CN116785501A - 促进心脏组织修复的modRNA转染改造的细胞及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及促进心脏组织修复的modRNA转染改造的细胞及其应用。本发明首次尝试应用结合细胞治疗和新型mRNA技术的新治疗方法来更好地促进心脏再生，在细胞植入前用VEGF mRNA转染iPSC‑CMs来控制VEGF短暂的过度分泌及释放，证实可提高移植细胞的存活率，刺激原位细胞增殖，促进在移植部位形成稳定的血管网，显著改善心脏功能，修复心脏损伤的效率很高。本发明为组织工程心脏再生领域中如何促进移植细胞的存活提供了可靠的解决方案，并且有可能促进modRNA在组织工程领域进一步的广泛应用，最终为心脏组织修复提供了一种更有效的治疗手段。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及促进心脏组织修复的modRNA转染改造的细胞及其应用。
背景技术
心肌缺血事件引发的心衰(heart failure，HF)在全球范围内发病率高，且目前的临床治疗策略对预后不良患者治疗效果差。对这部分患者，细胞治疗已被证明是一种潜在的、效果显著的、新颖的治疗方法。目前的临床前研究和临床研究已使用骨骼肌成肌细胞(SMs)、间充质干细胞(MSCs)、骨髓单核细胞(BMMNCs)、内皮祖细胞(EPCs)和人诱导多潜能干细胞来源的心肌细胞(hiPSC-CMs)来修复受损心肌组织、增强心脏整体功能。据报道，这些细胞治疗方法的主要作用机制是通过可溶性因子的释放来推动心脏修复过程，或者，通过移植细胞植入宿主心肌而部分恢复心肌泵功能。细胞治疗修复心脏在应用中始终存在着一些问题，其中就包括了移植细胞存活率低。因此，提高移植细胞存活率将极大地改善该治疗方法的效果。
为了解决细胞治疗中移植细胞的移植效率、存活率低这一问题，研究人员们曾试图将移植细胞与改良水凝胶、工程心脏组织(EHT)及工程心肌(EHM)等生物材料结合。此外，研究人员们还试图通过靶向调控损伤部位的炎性细胞因子及活性氧来控制该部位炎症反应水平，以此提高移植细胞存活率。其他可提高细胞活性和移植效率的方法还包括基因工程方法(如应用慢病毒在基因层面上改良种子细胞)，或使用细胞因子或药物抑制剂对种子细胞进行预处理，抑制移植后促凋亡途径的激活。
近期，可在体内生成目标蛋白的化学合成修饰信使核糖核酸(chemicallysynthetic modified message RNA，modRNA)作为心脏治疗的一种新型工具成为了研究热点。瞬时表达的化学修饰mRNAs(modRNAs)解决了传统基因治疗中存在的安全问题，例如，免疫原性和基因整合。
目前未见结合细胞治疗和新型mRNA技术的新治疗方法治疗心衰的报道，其效果尚难预知。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，第一方面提供一种用于促进心脏组织修复的细胞，所述细胞转染有modRNA，所述modRNA用于翻译促进心脏组织修复的蛋白或多肽。
在一个或多个实施方案中，所述细胞为骨骼肌成肌细胞、间充质干细胞、骨髓单核细胞、内皮祖细胞或心肌细胞。进一步地，在一个或多个实施方案中，所述心肌细胞由干细胞分化而来，所述干细胞的来源为胚胎干细胞、骨髓干细胞、周边血干细胞、脐带干细胞、脐带血干细胞或人诱导多潜能干细胞。
在一个或多个实施方案中，所述促进心脏组织修复的蛋白或多肽为VEGF、IGF-1、bFGF或PDGF。优选地，所述促进心脏组织修复的蛋白或多肽为VEGF，VEGF modRNA的序列如SEQ ID NO:1所示，其中尿苷都被N1-甲基假尿苷替代。
在一个或多个实施方案中，所述转染的方式为脂质体转染、纳米颗粒介导、粒子轰击、微注射或电穿孔。
本发明第二方面提供一种促进心脏组织修复的细胞的制备方法，包含使modRNA转染细胞的步骤，所述modRNA用于翻译促进心脏组织修复的蛋白或多肽。
本发明第三方面提供如上任一个实施方案所述的细胞在制备促进心脏组织修复的产品中的应用。
在一个或多个实施方案中，所述促进心脏组织修复包括改善或治疗心脏损伤。进一步地，在一个或多个实施方案中，所述心脏损伤是由冠状动脉疾病、心肌梗死、冠心病、心肌炎、感染或外伤引起的。
本发明的有益效果为：
细胞治疗是一种新型治疗方法，可以在心肌梗死或心脏损伤后促进心脏组织修复。然而，促进心脏再生的心肌细胞植入后存在存活率差及移植率低的问题。移植细胞是否能存活由许多因素共同决定，梗死区的氧供不足是影响其存活的主要因素之一。先前的心梗动物实验发现，VEGF可以减少心肌损伤、诱导血管新生。本申请首次尝试应用结合细胞治疗和新型mRNA技术的新治疗方法来更好地促进心脏再生。我们通过在植入前用VEGF mRNA转染iPSC-CMs来控制VEGF短暂的过度分泌及释放。实验证明，VEGF mRNA转染的iPSC-CMs提高了移植细胞的存活率，同时也在移植部位形成了稳定的血管网，修复心脏损伤的效率很高。另外，RNA转录组学数据及KEGG通路分析表明，VEGF mRNA转染iPSC-CMs的实验组中，PI3K-Akt信号通路和AGE-RAGE信号通路显著上调。iPSC-CMs中VEGF的过度表达在刺激原位细胞增殖的同时，还能通过改善移植物血管新生情况而部分解决梗死区氧供不足的问题。本研究为组织工程心脏再生领域中如何促进移植细胞的存活提供了可靠的解决方案，并且有可能促进modRNA在组织工程领域进一步的广泛应用，最终为心脏组织修复提供了一种更有效的治疗手段。
