CN116793909A - 诊断及鉴别诊断非阿尔兹海默病认知障碍的系统、组合物和试剂盒 - Google Patents
诊断及鉴别诊断非阿尔兹海默病认知障碍的系统、组合物和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供一种诊断及鉴别诊断非阿尔兹海默病认知障碍，即“非AD认知障碍”的系统、组合物和试剂盒。其中，用于诊断“非AD认知障碍”包括：第一检测模块，其用于检测受试者体液中细胞外囊泡(Extracellular Vesicle,EV)的中枢神经系统来源生物标志物，以确认携带中枢神经系统来源特异性标志物的EV的数量和粒径；第二检测模块，其用于检测受试者体液中EV的非AD认知障碍相关的标志物以确认携带非AD认知障碍相关的标志物的EV的数量和粒径；以及诊断及鉴别诊断模块，其基于第一检测模块和第二检测模块分别获得的中枢神经系统来源标志物和非AD认知障碍相关的标志物的检测结果来诊断受试者是否罹患非AD认知障碍。
Description
技术领域
本申请涉及生物医学技术领域，尤其是涉及体外诊断检测技术领域，涉及采用双标志物和/或多标志物进行非阿尔兹海默病认知障碍检测的方法和系统，优选采用双标志物和/或多标志物同时进行非阿尔兹海默病认知障碍检测的方法和系统。
背景技术
阿尔兹海默病(Alzheimer’s Disease,AD)主要由β淀粉样蛋白沉积及神经缠结导致中枢神经系统神经元损伤，患者出现认知障碍症状。临床工作中患者出现认知障碍症状就诊，认知障碍症状并非只由AD一种原因引起，临床工作中诊断患者为AD时其中常混杂有非AD认知障碍，其误诊率为23～88％，非AD认知障碍包括Lewy体痴呆、额颞叶痴呆、Pick病、伴有痴呆的肌萎缩性侧索硬化症等多种疾病。
基于临床认知量表及症状的诊断很难将AD与非AD认知障碍进行区分，影像学检查费用极为高昂然而对于鉴别AD与非AD认知障碍作用有限，AD与非AD认知障碍鉴别在临床工作中及科研领域一直是难点及研究瓶颈，并且为患者诊疗就医及后续治疗造成极大障碍，影响其治疗效果。本申请提供的诊断及鉴别诊断非AD认知障碍方法，能够有效提高AD与非AD认知障碍鉴别诊断能力，辅助非AD认知障碍诊断，能够极大改善非AD认知障碍误诊率。
基于脑脊液的生物标志物检测在神经系统疾病研究中广泛应用，但是在临床应用中由于脑脊液采集的有创性很难被患者接受，极大地限制了临床转化与后续应用。本申请主要基于外周血检测对非AD认知障碍进行诊断，能够广泛应用于临床实践及大规模筛查。同时，本申请中关键生物标志为创新性发现的外周血神经来源细胞外囊泡(ExtracellularVesicle,EV)相关生物标志物，能够通过检测外周血中神经系统来源EV及其携带的疾病相关蛋白直接反应中枢神经系统病变，从而实现对非AD认知障碍的诊断及鉴别诊断。本申请核心检测技术为纳米流式检测技术，通过这一技术实现对外周血中神经系统来源EV高灵敏、高通量检测，并且能够实现快速、低成本检测，为临床应用及大规模筛查提供了技术支持。
本申请聚焦非AD认知障碍诊断及鉴别诊断这一临床及科研难题，通过全新纳米流式检测技术，应用创新发现的中神经系统来源EV标志物，实现非AD认知障碍快速、高效诊断及鉴别诊断，为临床非AD认知障碍诊断工作提供新的技术手段及方法。
发明内容
如上所述，在本领域中还未存在利用外周体液有效地对非AD认知障碍进行诊断、鉴别诊断的系统、方法以及试剂盒，本申请旨在提供一种能够在外周体液中有效识别到不同中枢神经系统来源生物标志物，将其与疾病相关标志物联合检测，多重标记同时检测，以达到避免获取脑脊液，只通过少量外周体液样本就可以反应中枢神经系统变化的效果。
即，本申请利用在外周体液中识别中枢神经系统来源的生物标志物进行非AD认知障碍诊断及鉴别诊断。
具体来说，本申请涉及以下内容：
1.一种用于诊断及鉴别诊断非AD认知障碍的系统，其包括：
第一检测模块，其用于检测受试者体液中EV的中枢神经系统来源生物标志物，以确认携带中枢神经系统来源特异性标志物的EV的数量和粒径；
第二检测模块，其用于检测受试者体液中EV的非AD认知障碍相关的标志物以确认携带非AD认知障碍相关的标志物的EV的数量和粒径；
诊断模块，其基于第一检测模块和第二检测模块分别获得的中枢神经系统来源标志物和非AD认知障碍相关的标志物的检测结果来诊断受试者是否罹患非AD认知障碍。
2.根据项1所述的系统，其中，
所述第一检测模块和所述第二检测模块同时检测受试者体液中的中枢神经系统来源标志物和检测受试者体液中的非AD认知障碍相关的标志物；或者
所述第一检测模块和所述第二检测模块为同一模块，其同时检测受试者体液中的中枢神经系统来源标志物和检测受试者体液中的非AD认知障碍相关生物标志物。
3.根据项1或2所述的系统，其还包括：
富集模块，其用于获取受试者的体液并对其进行预处理以富集体液中的EV。
4.根据项3所述的系统，其中，所述富集模块还包括用于对富集的EV进行筛选。
5.根据项1-4中任一项所述的系统，其中，
诊断模块统计同时检测到携带中枢神经系统来源生物标志物和非AD认知障碍相关的生物标志物的EV的数量，基于统计的同时检测到携带中枢神经系统来源标志物和非AD认知障碍相关的标志物的EV的数量占总EV的数量的比值来诊断受试者是否罹患非AD认知障碍。
6.根据项1-5中任一项所述的系统，其中，所述粒径为相关蛋白阳性EV分布数量最多处所对应的粒径，诊断模块基于检测的粒径来鉴别诊断出罹患认知障碍的受试者罹患非AD认知障碍而不是阿尔兹海默病的受试者。
7.根据项1-6中任一项所述的系统，其中，所述EV为神经元来源的EV、星形胶质细胞来源的EV、少突胶质细胞来源的EV或小胶质细胞来源的EV。
8.根据项1-7中任一项所述的系统，其中，所述体液选自血液、血清、血浆、唾液、尿液、淋巴液、精液或乳汁中的一种或两种以上。
9.根据项1-8中任一项所述的系统，其中，所述中枢神经系统来源标志物为G蛋白偶联受体162(G Protein-Coupled Receptor 162,GPR162)、γ-氨基丁酸A型受体亚基δ(Gamma-Aminobutyric Acid Type A Receptor Subunit Delta,GABRD)、乙酰胆碱转移酶(Choline O-acetyltransferase，CHAT)、谷氨酸离子型受体NMDA型亚基2D(Glutamateionotropic receptor NMDA type subunit 2D，NR2D)中的一种或两种以上。
10.根据项1-9中任一项所述的系统，其中，所述非AD认知障碍相关的标志物为第217位磷酸化tau(pTau217)蛋白。
11.根据项3所述的系统，其中，所述富集模块具有进行以下步骤中的一种或两种以上的子模块：离心、超速离心、超滤管过滤、聚合沉降、特异性抗体捕获。
12.根据项1-11中任一项所述的系统，其中第一检测模块用于使受试者的EV与经标记的、与中枢神经系统来源标志物特异性反应的抗体进行反应，以及检测反应后标记信号的强度以判断具有中枢神经系统来源生物标志物的EV的存在及含量。
13.根据项1-12中任一项所述的系统，其中，第二检测模块用于使受试者的EV与经标记的、与非AD认知障碍相关标志物特异性反应的抗体进行反应，以及检测反应后标记信号的强度以判断具有非AD认知障碍相关标志物的EV的存在及含量。
14.根据项12或13所述的系统，其中，所述标记选自以下中的一种或两种以上：荧光标记、同位素标记、酶标记、化学发光剂标记、量子点标记或胶体金标记。
15.一种用于诊断及鉴别诊断非AD认知障碍的组合物，其包括：
用于靶向中枢神经系统来源标志物的抗体，以及
用于靶向非AD认知障碍相关的标志物的抗体。
16.根据项15所述的组合物，其中，所述中枢神经系统来源标志物为G蛋白偶联受体162(G Protein-Coupled Receptor 162,GPR162)、γ-氨基丁酸A型受体亚基δ(Gamma-Aminobutyric Acid Type A Receptor Subunit Delta,GABRD)、乙酰胆碱转移酶(CholineO-acetyltransferase，CHAT)、谷氨酸离子型受体NMDA型亚基2D(Glutamate ionotropicreceptor NMDA type subunit 2D，NR2D)中的一种或两种以上。
17.根据项15或16所述的组合物，其中，所述非AD认知障碍相关的标志物为第217位磷酸化tau(pTau217)蛋白。
18.根据项15-17中任一项所述的组合物，其中，所述用于靶向中枢神经系统来源标志物的抗体和所述用于靶向非AD认知障碍相关的标志物的抗体是经标记的抗体，优选所述标记选自以下中的一种或两种以上：荧光标记、同位素标记、酶标记、化学发光剂标记、量子点标记或胶体金标记。
19.一种用于检测受试者非AD认知障碍的试剂盒，其包括：
用于检测受试者生物体液中EV的中枢神经系统来源标志物的试剂，以及
用于检测受试者生物体液中EV的非AD认知障碍相关的标志物的试剂。
