二个模型中，BALB/C小鼠在D0和D21时肌内注射0.1μg LNP配制的MTE和Universal或PBS，并在D35时用小鼠适应的SARS-CoV-2MA30攻毒。攻毒后记录小鼠体重和存活率(图6A)。同样，PBS组的小鼠体重也显著减轻(6DPI时体重减轻27％)。虽然二价疫苗组小鼠在5DPI时体重也明显减轻(19％)，但所有小鼠在12DPI时均恢复(减少5％)。MTE组和Universal组在4DPI时体重仅轻微下降(3％)，10DPI时体重完全恢复(图6B)。在6DPI时，PBS组所有小鼠和二价疫苗组1只小鼠死亡，MTE组和Universal组均未死亡(图6C)。与第一个模型(C57BL6/J)相比，该模型(BALB/c背景)的二价疫苗保护较弱，可能是由于小鼠品系和所用病毒的差异有关。
(7)恒河猴对疫苗接种的体液反应。在研究第0周和第3周，23只恒河猴用50微克或5微克的MTE和Universal疫苗免疫，磷酸盐缓冲盐水(PBS)(每组n＝7/8)进行假免疫(图7A)。动物在最后一次免疫后2周受到挑战，通过气管内(IT，1.0毫升)和鼻内(IN，每个鼻孔0.5毫升)接种106TCID50(50％组织培养感染剂量)剂量的SARS-CoV-2病毒(BA.5或XBB1.5毒株)。在受到免疫学、病毒学和病理评估的挑战后，对动物进行了7天(n＝12)或14天(n＝11)的跟踪观察。鉴于RBD在介导病毒进入细胞和在大多数中和抗体反应中的重要性，本发明还通过Meso Scale Discovery(MSD)三明治电化学发光免疫测定法评估了RBD特异性体液反应。接种疫苗的动物出现RBD特异性IgG(图7B)，其大小与S蛋白的量相当，与RBD聚焦反应一致。同时还测量了血清抗体抑制ACE2与RBD抗原结合的功能活性，显示出引发了相当高剂量的反应(图7C)。说明MTE和Universal疫苗接种产生了强大的RBD特异性中和反应。
(8)疫苗接种免疫后结合抗体对MERS-CoV、SARS-CoV野生型和SARS-CoV-2突变型的毒株均有显著中和反应。在最后一次接种MTE和Universal通用疫苗两周后，采集恒河猴血清，用生物层干涉法评估血清特异性抗体反应。采用MERS-CoV、SARS-CoV野生型和定点诱变产生的SARS-CoV-2变体作为抗原，使用Kruskal-Wallis试验和Dunn检验评估MERS-CoV、SARS-CoV野生型和SARS CoV-2变异型结合抗体反应。结果显示，MTE和Universal通用疫苗接种两周后产生的结合抗体，均对人类冠状病毒MERS-CoV、SARS-CoV野生型和SARS-CoV-2突变型有显著的中和反应(图8)，特别是对最近流行的XBB.1.5变异型毒株，结合反应最好。
(9)MTE和Universal疫苗接种产生了强大的特异性结合抗体。本发明还用上述的二价疫苗为对照，检测了MTE和Universal疫苗免疫后，对SARS-CoV-2真病毒和假病毒的抗体中和反应，类似于遵循S特异性结合反应的模式(图9A，图9B)。在5μg和50μg两个剂量组，分别观察到2周的峰值ID50值(50％抑制性稀释-实现50％中和所需的血清稀释的对数)均很高，而且两组值比较接近。说明本发明的两个疫苗，在5μg的剂量下，也可以达到非常有效的中和防护作用。另外，由于在临床和临床前研究中，康复期COVID-19人类病例的血清经常被用作疫苗免疫原性的参考基准。本发明将MTE和Universal疫苗接种的猕猴伪病毒中和滴度与41名康复者在COVID-19后4周至8周的血清进行了比较。5μg组的滴度高出人类抗体水平均值约10倍(图9C)，这表明本发明的两个通用疫苗诱导的中和抗体活性，超过了人类感染后头几个月观察到的活性。因此，MTE和Universal疫苗接种产生了强大的RBD特异性结合抗体，具有有效的中和活性，阻断了RBD和宿主ACE2受体之间的相互作用。
(10)疫苗接种后记忆B细胞及T细胞活化百分比明显增高。MTE和Universal疫苗接种后，免疫记忆B细胞数量，无论在攻毒后的28天内，还是接种后的6周内，均明显高于对照组的产生量(图10A，B)。本结果也进一步说明，免疫接种后的保护相关性可能与组织驻留记忆B细胞在感染后扩展的能力相关。另外，肺部B细胞短暂的先天刺激可能是对呼吸道病原体的初始适应性免疫反应的关键，记忆性B细胞激活的程度可能取决于病毒激发剂量和随后的病毒复制。由此推论，本发明制备的MTE和Universal通用疫苗，均有显著的免疫记忆B细胞的产生。另外，MTE和Universal疫苗接种后2周T细胞活化的百分比，无论是CD4+T细胞，还是CD8+T细胞的活化百分比，均明显高于对照组(图10C,图10D)。另外，结果也显示接种疫苗后，无论5μg和50μg两个剂量组，还是CD4还是CD8T细胞，疫苗抗原刺激活化百分比均较高，特别是5μg剂量组几乎接近于50μg剂量组，说明本发明设计生产的两个通用疫苗，在5μg小剂量时对T细胞免疫刺激优势已经很明显。这些数据表明，MTE和Universal通用疫苗诱导了强大的Th1极化多功能CD4+T细胞，和细胞免疫相关的CD8+T细胞，有利于病毒清除，并具有关键的B细胞帮助能力。
(11)SARS-CoV-2挑战保护的疗效和免疫相关性。为了评估MTE和Universal疫苗接种后的保护效果，恒河猴在第二次免疫接种后2周通过同时上呼吸道/下呼吸道(IN/IT)路线进行高剂量(106TCID50)SARS-CoV-2BA.5和XBB.1.5的挑战，以评估上呼吸道(鼻咽[NP]拭子和唾液)和下呼吸道(支气管肺泡灌洗液[BAL])中是否存在病毒RNA。对总RNA和亚基因组E信使RNA(sgmRNA)进行了测量，后者被认为是病毒复制的更具体的指标。未接种疫苗的对照动物都显示出严重感染的证据，BAL中sgmRNA的平均水平为每毫升106/份。在NP拭子中，在挑战后第2天每毫升107份(图11A,B,C)。此外，对照组病毒复制在上呼吸道中以>104拷贝sgmRNA每毫升持续7天。在两种疫苗接种的动物中，病毒复制的规模和持续时间显著减少，第1天的sgmRNA分别在BAL和NP拭子中减少了1到2天对照组的Log值。到第2天，在上呼吸道的8只动物中，有5只观察到快速清除，在下呼吸道中，在8只动物中观察到4只快速清除。到第4天，除了一只动物外，在所有动物身上上下呼吸道都没有病毒复制。说明本发明的两种通用疫苗接种后，对呼吸道攻毒挑战有明显的防护作用。