附图说明
图1：iPSC-CMs分化过程及modRNA转染后的特征。A：iPSC-CMs分化过程；B：第18天iPSC-CMs免疫荧光染色鉴定，比例尺：25μm；C：第18天iPSC-CMs分化效率的流式分析；D-G：modRNA转染iPSC-CMs后的转染效率以及目标蛋白分泌情况；D：GFP modRNA转染iPSC-CMs后GFP表达情况，比例尺：200μm；E：GFP modRNA转染iPSC-CMs效率的流式分析；F-G：modVEGF转染iPSC-CMs后，F：新产生的，G：累积的VEGF蛋白浓度(*p<0.05，**p<0.01)；H：iPSC-CMs生长代谢等相关差异基因表达热图，蓝色表示低强度表达，红色表示高强度表达；I：KEGG通路分析中上调和下调最显著的生长代谢相关KEGG通路。
图2：转染VEGF modRNA可显著提高移植iPSC-CMs存活率。A：移植区Masson染色；B-D：心梗B：1周后，MI-iPSC-CMsmodLuc组；C：1周后和D：4周后MI-iPSC-CMsmodVEGF组移植区LaminA+C免疫荧光染色；比例尺：250μm，缩放快照比例尺：25μm；E：实验组和对照组移植区存活细胞统计分析(*p<0.05,**p<0.01)。
图3：移植iPSC-CMs后大鼠心功能的恢复情况。A：各组心梗1周、2周、4周后的M型超声心动图；B-D：各组心梗1周、2周、4周后LVEF统计分析；E-G：各组心梗1周、2周、4周后LVFS统计分析(*p<0.05,**p<0.01)。
图4：心肌梗死手术后及iPSC-CMs治疗后大鼠心肌的形态学分析。A：各组HE染色；B：各组Masson染色；C：各组梗死边缘区及梗死区局部放大图，比例尺：100μm；D：各组心梗面积统计分析；E：各组左室壁厚度的统计分析；F：各组梗死区vimentin免疫荧光染色，标尺：50μm；G：各组梗死区vimentin阳性细胞密度的统计分析(*p<0.05,**p<0.01)。
图5：VEGF modRNA转染有利于iPSC-CMs体内增殖。A-C：A：MI-iPSC-CMsmodLuc组和B：MI-iPSC-CMsmodVEGF组心梗1周后移植区Ki67免疫荧光染色；C：MI-iPSC-CMsmodVEGF组心梗4周后移植区Ki67免疫荧光染色；比例尺：75μm，缩放快照比例尺：25μm；D：心梗1周和4周后实验组和对照组Ki67阳性心肌细胞的统计分析(*p<0.05,**p<0.01)。
图6：VEGF modRNA转染的iPSC-CMs随着移植时间的延长而成熟。A-C：A：MI-iPSC-CMsmodLuc组和B：MI-iPSC-CMsmodVEGF组心梗1周后移植区Cnx43免疫荧光染色；C：MI-iPSC-CMsmodVEGF组心梗4周后移植区Cnx43免疫荧光染色；比例尺：75μm，缩放快照比例尺：7.5μm；D：两细胞治疗实验组心梗1周和4周后Cnx43阳性细胞的统计分析(*p<0.05,**p<0.01)。
图7：modVEGF转染的iPSC-CMs促进大鼠心肌血管化。A-B：A：梗死区各组和B：梗死边缘区各组的α-SMA和CD31免疫荧光染色；比例尺：100μm，局部放大比例尺：15μm。C-D：各组梗死区C：CD31阳性毛细血管密度和D：CD31/α-SMA阳性小动脉密度统计分析；E-F：各组梗死边缘区E：CD31阳性毛细血管密度和F：CD31/α-SMA阳性小动脉密度统计分析(*p<0.05,**p<0.01)。
图8：modRNA转染iPSC-CMs促进心脏修复可用于临床。
图9：iPSCs中多潜能标志物的免疫组织化学染色。表达A：Sox2、B：Oct4、C：TRA-1-60、D：Nanog的iPSCs，比例尺：25μm。
图10：iPSC和iPSC-CMs的分化和鉴定。A：心脏分化各阶段的iPSC，比例尺：500nm。B：iPSC-CMs的透射电镜图，比例尺：500nm。C：膜片钳测量单个心肌细胞的动作电位。
图11：VEGF modRNA转染iPSC-CMs促进功能性血管新生。A：VEGF modRNA转染iPSC-CMs后培养液上清促进内皮细胞成管情况；B：内皮细胞成管情况统计；C：VEGF modRNA转染iPSC-CMs后培养液上清培养内皮细胞的划痕实验，比例尺：500μm；D：划痕实验定量统计分析(*p<0.05,**p<0.01)。