20.根据项19所述的试剂盒，其中，所述用于检测受试者生物体液中EV的中枢神经系统来源标志物的试剂和用于检测受试者生物体液中EV的非AD认知障碍相关的标志物的试剂为项15-18中任一项所述的组合物。
21.根据项19所述的试剂盒，还包括：
用于获取受试者的生物样本的试剂和装置，优选用于获取受试者EV的试剂和装置。
22.一种用于诊断及鉴别诊断非AD认知障碍的方法，其包括：
第一检测步骤，其检测受试者体液中EV的中枢神经系统来源生物标志物，以确认携带中枢神经系统来源特异性标志物的EV的数量和粒径；
第二检测步骤，其检测受试者体液中EV的非AD认知障碍相关的标志物以确认携带非AD认知障碍相关的标志物的EV的数量和粒径；
诊断步骤，其基于第一检测步骤和第二检测步骤分别获得的中枢神经系统来源标志物和非AD认知障碍相关的标志物的检测结果来诊断受试者是否罹患非AD认知障碍。
23.根据项22所述的方法，其中，
所述第一检测步骤和所述第二检测步骤同时检测受试者体液中的中枢神经系统来源标志物和检测受试者体液中的非AD认知障碍相关的标志物；或者
所述第一检测步骤和所述第二检测步骤为同一步骤，其同时检测受试者体液中的中枢神经系统来源标志物和检测受试者体液中的非AD认知障碍相关生物标志物。
24.根据项22或23所述的方法，其还包括：
富集步骤，其获取受试者的体液并对其进行预处理以富集体液中的EV。
25.根据项24所述的方法，其中，所述富集步骤还包括对富集的EV进行筛选。
26.根据项22-25中任一项所述的方法，其中，
诊断步骤统计同时检测到携带中枢神经系统来源生物标志物和非AD认知障碍相关的生物标志物的EV的数量，基于统计的同时检测到携带中枢神经系统来源标志物和非AD认知障碍相关的标志物的EV的数量占总EV的数量的比值来诊断受试者是否罹患非AD认知障碍。
27.根据项22-26中任一项所述的方法，其中，所述粒径为相关蛋白阳性EV分布最多处对应的粒径，诊断步骤基于检测的粒径来鉴别诊断出罹患认知障碍的受试者罹患非AD认知障碍而不是AD。
28.根据项22-27中任一项所述的方法，其中，所述EV为神经元来源的EV、星形胶质细胞来源的EV、少突胶质细胞来源的EV或小胶质细胞来源的EV。
29.根据项22-28中任一项所述的方法，其中，所述体液选自血液、血清、血浆、唾液、尿液、淋巴液、精液或乳汁中的一种或两种以上。
30.根据项22-29中任一项所述的方法，其中，所述中枢神经方法来源标志物为G蛋白偶联受体162(G Protein-Coupled Receptor 162,GPR162)、γ-氨基丁酸A型受体亚基δ(Gamma-Aminobutyric Acid Type A Receptor Subunit Delta,GABRD)、乙酰胆碱转移酶(Choline O-acetyltransferase，CHAT)、谷氨酸离子型受体NMDA型亚基2D(Glutamateionotropic receptor NMDA type subunit 2D，NR2D)中的一种或两种以上。
31.根据项22-30中任一项所述的方法，其中，所述非AD认知障碍相关的标志物为第217位磷酸化tau(pTau217)蛋白。
32.根据项25所述的方法，其中，所述富集步骤具有进行以下步骤中的一种或两种以上的子步骤：离心、超速离心、超滤管过滤、聚合沉降、特异性抗体捕获。
33.根据项22-32中任一项所述的方法，其中第一检测步骤使受试者的EV与经标记的、与中枢神经系统来源标志物特异性反应的抗体进行反应，以及检测反应后标记信号的强度以判断具有中枢神经系统来源生物标志物的EV的存在及含量。
34.根据项22-33中任一项所述的方法，其中，第二检测步骤使受试者的EV与经标记的、与非AD认知障碍相关标志物特异性反应的抗体进行反应，以及检测反应后标记信号的强度以判断具有非AD认知障碍相关标志物的EV的存在及含量。
35.根据项33或34所述的方法，其中，所述标记选自以下中的一种或两种以上：荧光标记、同位素标记、酶标记、化学发光剂标记、量子点标记或胶体金标记。
发明的效果
利用本申请的方法、系统、试剂盒以及组合物，即使仅仅利用受试者的外周体液也能够诊断及鉴别受试者是否罹患AD，并能够将罹患AD和非AD认知障碍进行鉴别诊断。
利用本申请的方法、系统、试剂盒以及组合物能够有效地从外周体液中富集且特异性地标记能够反映非AD认知障碍疾病变化的生物标志物，相比直接检测外周体液中的疾病相关标志物，诊断效果更优。
利用本申请的方法、系统、试剂盒以及组合物可以有效地利用外周体液来进行检测，从而可以避免创伤性地获取受试者的脑脊液，大大降低受试者的取样风险、大大减轻检测的困难程度、大大增加检测的临床应用性和推广性。
利用本申请的方法、系统、试剂盒以及组合物，能够同时检测中枢神经系统来源标志物与疾病相关标志物，降低样本检测时间，更加高效、便捷。
本申请的核心是采用双标志物和/或多标志物进行非AD认知障碍检测的方法和系统，可以实现双标志物和/或多标志物的同时检测，即利用标志物来确认EV中来源于中枢神经系统的部分，在此基础上利用与疾病相关的标志物，产生的共同检测结果为疾病的诊断、鉴别诊断、追踪和药物评估服务。
附图说明
图1A显示对单颗粒纳米流式细胞仪使用250nm荧光质控球的质控结果；
图1B显示对单颗粒纳米流式细胞仪使用68～155nm粒径质控球的质控结果；
图1C显示对超速离心获得的EV的粒径分布、浓度分析结果；
图2A显示实施例4的发现队列中，与NC组和NAD组相比，AD组血浆中GPR162蛋白阳性EV占总EV数量的比值有下降的趋势，但这种差异无统计学显著性；
图2B显示实施例4的发现队列中，与NC组相比，AD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比值显著降低(****,p<0.0001)；与NC组相比，NAD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比值也显著降低(***,p<0.001)；
图2C显示实施例4的发现队列中，血浆中GPR162蛋白和pTau217蛋白双阳性EV占总EV数量的比值在NC组VS AD组(****,p<0.0001)、NC组VS NAD组(***,p<0.001)均存在显著性差异；
图2D显示实施例4的发现队列中，通过受试者工作特征曲线(Receiver operatingcharacteristic curve,ROC)分析进行诊断效率评估，GPR162蛋白和pTau217蛋白双标的曲线下面积(Area under curve,AUC)为0.85(NC VS AD)；
图2E显示实施例4的发现队列中，与NC组和NAD组相比，AD组血浆中GABRD蛋白阳性EV占总EV数量的比值有下降的趋势，但这种差异无统计学显著性；
图2F显示实施例4的发现队列中，与NC组相比，AD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比值显著降低(*,p<0.01)；
图2G显示实施例4的发现队列中，血浆中GABRD蛋白和pTau217蛋白双阳性EV占总EV数量的比值在NC组VS AD组(****,p<0.0001)、NC组VS NAD组(***,p<0.001)均存在显著性差异；
图2H显示实施例4的发现队列中，通过ROC分析进行诊断效率评估，GABRD蛋白和pTau217蛋白双标的AUC为0.85(NC VS AD)；
图2I显示实施例4的发现队列中，使用逻辑回归分析Enter方法纳入GPR162+pTau217和GABRD+pTau217数据，AUC为0.91(NC VS AD)；
图3A显示实施例4的发现队列中，与NAD组相比，AD组血浆中GPR162蛋白和pTau217蛋白双阳性EV分布极值对应的粒径显著降低(***,p<0.001)；
图3B显示实施例4的发现队列中，AD组血浆中GABRD蛋白和pTau217蛋白双阳性EV分布极值对应的粒径也显著降低(**,p<0.01)；
图3C显示实施例4的发现队列中，使用逻辑回归分析Enter方法纳入GPR162+pTau217和GABRD+pTau217分布极值粒径数据，AUC为0.82(AD VS NAD)；
图4A显示实施例4的验证队列中，与NC组和NAD组相比，AD组血浆中GPR162蛋白阳性EV占总EV数量的比值有下降的趋势，但这种差异无统计学显著性；
图4B显示实施例4的验证队列中，与NC组相比，AD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比值显著降低(****,p<0.0001)；与NAD组相比，AD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比值也显著降低(****,p<0.0001)；
图4C显示实施例4的验证队列中，血浆中GPR162蛋白和pTau217蛋白双阳性EV占总EV数量的比值在NC组VS AD组(****,p<0.0001)、AD组VS NAD组(****,p<0.0001)均存在显著性差异；
图4D显示实施例4的验证队列中，通过ROC分析进行诊断效率评估，GPR162蛋白和pTau217蛋白双标的AUC为0.74(NC VS AD)；