(12)呼吸道病理学和抗原表达。本发明还通过对每组三到五只猕猴的组织病理学分析来评估疫苗的有效性，这些猕猴在挑战后第7天进行尸检。到目前为止，所有未接种疫苗的动物都发现了多灶性、轻度至中度间质性肺炎的证据(图12，PBS)。肺炎的特征是II型肺细胞增生、肺泡水肿、肺泡炎症和坏死性碎片、肺泡间隔增厚、肺巨噬细胞(包括多核巨细胞)数量增加以及中小血管血管炎。四种未接种疫苗的动物的中叶和尾叶受到的影响最严重。在任何接种疫苗组的动物中都没有观察到间质性肺炎的组织学证据(图12，MTE和Universal)。然而，在每个疫苗组中，都有以中小口径血管为中心的最小到轻度单核到混合细胞浸润。免疫组织化学(IHC)在每只未接种疫苗的动物至少一个肺部分的少量肺泡肺细胞和巨噬细胞中证明了SARS-CoV-2病毒抗原(图12，IHC-PBS)。在任何疫苗组中，任何动物的肺部都没有检测到病毒抗原(图12，IHC-MTE，IHC-Universal)。总体而言，通过接种疫苗，病理发现病毒复制和炎症显著减少。第14天，接种疫苗的动物和未接种疫苗的动物之间没有观察到明显的组织病理学差异，这与该模型中的短暂的SARS-CoV-2病理学一致。所有群体的一些动物偶尔会出现轻微的血管周围浸润。总之，接种5微克或50微克MTE和Universal疫苗可以预防肺部的中度疾病和病毒蛋白的表达。
实施例1
本发明提出了一种MTE和Universal mRNA通用疫苗的设计合成。
功能性SARS-CoV-2T细胞MHC反应性抗原表位分析及表位富集片段鉴定。利用IEDB服务器V2.22(http://tools.iedb.org/tepitool/)和NetMHCpan 4.1服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)对SARS-CoV-2(野生型)原始毒株(Accession:NC045512.2)的所有结构蛋白和非结构蛋白中每个MHC T细胞表位鉴定预测序列，及HLA I类等位基因的潜在HLA-1表位位点进行预测。选择所有具有限制亲和力值(IC50)在10nM以内的潜在表位进行进一步筛选。表位富集片段被定义为每100个氨基酸中含有20个以上表位的SARS-CoV-2蛋白片段。相似长度的片段含有很少的表位也被鉴定出来。共有423个15至18-mer肽与10个氨基酸残基重叠，并跨越SARS-CoV-2的全蛋白组。利用GenScript软件合成pucc-MTE质粒构建体。采用伪utp法用T7聚合酶体外转录(IVT)合成MTE mRNA。进一步确定除Spike蛋白以外的100个T细胞反应多表位。接下来，将稳定表达编码SARS-CoV-2ORFs预测片段的质粒转染HEK293T细胞(在HEK293T细胞中过表达)，转染36h后，将100万个HEK293T细胞与20万个COVID-19恢复期患者MHC基因型匹配的记忆性CD8+T细胞共培养12h，流式细胞术(BD LSRFortessa)对ifp阳性靶细胞进行分选，并用FlowJo V_10软件进行分析。
结果：
两种SARS-Cov-2通用疫苗设计见图1，均在Spike蛋白成分(S1蛋白、RBD和TR1/TR2)诱导中和抗体的基础上增加了T细胞反应的抗原成分。一个mRNA编码超过100个(百)T细胞多表位(百多表位或MTE)疫苗，见表1及图1A。T细胞表位是由MHC I类(MHC I)或MHC II类(MHC II)分子分别呈递给CD8+和CD4+T细胞的8-11或13-25个氨基酸的长肽。MTE mRNA编码约100个T细胞表位，包括来自SARS-CoV-2原始毒株保守的MHC I和MHC II序列，这些表位来自SARS-CoV-2的非spike保守区域；另一个增加了E、M、N和RdRp的抗原成分，加上诱导中和抗体的4种抗原，称为8价通用疫苗(Universal)，见图1B。
表1.SARS-CoV-2100个T细胞多表位基因序列
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实施例2
本发明提出一种MTE表位序列与MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2冠状病毒表位序列比较和评分，以及MTE及Universal疫苗的表达。
SM-102的组成脂质摩尔百分比为48％，DSPC为12％，胆固醇为38％，DMG-PEG为2％。在1:3的流动比下，溶液在微流控装置中组合。每个微流控芯片的总流速为12mL/min。将LNP-mRNA混合物透析并离心浓缩。配制后的mRNA定量，本发明采用RiboGreen测定法。本发明遵循制造商的方案(赛默飞世尔:Quant-iTTMRiboGreenTM RNA试剂和试剂盒，Cat#R11490,R11491,T11493；No.MAN0002073)。配制后从LNPs中分离mRNA并进行琼脂糖凝胶电泳。凝胶电泳结果见图2B，本发明采用以前发明的针对Omicron变异的二价疫苗做对照(专利申请号：202210114265.9)。
结果：