图12AB和图12CDE：modVEGF转染iPSC-CMs后基因表达变化。A：所有差异表达基因的火山图；B：GO聚类分析所有上调差异基因中最显著的30个GO条目；C：KEGG通路分析所有上调差异基因中最显著的20个KEGG通路；D：GO聚类分析所有上调差异基因中最显著的30个GO条目；E：KEGG通路聚类分析所有下调差异基因中最显著的20个KEGG通路。
图13：心肌梗死损伤模型的构建。A：动物实验方案；B：心肌梗死术后的大鼠心脏；C：TTC染色结果；D：28天后心脏横切面梗死面积比较。
图14：转染VEGF modRNA的iPSC-CMs植入心肌利于其原位存活。iPSC-CMs植入A-B：1周后和C：4周后的细胞免疫荧光染色，比例尺：250μm，缩放快照比例尺：25μm。
图15：各组4周后的心脏大体形态。4周后各组心脏大体A：前面观和B：后面观；白色箭头指向后面观的心尖部位。
图16：iPSC-CMsmodVEGF组的心肌移植物4周后仍存活。A：4周后，iPSC-CMsmodVEGF组的大鼠心脏横切面HE染色；B-C：存活移植物放大图；D-E：存活移植物中细胞的形态和肌节结构(右上角放大图像)，黑色箭头指示移植物中的血管，比例尺：20μm。
图17：iPSC-CMs移植后表型分析。A-C：移植1周后，A：MI-iPSC-CMsmodLuc组和B：MI-iPSC-CMsmodVEGF组；C：移植4周后MI-iPSC-CMsmodVEGF组，α-肌动蛋白和肌钙蛋白cTnT的表达情况；比例尺：25μm。D-F：移植1周后，D：MI-iPSC-CMsmodLuc组和E：MI-iPSC-CMsmodVEGF组；F：移植4周后MI-iPSC-CMsmodVEGF组，肌球蛋白MLC2v和肌钙蛋白cTnT的表达情况；比例尺：25μm。
图18：iPSC-CMsmodVEGF组心肌移植物血管新生情况。A-B：iPSC-CMsmodVEGF组细胞移植A：1周后和B：4周后，心肌移植物中α-SMA和CD31的表达情况；比例尺：500μm，放大图比例尺：100μm。
具体实施方式
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法。
实施例
1材料和方法1.1心肌细胞的来源和培养
本研究使用的心肌细胞由人脐血诱导多潜能干细胞(CBiPS)分化而成，原始的CBiPS由李彦欣教授团队(上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心)提供。我们将人诱导多潜能干细胞(hiPSCs)培养在底部铺有matrigel涂层且加有E8培养基的6孔板中。当细胞融合至70％-80％时，进行细胞传代。在新的六孔板每孔加入E8培养基2ml，然后用1:10000EDTA(Gibco)进行传代，传代后的第一个24小时需要在培养基中添加Y27632(STEMCELL)5μM。于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养，培养基每日更换。通过单层分化法，用两种明确的化学物质调节Wnt/β-catenin信号通路，可将hiPSCs诱导分化成CMs。分化前2天，用Accutase消化hiPSCs，再以1x106细胞/孔的密度将hiPSCs接种到底部铺有matrigel涂层的12孔板上，每孔加入E8培养基2ml、Y27632 5μM。分化前1天，更换新的E8培养基2ml。分化当天，用RPMI/B27减胰岛素培养基2ml替代各孔中的E8培养基，待细胞融合后加入CHIR9902112μM，随后hiPSCs开始分化为心肌细胞。根据细胞的具体情况，在30-36h后各孔换上新的RPMI/B27减胰岛素培养基2ml。分化后第3天，各孔换成RPMI/B27减胰岛素培养基1ml、含有5μM Wnt抑制剂IWP2(STEMCELL,72124)的条件培养基1ml。分化后第5天，吸去旧培养基，更换为新的RPMI/B27减胰岛素培养基。从分化后第7天开始，每两天更新RPMI/B27减胰岛素培养基。以上所有细胞均需在37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养。
1.2免疫细胞化学
将细胞分离为单个细胞后接种在底部铺有matrigel涂层的24孔载玻片或玻璃底培养皿上。待细胞贴壁后，用4％多聚甲醛(PFA)室温固定20分钟，0.2％Triton-X100室温浸泡20分钟，再用10％山羊血清(GS)室温封闭2小时。随后，加一抗4℃孵育过夜、二抗室温孵育2小时，检测目标蛋白表达情况。加DAPI(1:10 000,Yeasen)室温染色10分钟，观察细胞核情况。一抗包括Cx43(ab11370,Abcam)、α-SMA(A5228,Sigma)、α-actin(A7811,Sigma)、MLC2V(ab79935,Abcam)、cTnT(15513-1-AP,Proteintech或ab8295,Abcam)、Islet1(39.3F7,DSHB)、Nanog、Oct4、Sox2、tra1-60(MAB4360,Merck_millipore)。用Alexa荧光标记物种特异性的二抗(ab150106,Abcam或ab150073,Abcam)来检测一抗。最后，用共聚焦激光扫描显微镜(Leica TSC SP8)获得图像。