图4E显示实施例4的验证队列中，与NC组相比，AD组血浆中GABRD蛋白阳性EV占总EV数量的比值显著下降(***,p<0.001)；与NC组相比，NAD组血浆中GABRD蛋白阳性EV占总EV数量的比值也显著下降(****,p<0.0001)；此外，与AD组相比，NAD组血浆中GABRD蛋白阳性EV占总EV数量的比值显著下降(****,p<0.0001)；
图4F显示实施例4的验证队列中，与NC组相比，AD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比值显著降低(***,p<0.001)；NAD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比值也显著降低(***,p<0.001)；
图4G显示实施例4的验证队列中，血浆中GABRD蛋白和pTau217蛋白双阳性EV占总EV数量的比值在NC组VS AD组(****,p<0.0001)、NC组VS NAD组(****,p<0.0001)、AD组VSNAD组(*,p<0.01)均存在显著性差异；
图4H显示实施例4的验证队列中，通过ROC分析进行诊断效率评估，GABRD蛋白和pTau217蛋白双标的AUC为0.84(NC VS AD)；
图4I显示实施例4的验证队列中，使用逻辑回归分析Enter方法纳入GPR162+pTau217和GABRD+pTau217数据，AUC为0.93(NC VS AD)。
图5A显示实施例4的验证队列中，与NAD组相比，AD组血浆中GPR162蛋白和pTau217蛋白双阳性EV分布极值对应的粒径显著降低(***,p<0.001)；
图5B显示实施例4的验证队列中，AD组血浆中GABRD蛋白和pTau217蛋白双阳性EV分布极值对应的粒径也显著降低(**,p<0.01)；
图5C显示实施例4的验证队列中，使用逻辑回归分析Enter方法纳入GPR162+pTau217和GABRD+pTau217分布极值粒径数据，AUC为0.88(AD VS NAD)；
图6A显示实施例7中，与NC组和NAD组相比，AD组血浆中CHAT蛋白阳性EV占总EV数量的比值显著降低(**,p<0.01)；
图6B显示实施例7中，与NC组相比，AD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比值显著降低(****,p<0.001)；与NC组相比，NAD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比值也显著降低(***,p<0.01)；
图6C显示实施例7中，血浆中CHAT蛋白和pTau217蛋白双阳性EV占总EV数量的比值在NC组VS AD组(****,p<0.001)、NC组VS NAD组(***,p<0.05)均存在显著性差异；
图6D显示实施例7中，通过ROC分析进行诊断效率评估，CHAT蛋白和pTau217蛋白双标的AUC为0.88(NC VS AD)；
图6E显示实施例7中，通过ROC分析进行诊断效率评估，CHAT蛋白和pTau217蛋白双标的曲AUC为0.88(AD VS NAD)；
图6F显示实施例7中，与NC组相比，AD组血浆中NR2D蛋白阳性EV占总EV数量的比例显著降低(***,p<0.001)；与NAD组相比，AD组血浆中NR2D蛋白阳性EV占总EV数量的比例也显著降低(***,p<0.001)；
图6G显示实施例7中，与NC组相比，AD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比值显著降低(****,p<0.0001)；与NAD组相比，AD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比例也显著降低(***,p<0.001)；
图6H显示实施例7中，血浆中NR2D蛋白和pTau217蛋白双阳性EV占总EV数量的比例在NC组VS AD组(****,p<0.0001)、NC组VS NAD组(***,p<0.001)均存在显著性差异；
图6I显示实施例7中，通过ROC分析进行诊断效率评估，NR2D蛋白和pTau217蛋白双标的AUC为0.82(NC VS AD)；
图6J显示实施例7的发现队列中，通过ROC分析进行诊断效率评估，NR2D蛋白和pTau217蛋白双标的AUC为0.69(AD VS NAD)；
图6K显示实施例7中，使用逻辑回归分析Enter方法纳入CHAT+pTau217和NR2D+pTau217数据，AUC＝0.96(NC VS AD)；
图6L显示实施例7中，使用逻辑回归分析Enter方法纳入CHAT+pTau217和NR2D+pTau217数据，AUC＝0.88(AD VS NAD)。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本申请的具体实施例。虽然附图中显示了本申请的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
在本申请中细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EV)是细胞间通信的成熟介质，是由不同类型的激活或凋亡细胞释放的小膜囊泡，包括白细胞、血小板、红细胞和内皮细胞，在人类和动物体液中均可检测到。EV被分为三个主要群体:凋亡小体、微泡和外泌体。
在本申请的一个具体实施方式中，本申请涉及一种诊断及鉴别诊断非阿尔兹海默病认知障碍，即“非AD认知障碍”的方法、系统、组合物和试剂盒，其包括：检测受试者生物体液中EV的中枢神经系统来源标志物，检测受试者生物体液中EV的非AD认知障碍相关的标志物，以及基于中枢神经系统来源标志物和非AD认知障碍相关的标志物的检测结果来鉴别诊断受试者是否罹患非AD认知障碍。
在本申请的一个具体实施方式中，本申请涉及一种诊断及鉴别诊断非阿尔兹海默病认知障碍，即“非AD认知障碍”的方法、系统、组合物和试剂盒，其包括：检测受试者生物体液中EV的中枢神经系统来源标志物以确认具有中枢神经系统来源标志物的EV的数量和粒径，检测受试者生物体液中EV携带的非AD认知障碍相关的标志物以确认具有非AD认知障碍相关的标志物的EV的数量和粒径，以及基于中枢神经系统来源标志物和非AD认知障碍相关的标志物的检测结果来鉴别诊断受试者是否罹患非AD认知障碍，其中，检测受试者生物体液中的中枢神经系统来源标志物和检测受试者生物体液中的非AD认知障碍相关的标志物同时进行。
在本申请的一个具体实施方式中，本申请涉及一种诊断及鉴别诊断非阿尔兹海默病认知障碍，即“非AD认知障碍”的方法、系统、组合物和试剂盒，其包括：第一检测模块，其用于检测受试者体液中EV携带的中枢神经系统来源标志物以确认携带中枢神经系统来源标志物的EV的数量和粒径，第二检测模块，其用于检测受试者体液中EV携带的非AD认知障碍相关的标志物以确认具有非AD认知障碍相关的标志物的EV的数量和粒径，以及诊断模块，其基于第一检测模块和第二检测模块分别获得的中枢神经系统来源标志物和非AD认知障碍相关的标志物的检测结果来鉴别诊断受试者是否罹患非AD认知障碍。
在本申请的一个具体实施方式中，本申请涉及一种诊断及鉴别诊断非阿尔兹海默病认知障碍，即“非AD认知障碍”的方法、系统、组合物和试剂盒，其包括：第一检测模块，其用于检测受试者体液中EV携带的中枢神经系统来源标志物以确认携带中枢神经系统来源标志物的EV的数量和粒径，第二检测模块，其用于检测受试者体液中EV携带的非AD认知障碍相关的标志物以确认携带非AD认知障碍相关的标志物的EV的数量和粒径，以及诊断模块，其基于第一检测模块和第二检测模块分别获得的中枢神经系统来源标志物和非AD认知障碍相关的标志物的检测结果来鉴别诊断受试者是否罹患非AD认知障碍。所述第一检测模块和所述第二检测模块同时检测受试者生物体液中的中枢神经系统来源标志物和检测受试者生物体液中的非AD认知障碍相关的标志物；或者所述第一检测模块和所述第二检测模块为同一模块，其同时检测受试者生物体液中的中枢神经系统来源标志物和检测受试者生物体液中的非AD认知障碍相关的标志物。
如上所述，在本申请的方法和系统中，发明人独创性地开发出一种新的方法和系统，即采用具有不同作用的双标志物和/或多标志物来进行检测，尤其是可以同时通过这样的双标志物和/或多标志物来进行检测，从而仅仅利用少量外周体液也能够有效地诊断及鉴别诊断非AD认知障碍。这样的检测方法和系统不需要提取患者的脑脊液，大大减轻了患者的取样风险。同时由于采用具有标识中枢系统来源的标志物和与待检测疾病相关的标志物的双重标记和/或多重标记，可以大大提高检测的准确程度，如果进一步同时进行检测，还可以提高整体检测的效率。而现有的其它方法往往需要更为复杂的提取、富集、或纯化步骤等才能够获取用于诊断的EV。本申请则简化了操作步骤，独创性地利用来源于中枢神经系统的标志物来标注来源，并结合与疾病相关的标志物，从而实现了疾病检测准确度和效率的提升。