将每个MTE表位序列与MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2变异的冠状病毒表位序列进行比较和评分(图2A)。MTE的T细胞表位与MERS-CoV的同源性为36.4％，与SARS-CoV的同源性为87.9％，与SARS-CoV-2omicron BA.2变体的同源性为98.3％，与SARS-CoV-2α变体、β变体、γ变体、δ变体和omicron BA.5变体的同源性超过99.8％(图2A)。进一步分析发现，与MERS-CoV有20多个表位，同源性超过70％。说明在SARS-CoV、SARS-CoV-2和SARS-CoV-2变体中，MTE中T细胞表位序列高度保守。
实施例3
本发明提出一种MTE和Universal mRNA通过T7聚合酶的IVT产生。
用MessengerMax(Invitrogen)转染293T进行MTE mRNA和Universal mRNA的表达。48h后，用流式细胞术(FC)、免疫荧光(IF)和western blot(WB)检测这三种mRNA的表达。对于IF，细胞用兔抗s1抗体(Sino Biological)和AF488偶联抗兔二抗(Abcam)孵育，并用机器成像。对FC细胞进行胰蛋白酶化，并用兔抗s1抗体(Sino Biological)和AF488偶联抗兔二抗(Abcam)孵育。使用C6(BD Biosciences)获取数据，并使用FlowJo(BD Biosciences)进行分析。对于WB，收集细胞并在裂解缓冲液中变性。将样品装入4-12％梯度的SDS-PAGE凝胶中，并转移到PVDF膜上。PVDF膜用小鼠抗s2单克隆抗体(Thermofisher,Cat#MA5-35946)和HRP偶联抗小鼠二抗(Invitrogen,Cat#62-6520)孵育。抗-肌动蛋白HRP抗体用于蛋白负载控制，购自Santa Cruz Biotechnology(sc-47778HRP)。6至8周大的雌性BALB/c小鼠在Noble Life Sciences(Woodbine,MD)的动物设施中繁殖和饲养。
结果：
免疫荧光染色显示MTE和Universal蛋白的膜定位(图3A)。流式细胞术证实了MTE(MFI 1.24M)和Uniiversal(MFI 1.17M)的细胞表面定位和高水平的蛋白表达(图3B，C)。在小鼠抗spike S1单克隆抗体变性条件下，Western blotting检测MTE和Universal蛋白。可见两条主要条带，分别对应约90KD的S1蛋白和198KD S1+RBDomi+RBDorig+HR1/HR2蛋白全长(图3D)。由于没有抗体可用于MTE检测，因此除了MTE mRNA外，还平行构建了MTE-hismRNA，在C端用6个组氨酸标记MTE。转染293T细胞后，裂解细胞，用His标签纯化柱试剂盒(SigmaAldrich,Cat#H7787)浓缩MTE-His融合蛋白，变性条件下进行Western blotting。在第一次和第二次洗脱(E1和E2)中观察到预期的72KD主带大小和较小分子量的降解产物(图3E)。
实施例4
本发明提出一种BALB/c小鼠接种后的免疫原性比较。
所有实验都是根据人道关怀和使用实验动物的规定和标准以及疫苗研究中心和动物关怀和使用委员会的规定进行的。
小鼠的免疫接种：将MTE mRNA-LNP和Universal mRNA-LNP疫苗分别进行BALB/c小鼠的免疫接种。以PBS为对照，在第0天(初始期)和第21天(增强期)用10μg LNP-mRNA疫苗肌内免疫BALB/c小鼠，在初始期和增强期两周后收集血清，在第35天收集脾脏。实验在苏州生物医药科技园动物中心进行。
ELISA间接法测定小鼠对Spike的抗体反应：ELISA板(Nunc MaxiSorp,Thermofisher,Cat#44-2404-21)包被1mg/mL重组Spike蛋白(Sino Biological Inc,Cat#40591-V08H)过夜，然后用2％BSA在PBS中阻断。将血清样品稀释200倍，然后用0.2％BSA的PBS进行1:5连续稀释，最多稀释8孔。样品采用1:2000山羊抗小鼠IgG-HRP(SouthernBiotech,Cat#1031-05)检测。用TMB底物(Sigma,Cat#T0440-1001)进行反应，用TMB停止液(Invitrogen,Cat#SS04)停止反应。使用Epoch ELISA仪(BioTek,Winooski,VT)在OD450处读取板。SARS-CoV-2假病毒，包括表达荧光素酶报告基因的Delta变体和Omicron变体(BA.5)以及XBB.1.5假病毒，用293T细胞包装收获后，液氮保存或立即使用。将HEK293T-hACE2细胞以每孔7.5×103个细胞的密度接种于384孔组织培养板中过夜。制备两倍连续稀释的热灭活血清样品(17.5μL)，并与7.5μL假病毒混合。37℃孵育1h后加入HEK293T-hACE2细胞。48h后，根据制造商的说明，在Steady-Glo Luciferase Assay(Promega)中裂解细胞。SARS-CoV-2中和滴度定义为样品稀释时，相对于病毒对照孔的平均值，观察到相对光单位(IC50)降低50％。
结果：
BALB/c小鼠的免疫接种见图4A。Spike结合抗体IgG滴度在MTE mRNA疫苗或Universal mRNA疫苗之间无显著差异。峰值特异性抗体IgG滴度的对数为4.93(MTE)vs.4.99(Universal)，增强后5.80(MTE)vs.5.80(Universal)(图4B)。IgG2a/IgG1的百分比决定Th1/Th2比值，本发明的LNP-mRNA配方未检测到Th1或Th2明显偏倚(图4C)。小鼠血清对Delta假病毒、Omicron假病毒和XBB.1.5假病毒进入细胞的抑制作用见图4(D，E，F)。发现针对Delta变体的假病毒的中和抗体(IC50的对数)滴度稍低于针对Omicron BA.5和XBB1.5变体的中和抗体滴度。因此，异质性变异的中和作用降低表明开发一种不依赖抗体但通用的SARS疫苗的重要性。