1.3流式细胞分析
根据使用说明，先用人心肌细胞消化液CardioEasy(CELLAPY,CA2012100)将心肌分离为单个细胞，再用eBioscience公司生产的固定和渗透试剂盒进行细胞内染色。用APC标记的cTnT抗体(130-106-689,Miltenyi)直接标记细胞，或用Islet1抗体(39.3F7,DSHB)和Tra-1-60抗体(MAB4360,Merck_millipore)间接标记，然后用Alexa Fluor 488结合驴抗鼠IgG H&L抗体(ab150105，Abcam)和Alexa Fluor 488结合驴抗兔IgG H&L抗体(ab150073,Abcam)标记。采用BD FACSCantoTM流式细胞仪和FlowJo_V10软件进行流式细胞分析。
1.4透射电子显微镜
将分化后第18天的iPSC-CMs经消化后重新培养于6孔板中。24小时后，用4％多聚甲醛固定过夜，然后用10％、30％、50％、70％、90％、100％酒精进行梯度脱水，最后将样本放在通风柜风干。醋酸铀酰将样本室温染色40分钟后，用透射电子显微镜(Hitachi H-7500)获得图像。
1.5电生理记录
iPSC-CMs产生的动作电位是可以检测到，因此，可以记录单个细胞的电生理变化。将心肌细胞消化为单个细胞后重新接种到共聚焦培养皿中(5×104/孔)，在倒置显微镜下用Axopatch700B(Axon Instruments,Inc.,Union City,CA,USA)膜片钳放大器记录所有细胞的电位变化。使用Flaming/Brown Micropipette Puller P97(Sutter Instruments Co,Novato,CA,USA)微型移液枪，在外径为1.5mm的薄壁硼硅酸盐玻璃管(Sutter InstrumentsCo,Novato,CA,USA)中进行实验。经过热抛光和内液填充，移液枪枪头的最终电阻为2-4MΩ。内液配方：(mM)150KCl、2.0MgCl2、5.0EGTA、10HEPES、2.0Na2ATP，外液配方：(mM)130NaCl、5.0KCl、1.0MgCl2、2.0CaCl2、20葡萄糖、10蔗糖、10HEPES。
1.6 modRNA合成
利用T7 RNA聚合酶可以介导线性DNA模板链体外转录为mRNA，该方法制造的mRNA包括了非特异性的5'和3'UTR片段以及一个poly(A)尾。用Ambion MEGAclear旋转柱纯化RNA，再用Antarcti Phosphatase(New England Biolabs)于37℃将RNA处理30分钟，去除残留的5′-磷酸基团。再次对RNA进行纯化，用Nanodrop one(Thermo Scientific)进行定量分析。纯化后，将modRNA以1μg/μl的浓度重悬于10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA中，以供后续研究使用。本研究中，mRNA链上所有的尿苷都被N1-甲基假尿苷(m1ψ)替代。人VEGF-A(165)、GFP、萤火虫荧光素酶modRNA的DNA序列分别如SEQ ID NO:1-3所示，各modRNA的序列分别与SEQ ID NO:1-3相同，仅用U替换T且尿苷都被N1-甲基假尿苷(m1ψ)替代。
1.7 modRNA转染与评价
用MessengerMax Lipofectamine(LIFE TECHNOLOGIES，LMRNA015)将modRNA转染到心肌细胞中。modRNA、MessengerMAX分别用50μl的Opti-MEM培养基稀释，室温孵育5分钟后，将两溶液混合，室温静置15分钟以形成脂质体-modRNA复合物。在Opti-MEM培养基中，用该复合物转染细胞4小时，再用细胞培养基替换转染培养基。根据公司的操作指导，含有hiPSC-CMs的12孔板中，每个孔需加4μg modRNA进行转染。
本研究中，modGFP是分析modRNA转染效率的工具。简单来说，可以先用人心肌细胞消化液CardioEasy(CELLAPY，CA201210)将转染了modGFP的心肌细胞分离成单个细胞，再用BD FACSCantoTM流式细胞仪进行检测分析。
本研究中，首先收集不同时间点(4h、12h、24h、48h、72h、96h、1w)的细胞培养基，通过ELISA实验(R&D系统)来量化VEGF蛋白的总含量、分析其表达动力学，进而评价modVEGF的转染效率。