进一步地，本申请的方法还包括：获取受试者的生物体液并对其进行预处理以富集生物体液中的EV，检测受试者生物体液中的中枢神经系统来源标志物是指检测受试者体液中富集的EV中的中枢神经系统来源标志物，检测受试者生物体液中的非AD认知障碍相关的标志物是指检测受试者体液中富集的EV携带的非AD认知障碍相关的标志物。
进一步地，本申请的方法还包括：获取受试者的生物体液并对其进行预处理以富集生物体液中的EV，对富集的EV进行筛选，检测受试者生物体液中的中枢神经系统来源标志物是指检测受试者体液中筛选的EV中的中枢神经系统来源标志物，检测受试者生物体液中的非AD认知障碍相关的标志物是指检测受试者体液中筛选的EV携带的非AD认知障碍相关的标志物。
本申请的方法还包括诊断模块统计同时检测到携带中枢神经系统来源标志物和非AD认知障碍相关的标志物的EV的数量，基于统计的同时检测到携带中枢神经系统来源标志物和非AD认知障碍相关的标志物的EV的数量占总EV的数量的比值来鉴别诊断受试者是否罹患非AD认知障碍。
在本申请的一个具体的实施方式中，同时检测到携带中枢神经系统来源标志物和认知障碍相关的标志物的EV的数量占总EV生物样本的数量的比值，在健康受试者和认知障碍(AD和非AD)受试者中存在显著差异。例如与健康受试者相比，该比值在AD和非AD受试者中显著降低。
进一步地，诊断模块基于检测的粒径来区分罹患认知障碍的受试者罹患阿尔兹海默病或罹患非AD认知障碍，其中所述粒径为分布极值对应的粒径。具体来说，通常将检测到中枢神经系统来源标志物和AD相关的标志物两者的EV称为双阳性EV，基于双阳性EV的数量和粒径来区分罹患认知障碍的受试者罹患AD或罹患非AD认知障碍。在本申请中，分布极值对应的粒径是指颗粒分布数量最多的粒径大小。在一个具体的实施方式中，分布极值对应的粒径是通过纳米流式检测仪及相关纳米颗粒流式分析仪测量得到的。
在本申请中，通过中枢神经系统来源标志物和非AD相关的标志物的EV的数量占总EV的数量的比值即可判断受试者是否罹患认知障碍。但是将认知障碍中的阿尔兹海默病和非AD认知障碍区分则需要进一步基于所检测到的EV的中枢神经系统来源标志物和EV的非AD认知障碍相关的标志物的分布极值对应的粒径。
在本申请的一个具体的实施方式中，同时检测到携带中枢神经系统来源标志物和认知障碍相关的标志物的分布极值对应的粒径，在AD和非AD认知障碍受试者中存在显著差异。例如与非AD受试者相比，该粒径在AD受试者中显著降低。
进一步地，本申请的系统还包括：富集模块，其对获取受试者的生物体液进行预处理以富集生物体液中的EV。
所述富集模块还可以包括用于对富集的EV进行筛选，以进一步提高所得到的EV的准确度。
本申请还涉及一种用于检测非AD认知障碍的组合物，其包括：用于靶向中枢神经系统来源标志物的抗体，以及用于靶向非AD认知障碍相关的标志物的抗体。
本申请还涉及一种用于检测受试者非AD认知障碍的试剂盒，其包括：用于检测受试者生物体液中EV的中枢神经系统来源标志物的试剂，以及用于检测受试者生物体液中EV的非AD认知障碍相关的标志物的试剂。
在一个具体的实施方式中，用于检测受试者生物体液中的中枢神经系统来源标志物的试剂和用于检测受试者生物体液中的非AD认知障碍相关的标志物的试剂为本申请所描述的上述组合物。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，生物体液为血液、血清、血浆、唾液、尿液、淋巴液、精液或乳汁。优选的生物体液是血液、血清、血浆、唾液或尿液。用于获取受试者生物体液的方法可以是任何本领域技术人员已知的方法。本领域技术人员可以针对所选用的生物体液的方法来从受试者中获取。
如在本文中所涉及的细胞外囊泡(Extracellular Vesicle，EV)是指从细胞膜上脱落或者从细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从40nm到1000nm不等。EV主要由微囊泡(Microvesicles，MVs)和外泌体(Exosomes，Exs)组成，微囊泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为100nm～1000nm。外泌体(Exosomes)由细胞内的多泡小体(Multivesicular Bodies)与细胞膜融合后以外泌体的形式释放到细胞外，直径约为30～150nm，可以由众多不同类型的细胞所释放，并且执行不同的细胞功能，包括细胞间通讯、抗原呈递、和蛋白质以及核酸的转移。EV广泛存在于细胞培养上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中，携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。在一个具体的实施方式中，优选所述EV为神经元来源的EV、星形胶质细胞来源的EV、少突胶质细胞来源的EV或小胶质细胞来源的EV。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，获取受试者的生物体液并对其进行预处理以富集生物体液中的EV的方法可以为离心、超速离心、超滤管过滤、聚合沉降或特异性抗体捕获。在本文中，离心、超速离心、超滤管过滤、聚合沉降或特异性抗体捕获均具有本领域技术人员可以理解的含义，本领域技术人员可以根据待获取的EV来选择合适的方法。
在本申请的方法或系统的一个实施方式中，采用超速离心的方法来从生物体液中富集EV，尤其是富集神经元来源的EV、星形胶质细胞来源的EV、少突胶质细胞来源的EV或小胶质细胞来源的EV。
在本申请的方法或系统的一个实施方式中，采用普通离心或超滤管过滤来富集EV，尤其是富集神经元来源的EV、星形胶质细胞来源的EV、少突胶质细胞来源的EV或小胶质细胞来源的EV。
在本申请的方法或系统的一个实施方式中，采用脂质探针对富集EV，尤其是富集神经元来源的EV、星形胶质细胞来源的EV、少突胶质细胞来源的EV或小胶质细胞来源的EV进行筛选。在本申请的方法或系统的一个实施方式中，脂质探针的序列为TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO:1)；5'端修饰：5`6-CY3；3'端修饰：3`Cholesteryl。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，所述中枢神经系统来源标志物是来源于如下神经元或细胞的生物标志物：成熟神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、未成熟神经元、施旺细胞、放射状胶质细胞、中间前体细胞、谷氨酸能神经元、GABA能神经元、多巴胺能神经元、5-羟色胺能神经元、胆碱能神经元。在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，优选中枢神经系统来源标志物是神经元来源的生物标志物。在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，优选中枢神经系统来源标志物是星形胶质细胞和/或少突胶质细胞来源的生物标志物。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，所述中枢神经系统来源标志物为位于中枢神经系统来源的EV表面的标志物。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，所述中枢神经系统来源的标志物为G蛋白偶联受体162(G Protein-Coupled Receptor162,GPR162)、γ-氨基丁酸A型受体亚基δ(Gamma-Aminobutyric Acid Type AReceptor Subunit Delta,GABRD)、γ-氨基丁酸A型受体亚基δ(Gamma-Aminobutyric Acid Type A Receptor SubunitDelta,GABRD)、乙酰胆碱转移酶(Choline O-acetyltransferase，CHAT)、谷氨酸离子型受体NMDA型亚基2D(Glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2D，NR2D)中的一种或两种以上。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，所述中枢神经系统来源的标志物为G蛋白偶联受体162(G Protein-Coupled Receptor162,GPR162)。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，所述中枢神经系统来源的标志物为γ-氨基丁酸A型受体亚基δ(Gamma-Aminobutyric Acid Type A ReceptorSubunit Delta,GABRD)。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，所述中枢神经系统来源的标志物为G蛋白偶联受体162(G Protein-Coupled Receptor162,GPR162)和γ-氨基丁酸A型受体亚基δ(Gamma-Aminobutyric Acid Type A Receptor Subunit Delta,GABRD)。