实施例5
本发明提出一种MTE和Universal mRNA疫苗保护小鼠免受SARS-CoV-2病毒致死性攻击。
在免疫原性研究中，K18-hACE2转基因小鼠在D0和D21时分别肌内注射0.1μg LNP-mRNA 2价疫苗(本发明组原有疫苗，专利申请号：202210114265.9)、LNP-mRNA MTE和LNP-mRNA Universal疫苗，并在D35，小鼠以5×103中位组织培养感染剂量(TCID50)SARS-CoV-2B.1.617.2(Delta)(BEI Resources SARS-CoV-2，分离株hCoV-19/USA/MDHP05647/2021,NR-55674)的剂量经鼻内攻击SARS-CoV-2δ变体。每天记录小鼠体重和存活率。感染后4d，每组处死5只小鼠，取脾进行T细胞免疫分析，并收集小鼠组织保存于Trizol或福尔马林中。
结果：
结果显示，PBS组的体重明显下降(6DPI时减少20％)，但在所有接种疫苗组(MTE和Universal组)中，1DPI时体重仅轻微下降(5％)，4DPI时体重恢复(图5B)。在6DPI时，模拟组的所有小鼠均死亡，而接种疫苗组没有小鼠死亡(图5C)。还使用qPCR定量检测了1mg肺mRNA中SARS-CoV-2δ型变异病毒。PBS组(1.4×107)检测到高拷贝的SARS-CoV-2病毒RNA,二价疫苗组肺中检测到低拷贝的病毒RNA(3590),MTE组(3386)和Universal组(507)检测到极低拷贝的病毒RNA(图5D)。肺组织学也显示PBS组肺中有广泛的中性粒细胞浸润，而2价疫苗和MTE及Universal疫苗组肺中没有中性粒细胞浸润(图5E)。同样，PBS组肺中检测到大量病毒颗粒，而2价疫苗组肺中检测到少量病毒颗粒，而MTE和Universal组肺中未检测到病毒颗粒(图5F)。
实施例6
本发明提出一种MTE和Universal mRNA疫苗保护小鼠适应性SARS-CoV-2MA30病毒攻击。
在小鼠适应SARS-CoV-2MA30的挑战研究中，BALB/c小鼠在北京动物中心的动物设施中喂养，并在第0天和第21天用配制的mRNA或PBS肌内免疫。第28天采集血清进行抗体检测。在第35天，用小鼠适应的SARS-CoV-2MA30以5×103PFU的剂量在50μL的体积内攻毒小鼠。记录小鼠的体重和存活率。4DPI时，每组处死5只小鼠，收集小鼠组织保存于Trizol中。MTE重叠肽由GenScript(Piscataway,NJ)合成。Spike S1重叠肽购自德国柏林JPT公司。采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)对接种小鼠脾细胞抗原特异性IFN按照ARV SOP进行ELISPOT检测。
简单地说，将96孔ELISPOT板(Millipore,Cat#MSIPS4510)包被10μg/mL IFN以3×105个细胞/孔的速度将淋巴细胞与0.5μg/mL刺长肽(JPT,Cat#PM-WCPV-S-1)、2μg/mL人MTE重叠肽(由Genscript合成)、刀蛋白A(0.125ug/mL)(Sigma,Cat#C5275-5MG)或单独培养基共培养，在200μL/孔T细胞培养基中，37℃,5％CO2，共培养48小时。将检测抗体Biotin-IFN用50μL/孔AEC显影液(BDbiosciences,Cat#551015)显影30分钟。用自来水冲洗停止显色。风干后，使用AID ELISPOT高分辨率阅读器系统和AID ELISPOT软件版本3.5(autoimmunediagnostics GmbH)对彩色斑点进行计数。
结果：
攻毒后记录小鼠体重和存活率(图6A)。同样，PBS组的小鼠体重也显著减轻(6DPI时体重减轻27％)。虽然二价疫苗组小鼠在5DPI时体重也明显减轻(19％)，但所有小鼠在12DPI时均恢复(减少5％)。MTE组和Universal组在4DPI时体重仅轻微下降(3％)，10DPI时体重完全恢复(图6B)。在6DPI时，PBS组所有小鼠和二价疫苗组1只小鼠死亡，MTE组和Universal组均未死亡(图6C)。
实施例7
本发明提出一种恒河猴对疫苗接种的体液反应。所有实验均是根据人道关怀和使用实验动物的规定和标准以及疫苗研究中心和动物关怀和使用委员会的规定进行的。
在研究第0周和第3周，23只恒河猴用50微克或5微克的MTE和Universal疫苗免疫，磷酸盐缓冲盐水(PBS)(每组n＝7/8)进行假免疫(图7A)。动物在最后一次免疫后2周受到挑战，通过气管内(IT，1.0毫升)和鼻内(IN，每个鼻孔0.5毫升)接种106TCID50(50％组织培养感染剂量)剂量的SARS-CoV-2病毒(BA.5或XBB1.5毒株)。在受到免疫学、病毒学和病理评估的挑战后，对动物进行了7天(n＝12)或14天(n＝11)的跟踪观察。实验地点在北京动物中心。
RBD特异性体液反应：采用MULTI-SPOT 96孔板(MSD)检测sars-cov-2特异性结合IgG抗体和ace2抑制抗体。复孔包被浓度为200～400ng/mL的SARS-CoV-2抗原S和RBD和牛血清白蛋白(BSA)作为阴性对照。四联MULTISPOT板用MSD阻断剂A缓冲液在室温下阻断1小时，同时以700转/分的转速摇动。在加入标准品和校准器对照品之前，用缓冲液清洗板。将血清样品在稀释缓冲液中按1:10000至1:10万稀释，然后分别加入四孔板中。在RT下孵育2小时，在700rpm下摇晃，然后洗涤。每孔加入MSD SULFO-TAG抗IgG抗体。在700转/分的转速下孵育1小时，清洗后每孔加入MSD GOLD Read缓冲液B。由MESO扇区SQ 120阅读器读取。使用DISCOVERY WORKBENCH MSD软件计算IgG浓度，并以任意单位/毫升报告。