1.8成管实验和划痕实验
在成管实验中，首先将1×105个人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养于48孔板中，培养基为matrigel(BD)100μl、培养过转染了modLuciferase或modVEGF的心肌细胞的培养基200μl。该处理24小时后，用LEICA DMI3000B显微镜观察并记录三维管状结构的形成情况。用Image-pro plus 6.0计算血管网的数量。所有实验均独立进行，且每组设有5个重复。
在划痕实验中，首先将5x105个HUVEC于6孔板中培养8小时。然后用100μl无菌移液枪的枪头划伤细胞层，清洗后培养24小时，该过程中，培养基为培养过转染了modLuciferase或modVEGF的心肌细胞的条件培养基。使用LEICA DMI3000B显微镜分别在0、12和24小时采集图像，并用Image pro plus 6.0进行结果测量。所有实验均独立进行，且每组设有5个重复。
1.9 RNA测序
照上述转染方案，对分化后第18天的iPSC-CMs分别进行VEGF modRNA转染处理(iPSC-CMsmodVEGF)和Luciferase-modRNA转染处理(iPSC-CMsmodLuc)。转染后培养3天，再用Trizol提取总RNA作为RNA测序的起始样本。然后将总RNA送到Novogene(中国北京)进行测序。我们利用poly-T oligo磁珠将mRNA从总RNA中纯化出来。在第一条链合成反应缓冲液(5X)中，于高温条件下用二价阳离子将mRNA碎片化。先用随机六聚体引物和M-MuLV逆转录酶合成第一条cDNA链，然后用RNaseH降解RNA。随后加入DNA聚合酶I和dNTP合成第二条cDNA链。在核酸外切酶/聚合酶的不断作用下，存在残留物的cDNA两端逐渐转化为钝端。DNA片段3'端腺苷酸化后，形成了具有发夹环结构的接头，利于杂交过程。为优先选择长度为370～420bp的cDNA片段，使用AMPure XP系统(Beckman Coulter，Beverly，USA)纯化库片段。PCR扩增后，用AMPure XP珠纯化PCR产物，进而获得最终库。构建库后，使用Qubit2.0荧光剂和Agilent 2100生物分析仪对样本进行量化检测。随后用qRT-PCR再次检测并量化库，以确保库的质量。库检查合格后，根据有效浓度和目标数据量的要求，将不同的库汇集起来，再用Illumina NovaSeq 6000进行测序。
1.10心肌梗死动物模型与细胞移植
动物管理和实验方案符合上海儿童医学中心动物管理和实验委员会的指导原则。该实验选用体重约200-250g的雄性Sprague-Dawley大鼠(上海杰思捷实验动物有限公司)。首先，将大鼠随机分为五组：a)假手术组：除不结扎冠脉外，其余处理与心肌梗死组相同；b)MI组：使大鼠发生心肌梗死事件，不进行治疗性处理；c)MI-Matrigel组：心肌梗死后于左心室边缘区注射Matrigel-PBS(体积比：1:1)混合液150μl、Y27632 5μM；d)MI-iPSC-CMsmodLuc组：心肌梗死后在左室边缘区注射Matrigel和modLuciferase转染的5×106个CMs(体积比：1:1)混合物150μl、Y27632 5μM；e)MI-iPSC-CMsmodVEGF组：心肌梗死后在左室边缘区注射Matrigel和modVEGF转染的5×106个CMs(体积比：1:1)混合物150μl、Y27632 5μM。采取公认的手术方法构建MI大鼠模型。首先，将大鼠固定于手术台，异氟醚持续麻醉下对其进行气管插管。然后，左胸切口充分暴露心脏，用6-0prolene缝线结扎左冠状动脉前降支，诱发心肌梗死事件。对接受治疗性处理的大鼠，按照各组实验设计，在心肌梗死边缘区三个固定的位点直接心肌注射溶液或细胞。处理结束后关闭胸腔，逐渐停用异氟醚，待动物苏醒。为有效避免免疫排斥反应，本实验在心肌梗死手术前1天至手术后28天期间，对大鼠使用免疫抑制剂：他克莫司0.25mg/kg/天、甲基强的松龙5mg/kg/天，每12小时给药一次。
1.11 TTC染色
TTC染色可提示心肌梗死情况：红色表示该区域心脏组织存活较好，无色表示该区域缺乏血供。在避光、37℃条件下，使用PBS充分溶解TTC 30分钟，得到2％TTC(w/v％)。心肌梗死24小时后处死大鼠，收集其心脏，彻底清洗后于-20℃冰箱冰冻，切出6张厚度为3mm的冰冻切片。预热2％TTC溶液，对冰冻切片避光、37℃染色30分钟。预热好的PBS洗涤三次后，在37℃用预热好的4％PFA固定冰冻切片30分钟。黑色背景成像，Image J分析左心室梗死面积百分比。
1.12超声心动图