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，所述中枢神经系统来源的标志物为乙酰胆碱转移酶(Choline O-acetyltransferase，CHAT)。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，所述中枢神经系统来源的标志物为谷氨酸离子型受体NMDA型亚基2D(Glutamate ionotropic receptor NMDAtype subunit 2D，NR2D)。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，所述中枢神经系统来源的标志物为乙酰胆碱转移酶(Choline O-acetyltransferase，CHAT)和谷氨酸离子型受体NMDA型亚基2D(Glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2D，NR2D)。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，所述非AD认知障碍相关的标志物为第217位磷酸化tau(pTau217)蛋白。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，所述中枢神经系统来源的标志物为GPR162蛋白，所述非AD认知障碍相关的标志物为pTau217蛋白。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，所述中枢神经系统来源的标志物为GABRD蛋白，所述非AD认知障碍相关的标志物为pTau217蛋白。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，所述中枢神经系统来源的标志物为GPR162蛋白和GABRD蛋白，所述非AD认知障碍相关的标志物为pTau217蛋白。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，所述中枢神经系统来源的标志物为CHAT蛋白，所述非AD认知障碍相关的标志物为pTau217蛋白。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，所述中枢神经系统来源的标志物为NR2D蛋白，所述非AD认知障碍相关的标志物为pTau217蛋白。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，所述中枢神经系统来源的标志物为CHAT蛋白和NR2D蛋白，所述非AD认知障碍相关的标志物为pTau217蛋白。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，检测受试者生物体液中的中枢神经系统来源标志物的步骤包括：使受试者的EV与经标记的、与中枢神经系统来源标志物特异性反应的抗体进行反应，以及检测反应后标记信号的强度以判断携带中枢神经系统来源标志物的EV的存在及含量；所述非AD认知障碍相关的标志物为蛋白质，检测受试者生物体液中的非AD认知障碍相关的标志物的步骤包括：使受试者的EV与经标记的、与非AD认知障碍相关标志物特异性反应的抗体进行反应，以及检测反应后标记信号的强度以判断携带非AD认知障碍相关标志物的EV的存在及含量。
进一步，在具体的实施方式中，优选时受试者的EV同时与经标记的、与中枢神经系统来源标志物特异性反应的抗体和经标记的、与非AD认知障碍相关标志物特异性反应的抗体进行反应，从而高效地追踪到双标和/或多标阳性的EV。
进一步，在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，还包括统计检测到中枢神经系统来源标志物和非AD认知障碍相关的标志物两者的EV的数量，和测量检测到中枢神经系统来源标志物和非AD认知障碍相关的标志物两者的EV的粒径，这样可以在追踪到双标和/或多标阳性的EV之后，还可以充分地考虑这样的EV的数量和/或其粒径，结合这些指标的结果来分析受试者罹患非AD认知障碍的风险。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，所述标记选自以下中的一种或两种以上：荧光标记、同位素标记、酶标记、化学发光剂标记、量子点标记或胶体金标记。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，荧光标记物选自以下中的一种或两种以上：Qdot525、Qdot545、Qdot565、Qdot585、Qdot605、Qdot625、Qdot655、Qdot705、Qdot800、Alexa350、Alexa 405、Alexa488、Alexa 532、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa 594、Alexa647、Alexa700、Alexa750。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，同位素标记、酶标记、化学发光剂标记、量子点标记或胶体金标记均可以采用本领域技术人员所熟知的方法。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，检测反应后标记信号的强度以判断中枢神经系统来源标志物的存在及含量可以采用，例如免疫测定，如ELISA、Luminex、MSD、Quanterix、Singulex、eCL8000、Cobas是用于测量蛋白质生物标志物的优选方法。
在本申请的方法或系统或组合物或试剂盒的具体实施方式中，用于统计检测到携带中枢神经系统来源标志物和非AD认知障碍相关的标志物两者的EV的数量，和/或测量检测到携带中枢神经系统来源标志物和非AD认知障碍相关的标志物两者的EV的粒径的检测仪器，包括但不限于粒度分析仪、纳米流式细胞仪。例如，利用纳米颗粒追踪技术检测EV的粒径，以及利用纳米流式分析技术检测上述双阳性的EV的数量。
在本申请的一个具体的实施方式中，涉及一种用于检测非AD认知障碍的组合物，其包括：用于靶向中枢神经系统来源标志物的抗体，以及用于靶向非AD认知障碍相关的标志物的抗体。
在本申请的一个具体的实施方式中，所述用于靶向中枢神经系统来源标志物的抗体和所述用于靶向非AD认知障碍相关的标志物的抗体是经标记的抗体，优选所述标记选自以下中的一种或两种以上：荧光标记、同位素标记、酶标记、化学发光剂标记、量子点标记或胶体金标记。
在本申请的一个具体的实施方式中，一种用于检测非AD认知障碍的组合物，其包括：用于靶向GPR162蛋白的抗体，以及用于靶向tau(pTau217)蛋白的抗体。
在本申请的一个具体的实施方式中，一种用于检测非AD认知障碍的组合物，其包括：用于靶向GABRD蛋白的抗体，以及用于靶向tau(pTau217)蛋白的抗体。
本申请涉及一种用于检测受试者非AD认知障碍的试剂盒，其包括：用于检测受试者生物体液中的中枢神经系统来源标志物的试剂，以及用于检测受试者生物体液中EV的非AD认知障碍相关的标志物的试剂。所述用于检测受试者生物体液中EV的中枢神经系统来源标志物的试剂和用于检测受试者生物体液中的非AD认知障碍相关的标志物的试剂可以为上述本申请涉及的组合物。
在本申请涉及的试剂盒中，还包括用于获取受试者的EV的试剂和装置。其中，用于获取EV的试剂和装置可以包括本领域技术人员所知的常用的试剂盒和装置。
利用本申请的方法、系统、试剂盒以及组合物，即使仅仅利用受试者的少量外周体液就能够诊断受试者是否罹患非AD认知障碍进行诊断及鉴别。
利用本申请的方法、系统、试剂盒以及组合物能够有效地从外周体液中富集且特异性地标记能够反映非AD认知障碍变化的生物标志物，相比直接检测外周体液中的疾病相关标志物，诊断效果更优。
利用本申请的方法、系统、试剂盒以及组合物可以有效地利用外周体液来进行检测，从而可以避免创伤性地获取受试者的脑脊液，大大降低受试者的取样风险、大大减轻检测的困难程度、大大增加检测的临床应用性和推广性。利用本申请的方法、系统、试剂盒以及组合物，能够同时检测中枢神经系统来源标志物与疾病相关标志物，降低样本检测时间，更加高效、便捷。
实施例
实施例1
超速离心对EV进行富集
1.来自受试者的血浆在37℃迅速解冻(2min内)，涡旋混匀；
2.血浆样品(>300μL)在4℃，2,000×g条件下离心15min，取上清；
3.接着在4℃，12,000×g条件下离心30min，取上清；
4.吸取100μL离心后的血浆至1.5mL超离管中，并加入900μL 0.22μm过滤的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)，混匀；
5.在4℃，100,000×g条件下，超速离心70min；