阻断S或RBD与ACE2结合的抗体：抗原包被板被阻断并按上述方法清洗。在MSD稀释液缓冲液中按1:25～1:10000稀释检测校准液和样品，然后加入孔中。在RT下孵育1小时，同时在700rpm下摇晃。加入与MSD sulo-tag结合的ACE2蛋白，在RT下孵育1小时，同时在700rpm下摇晃，并按照上述方法洗涤和读取。结合抗体的测量采用Octet生物层干涉法，使用前在PBS中水合的HIS1K生物传感器，使用Octet fort<s:1>bio Red96仪器(Sartorius)。所有分析步骤在30℃下进行，搅拌设置为1,000rpm。HIS1K生物传感器(Sartorius)用PBS进行基线平衡15s，然后将SARS-CoV2 RBD分子(30g/mL稀释在PBS中)加载120s。将生物传感器浸入测定缓冲液(PBS中15s)，再浸入血清样品(100倍稀释)180s，记录180s的结合反应(nm)。
结果：
恒河猴实验设计见图7A。鉴于RBD在介导病毒进入细胞和在大多数中和抗体反应中的重要性，本发明还通过Meso Scale Discovery(MSD)三明治电化学发光免疫测定法评估了RBD特异性体液反应。接种疫苗的动物出现RBD特异性IgG(图7B)，其大小与S蛋白的量相当，与RBD聚焦反应一致。同时还测量了血清抗体抑制ACE2与RBD抗原结合的功能活性，显示出引发了相当高剂量的反应(图7C)。说明MTE和Universal疫苗接种产生了强大的RBD特异性中和反应。
实施例8
本发明提出一种结合抗体对MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2突变型的毒株均有显著中和反应。主要采用假病毒血清中和抗体结合实验。
在最后一次接种MTE和Universal通用疫苗两周后，采集恒河猴血清，用生物层干涉法评估血清特异性抗体反应。采用MERS-CoV、SARS-CoV和定点诱变产生的SARS-CoV-2变体作为抗原，使用Kruskal-Wallis试验和Dunn检验评估MERS-CoV、SARS-CoV野生型和SARSCoV-2变异型结合抗体反应，具体如下。
SARS-CoV-2和SARS-CoV-1和MERS-Covermark假病毒中和实验。对SARS-CoV-2和SARS-CoV-1的S表达质粒序列进行密码子优化和修饰，分别去除C末端最后18和28个氨基酸，以促进S与假病毒粒子(PSV)的结合。通过将HEK293T/17细胞与SARS-CoV-2-S质粒(来源于原始毒株基因组序列(GenBank登录号MN908947.3))或SARS-CoV-1(Sino-11,GenBank登录号AY485277)质粒和MERS-Cov病毒质粒、BA.5、XBB.1.5表达质粒与HIV-1pNL4-3荧光素酶报告质粒(pNL4-3.luc)共转染产生PSV。(美国国立卫生研究院HIV试剂计划，目录号3418)。对SARS-CoV-2VOCs S表达质粒进行了类似的密码子优化和修饰，采用机器人液体处理(Biomek NXp Beckman Coulter)，采用半自动检测格式，使用表达ace2的HEK293靶细胞(Integral Molecular)检测传染性和中和效价。以水泡性口炎病毒G蛋白为假型的病毒粒子作为非特异性对照。待测血清于56℃水浴灭活30min，上清转移至1.5mL离心管中待用。取96孔板，加入DMEM完全培养基150uL/孔，分别设置病毒对照，受试样品组。用DMEM完全培养基将假病毒稀释至1.3×104(1×104～2×104)TCID50/mL，使每孔含假病毒的量为约500/孔。将上述96孔板置于细胞培养箱中(37℃，5％CO2)孵育1小时。加入Huh-7细胞。5％CO2培24小时后从细胞培养箱中取出96孔板，用多道移液器从每个上样孔中吸弃150uL上清，加入100uL荧光素酶检测试剂，室温避光反应2min。反应结束后，使细胞充分裂解，从每孔中吸出150uL液体，加于对应96孔化学发光检测板中，置于化学发光检测仪中读取发光值。
结果：
MTE和Universal通用疫苗接种两周后产生的结合抗体，均对人类冠状病毒MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2突变型有显著的中和反应(图8)，特别是对最近流行的XBB.1.5变异型毒株，结合反应最好。
实施例9
本发明提出一种MTE和Universal疫苗接种产生了强大的特异性结合抗体。
还用上述的二价疫苗为对照，检测了MTE和Universal疫苗免疫后，对SARS-CoV-2真病毒和假病毒的抗体中和反应，类似于遵循S特异性结合反应的模式。在5μg和50μg两个剂量组，分别观察2周的峰值ID50值(50％抑制性稀释-实现50％中和所需的血清稀释的对数)。
采用病毒中和实验，SARS-CoV-2和SARS-CoV-1和MERS-Covermark假病毒中和。对SARS-CoV-2和SARS-CoV-1的S表达质粒序列进行密码子优化和修饰，分别去除C末端最后18和28个氨基酸，以促进S与假病毒粒子(PSV)的结合。通过将HEK293T/17细胞与SARS-CoV-2-S质粒(来源于原始毒株基因组序列(GenBank登录号MN908947.3))或SARS-CoV-1(Sino-11,GenBank登录号AY485277)质粒和MERS-Cov病毒质粒、BA.5、XBB.1.5表达质粒与HIV-1pNL4-3荧光素酶报告质粒(pNL4-3.luc)共转染产生PSV。(美国国立卫生研究院HIV试剂计划，目录号3418)。对SARS-CoV-2VOCs S表达质粒进行了类似的密码子优化和修饰，采用机器人液体处理(Biomek NXp Beckman Coulter)，采用半自动检测格式，使用表达ace2的HEK293靶细胞(Integral Molecular)检测传染性和中和效价。以水泡性口炎病毒G蛋白为假型的病毒粒子作为非特异性对照。试验血清在生长培养基中1:40依次稀释；然后在96孔板上每孔加入25μL，并加入等量稀释的PSV，在37℃下孵育1小时，每孔中加入靶细胞(每孔40,000个细胞)，再孵育48小时。使用EnVision多模平板读取器(Perkin-Elmer)，使用Bright-GloLuciferase Assay System(Promega)测量相对光单位。用LabKey Server进行非线性回归拟合中和剂量响应曲线。最终滴度报告为达到50％抑制SARS-CoV-2(ID50)所需的血清稀释度的倒数。