分别在心肌梗死手术后1周、2周和4周对大鼠进行超声心动图检查，进而评估、比较各组的心功能。盲法技术员对异氟醚吸入麻醉的大鼠进行经胸超声心动图检查。使用配有MS-250换能器的超声仪器Vevo 2100进行检查。左室射血分数(LVEF)、左室缩短分数(LVFS)等心功能指标由Vevo 2100系统自动计算。
1.13心脏形态学和组织学评价
超声心动图分析实验后，采集心肌梗死手术后1周、4周的大鼠心脏。心脏于4％多聚甲醛(PFA)中固定过夜，再进行酒精梯度脱水、石蜡包埋，然后从心尖向结扎部位每隔500μm进行一次切片。根据公司的操作指导，各组随机选择5张2-4μm厚的切片进行苏木精-伊红染色(Solarbio，中国)和Masson三色染色(Solarbio，中国)。使用Leica DM6000 B显微镜观察心脏形态，并用Image pro plus 6.0计算左室壁厚度、瘢痕组织大小(％)。
在免疫组织化学实验中，首先在柠檬酸缓冲液(pH＝6.0)中对脱蜡心脏切片进行微波抗原提取。用0.2％Triton-X100浸泡切片20分钟，再用10％山羊血清室温封闭1小时。一抗标记组织切片上的靶蛋白，于4℃过夜，然后二抗室温染色2小时，最后使用1:1000DAPI溶液(Yeasen)对细胞核进行室温10分钟的染色。主要的一抗：Ki67(ab16667，Abcam)、CD31(ab182981，Abcam)、Lamin A&C(ab108595，Abcam)、Cx43(ab11370，Abcam)、α-SMA(A5228，Sigma)、α-actinin(A7811，Sigma)、MLC2V(ab79935，Abcam)、cTnT(15513-1-AP，Proteintech或ab8295，Abcam)。二抗由Alexa Fluor 555结合驴抗鼠IgG H&L抗体(1:1000，ab150106，Abcam)和Alexa Fluor 488结合驴抗兔IgG H&L抗体(1:1000，ab150073，Abcam)组成。本研究采用共聚焦激光扫描显微镜(Leica TSC SP8)进行图像记录和分析。
2结果
2.1心脏分化和iPSC-CMs的性能
本研究中，我们假设转染了VEGF modRNA的iPSC-CMs可以提高移植心肌细胞的存活率，促进心肌梗死后心脏功能的恢复。第一步，我们培养iPSCs并将其扩增分化成跳动的心肌细胞(图1A)。分化前，通过标记细胞多潜能标志物：Sox2、Oct4、Nanog、Tra-1-60对iPSCs干性进行鉴定(图9A-D)。培养至第18天的心肌细胞为后续体外、体内实验的种子细胞。iPSC-CMs呈多边形，形成了丰富的肌节结构，表达了心肌特异性标记物，包括cTnT、α-肌动蛋白以及mlc2v(图1B)。透射电镜证实心肌细胞内存在肌纤维、Z线、线粒体和缝隙连接(图10B)。单个iPSC-CM出现典型的动作电位(图10C)。心肌细胞分化实验方案的效率很高，约83.8％的iPSCs成功分化为CMs(图1C)。
2.2 iPSC-CMs可耐受modRNA转染，体外实验证明其促血管生成能力
首先，为了验证iPSC-CMs中modRNA的有效摄取和翻译，我们用绿色荧光蛋白(GFP)modRNA转染细胞。可观察到iPSC-CMs在转染4小时后开始表达GFP蛋白，荧光信号强度在转染20小时后达到峰值(图1D)。流式细胞分析发现，在转染20小时后，modRNA转染iPSC-CMs的效率高达64.9％，但在转染后的7天内，GFP蛋白信号逐渐减弱(图1D-E)。转染了modRNA的iPSC-CMs仍保持同步跳动能力，这意味着转染过程细胞毒性低。
其次，为研究modRNA转染后iPSC-CMs的分泌动力学，我们促使细胞过度表达编码VEGF-A165基因的mRNA。评估并比较转染了VEGF modRNA的iPSC-CMs(iPSC-CMsmodVEGF)和未转染的iPSC-CMs之间新产生的和累积的VEGF蛋白水平。在前3天，iPSC-CMsmodVEGF组的新生VEGF蛋白分泌水平显著高于未转染组(图1F)。比较累积的VEGF蛋白量时可发现，所有时间点的iPSC-CMsmodVEGF组VEGF水平均显著高于未转染组(图1G)。
为了进一步证明经modVEGF处理后iPSC-CMs分泌的VEGF蛋白仍具有功能性，我们关键性地测试了条件培养基能否在体外增强人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的促血管生成能力。成管试验中，我们通过对比iPSC-CMsmodVEGF组与对照组发现，使用来自iPSC-CMsmodVEGF组的条件培养基可显著增加管状结构生成(图11A，B)。另外，通过划痕实验，我们证明了iPSC-CMsmodVEGF组能更好地促进HUVEC增殖和迁移(图11C，D)。以上这些结果表明，转染了modVEGF的iPSC-CMs能够在体外产生强大的促血管生成能力，这进一步证明了它们在心肌细胞治疗中的潜力。
2.3 RNA测序显示转染VEGF激活的基因网络