6.弃去约900μL上清，向剩余液体中(约100μL)加入200μL PBS(0.22μm滤膜过滤)，使用200μL量程移液器吹吸200次，重悬沉淀；
7.向重悬后的液体中加入700μL PBS(0.22μm滤膜过滤)，混匀；
8.在4℃，100,000×g条件下，超速离心70min；
9.弃去上清，保留约150μL液体，使用200μL量程移液器吹吸200次，重悬沉淀；
10.分装，保存至-80℃待用。
实施例2
对超速离心获得的EV进行表征
使用Nanofcm对超速离心获得的EV的粒径及浓度进行表征。
1.首先使用250nm荧光质控球、68～155nm粒径质控球(购自厦门福流生物科技有限公司)对Nanofcm进行调试，使其荧光检测、粒径区分处于最佳状态(图1A、1B)。其中，图1A显示单颗粒纳米流式细胞仪使用250nm荧光质控球的质控结果。散射光通道(SS)，绿色荧光通道(FITC)和红色荧光通道(PC5)均处于信号值较高(第1列)、信号峰均一(第2，3列)的状态；说明单颗粒纳米流式细胞仪对荧光信号的检测已调整至较好的状态。图1B显示单颗粒纳米流式细胞仪使用68～155nm粒径质控球的质控结果。粒径质控球是由4种粒径不同的球混合而成，如图1B所示，单颗粒纳米流式细胞仪能够精确检测到该粒径球中4种不同粒径群的颗粒；说明该仪器对粒径信号的检测已调整至较好的状态。
2.取超离获得的细EV，根据具体情况，将其稀释至仪器记录颗粒数4000-8000个/min为佳。
3.根据Nanofcm记录结果，对超离获得的细EV的粒径分布、浓度情况进行分析(图1C)。
实施例3
利用标记方法标记用于检测生物标志物的抗体
使用的试剂：
利用Alexa Fluro荧光标记kit，来标记中枢神经系统来源EV生物标志物的抗体和相关阿尔茨海默病生物标志物的抗体。其中，中枢神经系统来源EV生物标志物的抗体为GPR162和GABRD多克隆抗体。阿尔茨海默病生物标志物的抗体为pTau217多克隆抗体。其中，标记GPR162和GABRD多克隆抗体的试剂为ZenonTM Alexa FluorTM 488Rabbit IgGLabeling Kit，购买自Thermo Fisher Scientific；标记pTau217多克隆抗体的试剂为ZenonTM Alexa FluorTM 647Rabbit IgG Labeling Kit，购买自Thermo FisherScientific。
1.样本封闭
(1)取10μL利用上述方法经超速离心分离的EV至0.6mL离心管；
(2)加入10μL 2％BSA溶液(0.22μm滤膜过滤)，混匀；
(3)室温(25-26℃)封闭1小时，以去除非特异性结合；
(4)加入10μL PBS(0.22μm滤膜过滤)稀释，终止封闭。
2.样本标记
本实验涉及中枢神经系统特异性标志物GPR162和GABRD；疾病相关标志物抗体pTau217。使用ZenonTM Alexa FluorTM 488Rabbit IgG Labeling Kit标记GPR162和GABRD，ZenonTM Alexa FluorTM 647Rabbit IgG Labeling Kit标记pTau217；
(1)取1μg相应标志物的抗体，用PBS(0.22μm滤膜过滤)稀释至5μL(0.2μg/μL)；
(2)加入5μL ZenonTM Alexa FluorTM Labeling Kit A液，混匀后室温(25-26℃)避光孵育20min；
(3)向(2)步骤的溶液中加入3μL(3μg)ZenonTM Alexa FluorTM Labeling Kit B液(B液稀释至1μg/μL)，混匀后室温(25℃)避光孵育10min，以淬灭游离荧光；
(4)加入PBS(0.22μm滤膜过滤)稀释至总体积50μL；
(5)取5μL ZenonTM Alexa FluorTM 647Rabbit IgG Labeling Kit标记的pTau217于步骤1封闭完毕的样本中，混匀后室温(25-26℃)避光孵育5min；
(6)加入3μL ZenonTM Alexa FluorTM 488Rabbit IgG Labeling Kit标记的GPR162或GABRD于步骤(5)样本中，混匀后4℃避光孵育过夜；
3.样本固定
(1)次日，在标记完毕的样本中加入20μL 4％PFA(0.22μm滤膜过滤)，混匀后室温(25-26℃)避光孵育20min；
(2)加入50μL PBS(0.22μm滤膜过滤)稀释固定后的样本，待用。
4.检测
使用NanoFCM纳米流式分析仪进行检测标记信号强度与粒径分布，从而确定相关生物标志物的存在及含量。
实施例4
在大量临床样本中检测上述生物标记物的鉴别诊断能力
1.发现队列
分别获取年龄、性别匹配的健康对照(NC组)28例、阿尔茨海默病受试者(AD组)44例、非AD-认知障碍(NAD组)31例的血浆样本，作为发现队列，利用上述实施例3方法进行实验。
利用纳米流式分析仪NanoFCM分别检测GPR162、GABRD单荧光标记、pTau217单荧光标记、GPR162和pTau217双荧光标记的EV数量、以及GABRD和pTau217双荧光标记的EV数量，计算其占总EV数量的比值，检测其区分NC、AD、NAD的能力。
发现队列中，与NC组和NAD组相比，AD组血浆中GPR162蛋白阳性EV占总EV数量的比值有下降的趋势，但这种差异无统计学显著性(图2A)；与NC组相比，AD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比值显著降低(****,p<0.0001)；与NC组相比，NAD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比值也显著降低(***,p<0.001)(图2B)；血浆中GPR162蛋白和pTau217蛋白双阳性EV占总EV数量的比值在NC组VS AD组(****,p<0.0001)、NC组VS NAD组(***,p<0.001)均存在显著性差异(图2C)。通过受试者工作特征曲线(receiver operatingcharacteristic curve,ROC)分析进行诊断效率评估，GPR162蛋白和pTau217蛋白双标的曲线下面积(area under curve,AUC)为0.85(图2D)。
发现队列中，与NC组和NAD组相比，AD组血浆中GABRD蛋白阳性EV占总EV数量的比值有下降的趋势，但这种差异无统计学显著性(图2E)；与NC组相比，AD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比值显著降低(*,p<0.01)(图2F)；血浆中GABRD蛋白和pTau217蛋白双阳性EV占总EV数量的比值在NC组VS AD组(****,p<0.0001)、NC组VS NAD组(***,p<0.001)均存在显著性差异(图2G)。通过ROC分析进行诊断效率评估，GABRD蛋白和pTau217蛋白双标的曲线下面积(area under curve,AUC)为0.85(图2H)。
使用逻辑回归分析Enter方法纳入GPR162+pTau217和GABRD+pTau217数据，AUC为0.91(NC VS AD)(图2I)。
经分析，依靠GPR162+pTau217或者GABRD+pTau217双阳性EV占总EV数量的比值，虽然能够很好地区分NC和AD患者；但是对AD和NAD的鉴别诊断能力有限。因此，将粒径分布作为参考因素，探索出使用极值粒径来对AD和NAD进行区分；即：不同实验组样本，目标蛋白阳性的囊泡的粒径分布可能存在差异；我们将目标蛋白阳性囊泡数目最大值对应的粒径进行分析，结果如下：
发现队列中，与NAD组相比，AD组血浆中GPR162蛋白和pTau217蛋白双阳性EV分布极值对应的粒径显著降低(***,p<0.001)(图3A)；AD组血浆中GABRD蛋白和pTau217蛋白双阳性EV分布极值对应的粒径也显著降低(**,p<0.01)(图3B)；使用逻辑回归分析Enter方法纳入GPR162+pTau217和GABRD+pTau217分布极值粒径数据，AUC为0.82(AD VS NAD)(图3C)。
发现队列的结果显示，血浆中GPR162蛋白和pTau217蛋白双阳性EV占总EV数量的比值以及血浆中GABRD蛋白和pTau217蛋白双阳性EV占总EV数量的比值均具有较好的区分健康对照和阿尔茨海默病的潜力，尤其是采用GPR162+pTau217双阳性EV比例与GABRD+pTau217双阳性EV比例进行联合诊断。对GPR162+pTau217双阳性EV和GABRD+pTau217双阳性EV分布极值粒径进行联合分析，能够较好地鉴别诊断阿尔茨海默病与非AD-痴呆。
紧接着，在样本量更大的验证队列中进行验证。
2.验证队列
分别获取年龄、性别匹配的健康对照(NC组)57例、阿尔茨海默病受试者(AD组)88例、非AD-痴呆(NAD组)62例的血浆样本，作为验证队列，利用上述实施例3方法进行实验。