另外，由于在临床和临床前研究中，康复期COVID-19人类病例的血清经常被用作疫苗免疫原性的参考基准。本发明将MTE和Universal疫苗接种的猕猴伪病毒中和滴度与41名康复者在COVID-19后4周至8周的血清进行比较。
结果：
图9A、图9B说明，本发明的两个疫苗，在5μg的剂量下，2周的峰值ID50值，也可以达到非常有效的中和防护作用。另外，5μg组的抗体滴度高出人类抗体水平均值约10倍(图9C)，这表明本发明的两个通用疫苗诱导的中和抗体活性，超过了人类感染后头几个月观察到的活性。因此，MTE和Universal疫苗接种产生了强大的RBD特异性结合抗体，具有有效的中和活性，阻断了RBD和宿主ACE2受体之间的相互作用。
实施例10
本发明提出一种疫苗接种后记忆B细胞及T细胞活化百分比明显增高。
B细胞探针结合检测：将之前分离和低温保存的pbmc离心至温RPMI/10％胎牛血清中，并在洗涤缓冲液中重悬(4％热灭活新生小牛血清/0.02％NaN3/无酚RPMI)。将pmcs转移到96孔中，在1×PBS中洗涤两次，并与Aqua Blue活/死细胞染色剂(Thermo FisherScientific)在室温下孵育20分钟。洗涤后，细胞与一抗在室温下孵育20分钟。使用以下抗体(单克隆抗体，除非注明):IgD FITC(山羊多克隆，南方生物科技)，IgM PerCP-Cy5.5(克隆G20-127,BD Biosciences)，IgA Dylight 405(山羊多克隆，Jackson ImmunoresearchInc)，CD20 BV570(克隆2H7,Biolegend)，CD27 BV650(克隆O323,Biolegend)，CD14 BV785(克隆M5E2,Biolegend)，CD16 BUV496(克隆3G8,BD Biosciences)，IgG Alexa 700(克隆G18-145，BD Biosciences)，CD3 APC-Cy7(克隆SP34-2,BD Biosciences)，CD38 PE(克隆OKT10,Caprico Biotechnologies)，CD21 PE-cy5(克隆B-ly4,BD Biosciences)，和CXCR5PE-cy7(克隆MU5UBEE,Thermo Fisher Scientific)。细胞在洗涤缓冲液中洗涤两次，然后与streptavidin-BV605(BD Biosciences)标记为Swild S-2P和streptavidin-BUV661(BDBiosciences)标记为Somi+RBDw S-2P在4℃(避光)条件下孵育30分钟。细胞在洗涤液中洗涤两次，剩余的红细胞用BD FACS裂解液(BD Biosciences)在室温下裂解10分钟。最后两次洗涤后，细胞被固定在0.5％甲醛中(Tousimis Research Corp)。所有抗体滴定以确定最佳浓度。在BD FACSymphony细胞仪上采集样本，并使用FlowJo version 10.7.2(BD,Ashland,OR)进行分析。
抗原特异性T细胞反应：冷冻保存的pbmc解冻，用50U/mL苯并酶核酸酶(Sigma-Aldrich)在R10中静置6小时。然后用肽池刺激12小时。在Brefeldin A(0.65L/mL,GolgiPlug,BD Cytofix/Cytoperm Kit，目录号555028)、抗cd28共刺激抗体(BDBiosciences目录号555725；1g/mL)和抗cd49d(BD Biosciences目录号555501；1μg/mL)和CD107a(H4A3,BD Biosciences目录号561348，批号9143920和253441)。刺激后，用LIVE/DEAD固定蓝死细胞染色(ThermoFisher#L23105)和荧光标记抗体混合物(BD Biosciences，除非另有说明)对细胞表面标记物CD4-PE-Cy5.5(S3.5,ThermoFisher#MHCD0418，批号2118390和2247858)、CD8-BV570(RPA-T8,biolgend#301038，批号B281322)、CD45RA BUV395(5H9，#552888，批号154382和259854)、CD28BUV737(CD28.2，#612815，批号0113886)、CCR7-BV650(GO43H7，#353234，批号B297645和B316676)，以及HLA-DR-BV480(G46-6，#566113，批号0055314)。细胞内细胞因子染色:CD3-Cy7APC(SP34-2，#557757，批号6140803和121752)、CD154-Cy7PE(24-31,biolgend#310842，批号B264810和B313191)、IFNγ-AF700(B27，#506516，批号B187646和B290145)、TNFα-FITC(MAb11，#554512，批号15360)、IL-2-BV750(MQ1-17H12,biolgend#566361，批号0042313)、IL-4BB700(MP4-25D2，批号0133487和0308726)、MIP-1b-PE(D21-1351，#550078，批号9298609)、CD69-ECD(TP1.55.3,BeckmanCoulter#6607110，批号7620070和7620076)，IL-21-AF647(3A3-N2.1，#560493，批号9199272和225901)，IL-13-BV421(JES10-5A2，#563580，批号9322765,210147和169570)，和IL-17a-BV605(BL168,biolgend#512326，批号B289357)。