通过RNA测序分析，我们比较了modVEGF处理组iPSC-CMs和对照组iPSC-CMs(转染了luciferase mRNA的iPSC-CMs，表示为iPSC-CMsmodLuc)的整体基因表达谱。在modRNA转染第3天后，我们发现iPSC-CMsmodVEGF组和iPSC-CMsmodLuc组的细胞间存在差异表达基因(DEGS)(图1H，图12A)。对上调和下调基因进行GO聚类分析和KEGG通路分析。分析结果表明，iPSC-CMmodVEGF组的细胞富含生长、代谢和细胞外基质相关基因，并激活了PI3K-Akt和AGE-RAGE等信号通路(图12B，C)。这些信号通路的明显激活表现为VEGFA、PIK3R5、SOX2、FLT1、ACTN1、MYLK、MMP2等基因的表达上调(图1H，I)。GO聚类分析和KEGG通路分析显示，心肌收缩相关基因和肾上腺素能信号通路的下调最为显著(图12D，E)。体外RNA测序结果表明，经modVEGF处理后iPSC-CMs的基因表达谱发生了动态变化。这些基因变化或许能更好地促进心肌细胞增殖、细胞间粘附及细胞内信号传导，减轻炎症反应，进而提高iPSC-CMs的移植能力。
2.4经modVEGF mRNA预处理的iPSC-CMs可显著提高移植细胞的存活率
我们使用心肌梗死大鼠模型研究转染了modVEGF的iPSC-CMs在宿主心肌中移植的能力(图13A)。我们使所有大鼠发生透壁性心肌梗死，并维持约35％的左心室梗死面积(图13B-D)。所有接受iPSC-CMsmodVEGF治疗的大鼠，其梗死区均表现出广泛的再肌化(图2A)。为了观察和比较iPSC-CMsmodVEGF组与对照组之间iPSC-CMs的移植情况，我们对梗死边缘细胞移植区进行组织切片，并用Lamin A&C染色(图2B-D，图14)。在iPSC-CMsmodLuc和iPSC-CMsmodVEGF治疗组中，均可发现移植处理1周后仍存活的移植细胞。然而，经modLuciferase预处理的移植细胞存活率较低，而iPSC-CMsmodVEGF组的移植细胞存活率较高(图2B，C，图14A，B)。iPSC-CMsmodLuc移植处理4周后，在大鼠心脏中未找到该细胞；在iPSC-CMsmodVEGF治疗组中，可发现大量移植心肌细胞存活(图2D、图14C)，而且与移植后1周的数据相比，移植细胞的密度显著增加(图2E)。
2.5经modVEGF mRNA处理的iPSC-CMs用于心脏移植可提高心肌梗死大鼠的心功能
为了证实经VEGF modRNA处理的iPSC-CMs对左心室(LV)功能有影响，我们用超声心动图对比了各组大鼠的心功能。具体地，我们建立了5个实验组，即假手术组、MI组、经Matrigel治疗的MI组(MI-Matrigel组)、经modLuc预转染的iPSC-CMs组和经modVEGF预转染的iPSC-CMs组。根据实验设计示意图(图13A)，在心肌梗死和细胞注射前，心肌梗死和细胞注射治疗后的第7天、第14天和第28天，分别对各组大鼠进行超声心动图检查(图3A)。
超声心动图显示心肌梗死1周后各组间大鼠LV功能下降水平无显著差异(图3B)。心脏超声检测结果的统计学分析表明，在心肌梗死及治疗1周后，实验组和每个对照组之间的左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)无显著差异(图3B，E)。然而，在心肌梗死及治疗2周后，iPSC-CMsmodVEGF组的大鼠LVEF和LVFS显著高于其他实验组(图3C，F)。4周后，iPSC-CMsmodVEGF组大鼠左室心功能显著改善，其中LVEF从30.9±4.2％改善至44.9±2.3％，LVFS从15.3±2.4％改善至23.4±1.4％。iPSC-CMsmodVEGF组大鼠LV功能改善显著高于iPSC-CMsmodLuc组，后者仅能看到LVEF从心肌梗死后1周的30.1±4.5％轻微改善到心肌梗死后4周的37.4±1.9％，LVFS从心肌梗死后1周的15.8±2.2％轻微增加到心肌梗死后4周的19.0±1.1％(图3D，G)。两个细胞治疗组均优于非细胞治疗组和对照组。经iPSC-CMsmodVEGF治疗的大鼠，其超声心动图参数显著升高，该结果同样证明了经mRNA处理的iPSC-CMs在心血管细胞治疗方向存在巨大的潜力。
2.6 iPSC-CMsmodVEGF治疗可减少心肌纤维化，维持心室壁的厚度
为了进一步评估细胞移植后MI大鼠心脏的组织形态学，需在心肌梗死术和治疗4周后采集大鼠心脏。对大鼠心脏大体形态的初步观察显示，在iPSC-CMmodVEGF组中，变白、损伤的区域较小(图15A，B)。HE染色分析表明，与其他治疗组相比，心肌梗死术后iPSC-CMsmodVEGF组(MI-iPSC-CMsmodVEGF组)的组织再生比例增加显著(图4A)。MI-iPSC-CMsmodVEGF治疗组的梗死边缘区有较大移植物存活(图16A-E)。通过Masson三色染色定量分析，MI-iPSC-CMsmodVEGF组的左室纤维疤痕尺寸明显较小，且室壁厚度维持良好(图4B-E)。Vimentin染色表明，在心肌梗死4周后，大多数组的梗死区都存在大量成纤维细胞；然而与其他治疗组相比，MI-iPSC-CMsmodVEGF组中观察到的浸润性成纤维细胞数量显著降低(图4F，G)。总之，心肌梗死后iPSC-CMmodVEGF治疗可部分减少纤维化面积，防止心肌变薄和心脏扩大。