验证队列中，与NC组和NAD组相比，AD组血浆中GPR162蛋白阳性EV占总EV数量的比值有下降的趋势，但这种差异无统计学显著性(图4A)；与NC组相比，AD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比值显著降低(****,p<0.0001)；与NAD组相比，AD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比值也显著降低(****,p<0.0001)(图4B)；血浆中GPR162蛋白和pTau217蛋白双阳性EV占总EV数量的比值在NC组VS AD组(****,p<0.0001)、AD组VS NAD组(****,p<0.0001)均存在显著性差异(图4C)。通过受试者工作特征曲线(receiveroperating characteristic curve,ROC)分析进行诊断效率评估，GPR162蛋白和pTau217蛋白双标的曲线下面积(area under curve,AUC)为0.74(NC VS AD)(图4D)。
验证队列中，与NC组相比，AD组血浆中GABRD蛋白阳性EV占总EV数量的比值显著下降(***,p<0.001)；与NC组相比，NAD组血浆中GABRD蛋白阳性EV占总EV数量的比值也显著下降(****,p<0.0001)；此外，与AD组相比，NAD组血浆中GABRD蛋白阳性EV占总EV数量的比值显著下降(****,p<0.0001)(图4E)；与NC组相比，AD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比值显著降低(***,p<0.001)；NAD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比值也显著降低(***,p<0.001)(图4F)；血浆中GABRD蛋白和pTau217蛋白双阳性EV占总EV数量的比值在NC组VS AD组(****,p<0.0001)、NC组VS NAD组(****,p<0.0001)、AD组VS NAD组(*,p<0.01)均存在显著性差异(图4G)。通过ROC分析进行诊断效率评估，GABRD蛋白和pTau217蛋白双标的曲线下面积(area under curve,AUC)为0.84(图4H)。
使用逻辑回归分析Enter方法纳入GPR162+pTau217和GABRD+pTau217数据，AUC为0.93(NC VS AD)(图4I)。
与发现队列情况相似，依靠GPR162+pTau217或GABRD+pTau217双阳性EV占总EV数量的比值，虽然能够很好地区分NC和AD患者；但是对AD和NAD的鉴别诊断能力有限。因此，我们依旧将粒径分布作为参考因素，使用极值粒径来对AD和NAD进行区分；我们将目标蛋白阳性囊泡数目最大值对应的粒径进行分析，结果如下：
验证队列中，与NAD组相比，AD组血浆中GPR162蛋白和pTau217蛋白双阳性EV分布极值对应的粒径显著降低(***,p<0.001)(图5A)；AD组血浆中GABRD蛋白和pTau217蛋白双阳性EV分布极值对应的粒径也显著降低(**,p<0.01)(图5B)；使用逻辑回归分析Enter方法纳入GPR162+pTau217和GABRD+pTau217分布极值粒径数据，AUC为0.88(AD VS NAD)(图5C)。
验证队列的结果与发现队列一致，即：血浆中GPR162蛋白和pTau217蛋白双阳性EV占总EV数量的比值以及血浆中GABRD蛋白和pTau217蛋白双阳性EV占总EV数量的比值均具有较好的区分健康对照和阿尔茨海默病的潜力，尤其是采用GPR162+pTau217双阳性EV比例与GABRD+pTau217双阳性EV比例进行联合诊断。对GPR162+pTau217双阳性EV和GABRD+pTau217双阳性EV分布极值粒径进行联合分析，能够较好地鉴别诊断阿尔茨海默病与非AD-痴呆。
综上，实施例4结果表明，采用GPR162+pTau217双阳性EV比例与GABRD+pTau217双阳性EV比例进行联合分析，能够较好地区分健康对照和阿尔茨海默病。对GPR162+pTau217双阳性EV和GABRD+pTau217双阳性EV分布极值粒径进行联合分析，能够较好地鉴别诊断阿尔茨海默病与非AD-痴呆。
实施例5
用PEG8000沉降富集EV
1.来自受试者的血浆在37℃迅速解冻(2min内)，涡旋混匀；
2.血浆样品(>300μL)在4℃，2,000×g条件下离心15min，取上清；
3.接着在4℃，12,000×g条件下离心30min，取上清；
4.吸取10μL离心后的血浆至1.5mL离心管中，加入70μL PBS和20μL 40％PEG8000，充分吹打混匀，室温静置30min；
5.12000g，4℃，离心20min；
6.弃上清，加入100μL PBS重悬，吹打混匀，10μL/管进行分装，保存于-80℃备用。
实施例6
1.样本封闭
(1)取10μL利用上述方法经PEG8000的EV至0.6mL离心管；
(2)加入10μL 2％BSA溶液(0.22μm滤膜过滤)，混匀；
(3)室温(25-26℃)封闭1小时，以去除非特异性结合；
(4)加入10μL PBS(0.22μm滤膜过滤)稀释，终止封闭。
2.样本标记
利用标记方法标记用于检测生物标志物的抗体
使用的试剂：
利用Alexa Fluro荧光标记kit，来标记CHAT、NR2D，以及pTau217的抗体。其中，标记CHAT抗体的试剂为ZenonTM Alexa FluorTM 488Mouse IgG2b Labeling Kit，购买自Thermo Fisher Scientific；标记NR2D抗体的试剂为ZenonTM Alexa FluorTM 488RabbitIgG Labeling Kit，购买自Thermo Fisher Scientific；标记pTau217抗体的试剂为ZenonTMAlexa FluorTM 647Rabbit IgG Labeling Kit，购买自Thermo Fisher Scientific。
(1)取1μg相应标志物的抗体，用PBS(0.22μm滤膜过滤)稀释至5μL(0.2μg/μL)；
(2)加入5μL ZenonTM Alexa FluorTM Labeling Kit A液，混匀后在室温(25-26℃)避光孵育20min；
(3)向(2)步骤的溶液中加入3μL(3μg)ZenonTM Alexa FluorTM Labeling Kit B液(B液稀释至1μg/μL)，混匀后室温(25℃)避光孵育10min，以淬灭未结合的游离荧光素；
(4)加入PBS(0.22μm滤膜过滤)稀释至总体积50μL；
(5)取5μL ZenonTM Alexa FluorTM 647Rabbit IgG Labeling Kit标记的pTau217于步骤1封闭完毕的样本中，混匀后室温(25-26℃)避光孵育5min；
(6)加入3μL ZenonTM Alexa FluorTM 488Rabbit IgG Labeling Kit标记的CHAT或NR2D于步骤(5)样本中，混匀后4℃避光孵育过夜；
3.探针孵育
使用试剂：合成DNA anchor，其序列为TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ IDNO:1)；5'端修饰：5`6-CY3；3'端修饰：3`Cholesteryl。该脂质探针能够与EV膜结合，探针标记阳性的颗粒被认为是真正的EV；该方法进一步提高了EV标记的科学性和准确度。
(1)次日，加入62μL PBS+5μL脂质探针(脂质探针工作液浓度10μM)(反应体积100ul，探针终浓度500nM)，4℃避光孵育1h。
(2)在标记完毕的样本中加入100μL 4％PFA(0.22μm滤膜过滤)，混匀后室温(25-26℃)避光孵育20min；
(3)用PBS稀释到合适浓度上机，标准：用CytoFLEX检测，每秒颗粒数小于1万个颗粒。在脂质探针门下收集50000个颗粒(此情况下总颗粒数约为100000；换言之，使用脂质探针对实施例5得到颗粒进行筛选，其中真正的EV约为50％)。4.检测
使用CytoFLEX的VSSC模式检测脂质探针阳性情况下，相关蛋白标记的阳性比例。
实施例7
在临床样本中检测上述生物标记物的鉴别诊断能力
分别获取年龄、性别匹配的健康对照(NC组)20例、阿尔茨海默病受试者(AD组)20例、非AD-痴呆(NAD组)20例的血浆样本，利用上述实施例6的方法进行实验。
利用CytoFLEX的VSSC模式分别检测CHAT、NR2D单荧光标记、pTau217单荧光标记、CHAT和pTau217双荧光标记的EV数量、以及NR2D和pTau217双荧光标记的EV数量，计算其占脂质探针标记阳性的EV数量的比例，检测其区分NC、AD、NAD的能力。