在FACSymphony A5 SORP(BectonDickenson)上测量样品染色，使用FlowJo v.9.9软件(Tree Star,Inc.)分析数据。在评估细胞因子表达之前，将CD4+和CD8+T细胞亚群预先置于记忆标记物上:CD45RA和CD28单阳性或双阴性。使用表达一种或多种细胞因子的细胞布尔组合来评估记忆CD4+或CD8+T细胞的总s特异性反应。对跨越SARS-CoV-2S或SARS-CoV-1S的两个多肽池的反应进行汇总。采用SPICE v6.0(NIH)软件显示多组分分布。
结果：
MTE和Universal疫苗接种后，免疫记忆B细胞数量，无论在攻毒后的28天内，还是接种后的6周内，均明显高于对照组的产生量(图10A，B)。说明本发明制备的MTE和Universal通用疫苗，均有显著的免疫记忆B细胞产生。另外，MTE和Universal疫苗接种后2周，无论是CD4+T细胞，还是CD8+T细胞的活化百分比，均明显高于对照组(图10C,D)，特别是5μg剂量组几乎接近于50μg剂量组。说明本发明设计生产的两个通用疫苗，在5μg小剂量时对T细胞免疫刺激优势已经很明显。这些数据表明，MTE和Universal通用疫苗诱导了强大的Th1极化多功能CD4+T细胞，和细胞免疫相关的CD8+T细胞，有利于病毒清除，并具有关键的B细胞帮助能力。
实施例11
本发明提出一种SARS-CoV-2挑战保护的疗效和免疫相关性。
恒河猴在第二次免疫接种后2周通过同时上呼吸道/下呼吸道(IN/IT)路线进行高剂量(106TCID50)SARS-CoV-2BA.5和XBB.1.5的挑战，以评估上呼吸道(鼻咽[NP]拭子和唾液)和下呼吸道(支气管肺泡灌洗液[BAL])中是否存在病毒RNA。
总蛋白和sgmRNA定量：采用定量反转录PCR(RT-qPCR)对NP拭子、BAL液和唾液样本的sgmRNA和总病毒载量RNA进行定量分析。引物靶向SARS-CoV-2的包膜(E)基因。采用EZ1DSP病毒试剂盒(Qiagen)在EZ1 Advanced XL仪器(Qiagen)上提取200μL的RNA。简单地说，样品在200μL的ATL缓冲液(Qiagen)中裂解，并转移到Qiagen EZ1进行提取。将噬菌体MS2(ATCC)加入RNA载体，作为提取对照，监测RNA提取和扩增的效率(77)。纯化后的RNA用90μL洗脱缓冲液(AVE)洗脱。RT-qPCR扩增反应分别在96孔Fast板上的不同孔中进行，分别对sgmRNA、RNA病毒载量和MS2 RNA三个靶标进行扩增反应，提取材料为10μL，引物0.72μM，探针0.2μM,TaqPath 1-step RT-qPCR(Life Technologies,Thermo Fisher Scientific,Inc.)。扩增循环条件为25℃2min,50℃15min,95℃2min,94℃3s,55℃30s,55℃荧光读取45个循环，以sars-cov-2e基因的RNA转录本作为校准标准。从标准曲线外推RNA拷贝值，并乘以45得到每毫升RNA拷贝数。用热灭活SARS-CoV-2(ATCC,VR-1986HK)制备的阴性对照(PBS)和两个阳性对照(每mL 106和103拷贝)提取并用于评估两种检测方法的性能。
结果：
对照组病毒复制在上呼吸道中以>104拷贝sgmRNA每毫升持续7天。在两种疫苗接种的动物中，病毒复制的规模和持续时间显著减少，第1天的sgmRNA分别在BAL和NP拭子中减少了1到2天对照组的Log值。g到第2天，在上呼吸道的八只动物中，有5只观察到快速清除，g在下呼吸道中，在八只动物中观察到4只快速清除。到第4天，除了一只动物外，在所有动物身上上下呼吸道都没有病毒复制。说明本发明的两种通用疫苗接种后，对呼吸道攻毒挑战有明显的防护作用。
实施例12
本发明提出一种呼吸道病理学和抗原表达。
本发明还通过对每组三到五只猕猴的组织病理学分析来评估疫苗的有效性，这些猕猴在挑战后第7天进行尸检。
组织病理学：用光镜和免疫组化法对经福尔马林固定的肺组织切片进行评价。肺部灌注10％中性缓冲福尔马林。肺切片常规处理成石蜡，5m处切片，苏木精和伊红染色。采用Dako Envision系统(Dako Agilent Pathology Solutions)进行免疫组化。简单地说，在脱蜡、过氧化物酶阻断和抗原回收后，切片用小鼠单克隆抗sars-cov核衣壳蛋白(#40143-MM05,Sino Biological)以1:4000的稀释率覆盖，在RT下孵育45分钟。冲洗后，过氧化物酶标记的聚合物(二抗)应用30分钟。棕色显色底物3,3二氨基联苯胺溶液(Dako AgilentPathology Solutions)作用8分钟。将底物显色溶液从载玻片上冲洗掉，用苏木精反染并冲洗载玻片。切片脱水，用Xyless清除，然后盖上盖子。组织切片由一位委员会认证的兽医解剖病理学家评估，他对研究组的分配是盲目的。
采用Dako Envision进行IHC。取左、右肺叶各3张组织切片，评价肺病理。各切片组织病理学评分为0～5.0分，缺席；1、最小(10％的组织切片受影响)；2、轻度(11％～25％的组织切片受影响)；3、中度(26～50％的组织切片受影响)；4、标记(51-75％受影响)；5、严重(75％的组织切片受影响)。切片评估水肿、透明膜、细胞浸润、肺泡组织细胞、II型肺细胞增生、间质纤维增生、支气管相关淋巴组织增生、细支气管变性、毛细血管巨核细胞和血栓形成。将每个病理发现的所有六个部分的评分合并为单个动物的最终评分(II型肺细胞增生[TIIPH]评分)。