2.7经modVEGF mRNA预处理的iPSC-CMs移植后原位增殖、成熟
接下来，我们研究了移植后细胞的活性。如图1H所示，未经处理和转染了modVEGFmRNA的iPSC-CMs之间基因表达谱的主要差异为参与细胞周期调节的基因表达增加。因此，我们评估了移植后4周内存活iPSC-CMs的增殖水平。Ki67染色分析表明，移植1周后，MI-iPSC-CMsmodVEGF组的iPSC-CMs增殖率显著高于MI-iPSC-CMsmodLuc组(图5A-B，D)。但移植4周后，iPSC-CMs的Ki67表达显著降低(图5B-D)。这些数据表明，iPSC-CMsmodVEGF在植入体内后具有强大的增殖潜力，这可能延长移植物存活时间。
有趣的是，iPSC-CMsmodVEGF治疗组形成的移植心肌呈现出结构的更加成熟，包括更大、更长的CMs(图6)。iPSC-CMsmodVEGF组也呈现更好的肌节结构及排列(图17)。iPSC-CMsmodEGF和iPSC-CMsmodLuc组的移植CMs还表达了缝隙连接蛋白43(Cx43)(图6A-C)。在iPSC-CMsmodVEGF治疗组中可以观察到Cx43在相邻CMs之间的定位表达逐渐增强(图6B-C)。而经定量组织学分析，MI-iPSC-CMsmodLuc组中只有少量iPSC-CMs表达Cx43，而MI-iPSC-CMsmodVEGF组中Cx43的表达增加(图6A-D)。移植4周后可检测到CMs增殖较少、Cx43表达增加，这可能表明移植的心肌细胞在原位成熟。
2.8经modVEGF处理的iPSC-CMs移植后可增强体内新生血管形成
先前的研究已证明，新生心肌细胞或心脏祖细胞的移植都促进了移植区宿主血管的生成，而心肌移植物内大量的新生血管网络对其长期存活至关重要。因此，为了评估VEGF-modRNA iPSC-CMs促进移植区新生血管形成的能力，我们进行了CD31和α-SMA染色分析。
结果显示，iPSC-CMmodVEGF移植1周后，移植区已形成毛细血管和成熟、稳定的小动脉(图18)。且在我们实验的终点，即心肌梗死及移植术4周后，这些毛细血管和小动脉网络维持原状。MI-iPSC-CMsmodLuc组在4周后未找到大存活移植物，因此推测该组新生血管形成较少。在梗死区域内，MI-iPSC-CMsmodVEGF组的毛细血管密度明显高于所有其他组(图7A、C、D)。在对CD31和α-SMA均呈阳性的动脉进行染色分析时发现，与其他组相比，移植iPSC-CMsmodVEGF后梗死区的动脉密度显著增加(图7C，D)。另外，我们还对梗死边缘区进行了CD31和α-SMA染色分析，结果表明，与假手术组以外的其他组相比，MI-iPSC-CMsmodVEGF组的毛细血管密度和小动脉密度同样显著增加(图7B，E，F)。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种皮片或皮瓣，其特征在于，所述皮片或皮瓣转染有modRNA。
2.根据权利要求1所述的皮片或皮瓣，其特征在于，所述转染的方式为脂质体转染、纳米颗粒介导、粒子轰击、微注射或电穿孔。
3.根据权利要求1所述的皮片或皮瓣，其特征在于，所述转染的方式是将皮片或皮瓣浸于含有modRNA的转染液中。
4.根据权利要求1所述的皮片或皮瓣，其特征在于，所述modRNA翻译促进创面愈合的蛋白或多肽。
5.根据权利要求4所述的皮片或皮瓣，其特征在于，所述modRNA为SDF-1α、PDGF、TGF、FGF、EGF、IGF或VEGF modRNA。
6.根据权利要求1所述的皮片或皮瓣，其特征在于，所述创面是由切割伤、挫伤、烧伤、化学性灼伤、褥疮或糖尿病导致的皮肤溃疡形成的。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述皮片为表层皮片、中厚皮片或全厚皮片；所述皮瓣为单纯皮瓣、筋膜皮瓣、复合皮瓣、联合皮瓣或组合组织皮瓣。
8.一种皮片或皮瓣的处理方法，其特征在于，包含用modRNA转染皮片或皮瓣的步骤。
9.权利要求1-7任意一种皮片或皮瓣在制备促进创面愈合的产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述创面是由切割伤、挫伤、烧伤、化学性灼伤、褥疮或糖尿病导致的皮肤溃疡形成的。
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