结果显示，与NC组相比，AD组血浆中CHAT蛋白阳性EV占总EV数量的比例显著降低(***,p<0.001)；与NAD组相比，AD组血浆中CHAT蛋白阳性EV占总EV数量的比例也显著降低(**,p<0.01)(图6A)。与NC组相比，AD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比例显著降低(***,p<0.001)；与NAD组相比，AD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比例也显著降低(**,p<0.01)(图6B)；血浆中CHAT蛋白和pTau217蛋白双阳性EV占总EV数量的比例在NC组VS AD组(***,p<0.001)、AD组VS NAD组(*,p<0.05)均存在显著性差异(图6C)。通过ROC分析进行诊断效率评估，CHAT蛋白和pTau217蛋白双标的AUC分别为0.88(NC VS AD)(图6D)，AUC＝0.82(AD vs NAD)(图6E)。
此外，与NC组相比，AD组血浆中NR2D蛋白阳性EV占总EV数量的比例显著降低(***,p<0.001)；与NAD组相比，AD组血浆中NR2D蛋白阳性EV占总EV数量的比例也显著降低(***,p<0.001)(图6F)。与NC组相比，AD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比值显著降低(****,p<0.0001)；与NAD组相比，AD组血浆中pTau217蛋白阳性EV占总EV数量的比例也显著降低(***,p<0.001)(图6G)；血浆中NR2D蛋白和pTau217蛋白双阳性EV占总EV数量的比例在NC组VS AD组(****,p<0.0001)、NC组VS NAD组(***,p<0.001)均存在显著性差异(图6H)。通过ROC分析进行诊断效率评估，NR2D蛋白和pTau217蛋白双标的AUC分别为0.82(NC VS AD)(图6I)，0.69(AD vs NAD)(图6J)。
使用逻辑回归分析Enter方法纳入CHAT+pTau217和NR2D+pTau217数据，AUC＝0.96(NC VS AD)(图6K)；AUC＝0.88(AD VS NAD)(图6L)。
经分析，依靠CHAT+pTau217和NR2D+pTau217双阳性EV占总EV数量的比例，不仅能够很好地区分NC和AD患者；也能有效鉴别诊断AD和NAD。
以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。
Claims (21)
1.一种用于诊断及鉴别诊断非阿尔兹海默病(Alzheimer’s Disease,AD)认知障碍的系统，其包括：
第一检测模块，其用于检测受试者体液中细胞外囊泡(Extracellular Vesicle,EV)的中枢神经系统来源生物标志物，以确认携带中枢神经系统来源特异性标志物的EV的数量和粒径；
第二检测模块，其用于检测受试者体液中EV的非AD认知障碍相关的标志物以确认携带非AD认知障碍相关的标志物的EV的数量和粒径；
诊断模块，其基于第一检测模块和第二检测模块分别获得的中枢神经系统来源标志物和非AD认知障碍相关的标志物的检测结果来诊断受试者是否罹患非AD认知障碍。
2.根据权利要求1所述的系统，其中，
所述第一检测模块和所述第二检测模块同时检测受试者体液中的中枢神经系统来源标志物和检测受试者体液中的非AD认知障碍相关的标志物；或者
所述第一检测模块和所述第二检测模块为同一模块，其同时检测受试者体液中的中枢神经系统来源标志物和检测受试者体液中的非AD认知障碍相关生物标志物。
3.根据权利要求1或2所述的系统，其还包括：
富集模块，其用于获取受试者的体液并对其进行预处理以富集体液中的EV。
4.根据权利要求3所述的系统，其中，所述富集模块还包括用于对富集的EV进行筛选。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的系统，其中，
诊断模块统计同时检测到携带中枢神经系统来源生物标志物和非AD认知障碍相关的生物标志物的EV的数量，基于统计的同时检测到携带中枢神经系统来源标志物和非AD认知障碍相关的标志物的EV的数量占总EV的数量的比值来诊断受试者是否罹患非AD认知障碍。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的系统，其中，所述粒径为相关蛋白阳性EV分布数量最多处所对应的粒径，诊断模块基于检测的粒径来鉴别诊断出罹患认知障碍的受试者罹患非AD认知障碍而不是AD。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，其中，所述EV为神经元来源的EV、星形胶质细胞来源的EV、少突胶质细胞来源的EV或小胶质细胞来源的EV。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的系统，其中，所述体液选自血液、血清、血浆、唾液、尿液、淋巴液、精液或乳汁中的一种或两种以上。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的系统，其中，所述中枢神经系统来源标志物为G蛋白偶联受体162(G Protein-Coupled Receptor 162,GPR162)、γ-氨基丁酸A型受体亚基δ(Gamma-Aminobutyric Acid Type A Receptor Subunit Delta,GABRD)、乙酰胆碱转移酶(Choline O-acetyltransferase，CHAT)、谷氨酸离子型受体NMDA型亚基2D(Glutamateionotropic receptor NMDA type subunit 2D，NR2D)中的一种或两种以上。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的系统，其中，所述非AD认知障碍相关的标志物为第217位磷酸化tau(pTau217)蛋白。
11.根据权利要求3所述的系统，其中，所述富集模块具有进行以下步骤中的一种或两种以上的子模块：离心、超速离心、超滤管过滤、聚合沉降、特异性抗体捕获。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的系统，其中第一检测模块用于使受试者的EV与经标记的、与中枢神经系统来源标志物特异性反应的抗体进行反应，以及检测反应后标记信号的强度以判断具有中枢神经系统来源生物标志物的EV的存在及含量。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的系统，其中，第二检测模块用于使受试者的EV与经标记的、与非AD认知障碍相关标志物特异性反应的抗体进行反应，以及检测反应后标记信号的强度以判断具有非AD认知障碍相关标志物的EV的存在及含量。
14.根据权利要求12或13所述的系统，其中，所述标记选自以下中的一种或两种以上：荧光标记、同位素标记、酶标记、化学发光剂标记、量子点标记或胶体金标记。
15.一种用于诊断及鉴别诊断非AD认知障碍的组合物，其包括：
用于靶向中枢神经系统来源标志物的抗体，以及
用于靶向非AD认知障碍相关的标志物的抗体。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中，所述中枢神经系统来源标志物为G蛋白偶联受体162(G Protein-Coupled Receptor 162,GPR162)、γ-氨基丁酸A型受体亚基δ(Gamma-Aminobutyric Acid Type A Receptor Subunit Delta,GABRD)、乙酰胆碱转移酶(CholineO-acetyltransferase，CHAT)、谷氨酸离子型受体NMDA型亚基2D(Glutamate ionotropicreceptor NMDA type subunit 2D，NR2D)中的一种或两种以上。
17.根据权利要求15或16所述的组合物，其中，所述非AD认知障碍相关的标志物为第217位磷酸化Tau(pTau217)蛋白。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的组合物，其中，所述用于靶向中枢神经系统来源标志物的抗体和所述用于靶向非AD认知障碍相关的标志物的抗体是经标记的抗体，优选所述标记选自以下中的一种或两种以上：荧光标记、同位素标记、酶标记、化学发光剂标记、量子点标记或胶体金标记。
19.一种用于检测受试者非AD认知障碍的试剂盒，其包括：
用于检测受试者生物体液中EV的中枢神经系统来源标志物的试剂，以及
用于检测受试者生物体液中EV的非AD认知障碍相关的标志物的试剂。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中，所述用于检测受试者生物体液中EV的中枢神经系统来源标志物的试剂和用于检测受试者生物体液中EV的非AD认知障碍相关的标志物的试剂为权利要求15-18中任一项所述的组合物。
21.根据权利要求19所述的试剂盒，还包括：
用于获取受试者的生物样本的试剂和装置，优选用于获取受试者EV的试剂和装置。
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