结果：
所有未接种疫苗的动物都发现了多灶性、轻度至中度间质性肺炎的证据(图12，PBS)。四种未接种疫苗的动物的中叶和尾叶受到的影响最严重。在任何接种疫苗组的动物中都没有观察到间质性肺炎的组织学证据(图12，MTE和Universal)。免疫组织化学(IHC)在每只未接种疫苗的动物至少一个肺部分的少量肺泡肺细胞和巨噬细胞中证明了SARS-CoV-2病毒抗原(图12，IHC-PBS)。在任何疫苗组中，任何动物的肺部均没有检测到病毒抗原(图12，IHC-MTE，IHC-Universal)。
总体而言，通过接种疫苗，病理发现病毒复制和炎症显著减少。第14天，接种疫苗的动物和未接种疫苗的动物之间没有观察到明显的组织病理学差异。总之，接种5微克或50微克MTE和Universal疫苗可以预防肺部的中度疾病和病毒蛋白的表达。
以上仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (10)
1.SARS-Cov-2 mRNA通用疫苗的制备，其特征在于，
所述通用疫苗包括SARS-CoV-2 MTE mRNA疫苗和SARS-CoV-2 Universal mRNA疫苗；
所述通用疫苗均基于中和抗体和T细胞反应的共免疫；
所述中和抗体与T细胞反应位点抗原间设有P2A剪切位点，所述剪切位点的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
所述SARS-CoV-2原始毒株序列来源于GenBank: MN908947.3，Omicron及XBB1.5变体公开的变异序列；
所述中和抗体由 S1、RBD、HR1/HR2 mRNA诱导。
2.根据权利要求1所述的SARS-Cov-2 mRNA通用疫苗的制备，其特征在于，所述SARS-CoV-2 MTE mRNA疫苗的T细胞反应由100个多表位 mRNA诱导。
3.根据权利要求1所述的SARS-Cov-2 mRNA通用疫苗的制备，其特征在于，所述SARS-CoV-2 Universal mRNA疫苗的T细胞反应由E、M、N和RdRp保守蛋白诱导。
4.根据权利要求1或2所述的SARS-Cov-2 mRNA通用疫苗的制备，其特征在于，所述SARS-CoV-2 MTE mRNA疫苗的中和抗体诱导抗原由Omicron变体S1蛋白、XBB.1.5变体RBD蛋白、原始毒株RBD蛋白和Omicron变体的HR1/HR2蛋白构成。
5.根据权利要求1或3所述的SARS-Cov-2 mRNA通用疫苗的制备，其特征在于，所述SARS-CoV-2 Universal mRNA疫苗的中和抗体诱导抗原由XBB.1.5 S1蛋白、Omicron RBD蛋白、原始毒株RBD蛋白和XBB.1.5 HR1/HR2蛋白构成。
6.根据权利要求1所述的SARS-Cov-2 mRNA通用疫苗的制备，其特征在于，所述SARS-CoV-2 MTE mRNA疫苗的T细胞反应抗原包含100个来自SARS-CoV-2非spike保守区域的T细胞表位，所述T细胞表位在已知的SARS-CoV-2变体以及冠状病毒家族的其他成员中均为保守的。
7.根据权利要求1所述的SARS-Cov-2 mRNA通用疫苗的制备，其特征在于，所述SARS-CoV-2 Universal mRNA疫苗的T细胞反应抗原包含E、M、N和RdRp保守蛋白。
8.根据权利要求1所述的SARS-Cov-2 mRNA通用疫苗的制备，其特征在于，
所述通用疫苗为以mRNA 疫苗结构为主体的疫苗，包含1个体外转录 mRNA、由抗原编码的开放阅读框、5’和3’端UTR及一个7甲基鸟苷5’帽结构，合并到第一个核苷酸的序列，和3’端Poly A；
所述通用疫苗进行密码子优化，假尿苷取代；
所述5’UTR区域结构为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，来自高表达的人类基因α-球蛋白的5 -UTR，以及一个优化的下游Kozak共识序列GCCACCAUG；
所述3'端UTR结构位于核苷酸3880-4174，由AES基因序列和mtRNA1组合而成，用于增加蛋白质表达和mRNA稳定性；
所述mtRNA1 为线粒体12S核糖体RNA；
所述Poly A序列约30-300个核苷酸单位；
各抗原之间的链接为SEQ ID NO：3。
9.根据权利要求1所述的SARS-Cov-2 mRNA通用疫苗的制备，其特征在于，
所述通用疫苗的mRNA疫苗的脂质系统配方包括可电离脂质十七烷-9-基8-[2-羟乙基-(6-氧-6-十一氧己基)氨基]辛酸酯，辅助脂质1,2-二硬脂酰-sng -甘油-3-磷酸胆碱，胆固醇和1,2-二肉豆醇-sng -3-磷酸乙醇胺- n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]；所述可电离脂质十七烷-9-基8-[2-羟乙基-(6-氧-6-十一氧己基)氨基]辛酸酯：辅助脂质1,2-二硬脂酰-sng -甘油-3-磷酸胆碱：胆固醇：1,2-二肉豆醇-sng -3-磷酸乙醇胺- n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]的摩尔百分比为48：12：38：2。
10.根据权利要求9所述的SARS-Cov-2 mRNA通用疫苗的制备，其特征在于，所述通用疫苗的mRNA疫苗的脂质系统配方通过使用微流体装置，将有机相中的脂质与含有mRNA的水相混合制备而得。
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